CN113138224A

CN113138224A - 一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法

Info

Publication number: CN113138224A
Application number: CN202110286852.1A
Authority: CN
Inventors: 闻崇炜; 刘莹; 张林松; 周林辉; 李孟喜; 徐卫东; 裴丹
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2021-03-17
Filing date: 2021-03-17
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2041-03-17
Also published as: CN113138224B

Abstract

本发明属于中药材分析及质量评价技术领域，具体涉及一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法。本发明对不同僵蚕药材醇提蛋白质经蛋白质分级沉淀试剂丙酮分级处理后对各沉淀部分进行十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳，并对凝胶各对应沉淀部分的电泳结果进行比对分析，可发现不同僵蚕药材的差异蛋白质。本发明设计方法简便易行、无需特殊设备及试剂、分辨率高、结果准确度高，常规实验室即可操作，利用常规的十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳可发现不同僵蚕药材的差异蛋白质，适用于不同等级或不同产地的僵蚕药材研究，为其品质鉴定及优质优价提供分析依据。

Description

一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法

技术领域

本发明属于中药材分析及质量评价技术领域，具体涉及一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法。

背景技术

僵蚕（Bombyx Batryticatus）为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyxmori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana (Bals.) Vuillant而致死的干燥体，具有息风止痉，祛风止痛，化痰散结的功效，临床可用于抽动障碍、支气管哮喘、顽固性蛋白尿及多种常见儿科疾病的治疗。

历代本草典籍指出优质僵蚕源于“蚕病风死”，具有“其色自白，死且不朽”，“曝燥都不坏”的特征，以“自僵死白色而条直者为佳”，“折断腹内黑而光亮者真”，63年版及77年版《中国药典》归纳为僵蚕以“身直、肥壮、质坚、色白、断面光亮者”及“条粗、质硬、色白、断面光亮者”为佳。为促进中药材商品的优质优价，《中药材商品规格等级（僵蚕）》（T/CACM1021.61-2018）据此将市售僵蚕药材划分为选货及统货两个等级。

僵蚕药材通常来源于蚕桑产业副产物，在我国各蚕桑产业区均有出产。因我国“东桑西移”工程的实施，促进了四川及云南蚕桑产业的发展，两地也因此成为僵蚕药的两大主要产区。由于气候及环境差异，中药材市场上通常以四川产僵蚕质量为优。

蛋白质为DNA信息表达的产物，具有高度多态性、特异性和稳定性，因此国际种子检验协会已采纳聚丙烯酰胺凝胶电泳、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和同工酶电泳等技术已广泛应用于农作物、蔬菜、牧草等种子的品种鉴定、纯度测定和亲缘关系分析等领域。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验室最常用的蛋白质定性定量分析技术，但其分辨率不高，不能用于要求更高的种内样品差异蛋白质发现及种内样品分析鉴定，因此也不适用于该技术不同等级或不同产地僵蚕药材差异蛋白质的发现及分析鉴定。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法。本发明通过对僵蚕药材提取醇提蛋白质后，应用蛋白质分级沉淀试剂丙酮分级处理后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳可以简便获得不同僵蚕药材的差异蛋白质。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明提供了一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法，所述方法包括以下步骤：

（1）僵蚕醇提蛋白质的提取：将僵蚕药材清洗后烘干、粉碎，加入乙醇溶液，常温震荡、离心后取上清液，得到僵蚕醇提蛋白质；

（2）取步骤（1）提取的僵蚕醇提蛋白质，加丙酮涡旋后静置，离心后得沉淀及上清液；

（3）取步骤（2）中得到的上清液，用丙酮分级沉淀后收集沉淀物；

（4）对各沉淀物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，凝胶染色及脱色后对差异蛋白条带进行对比分析，发现差异蛋白质。

进一步地，步骤（2）中所述醇提蛋白质与丙酮的用量关系为加丙酮至醇提蛋白质终浓度的8~10%（v/v）。

步骤（2）中所述涡旋的时间为10~20s，所述的离心为12000~14000×g离心10~15min。

步骤（3）中所述的分级沉淀中丙酮的终浓度为20%~80%（v/v）。

本发明还提供了一种僵蚕药材等级鉴定方法，所述的方法根据上述获得的僵蚕药材差异蛋白质对僵蚕药材进行统货、选货的鉴定。

本发明还提供了一种僵蚕药材产地鉴定方法，所述的方法根据上述获得的僵蚕药材差异蛋白质对僵蚕药材进行产地溯源的鉴定。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明对不同僵蚕药材醇提蛋白质经蛋白质分级沉淀试剂丙酮分级处理后对各沉淀部分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并对各对应沉淀部分的电泳结果进行比对分析，可发现相关的差异蛋白质。本发明设计方法简便易行、无需特殊设备及试剂、分辨率高、结果准确度高，常规实验室即可操作，利用常规的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现不同等级或不同产地的僵蚕药材的差异蛋白质，为其品质鉴定及优质优价提供分析依据。

