CN110146353B - 生化样品原位处理装置及磷酸化蛋白的质谱成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生化样品原位处理装置及磷酸化蛋白的质谱成像方法，涉及分析化学技术领域。所述生化样品原位处理装置包括：生化处理槽、被配置在生化处理槽内的载玻片托，以及被配置在载玻片托内的载玻片和双层磁铁，所述双层磁铁的磁力线垂直穿过所述载玻片；所述磷酸化蛋白质谱成像方法利用四氧化三铁悬浮液吸附固定磷酸化肽段，随后即可进行质谱检测。本发明利用磁场技术和磁性材料对生化样品进行原位处理，并应用于磷酸化蛋白的质谱成像中。

Description

生化样品原位处理装置及磷酸化蛋白的质谱成像方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域。更具体地，涉及一种生化样品原位处理装置及磷酸化蛋白的质谱成像方法。

背景技术

生物组织样品表面生化分子的处理是样本处理的一种模式，广泛应用于各种生物组织表面分析的样品前处理过程中，例如动物组织表面的染色，免疫组化，透射电镜，冷冻电镜等样品的表面处理等。简单的表面生化处理，如染色、免疫组化，生化分子在样品表面仅发生简单的非共价吸附或共价键合，不容易发生空间位移。但在较为复杂的、多步骤的样品表面生化处理过程中，样品表面的生化分子受多次物理和化学作用，会从其原有的位置发生位移，失去原有的空间位置信息。目前的表面生化处理领域缺少有效的原位处理技术，这在一定程度上阻碍了基于生物组织样品表面生化分子的处理后的质谱成像技术的发展和推广应用。简单的处理，无论是非共价吸附或共价键合，均不能实现组织表面生化分子所需的完全的生化处理，组织表面生化分子经过复杂的生化处理步骤，不能保留其原位的信息，满足不了质谱成像的要求。因此需要设计出一种基于原位固定的生化样品表面处理技术装置，使得组织样品表面的分子在受到多次物理和化学作用的界面处理时，保持空间位置相对处于原位，对基于生物组织样品表面生化分子处理后的质谱成像技术的建立和推广应用具有一定的实用意义。

蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程调节着包括细胞增殖、发育、分化、信号传导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩以及肿瘤发生等过程在内的几乎所有生命活动。因此，在组织切片表面原位解析磷酸化蛋白的分布及其修饰的动态变化对研究组织内部生物学信号通路及各种生命运动机理有重要的意义。截至目前为止，生物组织样品表面生化大分子------磷酸化修饰蛋白质的成像一般用免疫组化技术，随着质谱技术的发展，使得磷酸化蛋白质的质谱成像技术成为可能。目前为止，尚没有关于磷酸化蛋白质的质谱成像的报道，因此针对磷酸化蛋白质的质谱成像分析技术具有很强的实用意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种可利用磁场技术和磁性材料对生化样品进行原位处理的装置。

本发明的另一个目的在于提供一种利用上述装置进行磷酸化蛋白的质谱成像方法。

为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：

一种生化样品原位处理装置，包括：生化处理槽、被配置在生化处理槽内的载玻片托，以及被配置在载玻片托内的载玻片和双层磁铁；

所述载玻片托包括用于固定载玻片的第一本体部，以及结合固定在所述第一本体部底部的用于固定所述双层磁铁的第二本体部；

所述第二本体部包括有一端开口的容纳腔，所述双层磁铁位于所述容纳腔内；所述载玻片位于所述双层磁铁在第一本体部上的投影所限定的区域内，所述双层磁铁的磁力线垂直穿过所述载玻片。

