BRPI0809040A2 - Detecção e indentificação de microorganismos em membranas permeáveis transparentes. - Google Patents
Detecção e indentificação de microorganismos em membranas permeáveis transparentes. Download PDFInfo
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Classifications
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICROORGANISMOS EM MEMBRANAS
PERMEÁVEIS TRANSPARENTES
Referência cruzada com pedidos relacionados O presente pedido reivindica prioridade ao pedido 5 provisional US número de série 60/896.321 intitulado "Detection and identification of microorganisms on transparent permeable membranes", que é incorporado aqui a título de referência na íntegra.
Antecedentes da Invenção I. Campo da invenção
A presente revelação refere-se genericamente ao campo de biologia e em particular ao campo de rapidamente detectar, identificar e enumerar microcolônias de microorganismos.
2. Descrição da técnica anterior
A análise microbiológica moderna se baseia em duas tendências principais: 1) análise sem crescimento preliminar e 2) análise após esse crescimento preliminar. A primeira tendência inclui um grupo de alguns métodos imunológicos [por exemplo, imunofluorescência,
radioimunoensaio, Enzyme ImmunoAssay (EIA) para célula única]; um grupo de métodos baseado em análise de DNA/RNA através de Reação de cadeia de Polimerase (PCR); e um grupo de métodos de Citometria de fluxo [detecção de célula única 25 após rotulação por anticorpos fluorescentes ou substratos fluorogênicos]. Substratos artificiais são utilizados também para detecção e análise de células por meio microscópico. Não obstante, alguns desses métodos (PCR e imunologia) não são disponíveis para a detecção de células 3 0 vivas. Citometria de Fluxo em combinação com substratos artificiais (principalmente fluorogênicos) é capaz de detectar células vivas, porém é muito caro, e requer especialistas altamente versados em laboratório bem como amostras concentradas. Ainda assim um método rápido, barato e eficaz para detecção e identificação de células vivas em amostras médicas, biotecnológicas, alimentícias, agrícolas, farmacêuticas, ambientais e militares, diferentes, é ainda importante para muitas necessidades humanas. E os testes frequentemente utilizados que utilizam células em microbiologia [cromatografia de ácidos graxos, Ensaio Imunossorvente ligado por enzima (ELISA), espectrometria de massa, espectroscopia infravermelho de transformação Fourier (FTIR) e imunonálises] todos requerem crescimento preliminar de uma colônia de micróbios, que representa pelo menos uma cultura de célula inicial demorada antes que detecção e identificação possam ocorrer.
Apesar dessas alternativas de alta tecnologia, o crescimento regular em uma placa de Petri é ainda o método mais comum utilizado para detectar microorganismos presentes em uma amostra. Uma análise típica executará várias diluições de 10 vezes de uma amostra seguida pela aplicação de um mililitro da amostra diluída distribuída uniformemente sobre a superfície de um ágar nutriente. A quantidade de diluições de 10 vezes pode estar normalmente em qualquer faixa, por exemplo, 1 a 12, com cada diluição em uma faixa específica sendo revestida em uma placa de Petri para encontrar uma diluição apropriada para contar colônias microbianas. Entretanto, isso poderia exigir possivelmente vários até uma dúzia ou mais placas de Petri. Na prática, a diluição correta é encontrada quando o número de colônias bacterianas em uma placa contável não excede 250, como recomendado pela FDA. Para obter esse número, placass inoculadas são incubadas aproximadamente 24-48 horas para bactérias e 72-120 horas para fungos. Desse modo, um período de tempo relativamente longo é necessário para formar colônias facilmente visíveis a olho nu. Entretanto, se a amostra pertence a um incidente bio-risco sensível a tempo, ou um paciente hospitalar em tratamento crítico, então o tempo é da essência e incubação demorada e teste serial pode ser uma carga substancial com conseqüências potencialmente de ameaça à vida.
Colônias que aparecem em meios de nutriente sólido são simplesmente contadas para detecção e enumeração de crescimento microbiano total ou são removidas e analisadas de acordo com procedimentos microbiológicos tradicionais, espectrometria de massa, espectroscopia FTIR,
cromatografia, imunoensaios ou PCR.
A remoção de uma colônia suspeita e análise subsequente daquela colônia por métodos tradicionais longos e incômodos ou métodos e instrumentos de alta tecnologia complicados e caros levou à invenção de meios de nutrientes CHROMãgar™ contendo substâncias especiais, substratos e antibióticos que permitem crescimento e coloração específica simultânea de colônias de interesse. O CHROMãgar ™ Candida, CHROMágar™ 0157, CHROMágar™ Salmonella, CHROMãgar™ S. aureus e alguns outros são atualmente utilizados para identificação de colônias de interesse por cor rosa, verde ou azul. As substâncias que iniciam coloração são coletadas nos corpos celulares, o que causa problemas de crescimento. Portanto, colônias são atipicamente pequenas e muito frequentemente necessitam de incubação prolongada. Somente colônias de tamanho regular podem ser detectadas porque a cor é fraca, e pequena absorção de luz é inútil para microscopia. Isso significa que microcolônias (estágio inicial de formação de colônia) não podem ser detectadas com o uso de CHROMágar™. Somente espécies de interesse e algum número de outras espécies podem crescer em CHROMágar™. Portanto CHROMágar™ é inútil para a detecção e numeração microbiana abrangente (Organismos viáveis totais) que é mais comumente utilizado em microbiologia.
No geral, o crescimento em placas de Petri é uma operação microbiológica típica utilizada em laboratórios médico, industrial, biotecnológico, de pesquisa e farmacêutico. No mundo inteiro, centenas de milhares de análises são realizadas por esses métodos anualmente. Desse modo, há uma enorme demanda para um produto e procedimento mais eficiente, eficaz em termos de custo, preciso e conveniente para permitir detecção, identificação e enumeração para micróbios .
Sumário da Invenção
A presente revelação provê uma ou mais modalidades de um aparelho, um método e um material que superem as limitações da técnica anterior. Em particular, a presente revelação realiza isso com um dispositivo para detectar, identificar ou enumerar microorganismos que inclui um recipiente de meios para fornecer nutrientes para manter o crescimento de microorganismos e um elemento poroso, ou membrana porosa em contato com os meios de nutriente. 0 próprio elemento poroso permite que meios nutrientes passem através do mesmo para manter crescimento tanto para colônias de tamanho regular, tradicionais, como micro colônias (juntas denominadas "colônias"). E o elemento poroso é transferível a partir do recipiente para outros locais para subsequente processamento através de indicadores e inspeção visual adicional.
Como as colônias são transferíveis através do elemento poroso, os estágios de crescimento e indicador para as células e microcolônias podem ser segregados para resultados ótimos: o estágio de crescimento para crescimento rápido de células sem indicadores prejudiciais no mesmo que retardem crescimento, e o estágio indicador para coloração dedicada e identificação que permitem efetivamente que microcolônias de tamanho menor sejam detectadas rapidamente. Além disso, se as células forem avaliadas em um estágio inicial em tamanhos principalmente de microcolônia, porque podem ser eficazmente detectados com a presente invenção, então diluição serial é bem menos necessária. Desse modo, a presente invenção supera as limitações da técnica anterior que exigem essencialmente colônias de tamanho regular tradicionais de incubação prolongada, por exemplo, através de CHROMãgar, após diluição serial para evitar que as colônias excedam em crescimento umas às outras . Com um número menor de diluições ou nenhuma diluição necessária para a presente invenção, os resultados chegam mais rápido e recursos de laboratório são conservados. Em particular, o elemento poroso pode ser movido, juntamente com as colônias no elemento poroso ou nos meios nutrientes, localizados, superior ao elemento poroso, para etapas de processamento subsequentes para uma ampla faixa de tratamentos incluindo processamento indicador bioquímico ou enumeração de detecção visual manual ou automatizada, e análise de formato (diferenciação por formato) das microcolônias coloridas, que são facilmente visíveis sob um microscópio de luz padrão. Para permitir que a amostra seja inoculada no meio ou no elemento poroso, o elemento poroso tem uma propriedade que permite que a porção líquida da amostra seja comunicada através do mesmo para baixo no recipiente. Então, para promover crescimento de células retidas da amostra, o elemento poroso tem uma propriedade que permite que os nutrientes do meio sejam comunicados através do mesmo para as células. A seguir, para permitir que as células sejam processadas com indicador, o elemento poroso tem uma propriedade que permite que um indicador bioquímico como corantes diferentes ou conjugados de anticorpo sejam comunicados através do mesmo para as células, enquanto mantém a integridade de microcolônia e célula na membrana porosa sem dissolver ou retirar por lavagem as microcolônias. Finalmente, para permitir que as células e microcolônias sejam inspecionadas, o elemento poroso tem uma propriedade visual de transparência.
