CN105203677A

CN105203677A - 一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法

Info

Publication number: CN105203677A
Application number: CN201510665772.1A
Authority: CN
Inventors: 沈玉萍; 杨欢; 徐莹; 余江南; 陈慧卿; 曹进; 夏国华
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本发明涉及一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，属于中药技术领域；本发明首先将僵蚕粉碎后加入水，超声提取后离心取上清液加入饱和硫酸铵水溶液中，涡旋静置过夜；然后离心收集沉淀；将沉淀用水溶解，得样品溶液；使用反相键合固相萃取C4？Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，乙腈洗脱，得僵蚕供试品溶液；然后采用MALDI-TOF质谱仪检测僵蚕蛋白质，发现僵蚕蛋白质的分子量主要介于10？kDa~40？kDa之间，且m/z为14803的蛋白质易于离子化或含量较其他蛋白质高；本方法操作简便、快速、单次分析样品多、测定分子量范围宽、测定结果准确、重复性好，而且样品处理简便、消耗少、可分析不同来源、批次的动物药僵蚕中的蛋白质，为动物药僵蚕的准确鉴定提供了具体方法。

Description

一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，属于中药技术领域。

背景技术

僵蚕（BombyxBatryticatus），为蚕蛾科昆虫家蚕（BombyxmoriLinnaeus）4～5龄的幼虫感染（或人工接种）真菌门半知菌纲的球孢白僵菌（BeauveriabassianaBals.Vuillant）而致死的干燥虫体，又称白僵蚕、僵虫、姜虫、天虫等。僵蚕性平，味咸、辛；入肝、心、脾、肺四经。僵蚕能祛风热、息风止痉、祛风止痛、活络通经、化痰镇咳、解毒散结等。主治小儿惊痫、咽喉肿痛、头痛、中风抽搐、半身不遂、丹毒、乳腺炎等。

僵蚕是常见的中药动物药，疗效确实、药用价值高，年需求量在400吨以上，且常年外销出口。僵蚕伪品大多为用石灰水将死家蚕掺白加工而成，也有将地蚕冒充正品僵蚕使用。近年来，出现了新的伪品黑死蚕和空心僵蚕，由于外观、显微等均与正品相似，难以应用常规方法进行有效鉴别。中药僵蚕的化学成分主要为蛋白质、氨基酸、脂肪等物质，如亮氨酸、天冬氨酸以及变态活性融激素等，而蛋白质具有较高的种属和组织特异性，因此僵蚕的鉴别可以选择其所含有的蛋白质作为识别物。

目前，僵蚕的质量评价仍然主要依靠传统的生药学鉴别方法，即从外观、色泽、质地、气味等方面来评价真伪优劣，其经验依赖性强、准确性较低。对于僵蚕中丰富的蛋白质类化学成分，邱乙等（邱乙，汪云伟，程元柳，等.《基于差异蛋白质鉴别僵蚕及其新型伪品》，吉林中医药，2014年10期）通过分析总蛋白含量、可溶性蛋白含量差异以及应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术寻找差异蛋白质来鉴别僵蚕与伪品黑死蚕、空心僵蚕。但是，该方法存在步骤繁琐、时间和试剂消耗大、SDS-PAGE不能准确测定蛋白质分子量等固有缺陷。

基质辅助激光解吸附-飞行时间（MALDI-TOF）生物质谱技术具有检测速度快（以秒计）、单次分析检测样品多（384个）、测定分子量范围宽（500～500000Da）、测定结果准确、重复性好等优势；此外，相比其他鉴定手段，MALDI-TOF生物质谱技术稳定性更高，而且样品处理简便、消耗少、耐高浓度盐、缓冲剂和其他非挥发性成分的优点。因而，使用MALDI-TOF分析僵蚕中的蛋白质是一种比较合理且有效的手段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术难以准确获得僵蚕蛋白质的分子量信息，也缺乏整体质量的量化检测指标，与现代医药的发展要求不相适应，提供一种基于MALDI-TOF生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，为动物药僵蚕的准确鉴定提供方案。

