CN110231487B - 一种蛋白质原位酶切的处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种蛋白质原位酶切的处理方法,涉及分析化学技术领域。所述处理方法包括将带有组织切片的载玻片固定在生化样品原位处理装置上,所述生化样品原位处理装置包括有磁铁,磁铁的磁力线垂直穿过所述载玻片;将可键合蛋白的磁性微球喷洒到组织切片表面,室温孵育;利用70%乙醇清洗组织切片1‑2次,然后利用96%乙醇清洗组织切片15s,真空干燥;将蛋白酶溶液喷洒到组织切片表面,充分原位酶切后真空干燥。该方法适用于生物组织切片表面蛋白质原位质谱成像的样本制备中。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域。更具体地,涉及一种蛋白质原位酶切的处理方法。
背景技术
生物大分子蛋白质的成像一般用免疫组化,随着质谱技术的发展,目前已有少量关于蛋白质的质谱成像技术研究进展的报道。已报道的蛋白质谱成像的样本制备或者是直接检测组织切片表面的蛋白质分子的质量,该方法由于质谱质量检测范围较小,只能检测少数质量较小的蛋白的分布;或者在组织切片进行蛋白酶切,该方法由于需要将蛋白在溶液状态下酶切,会导致蛋白质分子在空间分布上发生位移,离开酶切前的原始位置,影响质谱成像的效果。因此寻找一种能够在原位固定蛋白质后,再进行酶切的手段,是非常必要的。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种质谱成像实验的样品处理过程中蛋白质原位酶切的处理方法。
为达到上述目的,本发明采用下述技术方案:
一种蛋白质原位酶切的处理方法,包括以下步骤:
将带有组织切片的载玻片固定在生化样品原位处理装置上,所述生化样品原位处理装置包括有磁铁,所述磁铁的磁力线垂直穿过所述载玻片;
将可键合蛋白的磁性微球喷洒到组织切片表面,室温孵育;
利用70%乙醇清洗组织切片1-2次,每次15-30s,然后利用96%乙醇清洗组织切片15s,真空干燥;
将蛋白酶溶液喷洒到组织切片表面,充分原位酶切后真空干燥。
优选地,所述处理方法还包括将组织切片固定在载玻片上的步骤:用冰冻切片的方法将组织切片制备成冰冻切片,在载玻片表面涂匀20ul多聚赖氨酸溶液,烘干,将冰冻切片转移到载玻片上,得到带有组织切片的载玻片。
优选地,所述可键合蛋白的磁性微球为NHS-EDC-苯乙烯磁性微球,所述处理方法还包括NHS-EDC-苯乙烯磁性微球的制备。
优选地,所述处理方法还包括将原位酶切处理后的组织切片与磁铁分离,放进质谱成像仪进行质谱检测。
优选地,所述生化样品原位处理装置包括:生化处理槽、被配置在生化处理槽内的载玻片托,以及被配置在载玻片托内的载玻片和双层磁铁;
所述载玻片托包括用于固定载玻片的第一本体部,以及结合固定在所述第一本体部底部的用于固定所述双层磁铁的第二本体部;
所述第二本体部包括有一端开口的容纳腔,所述双层磁铁位于所述容纳腔内;所述载玻片位于所述双层磁铁在第一本体部上的投影所限定的区域内,所述双层磁铁的磁力线垂直穿过所述载玻片。
优选地,所述第一本体部包括用于放置载玻片的卡槽以及用于固定载玻片的第一卡子,所述载玻片通过第一卡子被水平固定在所述卡槽内;
所述第二本体部还包括有用于固定所述双层磁铁的第二卡子,所述双层磁铁通过第二卡子被水平固定在所述容纳腔内。
优选地,所述生化样品原位处理装置还包括用于提拉载玻片托的提绳。
优选地,所述载玻片的厚度为0-2mm,且不包括0mm;载玻片与双层磁铁之间的距离为0-2mm;
所述载玻片与所述双层磁铁之间设有用于支撑所述载玻片的隔离板,所述隔离板的厚度为0-2mm。
优选地,所述第一本体部和所述第二本体部为一体结构,或者所述第一本体部和所述第二本体部为结合固定在一起的两个独立结构。
优选地,所述生化处理槽和载玻片托的材料为聚苯乙烯、透明塑料或玻璃。
本发明的有益效果如下:
本发明提供的在组织切片表面进行原位蛋白质酶切的方法,采用可键合蛋白的磁性微球与组织切片表面的蛋白质反应,用磁体吸附固定蛋白质后,进行蛋白酶切反应,然后进行质谱成像检测。切片表面的蛋白与磁性微球键合后再进行酶切,可以使得蛋白在酶切过程被磁力吸附在原位,实现酶切后的蛋白原位检测。与常规方法相比,本方法能够在原位固定蛋白,使得成像的蛋白稳定在原位。该方法适用于生物组织切片表面蛋白质原位质谱成像的样本制备中。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明生化样品原位处理装置中载玻片托结构示意图。
图2示出本发明生化样品原位处理装置中双层磁铁及其磁场结构示意图。
图3示出本发明生化样品原位处理装置的部分结构示意图。
图4示出本发明生化样品原位处理装置的结构示意图。
图5示出本发明实施例1中蛋白质谱成像检测图。
附图标记说明:1、生化处理槽;2、载玻片托;21、第一本体部;211、卡槽;212、第一卡子;22、第二本体部;221、容纳腔;222、第二卡子;23、隔离板;3、载玻片;4、双层磁铁;5、提绳。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
目前在质谱成像的样品制备过程中缺少对蛋白质进行原位酶切的方法。本发明提供一种蛋白质原位酶切的处理方法,具体地,下面结合附图进行详细说明。图1示出本发明生化样品原位处理装置中载玻片托2结构示意图。图2示出本发明生化样品原位处理装置中双层磁铁4及其磁场结构示意图。图3示出本发明生化样品原位处理装置的部分结构示意图。图4示出本发明生化样品原位处理装置的结构示意图。
所述处理方法包括以下步骤:
(1)将带有组织切片的载玻片固定在生化样品原位处理装置上,所述生化样品原位处理装置包括有磁铁,所述磁铁的磁力线垂直穿过所述载玻片3;
(2)将可键合蛋白的磁性微球喷洒到组织切片表面,室温孵育;
(3)利用70%乙醇清洗组织切片1-2次,每次15-30s,然后利用96%乙醇清洗组织切片15s,真空干燥;
(4)将蛋白酶溶液喷洒到组织切片表面,充分原位酶切后真空干燥。
本发明提供的在组织切片表面进行原位蛋白质酶切的方法,采用可键合蛋白的磁性微球与组织切片表面的蛋白质反应,用磁体吸附固定蛋白质后,进行蛋白酶切反应,然后进行质谱成像检测。切片表面的蛋白与磁性微球键合后再进行酶切,可以使得蛋白在酶切过程被磁力吸附在原位,实现酶切后的蛋白原位检测。与常规方法相比,本方法能够在原位固定蛋白,使得成像的蛋白稳定在原位。该方法适用于生物组织切片表面蛋白质原位质谱成像的样本制备中。
在本发明的优选实施方式中,所述处理方法还包括将组织切片固定在载玻片上的步骤:用冰冻切片的方法将组织切片制备成冰冻切片,在载玻片表面涂匀20ul多聚赖氨酸溶液,烘干,将冰冻切片转移到载玻片上,得到带有组织切片的载玻片。烘干的温度可以根据实际情况进行调节,优选为80℃,烘干是为了防止实验操作过程中出现掉片的问题。
优选地,所述可键合蛋白的磁性微球为NHS-EDC-苯乙烯磁性微球,所述处理方法还包括NHS-EDC-苯乙烯磁性微球的制备。其中NHS是N-羟基琥珀酰亚胺,EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在本发明的其他实施方式中,本领域技术人员也可以根据实验情况选择其他可键合蛋白的磁性微球。
需要说明的是,在蛋白质原位质谱成像实验中,还包括将原位酶切处理后的组织切片与磁铁分离、然后放进质谱成像仪进行质谱检测的步骤。
本发明中使用的生化样品原位处理装置可以提供垂直于载玻片的磁力线。在优选的实施方式中,所述生化样品原位处理装置如图1-4所示,包括:生化处理槽1、被配置在生化处理槽1内的载玻片托2,以及被配置在载玻片托2内的载玻片3和双层磁铁4;所述载玻片托2包括用于固定载玻片3的第一本体部21,以及结合固定在所述第一本体部21底部的用于固定所述双层磁铁4的第二本体部22;所述第二本体部22包括有一端开口的容纳腔221,所述双层磁铁4位于所述容纳腔221内;所述载玻片3位于所述双层磁铁4在第一本体部21上的投影所限定的区域内,所述双层磁铁4的磁力线垂直穿过所述载玻片3。