Existem duas modalidades diferentes de posicionamento de elemento poroso no meio. Em uma primeira modalidade, o elemento poroso é disposto no topo da camada de meio e não é coberto com nenhum meio subsequente. Para efetuar transporte de células, a membrana porosa nessa modalidade não tem porosidade maior do que a menor célula que se deseja avaliar para reter as células acima do elemento poroso. Desse modo, quando o elemento poroso é removido do meio para ser transportado para processamento subsequente, as células e colônias acompanham o elemento poroso intacto. Essa primeira modalidade é útil para análise fluorescente porque o próprio elemento poroso não tem fluorescência de segundo plano. Em uma segunda modalidade, o elemento poroso é disposto no topo da camada de meio e é subsequentemente coberta com meio adicional. Nessa modalidade, as células e microcolônias residirão no topo do meio adicional, e desse modo o elemento poroso pode ter tamanhos de poro maiores do que a célula menor porque as células e microcolônias são retidas na superfície superior do meio adicional, superior ao próprio elemento poroso. Consequentemente, quando o elemento poroso é retirado do recipiente, leva o meio adicional acima do elemento poroso, juntamente com microcolônias que residem naquele meio adicional. A segunda modalidade é útil para coloração absorvente de luz de micro colônias, porém, não detecção fluorescente porque o próprio meio nutriente tem uma quantidade elevada de fluorescência de segundo plano.
Para fornecer teste conveniente, um sistema de kit de teste inclui um recipiente de meio para fornecer nutrientes a fim de promover crescimento de microorganismos; uma membrana permeável; e um meio secundário escolhido do grupo que consiste em: agarose, carragenana, gelatina ou outros géis capazes de ser o veículo com a capacidade de liberar moléculas indicadoras, como substratos cromogênicos, substratos fluorogênicos ou anticorpos marcados com rádio ou fluorescentes.
No geral, a presente invenção provê um meio e aparelho muito mais rápido, mais eficaz, mais barato e mais robusto para: detecção de número total de microcolônias ou microorganismos viáveis (TVO) por microcolônias intensamente coloridas; diferenciação de um tipo de microcolônia de outro pelo formato facilmente visível de microcolônias, que são semiespecíficos para espécie ou grupo de espécies; detecção e identificação de microcolônias de microorganismos resistentes a antibióticos; identificação por uso de anticorpos imunofluorescentes ou radioimunomarcados; e detecção, diferenciação e/ou identificação por meio absorvente de luz ou por meio fluorescente. Esses e outros objetivos e vantagens da presente revelação tornar-se-ão evidentes para aqueles com conhecimentos comuns na técnica após ter lido a seguinte descrição detalhada das modalidades preferidas, que são também ilustradas nas várias figuras dos desenhos.
Breve Descrição das Várias Vistas dos Desenhos
Os desenhos incluídos com o presente são incorporados em e formam uma parte desse relatório descritivo. Os desenhos ilustram modalidades da invenção e juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção. Deve ser entendido que os desenhos mencionados nessa descrição não são traçados em escala a menos que especificamente mencionado como tal.
A figura 1 é um diagrama de blocos funcional que ilustra a relação espacial e funcional para duas modalidades da porosidade e elemento estrutural e elemento de meio de crescimento para avaliar uma amostra com células em solução, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
A figura 2A é um recipiente de meio ágar com múltiplos elementos de filtração no mesmo, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
A figura 2B é uma vista em seção transversal de múltiplas modalidades do meio e elemento de filtração mostrando relações espaciais, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
A figura 3 é uma ilustração dos componentes e etapas para um kit de detecção de células para detectar microcolônias pelo uso de meio e um elemento poroso transportável, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
A figura 4 é uma imagem anotada de uma cultura em um recipiente de meio ágar tendo múltiplos elementos porosos no mesmo juntamente com um meio secundário separado para coloração, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
As figuras 5A até 5H são fotomicrografias de várias espécies diferentes do gênero Bacillus identificado utilizando o elemento poroso transferível e o meio
2 0 secundário separado, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
A figura 6 é uma fotomicrograf ia de uma espécie do gênero Listeria identificado utilizando o elemento poroso transferível e o meio secundário separado, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
A figura 7 é uma fotomicrograf ia de uma espécie do gênero Staphylococcus identificado utilizando o elemento poroso transferível e o meio secundário separado, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
A figura 8 é uma fotomicrograf ia de uma espécie do gênero Escherichia identificado utilizando o elemento poroso transferível e o meio secundário separado, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
A figura 9 é uma fotomicrograf ia de uma espécie do gênero Pseudomonas identificado utilizando o elemento poroso transferível e o meio secundário separado, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
A figura 10 é um fluxograma do processo para detectar e identificar células e microcolônias, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
Descrição Detalhada da Invenção
Será feita agora referência em detalhe às modalidades preferidas da invenção. Os exemplos da modalidade preferida são ilustrados nos desenhos em anexo. Embora a invenção seja descrita em combinação com as modalidades preferidas, entende-se que as mesmas não pretendem limitar a invenção a essas modalidades. Em vez disso, a invenção pretende cobrir alternativas, modificações e equivalentes, que podem ser incluídos no espírito e escopo da invenção, como definido pelas reivindicações apensas. Adicionalmente, na descrição detalhada a seguir da presente revelação, inúmeros detalhes específicos são expostos para fornecer uma compreensão completa da presente revelação. Entretanto, será evidente para uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica que a presente revelação pode ser posta em prática sem esses detalhes específicos. Em outros casos, métodos bem conhecidos, procedimentos, componentes e detalhes microbiológicos não foram descritos em detalhe de modo a não obscurecer desnecessariamente aspectos da presente 3 0 revelação. Termos e Explicações Meio de crescimento. Meio de crescimento é um meio nutriente utilizado para crescimento de microcolônias no contexto da presente invenção. Pode ser meio geral para crescimento bacteriano, como Ágar de soja tríptica, meio para crescimento de levedura e fungos, como Ágar de dextrose Sabouraud, ou meio utilizado para crescimento de grupos especiais de microorganismos, como ágar Cetrimida utilizado para crescimento de espécies Pseudomonas, ou Ágar MacConkey utilizado para revelação de patõgenos entéricos Gram-negativos. Meio de crescimento serve como um substrato sólido para um elemento poroso montado em sua superfície.
