BR112012016132A2 - artigo de detecção microbiana - Google Patents

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Jesse D. Miller
Stephanie J. Moeller
Kurt J. Halverson
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Abstract

ARTIGO DE DETECÇÃO MICROBIANA. A presente invenção fornece um artigo para a detecção de um micro-organismo em uma amostra líquida. O artigo compreende uma membrana microporosa e uma camada de barreira para regular seletivamente o contato entre a amostra e um reagente de detecção. Um método de uso é também fornecido.

Description

- ANNAN NNNAAAASANADbaaANRAAiaiAALANANNNAAAAtA NIM nnaNaadnadnsr air AAA ts . 1/27 Tr “ARTIGO DE DETECÇÃO MICROBIANA” 7 Referência Remissiva a Pedidos de Depósito Correlatos O presente pedido reivindica o benefício sobre o pedido de patente provisório : U.S. nº 61/291.245, depositado em 30 de dezembro de 2009, que é aqui incorporado, por referência, em sua totalidade. . Antecedentes Quando as superfícies se tornam contaminadas com bactérias, fungos, leveduras, vírus ou outros microorganismos, ou “micróbios”, pode ocorrer doença (morbidez) e, às vezes, óbito (mortalidade). Isto pode ser particularmente verdadeiro quando as superfícies presentes em fábricas de processamento de alimentos e estabelecimentos de cuidados com a saúde (por exemplo, hospitais) são contaminadas com microorganismos.
Em instalações de processamento de alimentos, as superfícies (por exemplo, superfícies sólidas, superfícies de equipamentos, peças de vestuário protetoras, etc.) podem se tornar contaminadas. Tal contaminação pode ser causada por, ou transferida paraa carne ou outros alimentos. Em estabelecimentos para cuidados com a saúde, os micróbios podem ser depositados sobre superfícies (por exemplo, superfícies sólidas, | superfícies de equipamentos, vestuário, etc.) por indivíduos infectados ou por outros | meios. Uma vez que uma superfície se torna contaminada com micróbios, o contato com a superfície contaminada pode facilmente e prontamente transferir esses micróbios para —outroslocais, como outra superfície, um indivíduo, equipamentos, alimentos ou similares. Como é de conhecimento geral, a contaminação e a transferência microbiana em - certos ambientes podem representar riscos significativos para a saúde. Por exemplo, o alimento que deixa uma fábrica de processamento de alimentos será subsequentemente consumido, e - pode causar doenças e, possivelmente, morte. Microorganismos como Listeria monocytogenes, — Salmonella enteriditis, e Escherichia coli 0157: H7 são de particular preocupação.
A contaminação microbiana é uma preocupação em estabelecimentos de cuidado com a saúde, uma vez que alguns dos pacientes de tais estabelecimentos sofrem, com frequência, de infecções causadas por micróbios patogênicos e, dessa forma, introduzem os micróbios patogênicos em tais estabelecimentos. Além disso, muitas pessoas que estão presentes em tais estabelecimentos (os pacientes, por exemplo) encontram-se enfermas e podem apresentar deficiência imunológica. Esses indivíduos estão, dessa forma, em grande risco de contrair doenças por infecção com micróbios contaminadores.
Sumário A presente descrição refere-se a artigos e métodos que são usados para detectar um microorganismo. Em particular, esta descrição refere-se a um artigo de detecção multicamada que pode ser usado para permitir o crescimento de microorganismos durante
| AMAM UINIAAINANARAMRIAUNAAISSANANAANiNAUMA ALAN AiAAAM9AdoAtANAAAALAAMAMANONNNANARAANENNs AAA MNAmMtinAtirAta Adair, 2/27 ” um período de tempo limitado antes de reposicionar ou remover uma das camadas para , expor os microorganismos a um reagente de detecção.
Em um aspecto, a presente descrição apresenta um artigo para a detecção ou ' enumeração de microorganismos em uma amostra.
O artigo pode compreender um elemento — debase, umamembrana microporosa, uma lâmina de cobertura e uma camada de barreira. o . elemento de base pode compreender um substrato impermeável à água auto-suportado com superfícies principais superior e inferior.
A superfície principal superior do elemento de base pode compreender um primeiro revestimento a seco que inclui um agente gelificante solúvel em água fria.
A lâmina de cobertura pode compreender um segundo revestimento a seco que inclui um reagente de detecção.
A camada de barreira pode ser configurada para formar uma barreira de fluido entre a membrana microporosa e a lâmina de cobertura.
A membrana microporosa pode ser disposta entre o elemento de base e a camada de barreira.
Em qualquer uma das modalidades acima, o artigo pode compreender adicionalmente um espaçador.
O espaçador pode compreender uma abertura.
O espaçador — pode ser acoplado ao elemento de base para formar uma cavidade de recepção de amostra.
Em qualquer uma das modalidades acima, a lâmina de cobertura pode ser fixada ao elemento de base.
Em qualquer uma das modalidades acima, a membrana microporosa pode ser fixada ao elemento de base.
Em qualquer uma das modalidades acima, a camada de barreira pode ser fixada ao elemento de base.
Em qualquer uma das modalidades acima, acamada de barreira pode ser fixada de modo separável ao elemento de base.
