KR102321248B1 - 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법 - Google Patents

분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분광 샘플 지지대(spectrometric sample support) 상에 샘플을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, (i) 액적들 각각이 미생물 침전물(microorganism sediment)을 내부에 갖는, 예를 들어 세정액 또는 배양액의 액체의 개별적인 액적들의 배열을 함유하는 샘플 지지대를 제공하는 단계, (ii) 예를 들어, 면 섬유를 함유하는 흡수성 재료(absorbent material)로 된 플레이트를 제공하는 단계, (iii) 상기 미생물 침전물과 플레이트를 접촉시켜 액체의 액적들이 흡수성 재료에 흡수되도록, 샘플 지지대 상에 플레이트를 수직으로 내리는 단계, (iv) 액적 액체가 국소적으로 풍부한 플레이트를 샘플 지지대로부터 들어올려, 액체가 고갈된 미생물 침전물을 노출시키는 단계, 및 (v) 분광 측정, 예를 들면, 적외선 분광기 또는 MALDI 비행 시간 질량 분석법(time-of-flight mass spectrometry)에 의한 분광 측정을 위해, 노출된 미생물 침전물을 준비하는 단계를 포함한다.

Description

분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법{METHOD OF SAMPLE PREPARATION ON A SPECTROMETRIC SAMPLE SUPPORT}
본 발명은 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기서 (a) 액적들 각각이 미생물 침전물(microorganism sediment)을 내부에 갖는, 액체의 개별적인 액적들(droplets of liquid)의 배열을 함유하는 샘플 지지대가 제공되고, (b) 흡수성 재료(absorbent material)로 된 플레이트가 제공되며, (c) 액적 액체들이 흡수성 재료에 흡수되도록, 플레이트 및 샘플 지지대가 함께 놓여지고, (d) 액체가 국소적으로 풍부한 플레이트를 샘플 지지대로부터 (수직으로) 들어올려, 액체가 고갈된 미생물 침전물을 노출시키고, (e) 노출된 미생물 침전물을 분광 측정용으로 준비한다.
종래 기술은 이후에 특별한 측면을 참조하여 설명된다. 그러나, 이를 제한으로 이해해서는 안 된다. 또한, 종래 기술로부터 공지된 것의 유용한 추가 개발 및 변형이 본 도입부의 비교적 좁은 범위를 넘어서 사용될 수 있으며, 하기 개시내용을 읽은 후 이 분야의 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.
초기 실험에서, 배양액의 액적에 현탁된 미생물은 1시간 이하의 비교적 짧은 정치 시간(또는 "휴식 시간(rest time)") 후에 평평한 기판 상에 미생물의 침전물로서 축적되는 것으로 나타났다. 일종의 "바이오 필름(biofilm)"으로 침전된 미생물은, 예를 들어 흡수성 천을 액적과 접촉시킴으로써 잔류액 및 잔류 현탁 입자로부터 조심스럽게 분리될 수 있다. 이러한 "탈수(dehydration)" 후, 미생물의 종은 후속 질량 분광 측정으로 신뢰성 있게 결정될 수 있다 (국제 출원 WO 2018/099500 A1 참조). 이러한 발견은 기대와는 달리, 목적하는 미생물의 세포 침전물이 액체가 덜어질 때 액체와 함께 제거되지 않는 것으로 밝혀졌기 때문에 놀랍다. 이러한 발견은 성장을 촉진하기 위해 미생물의 배양 (또는 인큐베이션(incubation))을 가능하게 하고, 또한 질량 분석기의 이온 소스에 삽입하기 위한 샘플 지지대 플레이트 또는 적외선 분광기의 측정 슬롯에 삽입하기 위한 시편 슬라이드와 같은 하나의 동일한 기판 상에서 분석 측정을 위한 준비를 가능하게 한다.
평평한 기판 상의 액적에서 이 미생물 행태에 대한 완전히 개발된 과학적 설명은 아직 이용 가능하지 않지만, 샘플 지지대 표면과 미생물 세포 사이의 물리적 상호 작용, 및 미생물의 생화학적 및 생물 물리학적 특성으로 인한 접착 과정이 기판 상에 바람직한 접착 또는 침전을 담당하는 것으로 추정된다.
WO 2018/099500 A1에 공지된 기술의 추가 개발에서, 출원 EP 3 376 202 A1은 내면이 액적의 주변 영역과 접촉하게 되고, 모세관 힘(capillary force)을 통해 측면으로 액적 액체를 제거하는 오목부(indentation) 또는 홀을 갖는 마스크를 제안한다. 침전물과의 직접적인 접촉이 미생물의 고갈("플레이팅 효과(plating effect)")을 초래하여, 후속 분석 측정에서 관련 감도 손실에 영향을 줄 수 있으므로, 대부분의 미생물 침전물 아래에 있는 액적의 중심은 이 과정에서 손대지 않아야 한다.