Microcolônia. Uma microcolônia é uma colônia pequena que aparece após 3-6 horas de incubação. O tamanho típico de microcolônias é 10 - 100 μπι. São incolores e invisíveis em um microscópio de luz regular. Mesmo microcolônias coloridas como Staphylococcus aureus amarelo não são normalmente visíveis em um microscópio de luz. Portanto, microcolônias necessitam tipicamente de ser coloridas para se tornarem visíveis. A maioria das espécies microbianas produz microcolônias de formato específico durante estágios iniciais de crescimento (3-6 horas). Bem frequentemente, diferenças em seu formato são tão evidentes que os analistas têm uma boa oportunidade de diferenciar espécies simplesmente pelo formato de uma microcolônia dada (vide as figuras 5A-5H e 6 - 9). Microcolônias consistem em cadeias de células que não são mecanicamente conectadas entre si. Portanto, todos os meios de crescimento e meios secundários não devem conter líquidos livres, para que as células das microcolônias dissociem umas das outras. Todos os líquidos nutrientes e substâncias dissolvidas são ligados por agarose ou outro gel polimérico.
Membrana. A membrana, ou elemento poroso, é um material importante que permite crescimento e rotulação de microcolônias para tornar os mesmos visíveis e investigar seus formatos específicos. As exigências para essa membrana são as seguintes: deve ser transparente a luz para permitir transmitância de luz quando utilizadas com um microscópio; devem ser permeáveis a água e substâncias nutrientes de meios nutrientes e substâncias indicadoras de meio secundário para alimentar microorganismos durante formação de microcolônias e subequentemente colorir essas microcolônias; devem permitir que moléculas de rotulação penetrem e reajam com células de microcolônias; devem ser não permeáveis a células (com uma exceção notável de membrana porosa com uma camada de meio superior à mesma) de modo que células crescerão somente em um lado da membrana; devem ser resistentes a enzimas celulares externas para manter a estrutura de membrana intacta e manter semipermeabilidade; devem ser autoclaváveis porque as membranas devem ser estéreis antes de uso; devem ser hidrofílicas para permitir que água e a maior parte das substâncias penetrem livremente através da mesma membranas hidrofóbicas são fortemente resistentes a esse tipo de penetração; devem ser não fluorescentes e incolores porque fluorescência de segundo plano é rigorosamente intolerável para métodos fluorescentes de análise e cor pode mascarar a cor de microcolônias; não devem conter nenhuma substância que evite ou iniba crescimento microbiano. Além disso, a membrana não deve conter partículas visíveis ou fibras como membranas de filtração têm porque partículas e fibras evitam crescimento livre de microcolônias e são capazes de mudar o tempo de crescimento e formato de microcolônias (com uma exceção notável de camada de meio superior à membrana porosa). Os experimentos mostram que o melhor polímero para essas finalidades ê celulose regenerada e seus derivados como celofane, cuprofano e membranas de diálise. Outros polímeros que mostram as mesmas qualidades podem ser utilizados. Muitos outros tipos de materiais para uma membrana podem ser utilizados como materiais orgânicos ou inorgânicos com poros de ocorrência natural, ou com poros artificialmente criados. A membrana pode ser transparente para transmitir luz para melhores resultados de visualização, porém também pode ser translúcida, ou branca ou outras cores embora tenham resultados menos desejáveis para visualização.
Meio secundário. Meio secundário é um gel, polímero ou placa BioNanoChannel™ que serve como um veículo para substâncias indicadoras ou anticorpos marcados. Sua função principal é transportar substâncias indicadoras dissolvidas em líquido (soluções de tampão ou água) ou anticorpos e transferir as mesmas através da membrana até as microcolônias por difusão simples. Géis como Ágar puro (Agarose), gelatina, carragenana, ou outros polissacarídeos apropriados com moléculas poliméricas longas podem ser utilizados para ligar líquidos e substâncias em forma semisólida. O uso de somente soluções líquidas como indicadores é normalmente evitado (com a exceção notável de BioNanoChannel) porque soluções líquidas reais penetram rapidamente na membrana e formam áreas grandes onde todas as microcolônias dissociam, perdera seu formato e então fundem juntas novamente, formando um grande grupo de células. Anticorpos marcados, entretanto, são moléculas relativamente grandes (IgG tem tamanho de aproximadamente 5 150.000 Da) e não podem ser liberados facilmente da estrutura polimérica de um gel. Nesse caso, placas BioNanoChannel podem ser utilizadas em vez dos géis mencionados. Cada placa consiste em milhões de nanocanais pequenos, cada um com um diâmetro de 10 μπι ou menos. Desse 10 modo, anticorpos marcados são milhares de vezes menores do que nanocanais e podem mover-se livremente em líquido para dentro dos nanocanais a partir de um lado da placa. Após o líquido estar nos nanocanais, entretanto, é retido por forças capilares fortes e não se move rapidamente através
da membrana e desintegra microcolônias como líquido livre o faz .
Indicadores. No campo da presente invenção, indicadores são substâncias que são capazes de específica ou não especificamente rotular microcolônias. São 20 substratos cromogênicos e/ou fluorogênicos ou suas misturas e anticorpos marcados. Substratos cromogênicos e fluorogênicos produzem substâncias fluorescentes ou absorventes de luz após uma reação com enzima específica ou não específica, ou um grupo de enzimas. Moléculas pequenas 25 desses substratos podem deixar livremente um gel, passar através da membrana, e reagir com enzimas de células vivas. Anticorpos marcados por fluorocromos ou radioisõtopos e introduzidos em uma placa BioNanoChannel podem sair livremente de nanocanais e passar através da membrana, por
3 0 exemplo, desde que a membrana seja 10A6 Da poros ou maior. Anticorpos marcados não reagidos são removidos por transferência da membrana para outra placa BioNanoChannel uma ou mais vezes.
Detecção, diferenciação e identificação. 0 termo "detecção" é genericamente entendido como significando a capacidade de revelar e contar/enumerar quaisquer microcolônias independentemente de suas classificações taxonômicas. "Diferenciação" significa a capacidade de um método utilizado para diferenciar duas ou mais espécies entre si na membrana por seu formato, cor ou comprimento de onda/cor de fluorescência. "Identificação" significa a determinação de gênero e espécie de uma dada microcolônia. Detecção necessita somente de substratos cromogênicos ou fluorogênicos. Diferenciação se baseia nas diferenças em formatos ou cores de microcolônias. Identificação requer ouso de anticorpos, preferivelmente monoclonais.
Descrição detalhada das figuras
Com referência agora à figura 1, é mostrado um diagrama de bloco funcional 10, que ilustra a relação
espacial e funcional para duas modalidades da porosidade e elemento estrutural e elemento de meio de crescimento para avaliar uma amostra com células em solução, de acordo com uma modalidade da presente revelação. A primeira modalidade utiliza uma porosidade e elemento estrutural, ou meio, 14A 25 disposto acima da superfície superior 17 do meio de crescimento 16, com a porção líquida 18B da solução de amostra 12 passando através do meio de elemento de filtração 14A e para baixo através do meio de crescimento
16 em direção à parte inferior do recipiente que contem meio de crescimento 16, enquanto a porção de célula 2OB da solução de amostra 12 é retida ou impedida de passar através do meio de elemento de porosidade 14A em virtude do tamanho de poro da membrana ser menor do que o tamanho de células desejadas a serem bloqueadas. Os nutrientes 22 do meio de crescimento 16 são passados através do meio de membrana 14 para as células 20B localizadas no topo da função do elemento de porosidade 14A.