Em qualquer uma das modalidades acima, a membrana microporosa pode - compreender um material selecionado do grupo consistindo em poliéter sulfona, náilon, policarbonato, poliéster, acetato de celulose, ésteres de celulose misturados, fluoreto de - polivinilideno, nitro celuloses, uma cerâmica, um derivado de qualquer um dos anteriormente — mencionados, e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos anteriormente mencionados.
Em qualquer uma das modalidades acima, a membrana microporosa pode compreender adicionalmente um contorno de permeação.
Em qualquer uma das modalidades acima, o artigo pode compreender adicionalmente um meio de nutriente.
Em qualquer uma das modalidades acima, o artigo pode compreender adicionalmente um — agente seletivo.
Em qualquer uma das modalidades acima, o artigo pode compreender adicionalmente uma pluralidade de reagentes de detecção.
Em qualquer uma das modalidades acima, pelo menos dois da pluralidade de reagentes de detecção podem diferenciar pelo menos dois tipos de microorganismos.
Em qualquer uma das modalidades acima, a lâmina de cobertura pode — compreender adicionalmente um agente gelificante solúvel em água fria.
Em um outro aspecto, a presente descrição apresenta um método de detecção da presença ou ausência de um microorganismo em uma amostra.
O método pode compreender o fornecimento de uma amostra líquida suspeita de conter um microorganismo e um artigo de , detecção.
O artigo de detecção pode compreender um elemento de base, uma membrana microporosa, uma lâmina de cobertura e uma camada de barreira que forma uma barreira de . fluido entre a membrana microporosa e a lâmina de cobertura.
O elemento de base pode compreender um primeiro revestimento a seco que inclui um agente gelificante solúvel em água . fria.
A lâmina de cobertura pode compreender um segundo revestimento a seco que inclui um reagente de detecção.
A membrana microporosa pode ser disposta entre o elemento de base e a camada de barreira.
O método pode compreender adicionalmente o contato de uma quantidade predeterminada da amostra com o primeiro revestimento a seco.
O método pode compreender adicionalmente o contato da membrana microporosa com a amostra.
O método pode compreender adicionalmente a incubação do artigo durante um primeiro período de tempo.
O método pode compreender adicionalmente o reposicionamento da camada de barreira para proporcionar o contato entre a lâmina de cobertura e a membrana microporosa.
O método pode compreender adicionalmente a incubação do artigo durante um segundo período de tempo e a observação de uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano.
Em qualquer uma das modalidades acima do método, o reposicionamento da camada de barreira pode compreender a remoção da camada de barreira do artigo.
Em qualquer uma das modalidades acima do método, o artigo pode compreender adicionalmente um espaçador que forma uma cavidade de recepção de amostra com o elemento de base.
Nessas modalidades, o contato de uma quantidade predeterminada da amostra com o primeiro revestimento a seco pode compreender a transferência da - amostra para o interior da cavidade de recepção de amostra.
Em qualquer uma das modalidades acima do método, o método pode compreender . adicionalmente a mistura da amostra com um nutriente, um agente seletivo, um reagente de detecção, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos anteriormente mencionados.
Em qualquer uma das modalidades acima do método, o primeiro período de tempo pode ser de cerca de uma hora a cerca de 48 horas.
Em qualquer uma das modalidades acima do método, o segundo período de tempo pode ser de cerca de quinze minutes a cerca de noventa e seis horas.
Em qualquer uma das modalidades acima do método, pelo menos uma porção do primeiro revestimento a seco pode compreender uma pluralidade de reagentes de detecção.
Nessas modalidades, a observação de uma indicação de crescimento microbiano pode compreender a detecção e a diferenciação de dois ou mais tipos de microorganismos.
Em qualquer uma das modalidades acima do método, a observação de uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano pode compreender a enumeração de pelo menos um tipo de microorganismo.
Em qualquer uma das modalidades acima do método, a observação de uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano pode
- ASARRRMNANIARMMA AAA ÍNAiAAAMahAAtAAAAAAAANAAAAAANAAANANANNRANNAAAhA MN Ahatsaitnadbn taste. 4/27 compreender a obtenção de uma imagem do artigo.
Em qualquer uma das modalidades acima ' do método, a observação de uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano pode compreender adicionalmente a impressão, a exibição ou a análise da imagem.
BR As palavras “preferencial” e “de preferência” referem-se às modalidades da invenção que possam proporcionar certos benefícios, sob certas circunstâncias.
Entretanto, outras - modalidades podem, também, ser preferenciais sob as mesmas ou outras circunstâncias.
Além disso, a menção de uma ou mais modalidades preferenciais não implica no desuso de outras modalidades e não tem a intenção de excluir outras modalidades do escopo da invenção.
Para uso na presente invenção, “um”, “uma”, “o”, “a”, “ao menos um”, “ao menos uma”, “um ou mais” e “uma ou mais” são usados de maneira intercambiável.
Dessa forma, | por exemplo, uma amostra que compreende “um” microorganismo pode ser interpretada para significar que a amostra pode incluir “um ou mais” microorganismos.
O termo “e/ou” significa um ou todos os elementos mencionados ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos listados.