EP　3　376　202　A1에 기재되는 바와 같이, 프로파일링된 마스크에 의해 또는 액적을 둘러싸는 수직의 스페이서 상에 경질 플레이트를 배치하는 것에 의한 액체의 국소화, 비접촉식 제거는, 액적의 충분한 잔류액이 여전히 기판 상에 침전물 상에 남아, 미생물 침전물의 후속 분석에 혼선을 초래하고, 추가 정제 방법이 필요하게 될 수 있다는 단점이 있다.
따라서, 이러한 분리 공정에서 미생물 침전물의 가능한 적은 재료가 액체와 함께 제거되는 것을 보증하면서, 액체의 커버된 액적으로부터 개별 미생물 침전물을 완전히 충분히 분리할 필요가 있다. 본 발명에 의해 달성되는 추가 목적은 하기 개시내용을 읽음으로써 당업자에게 즉시 명확해진다.
본 발명은 분광 샘플 지지대(spectrometric sample support) 상에 샘플을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은, (i) 액적들 각각이 미생물 침전물(microorganism sediment)을 내부에 갖는, 액체의 개별적인 액적들의 배열을 함유하는 샘플 지지대를 제공하는 단계, (ii) 흡수성 재료(absorbent material)로 된 플레이트를 제공하는 단계, (iii) 상기 미생물 침전물과 플레이트를 접촉시켜 액체의 액적들이 흡수성 재료에 흡수되도록, 샘플 지지대 상에 플레이트를 수직으로 내리는 단계, (iv) 액적 액체가 국소적으로 풍부한 플레이트를 샘플 지지대로부터 들어올려, 액체가 고갈된 미생물 침전물을 노출시키고, 필요한 경우, 그 후 미생물의 세포 침전물 상에 임의의 잔류할 수 있는 액체의 임의의 잔여 필름을 건조시키는 단계, 및 (v) 노출된 미생물 침전물을, 분광 측정, 예를 들어 후속 적외선 분광 또는 질량 분광 측정을 위해 준비하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 상기 플레이트는 팽창성 흡수성 재료(swelling absorbent material)를 함유할 수 있고, 상기 플레이트와 샘플 지지대 사이에 오직 작은 갭이 존재할 때까지 상기 플레이트를 내려 액적의 상청액을 플레이트와 접촉시키고, 이에 의해 흡수시켜, 액적 액체가 흡수되고 미생물 침전물과 접촉하는 부위에서 흡수성 재료를 국소 팽창시킨다. 적절한 팽창 특성을 갖는 블로팅 보드(blotting board) 재료로 된 플레이트는 이 버전에 특히 적합하다는 것이 밝혀졌다. 블로팅 보드는 특히 수분에 민감한 예술 작품의 복원 및 보관으로부터 잘 알려져 있으며, 필수적으로 면 섬유의 비율이 높은, 50% 초과, 특히 60%의 양일 수 있는 중성이고, 산이 없고(acid-free), 흡수성이 있으며, 보풀이 적은 플리스 보드이다(low-lint fleece board).
초기에 접촉시키지 않는 갭 크기의 선택은 샘플 지지대 상에 쉽게 문질러지는 색상으로 코팅된 플레이트를 내림으로써 매우 간단하게 테스트할 수 있다. 플레이트를 다시 들어올린 후 샘플 지지대 상에서 미량의 색상이 발견되면, 갭이 직접 접촉을 방지하기에 충분하지 않아 다시 조정해야 한다. 따라서, 몇 밀리미터 분획의 갭을 실험적으로 설정하는 것이 용이하며, 이는 미생물 침전물과 접촉하게 될 때까지 국소화된 액체 흡수가 발생할 때 블로팅 보드와 같은 흡수성 재료의 팽창 반응을 통해 폐쇄될 수 있다.
다양한 다른 양태에서, 상기 플레이트를 샘플 지지대 바로 위에 놓고, 플레이트에 천천히 압력을 인가해, 상기 배열과 플레이트를 전체에 걸쳐 완전히 접촉시킬 수 있다.
