ES2911825T3 - Procedimiento para el tratamiento de muestras en un portamuestras espectrométrico - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para el tratamiento de muestras en un portamuestras, que presenta las etapas: - provisión del portamuestras, que comprende una disposición de gotas de líquido aisladas, cada una de las cuales encierra sedimentos de microorganismos, - provisión de una placa de un material absorbente, - descenso perpendicular de la placa sobre el portamuestras de tal manera que los sedimentos de microorganismos y la placa se toquen, absorbiéndose las gotas de líquido por el material absorbente, - elevación de la placa localmente enriquecida con gotas de líquido del portador de muestras, con lo cual se descubren los sedimentos de microorganismos empobrecidos en líquido y - preparación de los sedimentos de microorganismos descubiertos para una medición espectrométrica.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para el tratamiento de muestras en un portamuestras espectrométrico
Campo de la invención
La invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento de muestras en un portamuestras espectrométrico, en el que (a) se dispone un portamuestras que comprende una disposición de gotas de líquido aisladas, cada una de las cuales encierra sedimentos de microorganismos, (b) una placa de un material absorbente (c ) la placa y el portamuestras se unen de tal manera que la gota de líquido se absorbe en el material absorbente, (d) la placa localmente enriquecida con líquido se levanta del portamuestras (perpendicularmente), con lo que se descubren los sedimentos de microorganismos empobrecidos en líquido, y (e) los sedimentos de microorganismos descubiertos se preparan para una medición espectrométrica.
Antecedentes de la invención
El estado de la técnica se explica a continuación con referencia a un aspecto específico. Sin embargo, esto no debe entenderse como una limitación. Los desarrollos y cambios útiles de lo que se conoce del estado de la técnica anterior también pueden ser aplicables más allá del alcance comparativamente estrecho de esta introducción y serán fácilmente evidentes para los profesionales experimentados en este campo tras la lectura de la siguiente divulgación.
Experimentos previos han demostrado que los microorganismos que se suspenden en una gota de solución nutriente se acumulan en un depósito de microorganismos sobre una superficie plana después de un tiempo de espera (o "tiempo de reposo") relativamente corto de hasta una hora. Los microorganismos sedimentados allí en una especie de "biopelícula" pueden liberarse cuidadosamente del líquido residual y de las partículas suspendidas remanentes, por ejemplo, poniendo en contacto con las gotas un paño absorbente. T ras esta "deshumidificación", se puede detectar de forma fiable el tipo de microorganismo con una posterior medición espectrométrica de masas, véase la solicitud internacional WO 2018/099500 A1. Esta constatación fue sorprendente, ya que se encontró que, contrariamente a lo previsto, el sedimento de células de microorganismo de interés no se eliminó simultáneamente con el líquido aspirado. Este hallazgo permite el cultivo (o incubación) de microorganismos para la promoción del crecimiento y la preparación para una medición analítica en el mismo sustrato, como por ejemplo una placa portamuestras para la inserción en la fuente de iones de un espectrómetro de masas o un portaobjetos para la inserción en el compartimento de medición de un espectrómetro infrarrojo.
Aún no existe una explicación científica completamente desarrollada para este comportamiento microbiano en una gota sobre una superficie plana. Sin embargo, se supone que las interacciones físicas entre la superficie del portamuestras y las células del microorganismo, así como los procesos de adhesión debidos a las propiedades bioquímicas y biofísicas de la superficie de la célula de microorganismo, son responsables de la acumulación o sedimentación preferida en el sustrato.
En un desarrollo de la técnica conocida por el documento WO 2018/099500 A1, en la solicitud EP 3376 202 A1 se propone una máscara con muescas u orificios, cuyas superficies internas se ponen en contacto con las regiones marginales de las gotas y succionan el líquido de la gota lateralmente a través de fuerzas capilares. El centro de la gota, debajo del cual se encuentra la mayor parte del sedimento de microorganismos, debe permanecer intacto durante este proceso, ya que se temía que el contacto directo con el sedimento conduciría necesariamente al empobrecimiento de los microorganismos ("efecto de sello") y, por lo tanto, a una pérdida de sensibilidad a la que conduciría la siguiente medición analítica.