优选地，所述第一本体部包括用于放置载玻片的卡槽以及用于固定载玻片的第一卡子，所述载玻片通过第一卡子被水平固定在所述卡槽内；

所述第二本体部还包括有用于固定所述双层磁铁的第二卡子，所述双层磁铁通过第二卡子被水平固定在所述容纳腔内。

优选地，所述生化样品原位处理装置还包括用于提拉载玻片托的提绳。

优选地，所述载玻片的厚度为0-2mm，但不能为0mm；载玻片与双层磁铁之间的距离为0-2mm。

优选地，所述载玻片与所述双层磁铁之间设有用于支撑所述载玻片的隔离板，所述隔离板的厚度为0-2mm。

优选地，所述第一本体部和所述第二本体部为一体结构，或者所述第一本体部和所述第二本体部为结合固定在一起的两个独立结构。

优选地，所述生化处理槽和载玻片托的材料为聚苯乙烯、透明塑料或玻璃。

为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：

一种磷酸化蛋白的质谱成像方法，包括：

将蛋白酶切后的生物组织冰冻切片置于如上任一项所述的载玻片上，在所述生物组织冰冻切片的表面喷洒四氧化三铁悬浮液并孵育15min；

用50％的乙腈溶液清洗生物组织冰冻切片表面的非磷酸化肽段，未被原位固定的非磷酸化肽段被清除，真空抽干后进行质谱检测。

优选地，生物组织切片用冰冻切片的方法制备成冰冻切片，喷洒胰酶溶液并孵育2h，真空干燥，得到蛋白酶切后的生物组织冰冻切片。

优选地，所述四氧化三铁悬浮液的浓度为0.01-100ug/ul，喷洒体积为5-250ul。

本发明的有益效果如下：

本发明采用磁场和磁力作为驱动力，用磁铁及其固定槽作为装置的基体，可以方便精确地通过控制磁力线与组织切片表面生化分子的垂直角度来固定生化分子的二维空间分布，进而保持生化分子在复杂的生化处理过程中的原位性，这在质谱成像的样本处理过程中是极为重要的，可以保持复杂生化处理过程中生化分子的位置不变，用于生化分子位置信息的测定，从而促进质谱成像的组织切片样品表面生化处理的建立发展和推广应用。本发明提供的生化样品原位处理装置，整体结构简单，体积小，使用方便。

本发明在垂直磁力线的磁场中采用带磁性的四氧化三铁悬浮液与组织切片表面的蛋白酶切后的磷酸化肽段相结合，可以使得磷酸化肽段在随后的去除非磷酸化肽段的过程被磁力吸附在原位，实现磷酸化蛋白的原位检测。与常规磷酸化蛋白原位免疫组化成像方法相比，本方法能够在原位固定磷酸化蛋白，使得成像的磷酸化蛋白稳定在原位，成像清晰，处理方便，适用于生物组织切片表面低丰度磷酸化蛋白质原位质谱成像的样本制备中。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明生化样品原位处理装置中载玻片托结构示意图。

图2示出本发明生化样品原位处理装置中双层磁铁及其磁场结构示意图。

图3示出本发明生化样品原位处理装置的部分结构示意图。

图4示出本发明生化样品原位处理装置的结构示意图。

图5示出本发明实施例1中蛋白质谱成像检测图。

图6示出本发明实施例2中的磷酸化蛋白质谱成像检测图。

附图标记说明：1、生化处理槽；2、载玻片托；21、第一本体部；211、卡槽；212、第一卡子；22、第二本体部；221、容纳腔；222、第二卡子；23、隔离板；3、载玻片；4、双层磁铁；5、提绳。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

现有技术中表面生化处理领域缺少有效的原位处理技术，这在一定程度上阻碍了基于生物组织样品表面生化分子的处理后的质谱成像技术的发展和推广应用。针对现有技术中存在的问题，本发明一方面提供一种可利用磁场技术和磁性材料对生化样品进行原位处理的装置，另一方面提供一种利用上述装置进行磷酸化蛋白质谱成像的方法。