本发明通过以下步骤达到快速检测僵蚕蛋白质的目的：

一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，首先制备供试品溶液，利用生物质谱技术快速检测。

其中供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行：

1）将僵蚕粉碎，得细粉，加入适量水，超声提取，离心后取上清液；

其中，所述僵蚕细粉量与加入水的量的比例为1mg：10-60μL；所述超声提取时间为30分钟；所述离心条件为12000r/min离心15分钟。

2）将上清液缓慢加入饱和硫酸铵水溶液中，涡旋数秒，4℃静置过夜；

其中所述加入饱和硫酸铵水溶液的量与步骤（1）中加入水的量体积比为30-50：1。

3）将混合溶液再次离心，弃去上清液，收集沉淀；

其中，所述离心条件为12000r/min离心15分钟。

4）将上述沉淀用适量水溶解，得到样品溶液；

5）使用反相键合固相萃取C4Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，以乙腈洗脱，得到供试品溶液；

其中所述乙腈浓度为70%~90%，用量为5~10μL。

一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，检测方法按照下述步骤进行：

1）吸取供试品溶液0.5~1μL，点样，再取饱和3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液0.5~1μL，混合，挥干；

2）将样品板载入MALDI-TOF质谱仪中进行分析。

3）MALDI-TOF检测参数

AcceleratingVoltage：25kV

GridVoltage%：95%

GuideWireVoltage%：0.15%

DelayTime：450nsec

InputBandwidth：25MHz

DigitizerBinsize：1nsec

Massrange：5000-100000

LowMassGate：100Da

Shots/Spectrum：1000

Intensity：6000

本发明的有益效果如下：

（1）本发明的制备方法以水为溶剂从中药僵蚕中提取蛋白质类化学成分，然后以硫酸铵沉淀法、反相键合固相萃取技术除去提取液中的杂质，极大地纯化和浓缩了蛋白质样品，不仅避免了杂质对后续MALDI-TOF测定的干扰，而且该方法与常规的透析法相比，无需进行耗时的透析、冷冻干燥等操作，极大地缩短了样品制备时间。

（2）本发明的MALDI-TOF生物质谱分析与常用的SDS-PAGE技术相比，无需进行耗时的胶制备、蛋白质分离和染色操作，测定速度快，具有高通量特性；此外，由图1可见，僵蚕样品的质荷比信号丰富、清晰，直接而准确地体现了僵蚕蛋白质的分子量信息，弥补了SDS-PAGE不能直接给出准确分子量的缺陷。

附图说明

图1是僵蚕蛋白质MALDI-TOF质谱图谱。

具体实施方式

实施例1：

将20mg僵蚕粉碎，得细粉，加入200μL水，超声提取30分钟，12000r/min离心15分钟；将上清液缓慢加入6mL饱和硫酸铵溶液中，涡旋数秒，4℃静置过夜；将混合溶液于12000r/min再次离心15分钟，弃去上清液，收集沉淀；将上述沉淀用约100μL水溶解，得到溶液；使用反相键合固相萃取MilliporeC4Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，以70%乙腈10μL洗脱，得到供试品溶液；吸取供试品溶液1μL，点样，再取饱和3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液1μL，混合，挥干；将样品板载入MALDI-TOF质谱仪中进行分析。

实施例2：

将20mg僵蚕粉碎，得细粉，加入1000μL水，超声提取30分钟，12000r/min离心15分钟；将上清液缓慢加入50mL饱和硫酸铵溶液中，涡旋数秒，4℃静置过夜；将混合溶液于12000r/min再次离心15分钟，弃去上清液，收集沉淀；将上述沉淀用约100μL水溶解，得到溶液；使用反相键合固相萃取MilliporeC4Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，以80%乙腈5μL洗脱，得到供试品溶液；吸取供试品溶液0.5μL，点样，再取饱和3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液0.5μL，混合，挥干；将样品板载入MALDI-TOF质谱仪中进行分析。