附图说明

图1为工艺流程示意图图；

图2为一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法分析不同等级僵蚕药材所得结果图；

图3为一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法分析不同产地僵蚕药材所得结果图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的描述。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1

按《中药材商品规格等级（僵蚕）》（T/CACM 1021.61-2018）将亳州中药材市场所购僵蚕药材划分为选货及统货。将两种僵蚕药材水洗后置于40℃烘干，粉碎后过70目筛备用。准确称取两种等级僵蚕药材粉末，按液料比25：1（mL/g）加入40%乙醇（EtOH）溶液，25℃震荡提取8h，14000 ×g离心10 min后取上清液，分别得到选货及统货僵蚕药材的醇提蛋白质，置于-80℃保存备用。

图1是工艺流程示意图；按图1所示取5ml选货僵蚕的醇提蛋白质，加丙酮至其终浓度为10%（v/v），涡旋10s后静置，14000 r/min离心10 min，得沉淀A选及上清液A选；取全部上清液A选继续补加丙酮至其终浓度为20%（v/v），涡旋10s后静置，14000 r/min离心10min，得沉淀B选及上清液B选；取全部上清液B选继续补加丙酮至其终浓度为30%（v/v），涡旋10s后静置，14000 r/min离心10 min，得沉淀C选及上清液C选；取全部上清液C选继续补加丙酮至其终浓度为40%（v/v），涡旋10s后静置，14000 r/min离心10 min，得沉淀D选及上清液D选；取全部上清液D选继续补加丙酮至其终浓度为50%（v/v），涡旋10s后静置，14000 r/min离心10 min，得沉淀E选及上清液E选；取全部上清液E选继续补加丙酮至其终浓度为60%（v/v），涡旋10s后静置，14000 r/min离心10 min，得沉淀F选及上清液F选；取全部上清液F选继续补加丙酮至其终浓度为70%（v/v），涡旋10s后静置，14000 r/min离心10 min，得沉淀G选及上清液G选；取全部上清液G选继续补加丙酮至其终浓度为80%（v/v），涡旋10s后静置，14000 r/min离心10 min，得沉淀H选。

取5ml统货僵蚕的醇提蛋白质，采用与选货僵蚕的醇提蛋白质相同的提取方法分别获得统货僵蚕药材的沉淀A统、沉淀B统、沉淀C统、沉淀D统、沉淀E统、沉淀F统、沉淀G统及沉淀H统。

分别选货及统货僵蚕醇提蛋白质和上述得到的沉淀A选、沉淀A统、沉淀B选、沉淀B统、沉淀C选、沉淀C统、沉淀D选、沉淀D统、沉淀E选、沉淀E统、沉淀F选、沉淀F统、沉淀G选、沉淀G统、沉淀H选及沉淀H统进行常规十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后剥取凝胶进行考马斯亮蓝染色及脱色。图2是各沉淀的电泳结果对比图；其中，泳道1及泳道2分别为选货及统货僵蚕醇提蛋白质，泳道3、5、7、9、11、13、15、17分别为沉淀A选~H选；泳道4、6、8、10、12、14、16、18分别为沉淀A统~H统；泳道M为蛋白质分子量标准。由图2可见，统货僵蚕药材醇提蛋白质主要被终浓度20%（v/v）、50%（v/v）的丙酮沉淀；选货僵蚕药材醇提蛋白质主要被终浓度30%（v/v）、50%（v/v）、60%（v/v）、70%（v/v）的丙酮沉淀，经过对比后可将图2中标注的a、b、c、d及e部分标识为选货僵蚕与统货僵蚕的差异蛋白质。