下面结合附图进行详细说明。图1示出本发明生化样品原位处理装置中载玻片托结构示意图。图2示出本发明生化样品原位处理装置中双层磁铁及其磁场结构示意图。图3示出本发明生化样品原位处理装置的部分结构示意图。图4示出本发明生化样品原位处理装置的结构示意图。图5示出本发明生化样品原位处理装置进行样品处理的磷酸化蛋白质谱成像检测图。

一方面，本发明提供一种生化样品原位处理装置，包括：生化处理槽1、被配置在生化处理槽1内的载玻片托2，以及被配置在载玻片托2内的载玻片3和双层磁铁4；所述载玻片托2包括用于固定载玻片3的第一本体部21，以及结合固定在所述第一本体部21底部的用于固定所述双层磁铁4的第二本体部22；所述第二本体部22包括有一端开口的容纳腔221，所述双层磁铁4位于所述容纳腔221内；所述载玻片3位于所述双层磁铁4在第一本体部21上的投影所限定的区域内，所述双层磁铁4的磁力线垂直穿过所述载玻片3。

需要说明的是，双层磁铁4是指将磁铁设置为上下两平层，上层为N极，下层为S极，如附图2所示，双层磁铁4可以产生强磁场，磁力线的方向和分布如图所示，磁铁中间的磁力线为竖直方向，垂直穿过载玻片3，便于原位固定生化分子。生化处理槽1的尺寸略大于载玻片托2的尺寸，便于放置固定和取出载玻片托2。生化处理槽1具有可密封的上盖，可配制盛放生化处理的各种溶液，且能方便配合各种载玻片托2上进行的生化处理操作。

与现有技术相比，本发明有以下几处明显的优势：

1.本发明采用磁铁及其固定槽作为装置的基体，通过与外部的生化处理试剂槽的搭配，配合磁性材料，可原位实现全部的生化处理过程，因此该整体装置结构简单，可以准确地控制生物组织表面分子在生化处理过程中的原位性、使用方便。

2.本发明采用磁场和磁力作为驱动力，可以方便精确地通过控制磁力线与组织切片表面生化分子的垂直角度来固定生化分子的二维空间分布，进而保持生化分子在表面复杂的生化处理过程中的原位性，这在质谱成像的样本处理过程中是极为重要的，可以保持复杂生化处理过程重生化分子的位置不变，用于生化分子位置信息的测定，从而促进质谱成像的组织切片样品表面生化处理的建立发展和推广应用。

3.本发明通过磁场环境下在生物组织切片表面上处理各种不同生化分子和完成生化处理步骤，以及各种生化反应的引入，有效地避免了现有技术中组织切片表面生化分子的位置移动，使整个生化处理过程在组织切片的原有位置上有序进行。首先将待处理生化分子在组织切片表面与磁性纳米材料结合后，再通过磁场的垂直磁力线驱动将生化分子原位固定在切片表面，圆满地完成了生化处理过程。本发明结构简单，操作方便，原位固定效果好，检测结果稳定，可以广泛适用于质谱成像的生物组织表面的生化分子原位处理过程。

在本优选的实施方式中，如附图所示，所述第一本体部21包括用于放置载玻片3的卡槽211以及用于固定载玻片3的第一卡子212，所述载玻片3通过第一卡子212被水平固定在所述卡槽211内；卡槽211上方没有任何遮挡，方便喷制基质、反应试剂等各种生化处理操作。

进一步地，所述第二本体部22还包括有用于固定所述双层磁铁4的第二卡子222，所述双层磁铁4通过第二卡子222被水平固定在所述容纳腔221内。通过卡子固定载玻片3和双层磁铁4，使得操作过程中固定载玻片3和双层磁铁4的位置不会发生移动，保证装置的稳定性。

优选地，所述生化样品原位处理装置还包括用于提拉载玻片托2的提绳5，提绳5的作用是用于将载玻片托2以及其上装载的载玻片3和双层磁铁4平稳地放入或提出所述生化处理槽1。