Para uso na presente invenção, as menções de intervalos numéricos com extremos incluem todos os números contínuos nesta faixa (por exemplo, 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.). O sumário anterior da presente invenção não se destina a descrever cada uma das modalidades apresentadas ou todas as implementações da presente invenção.
A descrição a seguir exemplifica mais particularmente as modalidades ilustrativas.
Em diversos lugares ao longo do pedido, a orientação é fornecida através de listas de exemplos, nas quais os - exemplos podem ser usados de várias maneiras.
Em cada instância, a lista mencionada serve apenas com um grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva. - Breve Descrição dos Desenhos A invenção será explicada com mais detalhes com referência às figuras listadas abaixo, nas quais estruturas similares são indicadas por números similares em todas as várias vistas.
A Figura 1a é uma vista lateral explodida de uma modalidade de um artigo de detecção que compreende uma membrana microporosa de acordo com a presente descrição.
A Figura 1b é uma vista superior do artigo de detecção da Figura 1a.
A Figura 1c é uma vista em perspectiva superior, parcialmente em seção, do artigo de detecção da Figura 1a.
A Figura 2 é uma vista lateral explodida de uma modalidade de um artigo de detecção que compreende uma membrana microporosa acoplada a um carreador de membrana de acordo com a presente descrição.
- MSINMNMINNSNÍRINAASINANIA nina inatrittadiatasSAtAAaiAberrAAAAAAAAA ANANDA ta 5/27 A Figura 3a é uma vista lateral explodida de uma modalidade de um artigo de ' detecção que compreende um espaçador e uma membrana microporosa de acordo com a presente descrição.
' A Figura 3b é uma vista superior do artigo de detecção da Figura 3a.
A Figura 3c é uma vista em perspectiva superior, parcialmente em seção, do - artigo de detecção da Figura 3a.
A Figura 4 é uma vista lateral explodida de uma modalidade de um artigo de detecção que compreende um espaçador e uma membrana microporosa acoplada a um carreador de membrana de acordo com a presente descrição.
A Figura 5 é um diagrama de blocos de uma modalidade de um método para detectar um microorganismo em uma amostra líquida de acordo com a presente descrição.
Descrição Detalhada Antes de qualquer modalidade da invenção ser explicada em detalhes, deve-se entender que a invenção não se limita, em sua aplicação, aos detalhes da construção e da disposição dos componentes estabelecidos na descrição a seguir ou ilustrados nos desenhos em anexo. A invenção pode compreender outras modalidades e ser praticada ou realizada de várias maneiras. Deve-se entender também que a fraseologia e terminologia usadas na presente invenção têm propósito descritivo, e não devem ser consideradas limitadoras. O uso das expressões “que inclui”, “que compreende”, “que contém” ou “que tem” e variações das mesmas na presente invenção têm por objetivo abranger os itens mencionados posteriormente e seus equivalentes, bem como itens adicionais. Exceto - quando for especificado, ou quando for limitado de alguma maneira, os termos “sustentado” e “acoplado” e variações dos mesmos, são amplamente usados e abrangem os suportes e - acoplamentos diretos e indiretos. Deve-se compreender que outras modalidades podem ser utilizadas e alterações estruturais ou lógicas podem ser feitas sem que se afaste do escopo da presente descrição. Além disso, os termos como “parte frontal”, “parte traseira”, “topo”, “fundo” e similares são usados apenas para descrever a relação mútua entre os elementos, porém, não pretendem de forma alguma se referir às orientações específicas do aparelho, indicar ou conferir orientações necessárias ou requeridas do aparelho ou especificar como a invenção aqui descrita será usada, montada, exibida ou posicionada em uso.
A presente descrição é direcionada genericamente a métodos e artigos para a detecção de um microorganismo em uma amostra líquida. Os artigos de detecção multicamada fornecem i) uma camada de barreira reposicionável ou removível configurada para controlar a exposição de um microorganismo em cultura a um reagente de detecção e/ou a um agente — seletivo eii) uma membrana microporosa para evitar o contato direto entre microorganismos, e gerações dos mesmos, presentes na amostra líquida e na camada de barreira. A prevenção do contato direto entre os microorganismos e a camada de barreira elimina a possibilidade de
É ADRIANA AAA AAA ATA ALA. 6/27 espalhamento de microorganismos no interior e/ou a remoção de microorganismos do artigo , quando a camada de barreira é reposicionada ou removida do artigo. Os artigos multicamada da invenção da presente descrição permitem o uso de . concentrações relativamente altas de um reagente de detecção para reduzir o tempo necessário para detectar um microorganismo. A presença de uma camada de barreira no . artigo evita a exposição de microorganismos ao reagente de detecção (que pode estar presente em uma quantidade que poderia ser inibitória ou tóxica para o microorganismos) durante um primeiro período de incubação. Após o primeiro período de incubação, a camada de barreira pode ser reposicionada ou removida, expondo, dessa forma, os microorganismos, caso estejam presentes, ao reagente de detecção. Os artigos da presente descrição podem compreender um agente de lise e/ou agente seletivo opcionais que podem também ser sequestrados pela camada de barreira a partir do contato com os microorganismos durante o primeiro período de incubação.