No obstante, la extracción del líquido localmente sin contacto, ya sea a través de la máscara perfilada o la colocación de una placa dimensionalmente estable en un espaciador vertical que rodea las gotas, como se describe en el documento EP 3376 202 A1, tiene la desventaja de que aún puede permanecer una cantidad de líquido residual de gotas en el sustrato sobre el sedimento, de tal manera que se interfiere en el examen posterior del sedimento de microorganismos y pueden ser necesarias medidas de purificación adicionales.
La solicitud europea EP 1053784 A2 divulga el procesamiento de cantidades mínimas de muestra, por ejemplo en reacciones químicas o enzimáticas, de purificaciones o de investigaciones analíticas, en cantidades mínimas de líquido en el orden de magnitud un microlitro o menos, en particular para números muy grandes de muestras en procesos simultáneos. La divulgación se refiere a la reducción de las superficies de contacto con la pared del recipiente, que crecen de modo desproporcionada en el caso de cantidades mínimas de líquido, con sus efectos en su mayoría nocivos, mediante el uso de gotitas estacionarias (o colgantes) como microrreactores para el procesamiento, asentándose las gotitas en anclas fáciles de humedecer (liófilas) en superficies difíciles de humedecer (liofóbas) de lo contrario, y poseyendo estas de este modo un área de contacto con la pared bien definida. Las anclas pueden pasivarse o hacerse tensioactivas del modo deseado, esto último para favorecer ciertas etapas
de procesamiento. Otras conformaciones incluyen la integración de elementos eléctricos, ópticos, fluídicos u otros elementos microestructurados en el soporte para favorecer el procesamiento.
Por lo tanto, existe la necesidad de separar los sedimentos de microorganismos aislados de las gotas de líquido cubrientes de forma suficientemente completa y eliminar con el líquido la menor cantidad de material posible de los sedimentos de microorganismos durante este proceso de separación. Otros problemas a resolver por la invención resultarán fácilmente evidentes para el especialista en la lectura de la siguiente divulgación.
Sumario de la invención
La invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento de muestras en un portamuestras espectrométrico, que comprende las etapas: (i) provisión del portamuestras, que comprende una disposición de gotas de líquido aisladas, cada una de las cuales encierra sedimentos de microorganismos, (ii) provisión de una placa de un material absorbente, (iii) descenso perpendicular de la placa sobre el portamuestras de tal manera que los sedimentos de microorganismos y la placa se toquen, absorbiéndose las gotas de líquido por el material absorbente, (iv) elevación de la placa localmente enriquecida con gotas de líquido del portador de muestras, con lo cual se descubren los sedimentos de microorganismos empobrecidos en líquido y, opcionalmente, después de que se haya podido secar una película de líquido residual, remanente eventualmente, sobre los sedimentos de células de microorganismos, (v) preparación de los sedimentos de microorganismos descubiertos para una medición espectrométrica, por ejemplo, una siguiente medición por espectrometría infrarroja o de masas.
En diversas formas de realización, la placa puede presentar un material absorbente hinchable y se puede hacer descender a una distancia corta por encima del portamuestras, de modo que un sobrenadante de las gotas entre en contacto con la placa y sea absorbido por ella, hinchándose el material absorbente localmente en los puntos del líquido de las gotas absorbido y, por lo tanto, entrando en contacto con los sedimentos de microorganismos. Una hoja de papel secante, cuyo material tiene un comportamiento de hinchamiento correspondiente, ha demostrado ser especialmente adecuada para esta variante. El papel secante es conocido en particular por la restauración y el archivo de obras de arte sensibles a la humedad y representa esencialmente un cartón fluido neutro, libre de ácidos, absorbente y pobre en pelusa con una alta proporción de fibras de algodón, que puede ser más del 50 %, especialmente el 60 %.