需要说明的是,双层磁铁4是指将磁铁设置为上下两平层,上层为N极,下层为S极,如附图所示,双层磁铁4可以产生强磁场,磁力线的方向和分布如图所示,磁铁中间的磁力线为竖直方向,垂直穿过载玻片3,便于原位固定生化分子。生化处理槽1的尺寸略大于载玻片托2的尺寸,便于放置固定和取出载玻片托2。生化处理槽1具有可密封的上盖,可配制盛放生化处理的各种溶液,且能方便配合各种载玻片托2上进行的生化处理操作。
在本优选的实施方式中,如附图所示,所述第一本体部21包括用于放置载玻片3的卡槽211以及用于固定载玻片3的第一卡子212,所述载玻片3通过第一卡子212被水平固定在所述卡槽211内,卡槽211上方没有任何遮挡,方便喷制基质、反应试剂等各种生化处理操作。所述第二本体部22还包括有用于固定所述双层磁铁4的第二卡子222,所述双层磁铁4通过第二卡子222被水平固定在所述容纳腔221内。通过卡子固定载玻片3和双层磁铁4,使得操作过程中固定载玻片3和双层磁铁4的位置不会发生移动,保证装置的稳定性。
优选地,所述生化样品原位处理装置还包括用于提拉载玻片托2的提绳5,提绳5的作用是用于将载玻片托2以及其上装载的载玻片3和双层磁铁4平稳地放入或提出所述生化处理槽1。
优选地,所述载玻片3的厚度为0-2mm,例如可以为0.5mm,1mm,2mm,但不可以为0mm;载玻片3与双层磁铁4之间的距离为0-2mm,例如可以为0mm,0.5mm,1mm,1.5mm,2mm。这样设置的原因是:当磁力线离开磁体超过2mm,磁力线方向开始发生可见的弯曲,因此为保证磁力线垂直与载玻片33,载玻片3与双层磁铁4之间的距离不得超出2mm。
优选地,所述载玻片3与所述双层磁铁4之间设有用于支撑所述载玻片3的隔离板23,所述隔离板23的厚度为0-2mm。隔离板23需要超薄,并且机械强度足够大,既不影响磁铁的磁力作用,保证载玻片3与双层磁铁4之间的距离在2mm以内,又可以起到足够的支撑作用。需要进一步说明的是,此处的隔离板23的厚度可以为0mm,此时载玻片3与双层磁铁4之间的距离为0mm,载玻片3直接放置在双层磁铁4的表面,同样也可以进行本发明的原位固定实验。在本发明的其它实施方式中,隔离板23可以由第一本体部21和/或第二本体部22形成,本领域技术人员可以根据实际情况设置。
优选地,所述第一本体部21和所述第二本体部22为一体结构,或者所述第一本体部21和所述第二本体部22为结合固定在一起的两个独立结构。在实际设计过程中,本领域技术人员可以根据实际需要进行选择,当为一体结构时,该装置的整体性强,结构更简单;当为分体结构时,第一本体部21和第二本体部22之间可以通过粘接固定或其它可行的方式固定在一起。
优选地,所述生化处理槽1和载玻片托2的材料为聚苯乙烯、透明塑料或玻璃,本领域技术人员也可以选择其它可行的材料。需要说明的是,生化处理槽1、载玻片托2以及双层磁铁4均应该为非金属材料,且同时具备耐酸碱、耐有机溶剂、耐氧化的特点,防止在生化处理过程中被腐蚀或发生二次污染。
实施例1将本发明的处理方法用于肾组织切片的质谱成像样本制备
(1)准备小鼠肾组织切片,用冰冻切片的方法制备冰冻切片。载玻片表面涂匀20ul的多聚赖氨酸溶液,80℃烘干,防止实验操作过程中掉片。将冰冻切片转移到载玻片上。
(2)NHS-EDC-苯乙烯磁性微球的合成:MES为吗啉乙磺酸,先用pH=5.0的25mMMES50mg/ml的配置EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液,再将20ul的0.5%W/V的磁性微球用配好的50mg/ml EDC溶液反应后,再用配好的50mg/ml NHS溶液活化。