Os artigos e métodos da invenção permitem o uso de reagentes de detecção difusíveis. Quando usados em artigos tradicionais (por exemplo, placas de petri de ágar), os reagentes de detecção difusíveis (por exemplo, substratos de enzima cromogênicos ou fluorogênicos, descritos a seguir, que são hidrolisada em um produto detectável solúvel em água) podem se espalhar lateralmente através do dispositivo de detecção como zonas grandes, coloridas ou fluorescentes. Essas zonas podem se sobrepor a dois ou mais colônias de microorganismos, tornando difícil determinar se a zona foi produzida por apenas uma ou por mais de uma colônia. Ao fornecer um artigo que permite o crescimento de microorganismos - antes de os mesmos serem expostos ao reagente de detecção difusível, o usuário pode reduzir a quantidade de tempo de exposição dos microorganismos ao reagente, minimizando, dessa - forma, a difusão do indicador e reduzindo o tamanho das zonas coloridas ou fluorescentes correspondentes. Dessa forma, os artigos e métodos da invenção otimizam a resolução de mais de uma colônia de microorganismos em comparação com artigos e métodos tradicionais.
Salvo se definido de outro modo, todos os termos científicos e técnicos usados na presente invenção têm o mesmo significado conforme comumente compreendido pelo versado na técnica à qual a esta invenção pertence. Os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos podem ser usados na prática da presente invenção, e os métodos e materiais adequados exemplificados são descritos a seguir. Por exemplo, os métodos podem ser descritos compreendendo mais de duas etapas. Em tais métodos, nem todas as etapas podem ser necessárias para alcançar um objetivo desejado e a invenção abrange o uso de etapas isoladas para alcançar esses objetivos distintos. As descrições de todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a limitar.
O termo “microorganismo-alvo”, para uso na presente invenção, refere-se a um ' microorganismo específico (isto é, uma espécie de microorganismo) ou a um grupo particular de microorganismos (por exemplo, um gênero específico de microorganismos, BR bactérias coliformes, bactérias resistentes a antibióticos) a serem detectados.
Amostras e microorganismos . Um aspecto da presente invenção é que ela pode ser usada para detectar organismos presentes numa ampla variedade de superfícies.
Os dispositivos e métodos da presente invenção podem ser usados para uma variedade de aplicações nas quais é desejável detectar a presença ou ausência de microorganismos em uma amostra, incluindo, mas não ;se limitando a, amostras de alimentos (por exemplo, matérias primas, materiais de alimentos em processo, produtos finais), superfícies (por exemplo, superfícies ambientais, superfícies de processamento de alimentos, equipamentos), água (por exemplo, água de superfície, água de processo), e bebidas (por exemplo, leite cru, leite pasteurizado, sucos). As amostras podem consistir substancialmente de material sólido, semissólido, gelatinoso ou líquido, individualmente ou em várias combinações.
Os dispositivos da invenção, bem como os métodos da invenção, podem ser usados para determinar, qualitativa ou quantitativamente, a presença de um ou mais microorganismos de interesse.
Um analito clínico exemplificador de interesse a ser detectado é o Staphylococcus aureus (“S. aureus”). Este é um patógeno que causa um amplo espectro de infecções, incluindo: lesões superficiais, como pequenos abscessos cutâneos e infecções de sítio cirúrgico, condições sistêmicas e de risco de vida, como endocardite, pneumonia e - septicemia, bem como toxinoses, como intoxicação alimentar e síndrome do choque tóxico.
Algumas cepas (por exemplo, S. aureus resistente a meticilina ou MRSA) são - resistentes a todos, exceto a alguns antibióticos selecionados.
Í Analitos exemplificadores de interesse a serem detectados em áreas de Í processamento de alimentos são membros do gênero Listeria.
Os membros do gênero Listeria são classificados como bactérias gram-positivas, em formato de bastão e consistem nas espécies Listeria monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii e L. grayi.
Dentre estas, a L. monocytogenes é responsável pela maior parte dos casos de |listeriose humana, e pessoas com imunidade comprometida, mulheres grávidas, idosos e recém-nascidos têm maior susceptibilidade à infecção.
Os sintomas mais comuns de listeriose são septicemia, meningite e abortos espontâneos.
Outros microorganismos de interesse especial para propósitos analíticos incluem os organismos procariontes e eucariontes, particularmente as bactérias gram-positivas, as bactérias gram-negativas, os fungos, o micoplasma e a levedura.