Ao contrário da primeira modalidade, a segunda modalidade da figura 1 utiliza uma camada opcional adicional de meio de crescimento 13 superior a, ou disposto no meio de elemento estrutural e porosidade 14A. Desse modo, a porção líquida 18A da solução de amostra 12 passa através tanto do meio de crescimento de camada adicional 13 como do meio de elemento de porosidade 14A através do meio de crescimento 16, porém a porção de célula 20A da solução de amostra 12 é retida ou impedida de passar através da camada adicional do meio de crescimento 13 em virtude de que, embora o líquido possa permear o meio, as células não podem. Devido a isso, o meio de membrana 14A da segunda modalidade, não necessita atender a exigência de que porosidade seja menor do que o tamanho de célula que se deseja ser bloqueado. Em vez disso, o meio de elemento de porosidade 14A para essa segunda modalidade tem uma função primária de fornecer suporte estrutural de meio de crescimento de camada adicional 13 e células e microcolônias no mesmo para o meio de transferência 24. Uma função secundária do meio de elemento de porosidade 14A na segunda modalidade é para comunicar nutrientes 2 2 do meio de crescimento 16 para células e microcolônias localizadas na camada adicional do meio de crescimento 13 que ele próprio pode ter nutrientes para a mesma finalidade. Devido a isso, o elemento de filtração pode ser uma escola muito mais ampla de materiais e tamanho de poro para atender essa exigência estrutural e comunicação de nutrientes.
Uma função importante de meio de membrana 14A para todas as modalidades é a função de transferência, ou extração, 24 das células filtradas, retidas ou peneiradas localizadas no meio de elemento de porosidade 14A ou na camada adicional de meio de crescimento 13 disposta no mesmo, para processamento subsequente de células bloqueadas ou retidas ou microcolônias no estágio indicador 31 no elemento estrutural / porosidade alterada 14B pela interação com o indicador 23. A capacidade de transferir células viáveis e microcolônias enquanto mantém sua integridade permite que os estágios de indicador e crescimento para as células e microcolônias sejam segregados para resultados ótimos: o estágio de crescimento
21 para crescimento rápido de células sem indicadores prejudiciais no mesmo que retardaria de outro modo o crescimento, e o estágio indicador 31 para coloração dedicada e identificação que permitem efetivamente que microcolônias de tamanho menor sejam rapidamente detectadas. Além disso, se as células forem avaliadas em um estágio inicial principalmente em tamanhos de microcolônia, porque podem ser efetivamente detectados com a presente invenção, então diluição serial é bem menos necessária. Desse modo, a presente invenção supera a limitação do estado da técnica que essencialmente requer colônias de tamanho regular tradicionais de incubação prolongada, por exemplo, via CHROMágar, após diluição serial para evitar que as colônias cresçam excessivamente uma em relação à outra.
Com referência agora à figura 2A, um recipiente 202 de meio ágar 203 com múltiplas membranas 204 no mesmo é mostrado, de acordo com uma modalidade da presente revelação, para teste paralelo de uma amostra em um único recipiente. 0 recipiente 202 pode ser uma placa de Petri convencional fornecida para alojar meio nutriente 2 03 que contém somente substâncias que não evitariam ou inibiriam crescimento microbiano para promover crescimento não inibido de microcolônias para teste de resposta mais rápido em teste. Modalidades diferentes de meios 203 incluem um meio nutriente de finalidade geral sólido, ou um meio líquido ou semi-sólido, diferencial, seletivo ou meio com substâncias que somente afetam moderadamente crescimento microbiano.
0 Elemento Poroso 2 04 pode ser um elemento poroso que permite que a solução de amostra e meio nutriente passem através do mesmo. 0 elemento poroso pode ser uma membrana, uma membrana permeável, uma membrana de diálise, ou qualquer tipo de elementos de filtração existentes incluindo celulose, matéria plástica com furos, etc. 0 tipo específico de elemento poroso 204 escolhido depende de se uma camada de meio adicional é colocada sobre o mesmo. 0 elemento poroso pode ser transparente, permeável a água e permeável a substâncias nutrientes e substâncias indicadoras, porém opcionalmente não permeável a microorganismos. Em outra modalidade, o elemento poroso é uma membrana permeável que tem uma ou mais das seguintes características: é autoclavável, hidrofílico, não fluorescente, incolor, resistente a enzimas celulares secretadas, e tem poros regulares ou não regulares na faixa de: 1000-10^7 Daltons (Da) . O material do elemento poroso pode ser selecionado do grupo que consiste em: celulose 5 regenerada, celofane, cuprofano, membrana de diálise, e outro material que tem poros de tamanho apropriado e que atende a outras propriedades mencionadas aqui. É sabido que membranas de diálise são altamente permeáveis para substâncias/moléculas de certo tamanho, como os nutrientes 10 necessários para cultivar microorganismos. Poros de uma membrana de diálise podem variar de 1.000 a várias centenas de milhares Da (Daltons). O tamanho grande de poros permite que muitas substâncias sejam transferidas através da membrana. Entretanto, polímeros com moléculas grandes, como 15 o polímero de galactose em ágar de galactose utilizado em meio sólido microbiolõgico, não podem penetrar em membranas de diálise. Os experimentos mostram que microorganismos podem crescer na superfície de uma membrana de diálise quando a membrana é colocada no topo do meio de nutriente
2 0 sólido devido à fácil penetração de nutrientes através da
membrana para células em crescimento. Membranas de diálise em uma superfície de meio nutriente sólido ou instaladas em uma camada de ágar permitem transferência de colônias ou microcolônias que aparecem em sua superfície para outra superfície cheia de substâncias indicadoras.
Em outra modalidade o elemento poroso pode ser uma ampla variedade de elementos de filtro regular fornecidos principalmente para funções de comunicação de fluido e estrutural e não para uma função de retenção ou bloqueio de
3 0 células, cuja função é, em vez disso, executada por camada de meio adicional no topo do elemento de filtro como fornecido exclusivamente pela primeira modalidade da figura 1 .
Com referência agora à figura 2B, é mostrada uma vista em seção transversal 200 de múltiplas modalidades do meio e elemento poroso mostrando relação espacial, de acordo com uma modalidade da presente revelação. A seção transversal A-A ilustra um elemento poroso 204A simplesmente disposto no topo do meio nutriente sólido 206A, permitindo a fácil capacidade de transferência de estágio de crescimento no meio nutriente sólido 206A, porém possivelmente prejudicando uma aplicação uniforme de células da amostra sobre a superfície superior do elemento poroso. Ao contrário, a seção transversal A-A' da modalidade alternativa provê uma cavidade 210 na camada superior do meio nutriente sólido com uma profundidade suficiente para permitir recesso do elemento poroso 204B de zero até algum valor nominal 208, por exemplo, 0,1 - 5 mm, abaixo da superfície de meio nutriente sólido, desse modo fornecendo uma cavidade rasa na qual a amostra pode ser pipetada e espalhada com garantia de uma área superficial controlada. A cavidade 210 pode ser formada por um elemento quente no formato da cavidade, por moldagem do meio nutriente líquido em torno de um espaçador temporário no formato da cavidade que é removido após solidificação do meio. A seção transversal B-B fornece uma modalidade onde uma primeira porção de meio nutriente sólido é depositada então solidificada, seguido por colocação do elemento poroso 204C, seguido por uma segunda camada de meio nutriente 206C que cobre o elemento poroso em uma profundidade de camada de 212, deixando uma interface de emenda não visível 214 entre a primeira e segunda camada de meio nutriente 2 0 6B e C. A presente invenção é bem adequada para uma ampla variedade de métodos e procedimentos para colocar elemento poroso em ou dentro de meio nutriente.