본 발명은 흡수성 재료로 제조된 평평하고 보풀이 없는 플레이트를 평평한 샘플 지지대로 내리고 접촉시키거나 심지어 플레이트를 샘플 지지대 상에 부분적으로 배치하고, 모세관 힘이 아래에 숨겨진 미생물 침전물이 생체 재료가 너무 적어서 샘플 지지대의 후속 분광 분석이 유익한 결과를 제공하지 못할 정도로 고갈되지 않으면서 액적의 거의 모든 액적의 액체 상청액을 흡수성 재료로 끌어들이도록 샘플 지지대를 약간 아래로 누른다는 예상치 못한 놀라운 발견에 기초한다. 플레이트를 (수직으로) 들어올린 후에 액체의 필름은 남아 있지만, 이는 너무 얇아 몇 초안에 건조된다.
상기 샘플 지지대 및/또는 플레이트는 서로에 대해 상대적으로 스프링-장착되어, 플레이트를 눌렀을 때 인가된 과도한 압력이 스프링에 의해 흡수되는 것이 바람직하다. 스프링의 탄성 변형은, 일정한 접촉 압력이 샘플 지지대 상에서 플레이트에 인가되는 것을 보증한다. 압력은 적절한 스프링 상수를 설정함으로써 요건으로 조절될 수 있고, 미생물 침전물이 압력의 인가에 의해 악영향을 받지 않도록 조절될 수 있다.
다양한 양태에서, 상기 샘플 지지대를 향하는 플레이트 표면은 액적들로부터 액체의 흡수를 가속화시키도록 내리기 전에, 예를 들어 탈이온수 또는 메탄올/에탄올로 약간 습윤화될 수 있다(moistened). 약간의 습윤화 및 플레이트 주변에 위치한 섬유의 표면 젖음(surface wetting)은 특히 샘플 지지대 상에 적층된 액적들과 플레이트의 섬유 매트릭스 사이에 액체의 접촉 또는 액체 브릿지의 형성을 가능하게 하여, 주변부의 섬유 천(fiber fabric)은 시작부터 표면이 젖어있고, 플레이트가 샘플 지지대 상의 액적과 액체 접촉하게 될 때 시간이 소모되는 젖음(time-consuming wetting) 또는 흠뻑 젖음(soaking)을 겪을 필요가 없다.
플레이트는 셀룰로오스 및/또는 식물 섬유, 특히 면, 나이트로셀룰로오스(nitrocellulose), 나일론, 유리 섬유, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride) 또는 이들의 조합으로 제조된 흡수성 섬유를 갖는 것이 바람직하다. 특히 적합한 재료로서 블로팅 보드는, 예를 들어 60%의 면 섬유 및 40%의 표백된(pH 중성 및 산이 없는) 셀룰로오스의 혼합물을 함유할 수 있다.
액적의 종래의 체적은 약 1 내지 12 마이크로리터에 해당될 수 있다. 균일한 액적의 형태에서 이러한 체적은 대략 샘플 지지대의 표면에 걸쳐 2 또는 3 밀리미터의 직경에 해당될 수 있다.
적외 분광 또는 질량 분광 분석에서, 특히, 예를 들어 MALDI 비행 시간 분석(time-of-flight analysis)에서, 48, 96, 384 또는 1536 개별 액적은 샘플 지지대 상의 이미 정의된(및 규칙적인) 패턴으로 배열될 수 있다. 물론, 액적에 대해 바람직한 스팟, 예를 들어 소액성(lyophobic) 환경에서 친액성(lyophilic) 원형 영역을 갖는 샘플 지지대를 마킹하는 것도 가능하다. 그 후, 액적의 직경은 AnchorChip™ 유형의 표준화 정착판(anchor plate)으로 일어나는 바와 같이 친액성 원형 영역의 치수에 따라 자체 조절될 것이다.
액적은 특히 주로 적외선 분광법 또는 질량 분광법을 위한 샘플 제조법 및 샘플 가공법에 사용되는 액체를 함유할 수 있다. 액적은 배양액을 함유할 수 있고, 예를 들어 침전된 재료는 미생물을 함유할 수 있으며, 이는 배양액의 이러한 액적으로 배양된 후 적층된다. 침전된 미생물로부터 배양액의 분리는 특히 종/아종에 따른 적외선 분광 또는 질량 분광 동정(예를 들어, IR 투과 분광법 또는 MALDI 비행 시간 질량 분석법(time-of-flight mass spectrometry)), 또는 항생제 및 항진균제와 같은 항균 물질에 대한 미생물의 내성/감도의 빠른 측정과 같은 미생물의 다양한 특성화를 위한 샘플의 준비 단계로서 작용할 수 있다.