Organismos particularmente relevantes incluem membros da família Enterobacteriaceae, ou da família Micrococcaceae ou dos gêneros Staphylococcus Spp., Streptococcus Spp., Pseudomonas Spp., Enterococcus Spp.,
| AGNRRISAMMS UNA iai ALRAAMRNAMARAAlARAAA SA nata AMA SAMAANAHaA trai AAtaiatrAAAAASANAAAAAAAAAAAALAALAA A na . 8/27 Salmonella spp., Legionella spp., Shigella spp. Yersinia spp., Enterobacter spp., Escherichia " spp., Bacillus spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Corynebacteria spp., bem como Aspergillus spp, Fusarium spp. e Candida spp. Organismos particularmente virulentos incluem Staphylococcus aureus (incluindo cepas resistentes como Staphylococcus aureus resistente a —meticiina (MRSA)), S. epidermidis, Streptococcus pneumoniae, S. agalactiae, S. pyogenes, R Enterococcus faecalis, Enterococcus resistente a vancomicina (VRE), Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (VRSA), Staphylococcus aureus com resistência intermediária a vancomicina (VISA), Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Aspergillus niger, A. fumigatus, A. clavatus, Fusarium solani, F. oxysporum, F. chlamydosporum, Víbrio cholera, V. parahemolyticus, Salmonella cholerasuis, S. typhi, S. typhimurium, Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, Enterobacter sakazakii, Escherichia. coli O157, microorganismos contendo ESBL, e bastões gram-negativos resistentes a múltiplas drogas (MDR). Artigos de detecção A presente descrição apresenta artigos para a detecção da presença ou ausência de um microorganismo em uma amostra. A Figura 1a mostra uma vista lateral explodida de uma modalidade de um artigo de detecção 100 de acordo com a presente descrição. O artigo compreende um elemento de base 110 que inclui um primeiro substrato impermeável à água 112, uma primeira camada adesiva opcional 114 colada ao primeiro substrato 112, e um primeiro revestimento a seco 116. O primeiro substrato 112 é, de preferência, auto-suportado e não absorve água substancialmente. Alguns exemplos não-limitadores de materiais adequados para o primeiro . substrato 112 incluem poliéster, polipropileno, ou filmes de poliestireno. Outros materiais adequados incluem materiais de papel ou papelão que compreendem um revestimento (por - exemplo, polimérico) à prova de água. O primeiro substrato 112 pode ser transparente, translúcido ou opaca, dependendo de como se deseja visualizar as colônias bacterianas através do substrato 112. Para facilitar a contagem de colônias bacterianas, o primeiro substrato 112 pode ter um padrão de grades quadradas estampado sobre o mesmo, conforme descrito na patente U.S. nº 4.565.783, que é aqui incorporada, por referência. Os materiais usados para construir o primeiro substrato 112 devem ser relativamente inertes aos microorganismos e, de preferência, devem ser compatíveis com um processo de esterilização (por exemplo, esterilização com óxido de etileno).
Em algumas modalidades, o elemento de base 110 pode compreender adicionalmente uma primeira camada adesiva opcional 114 colada a uma superfície principal do primeiro substrato 112. A primeira camada adesiva 114 pode ser insolúvel em água, deve ser não-inibitória ao crescimento de microorganismos, e deve ser capaz de suportar o processo de esterilização, se for utilizado um processo de esterilização. De preferência, a primeira camada adesiva 114 é suficientemente transparente quando
| NRRnAASULINARAR AAA RANMA ALLA das MANDA Aiii SA AAA AMU stnaaianAbdaidA AMARAL thais AMA 9/27 umedecida para permitir a visualização de colônias bacterianas através do primeiro ' substrato 112 revestido com a camada adesiva 114. Em algumas modalidades, a primeira camada adesiva 114 pode compreender um adesivo sensível à pressão como um adesivo de copolímero de acrilato de isooctila/ácido acrílico sensível à alta pressão (96%, em —peso,deacrilato de isooctila e 4%, em peso, de ácido acrílico), por exemplo.
. Em algumas modalidades, o primeiro substrato 112 pode compreender uma primeira camada adesiva 114 que cobre toda uma superfície principal do substrato 112. Em algumas modalidades, o primeiro substrato 112 pode compreender uma primeira camada adesiva 114 que cobre apenas uma porção de uma superfície principal do substrato 112.
O primeiro revestimento a seco 116 compreende um agente gelificante solúvel em água fria (por exemplo, goma guar, goma de xantana, goma de alfarrobeira), conforme descrito na patente U.S. nº 4.565.783, que é aqui incorporada, por referência, em sua totalidade. Opcionalmente, o revestimento a seco 116 pode compreender, ainda, um meio de nutriente, um agente seletivo, um reagente de detecção, ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens supracitados. O meio de nutriente, o agente seletivo e/ou o reagente de detecção não devem interferir substancialmente com o agente gelificante e serão, em geral, escolhidos com base nos microorganismos a serem detectados. Alguns exemplos não- limitadores de nutrientes, agentes seletivos e reagentes de detecção adequado para detectar microorganismos podem ser encontrados nas patentes U.S. números 4.575.783, 5.089.413,
5.443.963,5.462.860, 5.601.998, 5.635.367, 5.681.712, e 5.364.766, cada uma das quais está aqui incorporada na íntegra, a título de referência. As quantidades de meio de nutriente, . agente seletivo e/ou reagente de detecção no primeiro revestimento a seco 116 são preparadas de modo que, quando colocadas em contato com uma quantidade predeterminada - de amostra líquida, facilitam o crescimento e/ou a detecção de um microorganismo.