实施例2

分别将购买的云南产僵蚕药材及四川产僵蚕药材（亳州中药材市场购得）水洗后置于40℃烘干，粉碎后过70目筛后备用，云南产僵蚕药材简称为滇、四川产僵蚕药材简称为川。准确称取两种产地僵蚕药材粉末，按液料比40：1（mL/g）加入40%乙醇（EtOH）溶液，25℃震荡提取12h，10000×g离心20 min后取上清液，即得对应的醇提蛋白质，置于-80℃保存备用。

分别取5ml滇、川的醇提蛋白质，加丙酮至其终浓度为8%（v/v），涡旋20s后静置，12000 r/min离心15min，分别得沉淀A滇、A川及上清液A滇、A川；取全部上清液A滇及A川分别继续补加丙酮至其终浓度为20%（v/v），涡旋20s后静置，12000 r/min离心15min，得沉淀B滇、B川及上清液B滇、B川；取全部上清液B滇及B川分别继续补加丙酮至其终浓度为30%（v/v），涡旋20s后静置，12000 r/min离心15min，得沉淀C滇、C川及上清液C滇、C川；取全部上清液C滇及C川分别继续补加丙酮至其终浓度为40%（v/v），涡旋20s后静置，12000 r/min离心15min，得沉淀D滇、D川及上清液D滇、D川；取全部上清液D滇及D川分别继续补加丙酮至其终浓度为50%（v/v），涡旋20s后静置，12000 r/min离心15min，得沉淀E滇、E川及上清液E滇、E川；取全部上清液E滇及E川分别继续补加丙酮至其终浓度为60%（v/v），涡旋20s后静置，12000 r/min离心15min，得沉淀F滇、F川及上清液F滇、F川；取全部上清液F滇及F川分别继续补加丙酮至其终浓度为70%（v/v），涡旋20s后静置，12000 r/min离心15min，得沉淀G滇、G川及上清液G滇、G川；取全部上清液G滇及G川分别继续补加丙酮至其终浓度为80%（v/v），涡旋20s后静置，12000 r/min离心15min，得沉淀H滇、H川。

分别取滇、川的醇提蛋白质、沉淀A滇、沉淀A川、沉淀B滇、沉淀B川、沉淀C滇、沉淀C川、沉淀D滇、沉淀D川、沉淀E滇、沉淀E川、沉淀F滇、沉淀F川、沉淀G滇、沉淀G川、沉淀H滇、沉淀H川进行常规十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后剥取凝胶进行考马斯亮蓝染色及脱色。图3是滇、川的醇提蛋白质及各分级沉淀的电泳结果对比图；其中，泳道1及泳道2分别为滇、川的醇提蛋白质，泳道3、5、7、9、11、13、15、17分别为沉淀A滇~H滇；泳道4、6、8、10、12、14、16、18分别为沉淀A川~H川；泳道M为蛋白质分子量标准。由图3可见，云南产僵蚕药材醇提蛋白质主要被终浓度30%（v/v）、50%（v/v）、60%（v/v）的丙酮沉淀，四川产僵蚕药材醇提蛋白质主要被终浓度20%（v/v）、30%（v/v）、50%（v/v）、60%（v/v）的丙酮沉淀；经过对比后可将图3中标注的L、M、N、O、P及Q部分标识为云南产僵蚕药材与四川产僵蚕药材的差异蛋白质。

本领域技术人员应理解，以上所述仅是本发明的较佳实施方式，并不用以限制本发明，在不背离本发明的精神和范围情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

Claims

1.一种适用于发现僵蚕药材差异蛋白质的简便方法，其特征在于，包括以下步骤：

（4）对各沉淀物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，凝胶染色及脱色后对差异蛋白条带进行对比分析，发现僵蚕药材差异蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述醇提蛋白质与丙酮的用量关系为加丙酮至醇提蛋白质终浓度的8~10%（v/v）。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述涡旋的时间为10~20s，所述的离心为12000~14000×g，离心10~15min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的分级沉淀中丙酮的终浓度为20%~80%（v/v）。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的分级沉淀为向僵蚕醇提蛋白质中添加丙酮至最低终浓度，涡旋后静置，离心后收集沉淀；将残留上清液逐次补加丙酮至稍高终浓度，涡旋后静置，收集各级沉淀，直至添加丙酮到最高终浓度。

6.根据权利要求1~5任一项所述的僵蚕药材差异蛋白质在分析僵蚕药材规格等级划分中的应用。

7.根据权利要求1~5任一项所述的僵蚕药材差异蛋白质在分析僵蚕药材产地溯源中的应用。