CN103969321B - 基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生化分析领域，涉及一种固定化酶原位酶解组织切片实现蛋白鉴定并应用于质谱成像的新方法。本发明利用表面具有羟基羧基等亲水基团的氧化石墨烯固定胰蛋白酶，通过提高酶解效率，实现组织切片上蛋白质的原位高效酶解及鉴定，并将其应用于质谱成像技术，确定了切片中蛋白质的分布。本发明所选用的载体材料氧化石墨烯具有极强的吸附能力，可在短时间内吸附胰蛋白酶，利用限域效应极大提高了胰蛋白酶的酶解效率，有效促进了组织切片原位酶解及蛋白的鉴定。本发明具有步骤简单、操作方便、快速高效等特点，可广泛用于蛋白质组学相关领域。

Description

基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法

技术领域

本发明属于生化分析领域，涉及一种基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法，具体涉及一种固定化酶原位酶解组织切片实现蛋白鉴定并应用于质谱成像的新方法。

背景技术

现有技术公开了基于生物质谱的组织成像技术作为质谱技术中的一个新领域在迅速发展。它通过直接扫描组织表面，结合专业的图像处理软件，将扫描产生的离子信号通过数据处理与图像重建，获得组织中化合物的组成，相对丰度及分布情况。该技术已广泛应用于探测组织切片中的小分子类物质、脂类、多肽和蛋白质的分布，能够确定病变组织和正常组织中不同部位的特定分子位置及相对含量，能够跟踪药物及其代谢产物的空间分布，因此越来越受到国内外科学家的关注。然而，在分析分子量较大的蛋白时，因其较低的离子化效率和检测灵敏度，质谱成像技术依然存在一些困难和挑战。现阶段，成像技术中使用的质谱仪器多与飞行时间质量分析器连用，随着被分析物分子量的增大，其灵敏度随之下降，且分辨率不足以直接完成对蛋白的鉴定。

现有技术中，发展了用高浓度的有机溶剂处理切片表面以提高成像技术中对蛋白质的检测效率的方法，但是其操作复杂耗时，易造成切片中蛋白的移位。在传统蛋白质组学研究中，将蛋白酶解成肽段可使其更易于质谱检测。现阶段的原位酶切技术是将酶液滴点在组织切片上，在适宜的温度和时间内，将蛋白质在其原有位置上酶切成若干肽段的一项新技术。目前该方法的条件仍有待优化：过高的胰酶量产生的自切肽段将影响低丰度蛋白质的检测。而胰酶的量过低，因切片厚度非常薄，蛋白含量很低造成不能被有效酶切。因此，亟需发展一种更高效，更便捷的原位酶解的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种步骤简单、操作方便、快速高效的原位酶解方法，具体涉及一种基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法，该方法结合固定化酶的技术，在短时间内快速酶切组织切片上的蛋白，并应用于质谱成像。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

1.选择合适的胰蛋白酶固定化材料。

2.利用材料与胰蛋白酶的相互作用将胰酶固定。

3.固定化酶在组织切片上原位酶解后进行质谱分析。

4.利用图像重构软件实现组织切片上蛋白分布的确定。

具体的，本发明的基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法，其特征是，选用合适的纳米材料作为胰蛋白酶吸附剂，利用其高效的酶解效率实现组织切片原位酶解及蛋白鉴定并应用于质谱成像，其包括步骤：