Em algumas modalidades, o primeiro revestimento a seco 116 (por exemplo, um agente gelificante à base de pó seco, opcionalmente com um nutriente, agente seletivo e/ou reagente de detecção à base de pó seco) pode ser acoplado ao primeiro substrato 112 mediante a adesão do revestimento 116 à primeira camada adesiva 114, conforme descrito na patente U.S. nº 4.565.783, por exemplo. Em algumas modalidades, o primeiro revestimento a seco 116 pode ser acoplado ao primeiro substrato 112 aplicando-se como revestimento uma mistura líquida que compreende um agente gelificante, opcionalmente com um nutriente, agente seletivo e/ou reagente de detecção à base de pó seco, sobre o primeiro substrato 112 ou a primeira camada adesiva 114 e a subsequente secagem da mistura, conforme descrito na patente U.S. nº 4.565.783, por exemplo. Em algumas — modalidades, o primeiro substrato 112 pode compreender um primeiro revestimento a seco 116 que cobre toda uma superfície principal do substrato 112. Em algumas modalidades, o primeiro substrato 112 pode compreender um primeiro revestimento a ' seco 116 que cobre apenas uma porção de uma superfície principal do substrato 112. Com referência à Figura 1a, o artigo 100 compreende adicionalmente uma membrana microporosa 150. Em algumas modalidades, a membrana microporosa 150, ou uma porçãoda mesma, é acoplada ao elemento de base 110. Na modalidade ilustrada, a . membrana microporosa 150 é acoplada ao elemento de base 110 por meio de uma tira de fita adesiva de dupla-face 130, ainda que um indivíduo de conhecimento comum na técnica reconheça que outros meios de acoplamento (por exemplo, adesivos, termocolantes, soldagem ultra-sônicaj) possam ser adequados. Opcionalmente, a membrana microporosa 150 pode compreender uma região de aba 151 que se estende além de um contorno periférico do elemento de base 110 e/ou da lâmina de cobertura 120. A membrana microporosa 150 pode compreender qualquer um de uma variedade de materiais de membrana microporosa permeável em água conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, membranas celulósicas (por exemplo, acetato de celulose, ésteres de celulose misturados, nitro celuloses), náilon, policarbonato, poliéter sulfona, náilon, poliéster, fluoreto de polivinilideno, cerâmica, um derivado de qualquer um dos anteriormente mencionados, e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos anteriormente mencionados. O tamanho de poro nominal da membrana microporosa 150 é selecionado em função dos microorganismos a serem detectados. Por exemplo, um tamanho de poro nominal de cerca de 0,05 um a cerca de 1,2uUm (por exemplo, 0,05 um, 0,1 um, 0,2 um, 0,45 pum, 0,8 um, ou 1,2 um), de preferência cerca de 0,2 um a cerca de 0,45 um, pode ser usado para detectar bactérias. Em algumas . modalidades, um tamanho de poro nominal de cerca de 0,05 um a cerca de 3 um (por exemplo, 0,45 um, 0,8 um, 1,2 um, ou 3 um), de preferência cerca de 0,45 um a cerca de - 1,2 um, pode ser usado para detectar levedura e/ou fungos.
Em qualquer modalidade, a membrana microporosa 150 deve ser configurada para formar uma barreira para evitar a transferência de microorganismos em uma amostra líquida depositada sobre o elemento de base 110 e entrar em contato com a camada de barreira
140. Em algumas modalidades, isso pode ser feito selecionando-se um volume de amostra e/ou dimensionando-se a membrana microporosa 150 de modo que a amostra líquida não — possa se espalhar para ou além da margem externa da membrana microporosa 150. Em algumas modalidades (conforme mostrado na Figura 1), a membrana microporosa 150 pode ser dimensionada para ser pelo menos coextensiva com as dimensões do elemento de base
110. O acoplar da membrana microporosa 150 ao elemento de base 110, conforme descrito acima, pode manter Vantajosamente a membrana 150 adequadamente posicionada para —evitaro contato direto entre a amostra e a camada de barreira 140.
A membrana microporosa 150 pode compreender adicionalmente um contorno de permeação lateral opcional 153 para confinar a permeação lateral de líquido a uma porção selecionada da membrana microporosa 150. O contorno de permeação 153 compreende ' uma área da membrana microporosa 150 que foi tratada (por exemplo, mediante a aplicação de uma composição), por exemplo, para restringir o movimento de uma amostra aquosa ao longo e/ou através da membrana microporosa. Por exemplo, uma composição —hidrofóbica (por exemplo, cera) pode ser aplicada em um padrão circular (vide Figura 1b), . por exemplo, e deixada penetrar na membrana microporosa 150. À composição pode formar uma barreira que evita substancialmente a difusão lateral de um líquido aquoso através da membrana microporosa 150. Dessa forma, uma amostra líquida em contato com a membrana microporosa 150 em uma região em um lado do contorno de permeação 153 será substancialmente impedida de se espalhar lateralmente através da membrana microporosa 150 para a região no outro lado do contorno de permeação.
