JP2010521968A5 - 透過性を有するメンブレン上の微生物の検知及び識別 - Google Patents

Description

培地上に位置する多孔性の要素の２つの異なる実施例が存在する。第１の実施例では、多孔性の要素は培地層の上に配置され、後のあらゆる培地にも覆われていない。細胞の輸送を有効にするために、この実施例中の多孔質膜には、評価されることが所望される最小の細胞よりも大きな多孔率を有さず、多孔性の要素上に細胞を捉える。このようにして、多孔性の要素が後の処理の為に、搬送されるべき培地から取り除かれる場合、細胞とコロニーは多孔性の要素を無傷で伴う。多孔性の要素はそれ自体は背景に蛍光がないので、この第１の実施例は蛍光性の分析に役立つ。
第２の実施例では、多孔性の要素は培地層の上に配置され、続いて更なる培地で覆われている。
この実施例では、細胞と微小コロニーは更なる培地上に存在するだろう。このようにして、細胞と微小コロニーが、多孔性の要素自体より上層の更なる培地の上面上に捉えられるので、多孔性の要素は最小の細胞より大きな気孔サイズを有することができる。従って、多孔性の要素がコンテナから取り除かれる場合、多孔性の要素上の更なる培地を該培地の上に存ずる微小コロニーとともに要する(take)。第２の実施例は、微小コロニーの光吸収性の彩色には役立つが、蛍光の検知には役立たない、何故なら培養液自体は、高い量の背景蛍光を有するからである。

指標
現在の発明の領域では、指標は微小コロニーに特定に又は非特定に、ラベルを付けることができる物質である。それらは、発色体及び／又は蛍光発生基質、あるいはそれらの混合及び標識付けられた抗体である。
発色体及び蛍光発生基質は、特定又は非特定の酵素、あるいは一群の酵素との反応の後に、光吸収性物質又は蛍光物質を生産する。
これらの基質の小さな分子は自由にゲルから離れ、メンブレンを通り抜けて、生きた細胞の酵素と反応することができる。蛍光色素又はラジオアイソトープによって標識付けられ、BioNanoChannel(商標)プレートへ導入された抗体は、例えばメンブレンが１０ ⁶ Ｄa又はそれ以上の大きさの孔であれば、ナノチャンネルを自由に出て、メンブレンを通過することができる。 反応しなかった標識抗体は、別のBioNanoChannel(商標)プレートにメンブレンを１回以上転送することにより除去される。

ＢＮＣは、一端又は両端から開口した多数の円筒形且つ並列な微小チャンネルを含むプレートであり、微小チャンネルの直径は約１−３０μｍで長さが１００−１０００μｍで、２センチメートル当たりの微小チャンネルの数は、約１００，０００−１，０００，０００である(直径／長さ＝１／１０−１／１００)。更に、BioNanoChannel装置及び方法の詳細及び記載は、Sergey Gazenkoと共願の発明の名称が「予備成長無しで１つの微生物を素早く検知し識別する装置」である米国特許出願第11/109,857号に用意されており、該出願の全体は、引用を以て本願への記載加入とする。

Claims (18)