필요한 경우, 항균 물질은, 예를 들어 항생제 또는 항진균제가 풍부한 배양액에서의 배양에 의해 미생물의 최소 억제 농도를 결정하기 위해 배양액에 첨가될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 액적은 샘플 제조법에 사용되는 세정액(예를 들어, 수용액 또는 순수한 탈이온수) 또는 다른 액체 작업 매질를 함유할 수 있다. 예를 들어, 미리-건조된 미생물 침전물 또는 건조된 매트릭스 물질 및 미생물 침전물로 코팅되는 샘플 스팟의 세정액은 플레이트로 흡수될 수 있다. 세정액은 바람직하게는, 매트릭스 물질 또는 임베딩된 샘플 결정을 갖는 매트릭스 결정 격자가 인-시츄 탈염(in-situ desalination)을 하기 위해 α-시아노-4-하이드록시신남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 친화성 제제로 용해되지 않도록 선택된다(Gobom et al., Anal. Chem. 73, 2001, 434-438 참조).
다양한 양태에서, 분광 샘플 지지대로서 금속, 유리 또는 세라믹 플레이트를 사용하는 것이 가능하다. 가능한 양태는 특히 스테인레스 스틸 기판 상에 서로 분리된 교번되는(alternating) 친액성 및 소액성 표면들을 함유하는, 이른바 정착판(anchor plate, AnchorChip™ Bruker Daltonik GmbH)과 같은 연마된 스테인레스 스틸 플레이트 또는 이의 응용물이다. 투과 측정을 위한 적외선 분광 시편 슬라이드로서 유리 플레이트도 가능하다. 샘플 지지대는 재사용 가능하거나 일회용일 수 있다.
매트릭스-보조 레이저 탈착(matrix-assisted laser desorption, MALDI)에 의한 이온화를 위한 종래의, 표준화된 샘플 지지대는 48, 96, 384 또는 1536 샘플 스팟의 규칙적인 배열을 함유할 수 있다. 샘플 지지대 및 흡수성 재료의 플레이트의 치수는 이들이 적절하다면 약 2 내지 5 밀리미터의 두께를 갖는 미량 정량판(microtiter plate)에 대응하여 각각이 127.76　mm (길이) × 85.48　mm (폭)일 수 있다. 그러나, 샘플 스팟 배열 및 따라서 샘플 지지대 상의 액적의 배열은 샘플 지지대 자체보다 적은 영역을 커버한다.
또한, 이 내용 모두가 함께 여기에 참조로 포함되는 EP 3 376 202 A1에 기재되는 바와 같이, 플레이트가 삽입되는 샘플 지지대용 가이드 또는 플레이트용 프레임이 제공될 수 있으며, 이는 액적의 배열 위로 내려가면서 플레이트의 정렬 및 가이드를 돕는다. 프레임은, 예를 들어 특히 흡수성 재료의 돌출된 크기에 맞춰 잘라진(cut-to-size) 경계를 폴딩한 후 이를 폴리머로 함침시킨 후 고정함으로써, 플레이트에 영구적으로 연결될 수 있다. 또한, 프레임은 적합한 폴리머를 사용하여 플레이트의 외주 상에 사출-성형될 수 있다.
플레이트는 바람직하게는 뻣뻣하고 보풀이 적은 섬유로부터 제조된다. 식물 섬유 및/또는 셀룰로오스는 이에 이상적이다. 이는, 예를 들어, 면 섬유, 나이트로셀룰로오스, 나일론, 유리 섬유, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 또는 이들의 조합과 같은 섬유성 재료, 예를 들어 약 60%의 면 섬유 및 40%의 표백된(pH 중성 및 산이 없는) 셀룰로오스를 함유하는 블로팅 보드를 가질 수 있다. 단단한 재료는 특히 흡수성 액체의 자동화 방법에 적합하다. 단단한 플레이트는 개조된 홀더에 고정되기 전에 로봇 팔과 같은 특별히 개조된 처리 장치에 의해 스토어에서 쉽게 제거될 수 있으며, 액체 흡수 단계로 이송된 후 요구되는 위치에 세팅되고, 필요한 경우에 폐기될 수도 있다.
플레이트의 제조와 관련하여, 연속적인 길이의 흡수성 재료를 제공한 후, 목적하는 외부 윤곽에 따라 플레이트 조각을 절단할 수 있다. 미생물학 실험실에서 사용하기 위해, 여전히 함유할 수 있는 임의의 현탁된 미생물과 함께 흡수되는 액체가 플레이트의 에지 또는 상부면을 투과할 수 없어, 액체로 국소화된 농축을 거친 후 임의의 오염의 위험 없이 플레이트를 이동하고 그리핑(gripped)할 수 있도록, 플레이트의 외부 치수를 선택하는 것이 편리하다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 도면의 요소들은 반드시 스케일 대로 도시되지 않았지만, 주로 본 발명의 원리를 (대략 개략적으로) 설명하기 위한 것이다. 도면에서, 동일한 참조 번호는 다른 도면에 대응하는 요소를 나타낸다.