O artigo 100 compreende adicionalmente uma camada de barreira 140. Em algumas modalidades, a camada de barreira 140 é acoplada de modo removível à membrana microporosa 150, conforme mostrado na Figura 1. A camada de barreira 140 pode ser acoplada à membrana microporosa 150 por meio de uma tira de fita adesiva de dupla-face 130. De preferência, a camada de barreira 140 compreende adicionalmente um meio de desacoplamento (por exemplo, perfuração 145) para facilitar o desprendimento e a remoção da camada de barreira 140 do artigo 100. Opcionalmente, a camada de barreira 140 pode compreender uma região de aba 141 que se estende além de um contorno periférico do elemento de base 110 e/ou da lâmina de cobertura 120. Deve-se reconhecer que outros meios de acoplamento (por exemplo, adesivos, BR termocolantes, soldagem ultra-sônica) podem ser adequados para fixar a camada de barreira 140 à membrana microporosa 150. Deve-se reconhecer, também, que a camada de - barreira 140 pode ser acoplada diretamente ao elemento de base 110, desde que a membrana microporosa seja disposta entre o elemento de base 110 e a camada de barreira
140. Em uma modalidade alternativa, certas misturas adesivas de baixa adesão, como aquelas descritas na patente U.S. nº 5.118.750, aqui incorporada na íntegra, a título de referência, podem ser usadas em pelo menos um lado da fita adesiva de dupla-face 130 para formar elementos separáveis entre a camada de barreira e a membrana microporosa 150ealâminade cobertura 120. Em ainda outra modalidade alternativa (não mostrada), a camada de barreira 140 pode ser disposta de maneira frouxa entre a membrana microporosa 150 e a lâmina de cobertura 120 antes e/ou depois da inoculação do artigo 100. A camada de barreira 140 deve ser resistente à água. A camada de barreira 140 é, de preferência, transparente para permitir a observação de objetos localizados sob a camada de barreira 140 e é substancialmente impermeável a bactérias, água e vapor d'água. Em geral, a camada de barreira 140 pode ter as mesmas propriedades que o elemento de base
110. Materiais exemplificadores da camada de barreira 140 incluem, por exemplo, filme de
E 12/27 polipropileno (por exemplo, 0,04 mm (1,6 mil) de polipropileno biaxialmente orientado (BOPP)) ' ou filme de polietileno. A camada de barreira 140 é mostrada com um extensão opcional (aba 141), que facilita a preensão e a remoção da camada de barreira 140 do artigo 110. O artigo 100 compreende adicionalmente uma lâmina de cobertura 120. A lâmina de i 5 cobertura 120 é, de preferência, acoplada (direta ou indiretamente) ao elemento de base 110. . Na modalidade ilustrada, a lâmina de cobertura 120 é acoplada à camada de barreira 140 por meio de uma tira de fita adesiva de dupla-face 130. Deve-se reconhecer que outros meios de acoplamento (por exemplo, adesivos, termocolantes, soldagem ultra-sônica) podem ser adequados para fixar a lâmina de cobertura 120 à camada de barreira de membrana microporosa 140. Deve-se reconhecer, também, que a lâmina de cobertura 120 pode ser acoplada diretamente ao elemento de base 110, desde que a membrana microporosa seja disposta entre o elemento de base 110 e a lâmina de cobertura 120. A lâmina de cobertura 120 inclui um segundo substrato impermeável à água 122, uma segunda camada adesiva opcional 124 e um segundo revestimento a seco 126. O segundo revestimento a seco 126 compreende um reagente de detecção para detectar um microorganismo.
O reagente de detecção pode ser detectado visualmente e/ou com o uso de um detector automatizado. O detector automatizado pode compreender um sistema de | formação de imagens. O reagente de detecção pode ser cromogênico, fluorogênico ou luminogênico. Em qualquer modalidade, o reagente de detecção, quando colocado em contato com uma quantidade predeterminada de amostra líquida atinge uma concentração suficiente para detectar um microorganismo-alvo. Vantajosamente, a quantidade do . reagente de detecção no segundo revestimento a seco 126 pode ser suficientemente alta para detectar rapidamente a presença de um microorganismo-alvo embora a alta - concentração de reagente de detecção na amostra líquida também iniba o crescimento do —microorganismo-alvo. Em algumas modalidades, a quantidade de reagente de detecção no segundo revestimento a seco 126 é suficiente para detectar um microorganismo-alvo embora iniba substancialmente o crescimento do microorganismo-alvo. Uma quantidade relativamente mais alta de reagente de detecção no segundo revestimento a seco 126 permite a detecção mais rápida dos microorganismos-alvos do que uma quantidade relativamente mais baixa de reagente de detecção embora a quantidade relativamente mais alta possa inibir substancialmente o crescimento dos microorganismos.
O reagente de detecção pode ser um indicador não-específico do tipo de microorganismo presente ou pode ser um indicador específico do tipo de microorganismo presente. Alguns exemplos não-limitadores de reagentes de detecção não-específicos incluem indicadores de pH (por exemplo, indicadores de pH de azobenzeno (por exemplo, vermelho de metila), indicadores de pH de sulfoftaleina (por exemplo, púrpura de bromocresol, vermelho de clorofenol, azul de bromotimol, azul de bromcreso!), e indicadores de pH de antroquinona (por exemplo, ácido suifônico de monoidrato 3,4-diidróxi-9,10-dioxo-2-antraceno de vermelho de : alizarina, sal de sódio)) e indicadores de óxi-redução (por exemplo, cloreto de trifenil tetrazólio (TTC), 3-[4,5-dimetil tiazol-2-1la)-2,5-brometo de difenil tetrazólio (MTT), sal interno de 2,3-bis[2- metóxi-4-nitro-5-sulfofenil])-2H-tetrazólio-5-carbóxi anilida (XTT), nitro azul tetrazólio). O reagente de detecção pode ser um indicador específico do tipo de microorganismo : presente. Reagentes de detecção específicos incluem, por exemplo, substratos para enzimas (por exemplo, glicosidases, proteases, aminopeptidases, fosfatases, esterases, e similares) que estão associados a certos microorganismos ou grupos de microorganismos.