Com referência agora ã figura 3, uma ilustração dos componentes e etapas para um kit de detecção de células 3 00 para detectar microcolônias utilizando meio e um elemento poroso transportável é mostrado, de acordo com uma modalidade da presente revelação. 0 elemento poroso 204D-1, após ser removido do recipiente 202 que contém meio de crescimento no estágio de crescimento 321, é transferido para o meio secundário 3 02 com substância indicadora no estágio indicador 331 que potencialmente altera as células e microcolônias no elemento poroso 204D-2. Em uma modalidade, duas ou mais etapas indicadoras são utilizadas para satisfazer um protocolo para indicar uma célula ou microcolônia desejada, por exemplo, segunda etapa indicadora utilizando meio 3 03 que transfere adicionalmente a substância indicadora para modificar potencialmente células ou microcolônias no elemento poroso 204D-3. 0 meio secundário é escolhido do grupo que consiste em: agarose, carragena, gelatina e um gel capaz de ser o veículo com a capacidade de liberar moléculas indicadoras. Em outra modalidade, o sistema de kit de teste provê uma concentração de gel em uma faixa de aproximadamente 0,1% 10% em um solvente de água, tampão, solução de cloreto de sódio ou meio nutriente líquido. 0 indicador para microcolônias pode ser um substrato cromogênico, substrato fluorogênico ou anticorpos marcados com rádio ou fluorescentes. Por exemplo, meio secundário pode ser ágar puro cheio de brometo de metil triazol tetrazólio (MTT), que colorirá as microcolônias violeta escuro. Células/microcolônias não coloridas são essencialmente 5 invisíveis no microscópio. Muitas outras substâncias podem ser utilizadas para detecção e diferenciação de microorganismos, incluindo aquelas que são tóxicas para células e limitam o crescimento. Muitos métodos rápidos e simples de detecção e identificação podem ser transformados 10 para serem utilizados com esse método.
Após processar com material indicador e processos, um elemento poroso final 204D-5 com microcolônias apropriadamente coloridas 322A e 322B pode ser visualmente observado e contado, por exemplo, sob um microscópio de luz 15 ou utilizando uma identificação de imagem de software e hardware automatizado, reconhecimento e sistema de enumeração com ampliação. A grade opcional 324, feita por impressão ou geometricamente formada por marcação ou gravação, desse modo fornecendo uma referência de contagem
2 0 conveniente ou métrica para fixar a área de superfície
contada para chegar em uma população de microcolônia final.
Em um ensaio alternativo, colônias e microcolônias podem ser identificadas com anticorpos marcados com corantes fluorescentes. Esse ensaio pode ser realizado, em 25 uma modalidade, utilizando um dispositivo de detecção BioNanoChannel ("BNC") 33 0 como o veículo para o anticorpo. Nesse caso, anticorpos são fornecidos na solução líquida dentro do nanocanal, sobre o qual é colocado o elemento poroso com as colônias. 0 topo do BNC provê suporte para o
3 0 elemento poroso 204D-4 para manter integridade e coesão de colônias existentes, enquanto permite discretamente que as moléculas grandes de anticorpos flutuem no nanocanal e sejam comunicadas para quaisquer colônias no elemento poros 204D-4, diretamente suspenso no topo do canal aberto. Uma membrana porosa com poros suficientemente grandes, por exemplo, 1Λ6 Da ou maiores ou como apropriado para o anticorpo específico que se deseja seja transferido para uma colônia. Somente a colônia apropriada (antígeno) reagirá quando o anticorpo entra em contato com ele. Anticorpo rotulado em excesso presente no elemento poroso pode ser removido por transferência, uma ou mais vezes, do elemento poroso para outro BNC tendo solvente ou tampão sem moléculas fluorescentes. Ao contrário, as moléculas de anticorpo grandes não teriam motilidade em ágar ou gel porque seu tamanho grande as impediria. Além disso, a colocação do elemento poroso diretamente sobre um recipiente aberto de meio líquido com anticorpos não manteria a integridade das colônias, visto que a membrana se tornaria saturada, inundada ou retirada por lavagem pelo fluido, desse modo dissolvendo e deslocando as colônias. Desse modo, o uso da membrana porosa transferível da presente revelação em combinação com uma placa BNC, que fornece suporte para a membrana porosa e um mecanismo de fornecimento para o anticorpo rotulado, provê uma solução muito eficaz que supera as limitações da técnica anterior.
0 BNC é uma placa que contém uma multiplicidade de microcanais cilíndricos e paralelos abertos de uma ou das duas extremidades, e tendo um diâmetro de microcanal de aproximadamente 1-3 0 μιιη com um comprimento de aproximadamente 100-1000 μτη e um número de microcanais por centímetro2 de aproximadamente 100.000 - 1.000.000, de comprimento (diâmetro/comprimento = 1/10 - 1/100). Detalhes adicionais e descrições do aparelho de BioNanoChannel e métodos são fornecidos no pedido de patente US 5 copertencente número de série 11/109.857 de Sergey Gazenko, intitulado "Device for rapid detection and Identification of single microorganisms without preliminary growth", o referido pedido é incorporado aqui a título de referência na íntegra.
Com referência agora à figura 4, uma imagem anotada
4 00 de uma cultura em um recipiente de meio ágar tendo múltiplos elementos porosos no mesmo juntamente com um meio secundário separado para coloração é mostrada, de acordo com uma modalidade da presente revelação. 0 recipiente de
placa de Petri 202A de meio nutriente com múltiplo elemento poroso como 204E e uma cultura sobre o mesmo ilustra o sucesso do crescimento de microcolônia no estágio de crescimento 421 bem como a clareza do elemento poroso e a facilidade de transferência do elemento poroso 204F para o
recipiente 302 no estágio indicador 431 com meio de indicação secundário no mesmo, cujo indicador executa claramente as microcolônias escurecidas, de outro modo, difíceis de serem detectas no estágio indicador de recipiente de meio somente nutriente 202A.
2 5 Com referência agora às figuras 5A até 5H
fotomicrografias de várias espécies diferentes do gênero Bacillus identificado utilizando o elemento poroso transferível e meio secundário separado são mostrados, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
3 0 Com referência agora à figura 6, uma fotomicrograf ia de uma espécie do gênero Listeria identificado utilizando o elemento poroso transferível e meio secundário separado é mostrada, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
Com referência agora à figura 7, uma fotomicrografia
de uma espécie do gênero Staphylococcus identificado utilizando o elemento poroso transferível e meio secundário separado é mostrada, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
Com referência agora à figura 8, uma fotomicrografia
de uma espécie do gênero Escherichia identificado utilizando o elemento poroso transferível e meio secundário separado é mostrada, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
Com referência agora à figura 9, uma fotomicrografia
de uma espécie do gênero Pseudomonas identificado utilizando o elemento poroso transferível e meio secundário separado é mostrada, de acordo com uma modalidade da presente revelação.
Com referência agora à figura 10, um fluxograma 1000
do processo para detectar e identificar colônias, incluindo microcolônias e colônias regulares, é mostrado de acordo com uma modalidade da presente revelação. Para começar, a etapa 10 02 provê um recipiente de meio nutriente tendo um 25 elemento poroso disposto no topo de, ou abaixo, da superfície do meio nutriente, como mostrado na figura 2B. Subsequentemente, na etapa 10 04 a amostra líquida é derramada, ou pipetada no recipiente em uma área acima do elemento poroso. A amostra pode ser tratada como uma
3 0 amostra de placa de espalhar a ser espalhada através da placa de Petri inteira, ou pode ser concentrada somente no elemento poroso, por exemplo, como mostrado na seção transversal A-A' onde o elemento poroso 204B é rebaixado na cavidade 210, desse modo limitando a amostra a ser exposta 5 somente ao elemento poroso 204B. A seguir na etapa 1006, os microorganismos são retidos ou bloqueados no elemento poroso ou alternativamente, em uma camada de meio adicional no topo do elemento poroso, o último mostrado em seção transversal B-B da figura 2B. A etapa 1008 provê incubação 10 para desenvolver microcolônias, embora muito mais curta do que uma incubação da técnica anterior típica para colônias de tamanho regular, embora a última seja outra modalidade da presente revelação. Na etapa subsequente 1010 o elemento poroso, e qualquer meio acima do mesmo, são transferidos do 15 recipiente com meio nutriente para outro meio com indicador para fins de ensaiar para detecção e/ou identificação de microorganismos. Na etapa 1012 uma investigação determina se etapas indicadoras adicionais são necessárias. Se forem, como é frequentemente o caso, a etapa 1010 é repetida, 2 0 porém mais provavelmente com um agente indicador novo ou complementar. Ou, a etapa 1014 provê uma etapa final de examinar formato ou cor de colônias para detectar, identificar ou enumerar microcolônias apropriadas.