도 1A 내지 1E는 흡수성 재료의 플레이트가 액적-함유 샘플 지지대 상에 배치되는 방법의 예시적인 양태의 개략도를 도시한다.
도 2A-2D는 플레이트가 샘플 지지대 위로 눌려질 때 스프링이 과도한 압력을 받음으로써, 압력이 균일하게 인가되도록 하는 방법의 변형을 개략적으로 도시한다.
도 3은 플레이트와 샘플 지지대 사이에 오직 작은 갭이 존재할 때까지 팽창하는 재료로 된 플레이트가 샘플 지지대를 향해 내려가는 방법의 예시적인 양태의 개략도이다.
도 4는 장내 세균 침전물로부터 배양액의 상청액을 제거한 후 MALDI 비행 시간 질량 분석법에 의해 수득되는 스펙트럼을 도시하는데, 예를 들어 Whatman® 셀룰로오스 여과지가 흡수성 재료로 사용되는 E. A. Idelevich et al., Clin. Microbiol. Infect. 2018 (7): 738-743에 공지되는 바와 같이, 비접촉식 방법을 사용하는 상면도 A, 본 발명의 원리에 따른 접촉 방법을 사용하는 하면도 B, 수직축: 임의의 단위의 강도; 수평축: 질량 대 전하비 m/z이다.
본 발명은 다양한 양태를 참조하여 설명 및 나타내지만, 당업자들은 첨부하는 청구범위에서 정의되는 바와 같이 교시되는 기술적 범위로부터 벗어나지 않고 형태 및 상세의 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.
도 1A는 적외선 분광법에 적합한 시편 슬라이드 플레이트 또는 MALDI 샘플 지지대 플레이트에 대응할 수 있는 샘플 지지대(4) 상에 8개의 줄을 따르는 액적(2)의 배열을 도시한다. 흡수성 재료의 플레이트(6)는 샘플 지지대(4) 위에 배치된다. 플레이트(6)는 샘플 지지대(4)를 향해 수직 방향으로 천천히 움직여, 액적(2)은 액적 액체가 모세관 힘에 의해 플레이트 재료(6)에 의해 흡수되도록, 특정 하강점으로부터 플레이트(6)의 흡수 재료와 접촉하게 된다(도 1B). 이전 개시내용과 달리, 이러한 하강 운동은 도 1c에 도시된 바와 같이 플레이트(6)가 샘플 지지대(4)에 놓이게 함으로써 끝낼 수 있다. 따라서, 플레이트(6)와 액적 배열(2) 사이에 전체-접촉이 생성될 수 있으며, 이는 미생물 침전물 상의 액적(2)으로부터 잔류액이 덜 남게되므로, 이후의 침전물의 분광 측정을 용이하게 한다.
놀랍게도, 이전에 추정된 "플레이팅 효과"는 우려했던 것보다 상당히 덜 표명된 것을 발견했다. 용어 "플레이팅 효과"는, 미생물의 다수의 세포가 플레이트(6)의 흡수성 재료와 직접 접촉하게 될 때 플레이트 상에 전달됨으로써 침전물로부터 제거되어, 이용 가능한 생체 재료의 양이 감소되기 때문에 후속 측정을 더욱 어렵게 하는 것을 말하고, 이는 이전 개시내용에서 액체의 비-접촉식 제거가 선호되는 이유이다. 실험은 출원인에 의해 인-하우스에서 수행되었고, 액체를 흡수시키는데 사용되는 플레이트를 배양했고, 미생물의 콜로니를 액적 액체가 흡수되는 부위에서 플레이트 표면 상에 형성할 수 있는 것을 보여준다. 그럼에도 불구하고, "플레이팅에 의해 제거되는" 생체 재료의 양은 기대와 달리 너무 작고, 샘플 지지대(4) 상에 남아 있는 재료의 후속 분광 분석은 역효과가 없었다.