La selección de la distancia todavía libre de contacto inicialmente se puede probar de forma muy sencilla haciéndose descender una placa provista de una pintura colorante contra el portamuestras. Si se pueden encontrar rastros de color en el portamuestras después de levantar la placa nuevamente, la distancia no fue lo suficientemente grande para evitar la colocación directa y debe reajustarse. De esta manera, se pueden ajustar fácilmente de modo experimental distancias de fracciones de milímetro, que pueden cerrarse debido al comportamiento de hinchamiento de un material absorbente como el papel secante en la absorción de líquido local hasta el contacto con el sedimento del microorganismo.
En diversas formas de realización alternativas, la placa se puede colocar directamente sobre el portamuestras y presionar suavemente para que la disposición y la placa se toquen en toda su superficie.
La invención se basa en el descubrimiento inesperado y, por lo tanto, sorprendente de que es posible hacer descender una placa plana y pobre en pelusa de un material absorbente contra un portamuestras plano y ponerla en contacto con este, en parte incluso colocándolo y presionándolo suavemente de modo que las fuerzas capilares absorban casi todo el líquido sobrenadante de una gota en el material sin que el sedimento de microorganismos oculto por debajo se empobrezca en tal medida que un siguiente análisis espectrométrico del portamuestras no proporcione ningún resultado significativo debido a biomaterial demasiado reducido. Aunque queda una película de líquido después de levantar la placa (perpendicularmente), esta es tan delgada que se seca en segundos.
El portamuestras y/o la placa están preferentemente ajustados por resorte entre sí, de modo que el sistema de resorte absorba una presión excesiva ejercida al presionar. La deformación elástica del sistema de resorte provoca que se matenga una presión de contacto uniforme de la placa sobre el portamuestras. Mediante selección apropiada de la constante de resorte, esta presión puede adaptarse a los requisitos y ajustarse de tal manera que el sedimento de microorganismos no se vea afectado por la presión.
En diversas formas de realización, la superficie de una placa orientada hacia el portamuestras se puede humedecer ligeramente antes del descenso, por ejemplo, con agua desionizada o metanol/etanol, para acelerar la absorción del líquido de la gota. La ligera humectación y la humectación superficial de las fibras que se encuentran en la superficie exterior de la placa facilita en particular la formación de una conexión de líquido o puente de líquido entre las gotas depositadas en el portamuestras y la red de fibras de la placa, de modo que el tejido de fibra situado en el exterior ya está humedecido superficialmente desde el principio y no se debe humedecer o impregnar apenas en el contacto de líquido con la gota en el portamuestras, requiriendo mucho tiempo.
La placa presenta preferiblemente fibras absorbentes de celulosa y/o fibras vegetales, en particular algodón, nitrocelulosa, nailon, fibra de vidrio, difluoruro de polivinilideno o combinaciones de los mismos. El papel secante como material particularmente adecuado puede contener, por ejemplo, una mezcla de 60% de fibras de algodón y 40% de celulosa blanqueada (producida a pH neutro y libre de ácidos).
Los volúmenes típicos de gota pueden corresponder a uno hasta doce microlitros. Estos volúmenes en forma de gota uniforme corresponden aproximadamente a un diámetro de dos, o bien tres milímetros sobre el área del portamuestras.
Especialmente en el análisis por espectrometría infrarroja o espectrometría de masas, por ejemplo análisis de tiempo de vuelo MALDI, se pueden disponer 48, 96, 384 o 1536 gotas aisladas en un patrón predefinido (y regular) en el portamuestras. Por supuesto, también es posible marcar el portamuestras con manchas de gotas preferidas, por ejemplo, áreas circulares liófilas en un entorno liófobo. El diámetro de las gotas se ajustará correspondientemente a las dimensiones del área circular liófila, como con las placas de anclaje estandarizadas del tipo AnchorChip™.