优选地，所述载玻片3的厚度为0-2mm，例如可以为0.5mm，1mm，2mm，但不可以为0mm；载玻片3与双层磁铁4之间的距离为0-2mm，例如可以为0mm，0.5mm，1mm，1.5mm，2mm。这样设置的原因是：当磁力线离开磁体超过2mm，磁力线方向开始发生可见的弯曲，因此为保证磁力线垂直与载玻片3，载玻片3与双层磁铁4之间的距离不得超出2mm。

优选地，所述载玻片3与所述双层磁铁4之间设有用于支撑所述载玻片3的隔离板23，所述隔离板23的厚度为0-2mm。隔离板23需要超薄，并且机械强度足够大，既不影响磁铁的磁力作用，保证载玻片3与双层磁铁4之间的距离在2mm以内，又可以起到足够的支撑作用。需要进一步说明的是，此处的隔离板23的厚度可以为0mm，此时载玻片3与双层磁铁4之间的距离为0mm，载玻片3直接放置在双层磁铁4的表面，同样也可以进行本发明的原位固定实验。在本发明的其它实施方式中，隔离板23可以由第一本体部21和/或第二本体部22形成，本领域技术人员可以根据实际情况设置。

优选地，所述第一本体部21和所述第二本体部22为一体结构，或者所述第一本体部21和所述第二本体部22为结合固定在一起的两个独立结构。在实际设计过程中，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，当为一体结构时，该装置的整体性强，结构更简单；当为分体结构时，第一本体部21和第二本体部22之间可以通过粘接固定或其它可行的方式固定在一起。

优选地，所述生化处理槽1和载玻片托2的材料为聚苯乙烯、透明塑料或玻璃，本领域技术人员也可以选择其它可行的材料。需要说明的是，生化处理槽1、载玻片托2以及双层磁铁4均应该为非金属材料，且同时具备耐酸碱、耐有机溶剂、耐氧化的特点，防止在生化处理过程中被腐蚀或发生二次污染。

另一方面，本发明还提供一种利用生化样品原位处理装置的磷酸化蛋白质谱成像方法，包括：

将蛋白酶切后的生物组织冰冻切片置于如上任一项所述的生化样品原位处理装置的载玻片3上，此时，生物组织冰冻切片置于垂直于磁力线的磁场中，在所述生物组织冰冻切片的表面喷洒一定规格和浓度的四氧化三铁悬浮液并孵育15min；用50％的乙腈溶液清洗生物组织冰冻切片表面的非磷酸化肽段，未被原位固定的非磷酸化肽段被清除，真空抽干后进行质谱检测。

本发明采用特定规格和浓度的带磁性的四氧化三铁悬浮液与组织切片表面的酶切后肽段里的磷酸化肽段相结合，可以使得磷酸化肽段在随后的去除非磷酸化肽段的过程中被磁力吸附在原位，实现富集后的原位检测。与常规蛋白成像样本制备方法相比，本方法能够原位富集并固定磷酸化蛋白，使得成像的磷酸化蛋白固定在原位。该方法适用于生物组织切片表面低丰度磷酸化蛋白质原位质谱成像的样本制备中。

优选地，生物组织切片用冰冻切片的方法制备成冰冻切片，喷洒胰酶溶液并孵育2h，真空干燥，得到蛋白酶切后的生物组织冰冻切片。

优选地，所述四氧化三铁悬浮液的浓度为0.01-100ug/ul，喷洒体积为5-250ul。

以下结合具体实施例对本发明做详细介绍。

实施例1

(1)将生物组织冷冻切片转移到预处理好的ITO载玻片上，真空干燥，并转移固定到载玻片托上，固定配套的较强磁场强度的双层磁铁；

(2)用基质喷雾仪喷制带有能跟-COOH键合的磁性纳米材料；生化处理槽配制盛放生化处理所需的各种溶液，包括70％乙醇、100％乙醇用于洗掉脂类等非氨基酸小分子；

(3)真空干燥，用基质喷雾仪喷基质，质谱成像检测。取得了很好的氨基酸质谱成像效果，如图5所示。

实施例2

(1)准备表面蛋白酶切后的生物组织切片，用冰冻切片的方法制备成冰冻切片，喷洒胰酶溶液后，孵育2h，真空干燥后得到生物组织冰冻切片。

(2)将蛋白酶切后的生物组织冰冻切片置于本发明提供的生化样品原位处理装置的载玻片3上，在所述生物组织冰冻切片的表面喷洒浓度为0.01ug/ul-100ug/ul的四氧化三铁悬浮液5-250ul并孵育15min；