(3)带有组织切片的载玻片固定在生化样品原位处理装置上,使磁铁的磁力线垂直穿过载玻片;将合成的NHS-EDC-苯乙烯微球喷洒到组织切片上,室温孵育反应30min。
(4)利用70%乙醇清洗组织切片1-2次,每次15-30s,然后利用96%乙醇清洗组织切片15s,真空干燥。
(5)将10ng/ul的胰酶溶液喷洒到组织切片上,放置在37℃环境中酶切16-18小时,充分酶切,然后真空干燥。
(6)CHCA为α-氰基-4羟基肉桂酸,将10mg/ml的CHCA溶液基质喷洒到组织切片,真空干燥。
(7)将组织切片与磁铁分离,送进MALDI-FTICR质谱成像仪进行检测,检测结果如图5所示,蛋白质酶切后不会发生位置的改变。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定,对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无法对所有的实施方式予以穷举,凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种蛋白质原位酶切的处理方法,其特征在于,包括以下步骤:
将带有组织切片的载玻片固定在生化样品原位处理装置上,所述生化样品原位处理装置包括有双层磁铁,所述双层磁铁是将磁铁设置为上下两平层,上层为N极,下层为S极,所述双层磁铁的磁力线垂直穿过所述载玻片;所述载玻片的厚度为0-2 mm,且不包括0mm;载玻片与双层磁铁之间的距离为0-2 mm;
将可键合蛋白的磁性微球喷洒到组织切片表面,室温孵育;
利用70%乙醇清洗组织切片1-2 次,每次15-30s,然后利用96%乙醇清洗组织切片15s,真空干燥;
将蛋白酶溶液喷洒到组织切片表面,充分原位酶切后真空干燥。
2.根据权利要求1所述的处理方法,其特征在于,所述处理方法还包括将组织切片固定在载玻片上的步骤:用冰冻切片的方法将组织切片制备成冰冻切片,在载玻片表面涂匀20ul多聚赖氨酸溶液,烘干,将冰冻切片转移到载玻片上,得到带有组织切片的载玻片。
3.根据权利要求1所述的处理方法,其特征在于,所述可键合蛋白的磁性微球为NHS-EDC-苯乙烯磁性微球,所述处理方法还包括NHS-EDC-苯乙烯磁性微球的制备。
4.根据权利要求1所述的处理方法,其特征在于,所述处理方法还包括将原位酶切处理后的组织切片与双层磁铁分离,放进质谱成像仪进行质谱检测。
5.根据权利要求1所述的处理方法,其特征在于,所述生化样品原位处理装置包括:生化处理槽、被配置在生化处理槽内的载玻片托,以及被配置在载玻片托内的载玻片和双层磁铁;
所述载玻片托包括用于固定载玻片的第一本体部,以及结合固定在所述第一本体部底部的用于固定所述双层磁铁的第二本体部;
所述第二本体部包括有一端开口的容纳腔,所述双层磁铁位于所述容纳腔内;所述载玻片位于所述双层磁铁在第一本体部上的投影所限定的区域内,所述双层磁铁的磁力线垂直穿过所述载玻片。
6.根据权利要求5所述的处理方法,其特征在于,所述第一本体部包括用于放置载玻片的卡槽以及用于固定载玻片的第一卡子,所述载玻片通过第一卡子被水平固定在所述卡槽内;
所述第二本体部还包括有用于固定所述双层磁铁的第二卡子,所述双层磁铁通过第二卡子被水平固定在所述容纳腔内。
7.根据权利要求5所述的处理方法,其特征在于,所述生化样品原位处理装置还包括用于提拉载玻片托的提绳。
8.根据权利要求5所述的处理方法,其特征在于,所述载玻片与所述双层磁铁之间设有用于支撑所述载玻片的隔离板,所述隔离板的厚度为0-2 mm。
9.根据权利要求5所述的处理方法,其特征在于,所述第一本体部和所述第二本体部为一体结构,或者所述第一本体部和所述第二本体部为结合固定在一起的两个独立结构。
10.根据权利要求5所述的处理方法,其特征在于,所述生化处理槽和载玻片托的材料为聚苯乙烯、透明塑料或玻璃。
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