En particular, las gotas pueden contener principalmente líquido que se utiliza en procedimientos de preparación de muestras y procedimientos de tratamiento de muestras para espectrometría infrarroja o espectrometría de masas. Por ejemplo, las gotas pueden presentar disolución nutriente, y el material sedimentado puede comprender microorganismos cultivados y entonces depositados en estas gotas de disolución nutriente. Una separación de la disolución nutriente de microorganismos sedimentados puede utilizarse, en particular, como etapa de procesamiento de una muestra para la identificación espectrométrica infrarroja o espectrométrica de masas (p. ej., mediante espectroscopia de transmisión IR o espectrometría de masas de tiempo de vuelo MALDI) según especie/subespecie u otra caracterización de los microorganismos, como por ejemplo la determinación rápida de la resistencia/sensibilidad de los microorganismos frente a sustancias antimicrobianas como antibióticos y antimicóticos.
Si es necesario, se puede añadir una sustancia antimicrobiana a la disolución nutriente, por ejemplo para determinar la concentración inhibitoria mínima de microorganismos por incubación en la gota de disolución nutriente enriquecida con antibióticos o antimicóticos.
Adicional o alternativamente, las gotas pueden contener líquido de lavado (como una disolución acuosa o agua desionizada pura) u otros medios de trabajo líquidos para usar en un método de tratamiento de muestras. Por ejemplo, el líquido de lavado de las manchas de muestra, que están cubiertos con sedimento de microorganismos previamente desecado o con sustancia de matriz desecada y sedimento de microorganismos, puede absorberse con la placa. El líquido de lavado se selecciona preferiblemente de tal manera que la sustancia de matriz, o bien la red cristalina de matriz con cristales de muestra incorporados no se disuelva, por ejemplo, en el caso de una preparación de afinidad de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico para desalinización in situ. (véase Gobom y col., Anal. Chem. 73, 2001,434-438).
En diversas formas de realización se puede usar una placa de metal, vidrio o cerámica como portamuestras espectrométrico. En particular, entran en consideración placas de acero inoxidable pulidas o sus modificaciones, como las denominadas placas de anclaje (AnchorChip™; Bruker Daltonik GmbH), que contienen áreas liófilas y liófobas delimitadas alternantemente sobre un sustrato de acero inoxidable. También es posible una placa de vidrio como portaobjetos espectrométrico infrarrojo para una medición de transmisión. El portamuestras puede ser reutilizable o ser un artículo desechable.
Un portamuestras común, estandarizado, para ionización por medio de desorción láser asistida por matriz (MALDI) puede comprender una disposición regular de 48, 96, 384 o 1536 manchas de muestra. Las dimensiones de un portamuestras y una placa de material absorbente pueden ser cada una de 127,76 mm (longitud) x 85,48 mm (anchura) correspondientemente a una placa de microtitulación con un espesor de aproximadamente dos a cinco milímetros, siempre que sean congruentes. Sin embargo, la disposición de manchas de muestra y, por lo tanto, la disposición de gotas sobre el portamuestras ocupa un área menor que el propio portamuestras.
Se puede prever un marco para la placa o un compartimento para el portamuestras en el que se introduce la placa, que ayuda a guiar y orientar la placa durante el descenso sobre la disposición de gotas, como se describe en el documento EP 3376 202 A1, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia en su totalidad. El marco puede, por ejemplo, estar firmemente conectado a la placa, en particular doblando un borde cortado sobresaliente del material absorbente e impregnándolo a continuación con un plástico que se endurece entonces. El marco también se puede inyectar en el perímetro exterior de la placa utilizando un plástico moldeado por inyección.
La placa está preferiblemente fabricada con un tejido rígido y pobre en pelusa. Las fibras vegetales y/o la celulosa son adecuadas para esto. Por ejemplo, esta puede presentar materiales de fibra como fibra de algodón, nitrocelulosa, nailon, fibra de vidrio, difluoruro de polivinilideno o combinaciones de los mismos, por ejemplo papel secante con aproximadamente un 60 % de fibras de algodón y un 40 % de celulosa blanqueada (producida a pH neutro y sin ácido). Los materiales dimensionalmente estables son apropiados en particular para procedimientos automatizados de absorción de líquido. Las placas dimensionalmente estables pueden retirarse con facilidad de un depósito de almacenamiento mediante dispositivos de manipulación especialmente adaptados, como brazos robóticos, sujetarse en un soporte adaptado, alimentarse a la etapa de absorción de líquido y después depositarse en un lugar de almacenamiento, si es necesario también eliminarse.