（1）将离体的组织切片用导电胶带固定于质谱靶板上；

（2）依次用不同浓度的乙醇溶液润洗切片表面，每次润洗一分钟；

（3）将胰蛋白酶与氧化石墨烯材料按照事宜比例，在磷酸缓冲溶液中混合，4摄氏度条件下孵育；

（4）将固定化酶用25mM碳酸氢铵溶液稀释后均匀铺展在组织切片上，并放入37摄氏度恒温箱，至组织切片表面的溶液完全蒸发；

（5）配制含三氟乙酸和乙腈水溶液配制成CHCA基质溶液，用基质覆盖仪将基质溶液均匀喷洒在组织切片上，待基质完全干燥后送入质谱仪进行成像分析；

（6）将扫描结果导入成像软件中，通过图像重构技术处理，选择合适的肽段得到组织切片中蛋白分布的质谱成像图。

本发明中，组织切片的厚度通常为14μm。

本发明中，依次用50%，75%，100%的乙醇溶液润洗切片表面。

本发明中，润洗时间为1分钟。

本发明中，材料与胰蛋白酶的浓度为400ng/μL。

本发明中，磷酸缓冲溶液浓度为20mM（pH5）。

本发明中，其特征是混合比例为1:1。

本发明中，是4摄氏度条件下孵育5分钟。

本发明中，将固定化酶用25mM碳酸氢铵溶液稀释10倍。

本发明中，是CHCA基质溶液（5mg/mL,0.1%三氟乙酸50%乙腈）用基质覆盖仪将基质溶液均匀喷洒在组织切片上。

本发明方法中，优选的具体条件是：

1.组织从负80摄氏度转移至冷冻切片机，冷冻切片机操作温度为负18摄氏度，获取厚度为14μm的组织切片，并用导电胶带固定于质谱靶板上。

2.依次用50%，75%，100%的乙醇溶液润洗切片除去脂类等干扰物质，每次润洗一分钟。

3.将400ng/μL胰蛋白酶与400ng/μL氧化石墨烯材料按照1:1比例，在20mM磷酸缓冲溶液中（pH5）混合，4摄氏度条件下孵育5分钟。

4.将固定化酶用25mM碳酸氢铵溶液稀释后均匀铺展在组织切片上，并放入37摄氏度恒温箱，至组织表面的溶液完全蒸发。

5.用含0.1％三氟乙酸的50％乙腈水溶液配制成5mg/mL的CHCA基质溶液，用基质覆盖仪将基质溶液均匀喷洒在组织切片上，待基质完全干燥后送入质谱仪分析。

6.将扫描结果导入成像软件中，通过图像重构软件处理，得到组织切片中蛋白分布的质谱成像图。

本发明的优点是：

本发明使用的氧化石墨烯材料，因其表含有大量的含氧活性基团，如羰基、羧基、羟基与环氧基等而具有良好的生物相容性和水溶液稳定性。利用氧化石墨烯与胰蛋白酶之间的氢键、π-π相互作用、离子键等非共价键作用，可快速地将胰蛋白酶固定，不仅操作简便，且提高了酶解效率。用制成的固定酶进行标准蛋白如牛血清白蛋白，马心肌红蛋白和α-酪蛋白的靶上酶解，10分钟内酶解即可完成。同时，氧化石墨烯不干扰质谱检测，且起到稳定信号的作用，酶解后也无需将其从靶上去除，即可直接用于质谱鉴定。

本发明所选用的氧化石墨烯材料能快速、高效率地固定胰蛋白酶，不干扰质谱检测，提高了靶上酶解的效率。本方法具有步骤简单、操作方便、快速高效等特点。

附图说明

图1为本方法的操作流程示意图。

图2为未掺杂氧化石墨烯材料的5ng/μL牛血清白蛋白酶解肽段质谱图（a）与掺杂等量氧化石墨烯材料的5ng/μL牛血清白蛋白酶解肽段质谱图（b），●代表牛血清白蛋白酶解肽段。

图3为掺杂及未掺杂氧化石墨烯材料的10ng/μL牛血清白蛋白酶解肽段质谱信号重复性对比图，■为未掺杂氧化石墨烯材料的10ng/μL牛血清白蛋白酶解肽段质谱信号，●为掺杂氧化石墨烯材料的10ng/μL牛血清白蛋白酶解肽段质谱信号。

图4为时间对氧化石墨烯固定胰蛋白酶量的影响。

图5为pH对氧化石墨烯固定胰蛋白酶量的影响。

图6为氧化石墨烯的红外光谱图（a），胰蛋白酶的红外光谱图（b）和固定胰蛋白酶后氧化石墨烯的红外光谱图（c）。

图7为固定化酶靶上酶解10ng/μLα-酪蛋白酶解肽段质谱图（a）和游离酶靶上酶解10ng/μLα-酪蛋白酶解肽段质谱图（b）。

图8为酶解前的人晶状体组织切片质谱图（a）和固定化酶酶解后的组织切片质谱图（b）。

图9为人晶状体组织切片光学图片（a）肽段QYLLDKKEYR质谱成像图（b）肽段GRQYLLDKKEYR质谱成像图（c）肽段KPIDWGAASPAVQSFR质谱成像图（d）。

表1为游离酶和固定化酶靶上酶解不同浓度的α-酪蛋白和牛血清白蛋白的蛋白得分和序列覆盖度。

表2为质谱成像过程中鉴定到的人晶状体组织切片中的蛋白及肽段的信息。

具体实施方式

下面的实例是对本发明提出的利用固定化酶原位高效酶解组织切片实现蛋白鉴定并应用于质谱成像技术的新方法的进一步说明。

实施例1

氧化石墨烯材料对质谱检测信号干扰的考察试验

分别配制浓度为5ng/μL的牛血清白蛋白酶解肽段溶液及其与氧化石墨烯材料分散液的混合溶液（1：1比例配制）。分别取1μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的CHCA基质溶液（0.1%三氟乙酸50%乙腈水溶液）。干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析，结果如图2所示。

分别配制浓度为10ng/μL的牛血清白蛋白酶解肽段溶液及其与氧化石墨烯材料分散液的混合溶液（1：1比例配制）。分别取1μL点样于MALDI靶板上，连续点样于十个靶点。待干燥后在十个靶点上分别点样等体积的CHCA基质溶液（0.1%三氟乙酸50%乙腈水溶液）。干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS连续分析，结果如图3所示。