1. 微生物を成長させ、検知し、識別又は列挙する方法であって、
   培地の容器を提供する工程であって、培地の天面に又は天面の下に多孔性の要素が配備され、培地は微生物の成長を維持する栄養を有し、多孔性の要素は、１０００乃至１０ ⁷ ダルトンの範囲の孔を有する工程と、
   多孔性の要素上方の領域にて、容器に液体サンプルを注ぐ工程と、
   多孔性の要素内に、又は多孔性の要素上方の培地の上に、微生物を捉える工程と、
   微生物が成長するのに十分な時間、容器を培養する工程と、
   微生物を評価し、検知し、識別する目的で、容器から第２の培地へ多孔性の要素及び該要素上方の培地を移動する工程と、
   微生物の検知、識別又は列挙のために微生物を検討する工程と、を含んでおり、
   微生物を成長させ、検知し、識別又は列挙する工程は、最大で６時間かけて行われる方法。
2. 多孔性の要素は、再生セルロース、セロファン又はキュプロファン等のポリマー及び透析メンブレンから成るグループから選択される透過性メンブレンである、請求項１に記載の方法。
3. 微生物の検討では、微生物を識別するために、単クローン抗体が用いられる、請求項１に記載の方法。
4. 検討する工程は、手動又は自動化された画像検知及び認識装置を用いて実行される、請求項１に記載の方法。
5. 更に、生存可能な微小コロニー(ＴＶＯ)の総数を検知する工程を含む、請求項１に記載の方法。
6. 第２の培地は、多孔性の要素上の微生物の識別を手助けする指標物質を含む、請求項１に記載の方法。
7. 多孔性の要素は、濾過不可能又は濾過可能なサンプルの何れかを捉える、請求項１に記載の方法。
8. 請求項１乃至７の何れかに記載の方法で用いられる装置であって、
   栄養を付与して微生物の成長を維持する培地の容器と、
   培地に接して、培地の栄養物質が通過することを許して細胞の成長を維持する多孔性の要素であって、指標を用いた次の処理の為に容器から移動可能であり、透明で、水が透過でき、培地の栄養物質に対して透過性がある多孔性の要素とを具えている装置。
9. 多孔性の要素は、微生物に対しては透過性はないが、オートクレーブ可能であり、親水性であり、非蛍光性であり、無色であり、分泌された細胞酵素に耐性がある透過性のあるメンブレンである、請求項８に記載の装置。
10. 培地は、微生物の成長を阻止せず又は禁止しない物質のみを含み、培地は固形の汎用栄養素培地又は選択的若しくは鑑別培地の何れかである、請求項８に記載の装置。
11. 多孔性の要素は、更なる培地の上層を有し又は有さない容器内の培地上に配備された、請求項８に記載の装置。
12. 多孔性の要素は、１０ ⁶ −１０⁷Ｄaの範囲内の規則的な又は不規則的な孔を具えた透過性のあるメンブレンである、請求項８に記載の装置。
13. 培地は、固体、半固体又は液体状態であって、多孔性の要素は、栄養を培地から多孔性の要素の上方又は上に位置する微生物へ伝達する、請求項８に記載の装置。
14. 更に、平行テスト用に平行に配列され、培地上又は培地内に配備された複数の多孔性の要素を具える、請求項８に記載の装置。
15. 微生物を成長させ、検知し、識別し又は列挙するテストキットシステムであって、
    請求項８乃至１４の何れかに記載された装置と、
    一端又は両端から開口しており、筒状で平行に配置された複数のチャンネルを有しており、各チャンネルは、１μｍ乃至３０μｍの直径と、１００μｍ乃至１０００μｍの長さとを有している検出プレートと、
    を含んでおり、
    第２の培地は、指標物質を微生物の微小コロニーへ解放するキャリアとして作動するシステム。
16. 第２の培地は、アガロース、カラゲナン、ゼラチン及び伝達可能なゲルからなるグループから選択され、ゲルの濃度は水溶液、バッファ、食塩水又は液状栄養素培地内にて０.１％−１０％の範囲である、請求項１５に記載のテストキットシステム。
17. 請求項８乃至１４の何れかに記載の微生物の検知装置を製造する方法であって、
    培地の容器を供給する工程と、
    容器内の培地の天面に多孔性の要素を堆積させる工程と、
    多孔性の要素上及び容器内の培地の天面に更なる液体培地を注ぐ工程であって、容器内の培地又は更なる液体培地の何れかは、細胞の成長を促進する栄養素を有する工程と、
    多孔性の要素を受け入れる空隙を培地の天面に形成する工程と、
    多孔性の要素の天面が培地の天面と同一面又は天面以下になるように、多孔性の要素を空隙に挿入する工程と、
    如何なる培地も無い多孔性の要素が天面よりも低くなるように、如何なる培地も多孔性の要素を空隙に堆積させる工程とを有する、方法。
18. 更に、空隙を形成する工程は、
    培地の天面にスペーサを置く工程と、
    スペーサ上及び培地の容器の天面上に液体培地を注ぐ工程と、
    液体培地が凝固するのを許し、スペーサ上に培地の薄い層を付与する工程と、
    スペーサ上の培地の薄い層とともに、スペーサを除去して、培地内に空隙を形成する工程を有する、請求項１７に記載の方法。