Con respecto a la producción de la placa, es posible proporcionar una cinta del material absorbente y después cortar las piezas de placa a la longitud según el contorno exterior deseado. Para la utilización en un laboratorio microbiológico, es aconsejable seleccionar las dimensiones exteriores de la placa de tal manera que el líquido absorbido con los microorganismos suspendidos, que queden eventualmente en este, no pueda penetrar hasta el lado estrecho de la placa o hasta la parte superior de la placa, de modo que la placa enriquecida localmente con líquido pueda agarrarse y moverse allí sin riesgo de contaminación.
Breve descripción de las figuras
Para una mejor comprensión de la invención, se hace referencia a las siguientes figuras. Los elementos en las figuras no están representados necesariamente a escala, sino que pretenden sobre todo ilustrar los principios de la invención (en su mayor parte esquemáticos). En las figuras, signos de referencia iguales caracterizan elementos correspondientes en las diversas vistas.
Las Figuras 1A a 1E muestran esquemáticamente un ejemplo de realización de un procedimiento en el que se coloca una placa de material absorbente sobre un portamuestras que soporta gotas.
Las Figuras 2A a 2D ilustran esquemáticamente una modificación del procedimiento en el que un resorte absorbe la presión excesiva al presionar la placa sobre el portamuestras y asegura así una aplicación de presión uniforme.
La Figura 3 muestra esquemáticamente un ejemplo de realización para un procedimiento en el que se hace descender una placa de material hinchable hasta una pequeña distancia sobre el portamuestras.
La Figura 4 muestra espectros de espectrometría de masas de tiempo de vuelo MALDI después de la eliminación de sobrenadantes de cultivo de un sedimento de Enterobacteriales, una vez usando un procedimiento sin contacto, diagrama superior A, como se ejemplifica en E. A. Idelevich y col., Clin. microbiol infección 2018(7): 738-743, donde se utilizó papel de filtro de celulosa Whatman® como material absorbente, y una vez usando un procedimiento de contacto según principios de la invención, diagrama inferior B; eje vertical: intensidad en unidades arbitrarias; eje horizontal: masa referida a la carga m/z.
Descripción detallada
Aunque la invención se ha representado y explicado por medio de un número de formas de realización, los especialistas reconocerán que se pueden realizar diversos cambios en forma y detalle sin apartarse del alcance de la enseñanza definida en las reivindicaciones adjuntas.
La Figura 1A muestra una disposición de gotas (2) a lo largo de una fila de ocho sobre un portamuestras (4), que puede corresponder a una placa portamuestras MALDI o un portaobjetos apto para espectrometría infrarroja. Se coloca una placa (6) de un material absorbente sobre el portamuestras (4). La placa (6) se mueve lentamente en perpendicular contra el portamuestras (4), entrando en contacto las gotas (2) con el material absorbente de la placa (6) desde un determinado punto de descenso, de modo que el líquido de la gota puede absorberse por el material de la placa (6) a través de fuerzas capilares, Figura 1B. A diferencia de las divulgaciones anteriores, este movimiento de descenso puede terminar con la colocación de la placa (6) sobre el portamuestras (4), como se representa en la Figura 1C. De esta manera, se puede producir un contacto de toda la superficie entre la placa (6) y la disposición de gotas (2), que deja menos líquido residual de las gotas (2) sobre los sedimentos de microorganismos y, por lo tanto, facilita las siguientes espectrométricas de los sedimentos.
Sorprendentemente, se ha comprobado que un efecto de sello previamente supuesto, según el cual muchas células de microorganismos son eliminadas del sedimento por transferencia a éste en el contacto directo con el material absorbente de la placa (6), y de este modo dificultan una subsiguiente medición debido a la reducción del biomaterial disponible, por lo cual se defendía una extracción del líquido sin contacto en divulgaciones anteriores, es significativamente menos pronunciado de lo que se temía. Aunque los experimentos en las instalaciones del solicitante, en los que se incubaron las placas utilizadas para absorber líquido, han demostrado que pueden formarse colonias de microorganismos en el área de la placa en los puntos donde se han absorbido gotas de líquido, la cantidad de biomaterial "sellado", en contra de las expectativas, resultó ser tan reducida que las siguientes investigaciones espectrométricas del material que queda en el portamuestras (4) no se vieron afectadas.