Exemplos
2 5 A detecção de número total de microorganismos viáveis
(TVO) é um dos procedimentos de laboratório mais necessários no mundo. Mostra a presença e nível de contaminação microbiana na indústria alimentícia, biotecnológica, ambiental e outras. Um TVO regular é realizado fazendo várias diluições de 10 vezes (3-12) de uma amostra em tampão, meio nutriente líquido, ou 0,9% de solução NaCl e então espalhando um mililitro de cada diluição na superfície de placas de Petri regulares cheias de um ágar de nutriente apropriado. As placas são incubadas 5 24-48 horas a 32-37°C. Após isso as placas são removidas do incubador e colônias são enumeradas. Esse procedimento necessita 3-12 tubos para diluições, 3-13 placas de Petri, e incubação de longo prazo. Os resultados aparecem somente após 24-48 horas. Esse procedimento simples é repetido 10 centenas de milhões de vezes no mundo inteiro anualmente. O método da presente revelação, descrito aqui é muito mais rápido (3-6 horas), não requer diluições de 10 vezes, e necessita somente de 1-2 placas com membranas préinstaladas. A instalação das membranas é feita por colocar 15 várias membranas de diálise de formato redondo, esterilizadas (121°C, 15 min.) (tamanho de poro 12.000
18.000 Da) na superfície de ágar nutriente solidificado em uma placa de Petri. Outras membranas com um tamanho de poro diferente ou membranas de celofane podem ser utilizadas
2 0 também. A superfície inteira da placa com membranas é então coberta por meio nutriente sólido quente (80-90°C) por 1-2 segundos; o meio em excesso não solidificado após 1-2 segundos é despejado para fora. Isso significa que todas as membranas serão cobertas por uma camada delgada (0,1 - 0,2
2 5 mm) de meio nutriente. A camada superior tem uma permuta
livre com o meio inferior, significando que toda água e substâncias nutrientes exceto o Agarose de polímero podem ser transferidas entre as duas camadas.
0 procedimento, de acordo com a presente invenção, é o
3 0 seguinte: um mililitro de amostra é transferido para e espalhado sobre a superfície da placa de Petri com membranas instaladas (figura 2) . Líquido da amostra é absorvido no meio, a placa é incubada, e células vivas, se houver, começam o crescimento e formação de microcolônia.
5 Os experimentos mostram que todas as bactérias investigadas formam microcolônias em 5 horas a 35-37°C. Essas microcolônias consistem em várias dezenas a várias centenas
I
de células essencialmente invisíveis e não coloridas. Para colorir as mesmas, a membrana é desprendida da placa 10 utilizando fórceps estéril e é transferida para um meio secundário. 0 meio secundário, de acordo com um método padrão, é 1% de agarose puro em 0.15M de tampão fosfórico, pH 7,5 com substrato cromogênico brometo de 3-(4,5-dimetil tiazolil-2)-3,5-difenil tetrazõlio em concentração 0,7 mg 15 por ml. Esse substrato levemente amarelo tem a capacidade de se tornar violeta escuro após uma reação com desidrogenases de células vivas. Essa substância tem a capacidade de alterar a cor de todas as leveduras e bactérias aeróbicas e anaeróbicas conhecidas, porque reage 20 com a etapa final da cadeia de elétron-transporte de microorganismos. Em outras palavras, não bloqueia o início ou parte média da cadeia de respiração, que pode levar à morte celular prematura. Desse modo, um produto de cor é coletado em grandes concentrações na superfície de 25 mesosomas celulares (local de desidrogenases dentro das células), transmitindo uma cor violeta escura, ou preta, para os corpos celulares. O tempo necessário para colorir microcolônias está tipicamente na faixa de 10-20 min a 30- 40°C. Esse tempo é suficiente para liberar as moléculas do
3 0 substrato e permitir que as mesmas penetrem na membrana e camada fina de meio nutriente sólido por difusão e reajam com desidrogenases. Após término da reação, a placa com meio secundário e microcolônias coloridas é colocada sob um microscópio de luz e microcolônias são enumeradas. O 5 tamanho e formato de microcolônias podem ser uma característica adicional para diferenciação de espécie (figura 5.1-5.8).
Esse método necessita somente 5-6 horas e muito menos material e manipulação do que o método da técnica anterior.
É importante observar que o presente exemplo não necessita inúmeras diluições de 10 vezes, porém somente 1-2 diluições no caso de uma concentração extremamente elevada. Essa conveniência é possível devido ao tamanho relativamente pequeno de microcolônias: a concentração de células em uma
amostra pode ser milhões por mililitro, porém todas as microcolônias crescerão separadamente sem sobreposição porque o quadrado do tamanho de uma microcolônia é milhares de vezes menor do que o quadrado do tamanho de uma colônia regular.
2 0 Modalidade fluorescente
Membranas utilizadas no presente método são feitas de celulose regenerada, que é material transparente e não fluorescente. Não obstante, o próprio meio nutriente contém substâncias altamente fluorescentes. Isso limita o uso de
2 5 uma camada fina de meio nutriente acima do elemento poroso,
ou membrana, como foi descrito em uma modalidade. A membrana recomendada nesse caso é uma membrana de diálise de 100.000 Da. 0 tamanho relativamente grande de poros nessa membrana permite crescimento satisfatório de
3 0 microcolônias mesmo sem a camada fina de meio acima delas. O aumento de umidade também é útil nessa modalidade porque cria condições mais favoráveis (microclima) para formação de microcolônia. Após 5-6 horas de crescimento, a membrana é removida para um meio secundário cheio de um ou mais 5 substratos fluorogênicos. Para detecção de TVO, uma mistura recentemente preparada de fosfato de 4-metilumbeliferila e acetato de 4-metilumbeliferila em uma concentração de 0,1 mg por mL de Acetona é utilizada. Essa mistura é derramada na superfície de um meio secundário (Agarose a 1% em água 10 destilada) por vários minutos antes da membrana que contém microcolônias ser montada acima. A incubação demora 10-15 minutos a 35-40°C. Todas as microcolônias obtêm fluorescência azul que é muito visível em um microscópio fluorescente porque a mistura de substratos utilizados 15 reage com um número grande de fosfatases e esterases presentes em todas as células vivas. A membrana não fluorescente transparente a luz permite uso de um microscópio fluorescente barato com luz UV de excitação (por exemplo, comprimento de onda de 350-380 nm) dirigida 2 0 da parte inferior para o topo, embora microscópios epifluorescentes caros também possam ser utilizados.
Modalidade imunofluorescente: identificação A identificação de microorganismos por anticorpos marcados com fluorocromos (FITC, Fluoresceína, Rodamina, ou outro) pode ser executada pelo uso do elemento poroso, ou membrana, sem uma camada de meio nutriente sólido acima. As imunoglobulinas utilizadas como anticorpos são um complexo molecular de proteína muito grande. Por exemplo, a imunoglobulina G frequentemente utilizada (IgG) é em torno de 150.000 Da. Tal complexo grande deve ser capaz de passar através da membrana e reagir (interação de anticorpoantígeno) com os antígenos de superfície expressos de células. Portanto, o tamanho de poros de membrana é maior, por exemplo, 10a6 Da ou maior.