(3)将处理后的生物组织冰冻切片置于垂直磁力线的磁场里进行吸附，带磁性的四氧化三铁悬浮液与生物组织冰冻切片表面的酶切后肽段里的磷酸化肽段相结合，使得磷酸化肽段被磁力吸附固定在原位；

(4)用50％乙腈溶液清洗组织切片表面的非磷酸化肽段，去除未被固定的非磷酸化肽段，真空抽干30min，质谱检测可以观察到磷酸化肽段的质谱成像分布图，如图6所示。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种生化样品原位处理装置，其特征在于，包括：生化处理槽、被配置在生化处理槽内的载玻片托，以及被配置在载玻片托内的载玻片和双层磁铁；所述载玻片的厚度为0-2mm，且不包括0mm；载玻片与双层磁铁之间的距离为0-2 mm；

所述载玻片托包括用于固定载玻片的第一本体部，以及结合固定在所述第一本体部底部的用于固定所述双层磁铁的第二本体部；

所述第二本体部包括有一端开口的容纳腔，所述双层磁铁位于所述容纳腔内；所述载玻片位于所述双层磁铁在第一本体部上的投影所限定的区域内，所述双层磁铁的磁力线垂直穿过所述载玻片；

所述双层磁铁是将磁铁设置为上下两平层，上层为N极，下层为S极。

2.根据权利要求1所述的生化样品原位处理装置，其特征在于，所述第一本体部包括用于放置载玻片的卡槽以及用于固定载玻片的第一卡子，所述载玻片通过第一卡子被水平固定在所述卡槽内；

所述第二本体部还包括有用于固定所述双层磁铁的第二卡子，所述双层磁铁通过第二卡子被水平固定在所述容纳腔内。

3.根据权利要求1所述的生化样品原位处理装置，其特征在于，所述生化样品原位处理装置还包括用于提拉载玻片托的提绳。

4.根据权利要求1所述的生化样品原位处理装置，其特征在于，所述载玻片与所述双层磁铁之间设有用于支撑所述载玻片的隔离板，所述隔离板的厚度为0-2 mm。

5.根据权利要求1所述的生化样品原位处理装置，其特征在于，所述第一本体部和所述第二本体部为一体结构，或者所述第一本体部和所述第二本体部为结合固定在一起的两个独立结构。

6.根据权利要求1所述的生化样品原位处理装置，其特征在于，所述生化处理槽和载玻片托的材料为聚苯乙烯、透明塑料或玻璃。

7.一种磷酸化蛋白的质谱成像方法，其特征在于，包括：

将蛋白酶切后的生物组织冰冻切片放置在如权利要求1-6任一项所述的生化样品原位处理装置的载玻片上，在所述生物组织冰冻切片的表面喷洒四氧化三铁悬浮液并孵育15min；

用50%的乙腈溶液清洗生物组织冰冻切片表面的非磷酸化肽段，未被原位固定的非磷酸化肽段被清除，真空抽干后进行质谱检测。

8.根据权利要求7所述的质谱成像方法，其特征在于，生物组织切片用冰冻切片的方法制备成冰冻切片，喷洒胰酶溶液并孵育2h，真空干燥，得到蛋白酶切后的生物组织冰冻切片。

9.根据权利要求8所述的质谱成像方法，其特征在于，所述四氧化三铁悬浮液的浓度为0.01 -100 μg/μl，喷洒体积为5-250 μl。

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