Aún no se ha encontrado una explicación científica desarrollada para estas propiedades ventajosas. Sin embargo, se sospecha que la interacción entre las fibras del material de la placa y los microorganismos es muy pequeña, por lo que ambos no se adhieren bien entre sí, lo que contrarresta el efecto de sello. Además, se supone que la limitación del movimiento de la placa a un descenso puramente perpendicular sobre el portamuestras evitando movimientos laterales de cizallamiento, en contraste con la divulgación anterior, donde se recomendaban movimientos laterales, también podría reducir, y en caso dado eliminar el riesgo de que un engrase de biopelícula del microorganismo, que podría conducir a la transposición de células del portamuestras al material de la placa.
Después del contacto se efectúa la absorción de la gota de líquido en muy poco tiempo, posiblemente favorecida por una ligera humectación previa del material de la placa; generalmente fracciones de segundo. Después se puede elevar de nuevo y retirar la placa enriquecida localmente con líquido (6), Figura 1D. El líquido absorbido se mantiene seguro en la red capilar de la placa (6), de modo que no hay riesgo de que gotee nuevamente y contamine el portamuestras (4) al elevarlo (verticalmente). Más bien se trata de una forma de eliminación de líquidos muy segura y fiable. La placa parcialmente empapada (6) normalmente se desecha como material consumible, lo que es ventajoso en aplicaciones microbiológicas. Sin embargo, opcionalmente también podría ser lavable y entonces reutilizable.
Como ya se explicó anteriormente, los sedimentos de microorganismos encerrados por las gotas (2) no se eliminan mediante la suave absorción del líquido por medio de fuerzas capilares, sino que en su mayoría permanecen en el centro de la superficie del portamuestras (4), donde se depositaron las gotas (2). El material sedimentado y ahora liberado del líquido está disponible para su posterior procesamiento, como por ejemplo una preparación de muestras para espectrometría infrarroja, la ionización mediante desorción láser asistida por matriz o etapas de procesamiento similares, indicados mediante pipeteo de un líquido de trabajo, por ejemplo, sustancia matriz para MALDI, en (8) en la Figura 1E.
La distancia desde el borde de la placa hasta la gota más cercana corresponde preferiblemente al menos al radio de la gota en el área del portamuestras, el diámetro de la gota es más seguro para evitar que los componentes peligrosos desde el punto de vista biológico sean succionados demasiado cerca del borde, donde la placa se sujeta por el personal del laboratorio si es necesario, en el caso de absorción de líquido en el material absorbente. Se debe mantener una distancia de seguridad similar para el espesor mínimo de la placa para evitar una imbuición del líquido absorbido en el área de la placa que está alejada de la absorción del líquido.
En una variante del procedimiento explicado anteriormente, la placa (16) también se puede presionar ligeramente tras el descenso y la colocación sobre el portamuestras (14) para garantizar un contacto en toda la superficie de la placa (16) y la disposición (12) o la superficie del portamuestras que permita la absorción de líquidos más completa posible. Para evitar que se ejerza una presión excesiva (por ejemplo por parte de personal de laboratorio sin experiencia), en especial en el caso de presión manual, que pueda afectar al sedimento de microorganismos, la placa (16) y el portamuestras (14) pueden ajustarse por resorte entre sí, se indica esquemáticamente en las figuras 2A a 2D mediante los resortes helicoidales (18). No hace falta decir que el portamuestras (14), la placa (16) o también ambos elementos pueden ajustarse por resorte para lograr el efecto deseado, aunque en la secuencia de la Figura 2 solo se ilustra el resorte del portamuestras (14).