Para executar o método, uma amostra, contendo células
vivas de espécies diferentes, incluindo espécie alvo, é espalhada sobre a superfície da membrana. O líquido é embebido no meio de crescimento de ágar e a placa é incubada 5-6 horas a 35-370C em condições altamente úmidas 10 para formar microcolônias. Após isso, a membrana com microcolônias em sua superfície é colocada sobre uma placa BioNanoChannel cheia de uma solução que contém anticorpo rotulado complementar a microorganismos alvo (por exemplo, IgG-FITC). Moléculas de anticorpo rotulado flutuam 15 livremente dentro de nanocanais, cada nanocanal tendo um diâmetro de 10 μΜ e comprimento de 500 μΜ. Em torno de 2,5 milhões de nanocanais cobrem a placa BioNanoChannel, que tem um diâmetro de 25 mm. Desse modo, a solução com anticorpos é "retida" dentro de uma coleção maciça de
2 0 canais de vidro minúsculos. Isso é importante para evitar áreas úmidas com líquido extra que podem dissolver microcolônias e misturar células alvo com células de outras espécies. O uso de uma placa BioNanoChannel também é importante porque permite que as moléculas de IgG grandes 25 vagueiem livremente, ao passo que o Agarose utilizado em outras modalidades (aquelas para moléculas pequenas) não seria capaz de liberar IgG de sua estrutura polimérica.
As moléculas de IgG rotulado atingem todas as microcolônias por difusão e reagem com antígenos alvo. Esse processo pode demorar 0,5 - 1,0 hora em temperatura ambiente. Moléculas não reagidas podem ser removidas por colocar a membrana em outra placa BioNanoChannel™ cheia de solução de lavagem (PBS, pH 7,5) por 10 - 2 0 minutos. Após isso, a membrana com microcolônias rotuladas e não 5 rotuladas (fluorescente e não ou fracamente fluorescente) é colocada sob um microscópio fluorescente e microcolônias fluorescentes (alvo) são detectadas e enumeradas.
A detecção, identificação e/ou reconhecimento de formato de microcolônia podem ser realizados pelo operador 10 utilizando um método visual ou pelo uso de identificadores de imagem. Tipos diferentes de identificadores de imagem atualmente sendo utilizados se baseiam em câmeras CCD e programas de identificação de imagem de computador e são combinados com um microscópio e computador para criar uma 15 imagem e analisar a mesma.
A identificação de microcolônias pode ser melhorada pelo uso de micromanipuladores, que removem uma microcolônia escolhida pelo formato ou fluorescência, seguido pela identificação da microcolônia por PCR ou 20 outros métodos apropriados. A remoção de microcolônias pode ser realizada por métodos diferentes. Entretanto, a identificação de uma microcolônia por PCR não significa necessariamente que a remoção específica de uma dada microcolônia é necessária porque os métodos PCR permitem
2 5 reconhecimento do DNA de um organismo alvo no DNA
antecedente de outra espécie.
Membranas de tamanhos de poro diferentes e outras qualidades são úteis para virologia, especialmente em casos quando culturas de célula são utilizadas para crescimento e
3 0 detecção de vírus através de furos nas camadas celulares. Qualidade de descontaminação
A descontaminação de ambientes internos após uma epidemia, a presença de pessoa(s) com uma doença mortal, ou um ataque biológico de militar estrangeiro ou terrorista 5 são todos dilemas muito importantes para o microbiologista médio. A presença e quantidade de células sobreviventes após descontaminação definem a possibilidade de uso adicional de instalações descontaminadas. Essa análise deve ser concluída em um tempo muito curto, especialmente se uma 10 instalação de uso público importante for envolvida (aeroportos, instalações governamentais ou militares, ou outros lugares de alto acesso ao público e importância). Somente células sobreviventes/vivas devem ser detectadas nessa circunstância. E somente o crescimento efetivo de 15 células é conhecido como sendo o método mais seguro de detectar microorganismos vivos. O crescimento regular demora 24-4 8 horas ou mais para criar uma colônia. A presente invenção permite os mesmos resultados em 5-6 horas, é muito mais barato, e requer muito menos
2 0 processamento manual; desse modo significando que um número
maior de amostras pode ser analisado. Por exemplo, se uma área foi contaminada por esporos de Bacillus anthracis; e a descontaminação extermina todas as células vegetativas e esporos, então somente esporos de Bacillus podem 25 sobreviver. Esporos de Clostridium, Actinomycetes e Fungos não são cultivados em meio utilizado para B. anthracis devido a diferentes motivos. Desse modo, a única espécie de Bacillus que estará crescendo nesse meio é B. anthracis. TSA pode ser utilizado nesse caso. Amostras de líquido de
3 0 diferentes partes de uma instalação são colocadas em TSA com a membrana com camada fina de TSA acima. Após 5 horas de incubação a 37°C, membranas com microcolônias possíveis são transferidas para placas com brometo de 3-(4,5- dimetiltiazolil-2)-3,5-difenil tetrazólio (Agarose a 1% 5 puro em PBS pH 7,5). Em 10-20 minutos microcolônias intensamente coloridas de um formato específico podem ser reconhecidas a partir de outras espécies Bacillus (por exemplo, a figura 5.4 mostra o que se parece com Bacillus subtilis globigii, conhecido como um modelo em pesquisa de 10 B. anthracis) . Essas microcolônias podem ser removidas e analisadas por PCR rápido (1-1,5 horas) para confirmação de B. anthracis sobrevivendo à descontaminação. Desse modo, a permissão para continuar o uso da instalação pode ser concedida após 6-8 horas em vez de 24-48 ou mais horas.
Detecção de microorganismos resistentes a antibiótico
A detecção de microorganismos resistentes ao antibiótico em amostras humanas e como infecções nosocomais (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxitoca e outro) é um problema médico de crescimento rápido. A vida de uma pessoa infectada depende intensamente do diagnóstico rápido de uma cepa resistente a antibiótico. O crescimento e criação de uma colônia na presença de um antibiótico é somente um método seguro amplamente utilizado em diagnóstico de cepas resistentes a antibiótico. Demora atualmente 24 horas para encontrar crescimento/colônias em placas com meio nutriente e antibiótico (CHROMágar, MRSA ou outro) . A limitação dessa análise a 6-8 horas pode salvar dezenas de milhares de vidas no mundo inteiro anualmente. Como exemplo, o método geral para a detecção rápida de Staphylococcus aureus ê o seguinte: uma amostra (sangue ou ambiental), presumivelmente contendo S. aureus resistente a antibiótico, é espalhada em uma placa cheia de meticilina (meio MRSA) com membranas instaladas. Após 5-6 horas a membrana é transferida para uma placa com Agarose e um 5 substrato cromogênico. Após 10-15 minutos todas as microcolônias obtém uma cor violeta escura e se tornam visíveis. As microcolônias de formato específico (figura 7) são reconhecidas como S. aureus resistente a antibiótico.
Detecção rápida de E. coli A presença de E. coli e amostras ambientais e de
alimento é conhecida como sendo uma característica segura de contaminação fecal. Somente células vivas são importantes para obter resultados de enumeração; métodos PCR e imunológicos são ineficazes nesse caso. A capacidade de formar uma colônia é a característica mais segura de E. coli vivo. Para crescimento e detecção de E. coli, MacConkey ágar é amplamente utilizado para microorganismos Lactose-positiva; Gram-negativos. Alternativamente, meio CIRCLEGROW® é utilizado para crescimento rápido de E. coli. Ágar LB pode também ser utilizado. Todos esses meios são apropriados para crescimento de microcolônias de E. coli e alguns outros micróbios presentes em uma amostra. O elemento poroso, ou membrana, instalado na superfície de meio não deve ter uma camada delgada de meio ágar no topo e deve ter poros de tamanho apropriado, por exemplo, 50.000
100.000 Da. E. coli forma microcolônias bem visíveis após 4-6 horas de incubação a 370C (figura 8) . Após o período de incubação, a membrana contendo tanto E. coli como microcolônias de outras espécies é transferida para uma placa BioNanoChannel cheia de 4-metilumbeliferil-S-Dgalactopiranoside (0,1 mg/ml em etanol a 35%). Após 5-10 minutos de incubação, microcolônias de E. coli obtêm fluorescência azul brilhante sob um microscópio fluorescente em UV de excitação de 350-380 nm. Outras microcolônias permanecem incolores.