이러한 유리한 특성의 완전히 개발된 과학적 설명을 발견하는 것이 여전히 가능하지 않지만, 플레이트 재료의 섬유와 미생물 사이의 상호 작용은 너무 작아 다른 것에 잘 접착되지 않아 플레이팅 효과를 방해한다고 추측된다. 또한, 측면 이동이 실제로 추천된 초기 개시내용과 달리, 측면 전단 운동을 억제하면서 샘플 지지대 상으로 플레이트 이동을 순수하게 수직으로 낮추는 것으로 제한하는 것이 미생물 바이오필름이 번질 위험을 감소 및 가능하게는 제거하는데, 이는 샘플 지지대로부터 플레이트 재료로의 세포 이동을 초래할 수 있는 것이 추측된다.
접촉시킨 후, 액적 액체는, 필요한 경우에 플레이트 재료를 약간 미리-습윤화함으로써 매우 짧은 시간, 보통 순식간에 흡수된다. 그 후, 액체가 국소적으로 풍부한 플레이트(6)는 다시 들어 올려 제거될 수 있다(도 1D). 흡수된 액체는 플레이트(6)의 모세관 매트릭스에서 단단히 고정되어, 플레이트가 수직으로 들어올려져 샘플 지지대(4)를 오염시키는 동안, 다시 떨어질 위험이 없다. 반면에, 이는 액체를 제거하기 위한 매우 안전하고 신뢰성 있는 방법이다. 부분적으로 흡수된 플레이트(6)는 일반적으로 소모성 재료로 배치되며, 이는 미생물학적 적용에 유리하다. 그러나, 적절한 경우, 세척 및 재사용이 가능하다.
상술한 바와 같이, 액적(2)에 동봉된 미생물 침전물은 모세관 힘에 의한 액체의 부드러운 흡수에 의해 제거되지 않지만, 액적이 적층되어 있는 샘플 지지대(4)의 표면의 중심에 크게 남아 있다. 따라서, 이제 액체가 제거된 침전된 재료는 작업 매질, 예를 들어 도 1E의 (8)에서 MALDI용 매트릭스 물질을 피펫팅함으로써 표시되는, 적외선 분광법에서의 샘플 준비, 매트릭스-보조 레이저 탈착에 의한 이온화 또는 유사한 처리 단계와 같은 추가 가공에 이용 가능하다.
플레이트 에지와 가장 가까운 액적 사이의 거리는 바람직하게는 샘플 지지대의 표면 상에서 적어도 액적 반경에 대응한다. 플레이트의 에지는 실험자에 의해 그리핑될 수 있기 때문에, 액체가 흡수성 재료로 흡수될 때 생물에 유해한 구성이 에지에 너무 가깝게 들어가는 것을 억제하기 위한 액적 직경을 갖는 것이 더욱 안전하다. 흡수된 액체가 액체의 흡수로부터 멀어지는 방향으로 플레이트 표면을 관통하는 것을 방지하기 위해서, 유사한 안전 거리는 플레이트의 최소 두께에 대해서 관측되어야 한다.
상기 설명된 방법의 변형에서, 샘플 지지대(14)를 향해 내리고 접촉시킨 후, 플레이트(16)는, 플레이트(16)와 배열(12) 또는 샘플 지지대 표면 사이에 전체 접촉되는 것을 보증하도록 샘플 지지대에 대해 가볍게 눌릴 수 있고, 이는 액체가 가장 완전히 흡수되도록 한다. 특히, 미생물 침전물에 해로운 영향을 미칠 수 있는 손으로 눌릴 때(예를 들어, 미경험 실험자에 의해), 과도한 압력이 인가되는 것을 억제하기 위해, 플레이트(16) 및 샘플 지지대(14)는 도 2A 내지 2D에서 코일 스프링(18)에 의해 개략적으로 표시되는 바와 같이, 서로에 대해 스프링-장착될 수 있다. 샘플 지지대(14), 스프링(16) 또는 두 요소 모두는 목적하는 효과를 달성하기 위해 스프링 장착될 수 있지만, 샘플 지지대(14)의 스프링만 도 2에 도시된 순서로 표시되어 있음을 이해해야 한다.