Se hace descender una placa (16) de un material absorbente contra el portamuestras (14) que soporta las gotas de líquido (12), Figura 2A. En este estado, el sistema de resorte (18) está aflojado. Tan pronto como la placa (16) entra en contacto con el sobrenadante de la gota, lo que ocurre antes del contacto con la superficie del portamuestras, el líquido de la gota es absorbido en el material absorbente de la placa (16), Figura 2B. También en este estado, el sistema de resorte (18) todavía está aflojado. Tan pronto como la placa (16) se coloca sobre el portamuestras (14) se percibe resistencia durante el movimiento de descenso. Ahora se puede ejercer presión para garantizar contacto uniforme, y en especial en toda la superficie, de la placa (16) y la superficie del portamuestras o la disposición (12) y para absorber la mayor cantidad posible de líquido residual, Figura 2C. El resorte (18) ahora se comprime según la presión ejercida N y la constante de resorte, e impide de este modo una presión excesiva sobre los sedimentos de microorganismos. Después de un período de fracciones de un segundo, cuando el líquido ha sido absorbido por el material de la placa, la placa (16) se puede levantar perpendicularmente de nuevo y de este modo descubre los sedimentos de microorganismos empobrecidos en líquido, que son entonces accesibles para su posterior procesamiento en el portamuestras (14), Figura 2D. La suspensión (18) se afloja de nuevo en este caso.
No hace falta decir que los resortes helicoidales (18) del ejemplo citado anteriormente solo sirven para ilustrar el principio del resorte. También se pueden usar otros mecanismos de resorte en los procedimientos presentados en este documento, según lo considere apropiado un profesional.
Anteriormente se han descrito formas de realización en las que la placa absorbente (26) se coloca directamente sobre el portamuestras (24). Sin embargo, también es posible distanciar la placa (26) ligeramente por encima del portamuestras (24), por ejemplo mediante apoyo sobre una arista lateral (28) si está fabricada con un material absorbente hinchable, Figura 3. Mediante el contacto del área de la placa con los sobrenadantes de las gotas, el líquido se absorbe localmente en la placa (26) y conduce allí un aumento de volumen ("hinchamiento"), de modo que el material hinchado entra en contacto suavemente con los sedimentos de microorganismos, véase el corte ampliado en la Figura 3. Se ha demostrado que este contacto suave no afecta más al sedimento, en particular solo unas pocas células de microorganismos se transfieren al área de la placa ("efecto de sello"), pero este permite absorber la gotita de líquido más completamente de lo que era posible con las técnicas antes publicadas, mediante uso de materiales que no se hinchan, basadas estrictamente en la distancia. De este modo se reduce la cantidad de líquido residual que queda en el portamuestras (24) tras la elevación (perpendicular) de la placa empapada localmente (26), lo que facilita las subsiguientes mediciones espectrométricas.
Para simplificar el manejo de la placa, esta se puede insertar o sujetar en un marco. Por ejemplo, el marco se puede dimensionar de tal manera que encierre al ras un portamuestras en el que se encuentra un campo de gotas, como se describe en el documento EP 3376202 A1. Este puede diseñarse como un artículo desechable que se elimina junto con la placa saturada, o también puede ser lavable y reutilizable. Las posibles configuraciones comprenden un marco con un contorno interior escalonado sobre el que se puede colocar la placa con un ajuste por fricción. Si el marco se desliza hacia abajo alrededor del contorno exterior del portamuestras, el contacto con el líquido se produce a partir de un punto determinado. El marco también tiene la ventaja de proporcionar una orientación y una guía fiables de la placa con respecto al campo de gotas.
En una forma de realización alternativa, asimismo descrita en principio en el documento EP 3376 202 A1, el marco se puede conectarse firmemente con la placa. Por ejemplo, un borde cortado sobresaliente del material absorbente puede doblarse e impregnarse entonces con un plástico, que después se endurece para garantizar la resistencia y la estabilidad dimensional (variante de una pieza). Si es necesario, el marco también se puede inyectar en la placa en el perímetro exterior usando un plástico moldeado por inyección.