实施例2

氧化石墨烯材料对胰蛋白酶吸附能力的试验

在20mM磷酸缓冲溶液中（pH5）配制终浓度为400ng/μL的氧化石墨烯材料分散液和胰蛋白酶溶液，等比例混合孵育至一定时间后，离心5分钟取上清液。用BCA蛋白浓度测定方法测定上清液中未固定的胰蛋白酶浓度。根据胰蛋白酶原浓度及上清液中未固定的胰蛋白酶浓度求得氧化石墨烯材料对胰蛋白酶的吸附量。结果如图4所示。

在不同pH条件下（pH4-10）重复上述实验。结果如图5所示。

实施例3

固定化酶与游离酶对标准蛋白靶上酶解效果的研究

如实施例2中所述将胰蛋白酶固定后（pH5），将其用25mM碳酸氢铵缓冲液中稀释10倍。

配制α-酪蛋白的水溶液（10ng/μL），取1μL上述溶液点样于MALDI靶板上，待干燥后将用25mM碳酸氢铵稀释的游离酶或固定化酶再点样于相应靶点上，并放置于37摄氏度恒温箱酶解。酶解完成后将1μLDHB基质溶液（0.1%三氟乙酸50%乙腈水溶液）点样于MALDI靶板上，干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析，结果如图7所示。

牛血清白蛋白和马心血肌红蛋白（10ng/μL）用上述方法酶解后通过mascot搜库软件搜库，设置搜库参数为：胰酶消化，最大漏切位点为1个，种限定于哺乳动物，母离子误差±0.1Da，可变修饰为甲硫氨酸氧化。

表1为游离酶和固定化酶靶上酶解不同浓度的α-酪蛋白和牛血清白蛋白的蛋白得分和序列覆盖度。

表2为质谱成像过程中鉴定到的人晶状体组织切片中的蛋白及肽段的信息。

表1

表2

实施例4

固定化酶用于组织切片原位酶解及质谱成像的研究

人晶状体组织从负80摄氏度转移至冷冻切片机，冷冻切片机操作温度为负18摄氏度，连续获取厚度为14μm的组织切片，并用导电胶带固定于质谱靶板上。依次用50%，75%，100%的乙醇溶液润洗除去脂类等干扰物质，每次润洗一分钟。待切片完全干燥后，取其中一片利用TM-Sprayer^TM基质覆盖仪对组织切片表面喷洒一层CHCA基质溶液（5mg/mL,0.1%三氟乙酸50%乙腈水溶液），干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析。结果如图8所示。

取另一片组织切片，用50%，75%，100%的乙醇溶液润洗干燥后将稀释后的固定化酶（如实施例3所述）均匀铺展在切片表面并置于37摄氏度恒温箱原位酶解。酶解结束后，切片送入MALDI-TOF/MS进行成像分析。取三条肽段用图像重构软件做出成像图，结果如图9所示。图9为人晶状体组织切片光学图片（a）肽段QYLLDKKEYR质谱成像图（b）肽段GRQYLLDKKEYR质谱成像图（c）肽段KPIDWGAASPAVQSFR质谱成像图（d）。

Claims (10)

1.一种基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法，其特征是，选用纳米材料作为胰蛋白酶吸附剂，利用其高效的酶解效率实现组织切片原位酶解及蛋白鉴定并应用于质谱成像，其包括步骤：

(1)将离体的组织切片用导电胶带固定于质谱靶板上；

(2)依次用不同浓度的乙醇溶液润洗切片表面，每次润洗一分钟；

(3)将胰蛋白酶与氧化石墨烯材料在磷酸缓冲溶液中混合，4摄氏度条件下孵育；

(4)将固定化酶用25mM碳酸氢铵溶液稀释后均匀铺展在组织切片上，并放入37摄氏度恒温箱，至组织切片表面的溶液完全蒸发；

(5)配制含三氟乙酸和乙腈水溶液配制成CHCA基质溶液，用基质覆盖仪将基质溶液均匀喷洒在组织切片上，待基质完全干燥后送入质谱仪进行成像分析；

(6)将扫描结果导入成像软件中，通过图像重构技术处理，选择合适的肽段得到组织切片中蛋白分布的质谱成像图。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征是组织切片厚度为14μm。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征是依次用50％，75％，100％的乙醇溶液润洗切片表面。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征是润洗时间为1分钟。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征是材料与胰蛋白酶的浓度为400ng/μL。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征是磷酸缓冲溶液浓度为20mMpH5。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征是胰蛋白酶与氧化石墨烯材料混合比例为1:1。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征是4摄氏度条件下孵育5分钟。

9.按照权利要求1所述的方法，其特征是将固定化酶用25mM碳酸氢铵溶液稀释10倍。

10.按照权利要求1所述的方法，其特征是CHCA基质溶液含5mg/mL,0.1％三氟乙酸50％乙腈，用基质覆盖仪将基质溶液均匀喷洒在组织切片上。