흡수성 재료로 된 플레이트(16)를 액체(12)의 액적을 포함하는 샘플 지지대(14)를 향해 내렸다(도 2A). 이러한 상태에서, 스프링(18)은 압축되지 않는다. 플레이트(16)가 샘플 지지대 표면과 접촉이 이루어지기 전에도 발생하는 액적 상청액과 접촉하자마자, 액적의 액체는 플레이트(16)의 흡수성 재료로 흡수된다(도 2B). 이러한 상태에서도, 스프링(18)은 여전히 압축되지 않는다. 플레이트(16)가 샘플 지지대(14)에 닿자마자, 내려가는 이동에 대한 저항성이 눈에 띄었다. 압력은 플레이트(16)와 샘플 지지대 표면 또는 배열(12) 사이의 균일하고, 특히 전체 접촉을 보장하고 잔류액을 가능한 한 많이 흡수하도록 힘을 가할 수 있다(도 2C). 스프링(18)은 이제 가해진 압력 N 및 스프링 상수의 함수로서 압축되어, 미생물 침전물에 과도한 압력이 인가되는 것을 방지한다. 액체가 플레이트 재료 내로 흡수될 때, 순식간의 기간 후, 플레이트(16)는 다시 수직으로 들어 올려질 수 있고, 따라서 미생물 침전물을 노출시키며, 이는 이제 샘플 지지대(14) 상에 추가 가공이 접근 가능하다(도 2D). 그 후, 스프링(18)은 이러한 공정에서 다시 이완된다.
상기 예로부터의 코일 스프링(18)은 완충 원리(cushioning principle)를 설명하기 위한 것일 뿐이라는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에 제시된 방법에서, 본 기술 분야의 전문가들이 편리하다고 여기는 다른 완충 메커니즘도 사용될 수 있다.
흡수성 플레이트(26)가 샘플 지지대(24)와 직접 접촉하게 되는 양태가 앞서 기재되었다. 그러나, 팽창성, 흡수성 재료로부터 제조될 때, 예를 들어 측면 림(lateral rim)(28) 상에 플레이트를 배치시킴으로써, 플레이트(26)와 샘플 지지대(24) 사이의 약한 갭을 유지할 수 있다(도 3). 플레이트 표면을 액적 상청액과 접촉시킬 때, 액체가 플레이트(26) 내로 국소적으로 흡수되어, 팽창된 재료가 미생물 침전물과 부드럽게 접촉하도록 부피의 증가("팽창")를 초래한다(도 3의 확대된 부분 참조). 침전물은 이러한 부드러운 접촉에 의해 역효과가 없고, 특히 단지 적은 미생물 세포만이 플레이트 표면 상으로 이동("플레이팅 효과")하지만, 비-팽창성 재료의 사용 때문에 엄격하게 작동되는 이전에 공개된 기술에서 가능한 것보다 더욱 완전히 액적의 액체를 흡수시키는 것을 발견했다. 국소화된 포화(localized saturation)를 이용하는 플레이트(26)가 (수직으로) 들어 올려진 후, 샘플 지지대(24) 상에 남아 있는 잔류액의 양은 감소되어, 추후 분광 측정을 용이하게 한다.
플레이트의 처리를 단순화하기 위해서, 이는 프레임으로 삽입 또는 크램핑(clamped)될 수 있다. 프레임은, 예를 들어 EP　3　376 202 A1에 기재된 바와 같이 액적의 어레이가 배치되는 샘플 지지대 주변에 플러쉬(flush)를 피팅(fit)하도록 치수를 정할 수 있다. 포화된 플레이트와 함께 처분되는 일회용품 또는 세척 가능하고 재사용 가능한 물품으로 설계될 수 있다. 가능한 양태는 계단식 내부 윤곽을 갖는 프레임을 포함하며, 상기 플레이트에는 마찰 고정되도록 플레이트가 배치될 수 있다. 프레임이 샘플 지지대의 외부 윤곽 주위로 슬라이딩 되면, 액체와의 접촉이 특정 지점에서 이루어진다. 또한, 프레임은 액적 어레이에 대한 플레이트의 신뢰성 있는 정렬 및 가이드가 보장되는 이점을 갖는다.
다른 양태에서, EP　3　376 202 A1의 원리에서 기재된 것과 마찬가지로, 프레임은 플레이트에 단단히 고정될 수 있다. 예를 들어, 흡수성 재료의 돌출된 크기에 맞춰 잘라진 경계는, 예를 들어 폴딩된 다음 폴리머로 함침될 수 있고, 이후 안정성과 강성을 보장하도록 고정된다(단일 변형(single-piece variant)). 필요한 경우, 또한 프레임은 적합한 폴리머를 사용하여 외주에서 플레이트 상에 사출 성형될 수 있다.
마찬가지로, EP　3　376 202 A1에 공지된 것은 액적 어레이를 포함하는 샘플 지지대가 모든 면을 둘러싸는 가이드에 삽입되는 기술이다. 플레이트는 샘플 지지대와 유사한 치수를 가질 수 있고, 상부 가이드 개구로부터 샘플 지지대 상의 아래쪽으로 천천히 미끄러진다. 가이드 벽의 그립 홈(grip recess)은 시료 지지대와 플레이트를 더 쉽게 삽입하고, 다시 들어올릴 수 있게 한다.