实施例3：

将20mg僵蚕粉碎，得细粉，加入1200μL水，超声提取30分钟，12000r/min离心15分钟；将上清液缓慢加入60mL饱和硫酸铵溶液中，涡旋数秒，4℃静置过夜；将混合溶液于12000r/min再次离心15分钟，弃去上清液，收集沉淀；将上述沉淀用约100μL水溶解，得到溶液；使用反相键合固相萃取MilliporeC4Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，以90%乙腈5μL洗脱，得到供试品溶液；吸取供试品溶液0.5μL，点样，再取饱和3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液0.5μL，混合，挥干；将样品板载入MALDI-TOF质谱仪中进行分析。

检测试验例：

1、材料

1.1仪器

ABI4800MALDI-TOF生物质谱仪，UltraSonik57H数控超声波清洗器，SIEMENS自动超纯水器，BiofrontierAX26电子天平，Eppendorf5415R离心机。

1.2药品与试剂

色谱纯乙腈，色谱纯三氟乙酸，3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸，硫酸铵，MilliporeC4Ziptip，AppliedBiosystemOpti-TOF384样品板。

2、仪器条件

2.1MALDI-TOF检测参数

AcceleratingVoltage：25kV

GridVoltage%：95%

GuideWireVoltage%：0.15%

DelayTime：450nsec

InputBandwidth：25MHz

DigitizerBinsize：1nsec

Massrange：5000-100000

LowMassGate：100Da

Shots/Spectrum：1000

Intensity：6000

2.2鉴定结果

典型MALDI-TOF质谱图如图1所示；僵蚕蛋白质的质荷比（m/z）信号的位置直接由质谱仪自带软件标出，主要包括：14803，14950，27801和39576四个峰，其中m/z14803的丰度最高，m/z39576的丰度最低，表明僵蚕蛋白质的分子量主要介于10kDa~40kDa之间，并且m/z为14803的蛋白质更易于离子化或者含量较其他蛋白质高。本发明中的检测方法可直接、全面简便地测定僵蚕蛋白质的分子量，比SDS-PAGE技术更为准确、快速，具有高通量特点，为中药僵蚕的质量控制提供了一种新的方案。

Claims

1.一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：

（1）制备僵蚕供试品溶液；

（2）利用质谱仪进行检测：吸取供试品溶液，样品板中点样，再取饱和3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液，混合，挥干；将样品板载入质谱仪中进行分析，利用生物质谱技术快速检测。

2.根据权利要求1所述的一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，其特征在于，所述吸取供试品溶液0.5~1μL；所述取饱和3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液的量与供试品溶液量相同。

3.根据权利要求1所述的一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，其特征在于，所述质谱仪为MALDI-TOF。

4.如权利要求1所述僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

（1）将僵蚕粉碎，得细粉，加入适量水，超声提取，离心后取上清液；

（2）将上清液缓慢加入饱和硫酸铵水溶液中，涡旋数秒，4℃静置过夜；

（3）将混合溶液再次离心，弃去上清液，收集沉淀；

（4）将上述沉淀用适量水溶解，得到样品溶液；

（5）使用反相键合固相萃取C4Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，以乙腈洗脱，得到僵蚕供试品溶液。

5.根据权利要求4所述的僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的僵蚕细粉与加入水的量的比例为1mg：10-60μL；所述超声提取时间为30分钟。

6.根据权利要求4所述的僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述加入饱和硫酸铵水溶液的量与步骤（1）中加入水的量体积比为30-50：1。

7.根据权利要求4所述的僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述乙腈浓度为70%~90%，用量为5~10μL。

8.根据权利要求4所述的僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（3）中所述离心条件均为12000r/min离心15分钟。