Asimismo, por el documento EP 3376202 A1 es conocido insertar un portamuestras, que soporta el campo de gotas en un compartimento que encierra todos los lados. A continuación, la placa se puede dimensionar de modo similar al portamuestras y deslizarse lentamente hacia abajo sobre el portamuestras desde la abertura superior del compartimento. Los asideros en las paredes del compartimento pueden facilitar la inserción y la extracción del portamuestras y la placa.
La Figura 4 muestra datos de medición que ilustran las ventajas del procedimiento aquí descrito. La eliminación (casi) completa de un sobrenadante de gota, aquí sobrenadante de cultivo o disolución nutriente después de la incubación bacteriana directamente en un portamuestras MALDI, según principios de la presente divulgación, diagrama inferior B, y por lo tanto también la eliminación de contaminaciones, por ejemplo, componentes del medio nutriente o sales que pueden interferir en la medición subsiguiente, conduce a una calidad mejorada de los datos de medición en forma de intensidades más altas de las señales iónicas, así como una relación señal respecto a ruido mejorada.
Con respecto a una determinación de la susceptibilidad antibiótica (antibiótico de cefalosporina: ceftazidima) de las bacterias gramnegativas examinadas, el procedimiento de contacto según la invención y el procedimiento sin contacto del estado de la técnica proporcionaron resultados coincidentes después de 4 h/4,5 h/5 h de incubación en comparación con un procedimiento de microdilución de disolución nutriente habitual (20 h de incubación) al 95 %/100 %/100 %, o bien 93 %/93 %/92 %, lo que subraya el gran beneficio de estos procesos.
Además de las realizaciones explicadas de modo ejemplar, también son concebibles otras formas de realización de la invención. Con el conocimiento de esta divulgación, para el especialista es posible diseñar sin más otros procedimientos ventajosos para el tratamiento de muestras para una medición espectrométrica infrarroja o espectrométrica de masas utilizando un procedimiento de ionización de desorción, que debe estar cubierto por el alcance de protección de la patente. reivindicaciones incluyendo posibles equivalentes.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para el tratamiento de muestras en un portamuestras, que presenta las etapas:
- provisión del portamuestras, que comprende una disposición de gotas de líquido aisladas, cada una de las cuales encierra sedimentos de microorganismos,
- provisión de una placa de un material absorbente,
- descenso perpendicular de la placa sobre el portamuestras de tal manera que los sedimentos de microorganismos y la placa se toquen, absorbiéndose las gotas de líquido por el material absorbente,
- elevación de la placa localmente enriquecida con gotas de líquido del portador de muestras, con lo cual se descubren los sedimentos de microorganismos empobrecidos en líquido y
- preparación de los sedimentos de microorganismos descubiertos para una medición espectrométrica.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la placa presenta un material absorbente hinchable y se hace descender hasta una pequeña distancia sobre el portamuestras, de modo que un sobrenadante de gotas entra en contacto con la placa y es absorbido por esta, hinchándose localmente el material absorbente en los puntos del líquido de gotas absorbido y entrando en contacto con los sedimentos de microorganismos.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la placa se coloca directamente sobre el portamuestras y se presiona suavemente, de modo que la disposición y la placa estén en contacto en toda la superficie.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el portamuestras y/o la placa están ajustados por resorte entre sí, de modo que la presión excesiva aplicada al presionar es absorbida por el sistema de resorte.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un área de placa orientada hacia el portamuestras se humedece ligeramente antes del descenso para acelerar la absorción de líquido de las gotas.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la placa presenta fibras absorbentes de celulosa y/o fibras vegetales.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que un volumen de gota corresponde aproximadamente a uno hasta doce microlitros.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los sedimentos de microorganismos se disponen en gotas de líquido de disolución nutriente o líquido de lavado.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que se mezcla una sustancia antimicrobiana con la disolución nutriente.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la preparación de los sedimentos de microorganismos descubiertos va seguida de una medición espectrométrica infrarroja o de masas del portamuestras.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que se establece un tiempo breve entre la elevación de la placa y la preparación para permitir que se seque una película de líquido residual que quede eventualmente sobre los sedimentos de células de microorganismos.
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