Modalidades Alternativas
A presente descrição é aplicável a uma ampla variedade de aplicações e não é limitada a nenhum tipo especifico de ensaio, meio, filtro, membrana ou microorganismo descrito
na presente revelação. Em vista das modalidades descritas aqui, a presente revelação foi mostrada como fornecendo um método e aparelho que supera as limitações da técnica anterior, como inúmeras diluições seriais; tempo excessivo; e consumo de recurso de laboratório e resultados fracos.
Por exemplo, aspectos da presente revelação podem ser
adaptados para detectar vírus que crescem em uma camada delgada de células procarióticas ou eucarióticas e produzem buracos nítidos na superfície no lugar onde os vírus se propagaram. Nesse caso, a coloração pode ser células
2 0 coloridas que são intactas e não infectadas por vírus e
pequenos espaços claros, ou placa, onde as células são infectadas e desintegradas por vírus sem células viáveis para colorir.
As descrições acima de modalidades específicas da
presente revelação foram apresentadas para fins de ilustração e descrição. Não pretendem ser exaustivas ou limitar a invenção âs formas precisas reveladas. Naturalmente, muitas modificações e variações são possíveis ã luz do ensinamento acima. As modalidades foram escolhidas
3 0 e descritas para explicar melhor os princípios da invenção e sua aplicação prática, para desse modo permitir que outros versados na técnica utilizem melhor a invenção e várias modalidades com várias modificações como adequadas ao uso específico considerado. Pretende-se que o escopo da 5 invenção seja definido pelas reivindicações apensas ao presente e suas equivalentes.
Claims (20)
1. Dispositivo para detectar, identificar ou enumerar microorganismos caracterizado por compreender: um recipiente de meio para fornecer nutrientes para manter crescimento de microorganismos; um elemento poroso em contato com o meio nutriente, em que o elemento poroso permite que meio nutriente passe através do mesmo para manter crescimento de células, o elemento poroso é transferível do recipiente para 1 processamento subsequente com indicadores ou com inspeção visual, e o elemento poroso é transparente, permeável à água e permeável a substâncias nutrientes e substâncias indicadoras.
2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento poroso é uma membrana permeável que é impermeável a microorganismos, porém é autoclavável, hidrofílica, não fluorescente, incolor e é resistente a enzimas celulares secretadas.
3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio contém somente substâncias que não evitariam ou inibiriam crescimento microbiano, e em que o meio é um meio nutriente de finalidade geral sólido ou um meio seletivo ou diferencial.
4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento poroso é disposto acima do meio no recipiente com ou sem uma camada superior de meio adicional.
5. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento poroso é selecionado do grupo que consiste em: celulose regenerada, celofane, cuprofano e membrana de diálise.
6.Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento poroso é uma membrana permeável com poros regulares ou não regulares na faixa de: 1000-10 7 Da.
7. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio está em um estado sólido, semi-sólido ou líquido e em que o elemento poroso comunica nutrientes do meio para microorganismos localizados acima ou no elemento poroso.
8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: uma pluralidade de elementos porosos dispostos sobre ou no meio em um arranjo paralelo para teste paralelo.
9. Sistema de kit de teste para detectar, identificar ou enumerar microorganismos caracterizado por compreender: um recipiente de meio nutriente para manter crescimento de microorganismos; um elemento poroso em contato com o meio nutriente, em que o elemento poroso é para suportar colônias no elemento poroso, ou no meio superior ao elemento poroso, e para transferir colônias para etapas de processamento indicador subsequentes, o elemento poroso sendo transparente, permeável a água, permeável a substâncias nutrientes e substâncias indicadoras; e um meio secundário que atua como um veículo para liberar moléculas indicadoras para colorir colônias.
10. Sistema de kit de teste, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o meio secundário é escolhido do grupo que consiste em: agarose, carragena, gelatina, e um gel capaz de comunicar e em que a concentração de gel pode estar em uma faixa de aproximadamente 0,1% a 10% em um solvente de água, tampão, solução de cloreto de sódio ou meio nutriente líquido.
11. Sistema de kit de teste, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o indicador para microcolônias pode ser um substrato cromogênico, substrato fluorogênico ou anticorpos marcados com rádio ou fluorescentes.
12. Método para detectar, identificar ou enumerar microorganismos caracterizado por compreender as etapas de: fornecer um recipiente de meio com um elemento poroso disposto no topo, ou sob a superfície superior, do meio, em que o meio tem nutrientes para manter crescimento de microorganismos; derramar uma amostra líquida no recipiente em uma área acima do elemento poroso; reter microorganismos no elemento de filtração ou no meio acima do elemento poroso; incubar o recipiente; transferir o elemento poroso e qualquer meio acima do mesmo a partir do recipiente para um meio secundário com um indicador para fins de avaliação dos microorganismos dentro deste; transferir o elemento poroso a partir do meio secundário para um dispositivo para detectar e identificar células; e examinar um formato de colônias para detecção, identificação ou enumeração de microorganismos.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a etapa de examinar é executar manualmente ou com um sistema de identificação e reconhecimento de imagem automatizado.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender ainda as etapas de: detectar o número total de microcolônias viáveis (TVO).
15. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de detectação e identificação de células é um microscópio ou sistema de detecção de imagem automatizado.
16. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o meio secundário contém uma substância indicadora para auxiliar na identificação de microorganismos no elemento poroso.
17. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o elemento poroso retém amostras filtráveis ou amostras não filtráveis.
18. Método para fabricar um dispositivo de detecção para microorganismos caracterizado por compreender as etapas de: fornecer um recipiente de meio; depositar um elemento poroso no topo do meio no recipiente; e derramar meio líquido adicional sobre o elemento poroso e sobre uma superfície superior do meio no recipiente, onde o meio no recipiente ou o meio líquido adicional tem nutrientes para promover crescimento de células.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de: criar uma cavidade em uma superfície superior do meio para aceitar um elemento de filtração inserir o elemento de filtração na cavidade de tal modo que uma superfície superior do elemento de filtração está uniforme com ou mais baixo do que a superfície superior do meio; e depositar um elemento de filtração sem nenhum meio no mesmo na cavidade de tal modo que o elemento de filtração sem nenhum meio é aproximadamente mais baixo do que a superfície superior.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a etapa de criar uma cavidade compreende as seguintes etapas: colocar um espaçador no topo do meio; derramar meio líquido sobre o espaçador e sobre a superfície superior do recipiente de meio para formar uma superfície superior; permitir que meio líquido solidifique pelo menos parcialmente para fornecer uma camada fina de meio acima do espaçador; e remover o espaçador juntamente com a camada fina de meio acima do espaçador para criar uma cavidade no meio.
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| AT515571B1 (de) * | 2014-03-26 | 2018-01-15 | Thonhauser Gmbh | Verfahren zum Reinigen von Anlagen |
| US20160018298A1 (en) * | 2014-05-05 | 2016-01-21 | Geoffrey N. Roth | Apparatus and process for growth, maintenance, detection and /or examination of items in fluidic test samples |
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