도 4는 본 명세서에 기재되는 방법의 이점을 나타내는 측정 데이터를 묘사한다. 본 개시내용(하부 도면 B)의 원리에 따라 MALDI 샘플 지지대 상에서 직접적으로 박테리아 배양 후, 액적 상청액, 여기서는 배양액 또는 배양액 상청액을 (거의) 완전히 제거 및 후속 측정을 방해할 수 있는 오염 물질, 예를 들어 영양 배지 또는 염의 구성 성분의 제거는, 더 높은 이온 신호 강도 및 개선된 신호 대 노이즈 비율(signal-to-noise ratio)의 형태로 우수한 품질의 측정 데이터를 생성한다.
분석되는 그램-음성 박테리아의 항생제 민감성(세팔로스포린 항생제(cephalosporin antibiotic); 세프타지딤(ceftazidime))의 결정에 관하여, 본 발명에 따른 접촉 방법 및 선행 기술에 따른 비접촉식 방법은 종래의 배양액 미세 희석법(20시간 배양)과 비교하여 각각 95%/ 100%/ 100% 및 93%/ 93%/ 92%에서 4시간/ 4.5시간/ 5시간 배양 후 일관된 결과를 생성했고, 이는 이러한 절차의 큰 이점을 강조한다.
본 발명의 다른 양태는 실시예에 의해 기재되는 양태 이외에도 가능하다. 본 개시내용의 지식으로, 당업자는 탈착 이온화 방법을 사용하여 적외선 분광 또는 질량-분광 측정을 위한 추가의 유리한 샘플 제조 방법을 용이하게 설계할 수 있으며, 이는 임의의 등가물을 포함하는 청구 범위의 보호 범위에 포함된다.

Claims (11)

  1. 분광 샘플 지지대(spectrometric sample support) 상에서 샘플을 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    - 액적들 각각이 미생물 침전물(microorganism sediment)을 내부에 갖는, 액체의 개별적인 액적들(droplets of liquid)의 배열을 함유하는 샘플 지지대를 제공하는 단계,
    - 흡수성 재료(absorbent material)로 된 플레이트를 제공하는 단계,
    - 상기 미생물 침전물과 플레이트를 접촉시켜 액체의 액적들이 흡수성 재료에 흡수되도록, 샘플 지지대 상에 플레이트를 수직으로 내리는 단계,
    - 액적 액체가 국소적으로 풍부한 플레이트를 샘플 지지대로부터 들어올려, 액체가 고갈된 미생물 침전물을 노출시키는 단계, 및
    - 노출된 미생물 침전물을 분광 측정용으로 준비하는 단계를 포함하는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플레이트는 팽창성 흡수성 재료(swelling absorbent material)를 함유하고, 상기 플레이트와 샘플 지지대 사이에 오직 갭이 존재할 때까지 상기 플레이트를 내려 액적의 상청액을 플레이트와 접촉시키고, 이에 의해 흡수시켜, 액적 액체가 흡수되고 미생물 침전물과 접촉하는 부위에서 흡수성 재료를 국소 팽창시키는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 플레이트를 샘플 지지대 바로 위에 놓고, 플레이트에 천천히 압력을 인가해, 상기 배열과 플레이트를 전체에 걸쳐 완전히 접촉(all-over contact)시키는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 샘플 지지대 및 플레이트 중 하나 이상은 서로에 대해 상대적으로 스프링-장착되어, 플레이트를 눌렀을 때 인가된 과도한 압력이 스프링에 의해 흡수되는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플 지지대를 향하는 플레이트 표면은 액적들로부터 액체의 흡수를 가속시키도록 내리기 전에 습윤화되는(moistened) 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플레이트는 셀룰로오스 및 식물 섬유 중 하나 이상의 흡수성 섬유를 갖는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액적의 체적은 1 내지 12 마이크로리터(microliter)에 해당되는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물 침전물은 배양액(nutrient solution) 또는 세정액의 액체 액적 내에 제공되는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 배양액에 항균 물질이 첨가되는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 노출된 미생물 침전물을 준비한 후 샘플 지지대로부터 적외선 분광 또는 질량 분광 측정하는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플레이트를 들어올리는 것과 미생물 세포 침전물 상의 임의의 잔류하는 잔류액 필름이 건조되도록 준비하는 것 사이에 짧은 대기 시간이 존재하는 것인, 분광 샘플 지지대 상에서 샘플을 제조하는 방법.
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