O reagente de detecção pode ser capaz de formar um precipitado colorido. É conhecida uma variedade de corantes que poderiam ser incorporados nos métodos da presente invenção e dispositivos da presente descrição, corantes que incluem indolila incluindo, mas não se limitando a, fosfato de 5-bromo-4-cloroindolila ou sais de dissódio desse composto, piranosídeo de 5-bromo-4-cloroindolila ou sais de dissódio desse composto, incluindo 5-bromo-4-cloro-3 indolila-B-D-ácido glicurônico, 5-bromo-4-cloro-3- indoxila- B -D-galactosídeo, fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila- B -D-glucopiranosídeo, fosfato de 6-cloro-3-indolila, fosfato de 5-bromo-6-cloro-3-indolila.
De preferência, o precipitado colorido é azul. Os substratos que criam um precipitado colorido azul incluem, mas não se limitam a, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil- B -D- galactosaminida, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil- B -D-glucosaminida, 5-bromo-4-cloro-3- indoxil-B -D-celobiosídeo, 5-bromo-4-cloro-3- B -D-fucopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil- a -D-galactopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil- -galactopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3- . indoxil- a -D-glucopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil- 8 -D-glucopiranosídeo, B5-bromo-4- cloro-3-indoxil- B -D-ácido glicurônico, sal de ciclo hexil amônio, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil- B - - D-ácido glicurônico, sal de sódio, e 5-bromo-4-cloro-3-indoxil- 8 -D-xilopiranosídeo.
Os corantes podem servir como substratos para enzimas específicas presentes em certos tipos de bactérias. Por exemplo, corantes que produzem precipitado azul que são substratos para esterases incluem, mas não se limitam a 5-bromo-4-cloro-3-indoxil butirato, 5- bromo-d4-cloro-3-indoxil caprilato e 5-bromo-4-cloro-3-indoxil palmitato. Os substratos para fosfatases incluem, mas não se limitam a, sal de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil fosfato di(2-amino- — 2-metil-1,3-propanodiol!), sais dissódicos de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil fosfato, 5-bromo-4-cloro- 3-indoxil fosfato e sal de p-toluidina, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil fosfato e o sal de potássio.
Corantes cromogênicos que são substratos para glicosidases incluem, mas não se limitam a, 3-indoxil- 8 -D-galactopiranosídeo, 3-indoxil- B -D-glucopiranosídeo, sal de 3- indoxil- 8 -D-ácido glicurônico ciclo hexil amônio, e sal de sódio 3-indoxil- É -D-ácido —glicurônico. Outros substratos cromogênicos para fosfatases incluem, mas não se limitam a sal de 3-indoxil fosfato di(2-amino-2-metil-1,3-propanodiol), e sais dissódicos de 3-indoxil
| AUIRUIRANNURUMINASIUUAINAAÁRAIMMA AAA AMAS NUNRAMAAD ANDAM AAA A AMiAAASAAAAAA ha AAAANARAnAANnrA tardia. 14/27 fosfato, sal de 3-indoxil fosfato p-toluidina.
Os substratos para sulfatases incluem, mas não ' se limitam a, sal de potássio 3-indoxil sulfato.
Corantes precipitáveis que produzem uma cor magenta para glicosidases, esterases, fosfatases e sulfatases incluem, mas não se limitam a, 5-bromo-6-cloro-3- i 5 — indoxil-N-acetil- 8 -D-glucosaminida, 5-bromo-6-cloro-3-indoxil- 8 -D-galactopiranosídeo, 5- . bromo-6-cloro-3-indoxil- B -D-galactopiranosídeo, 5-bromo-6-cloro-3-indoxil- B -D- glucopiranosídeo, e 5-bromo-6-cloro-3-indoxil- B “ácido glicurônico, sal de ciclo hexil amônio como substratos para glicosidases, 5-bromo-6-cloro-3-indoxil butirato, 5-bromo-6- cloro-3-indoxil caprilato, e 5-bromo-6-cloro-3-indoxil palmitato servem como substratos para esterases, 5-bromo-6-cloro-3-indoxil fosfato, sal de p-toluidina para fosfatases e 5- bromo-6-cloro-3-indoxil sulfato, sal de potássio servem as substratos para sulfatases.
Corantes precipitáveis que produzem uma cor salmão para glicosidases, esterases e fosfatases incluem, mas não se limitam a, 6-cloro-3-indoxil- B -galactopiranosídeo, 6-cloro-3- indoxil- 8 -D-glucopiranosídeo, e 6-cloro-3-indoxil- 8 -D-ácido glicurônico, sal de ciclo hexil amônio para glicosidases, 6-cloro-3-indoxil butirato, 6-cloro-3-indoxil caprilato, e 6-cloro-3- indoxil palmitato para esterases, e 6-cloro-3-indoxil fosfato, sal de p-toluidina para fosfatases.
Os substratos cromogênicos que produzem uma cor púrpura incluem 5-iodo-3- indoxil- 8 -D-galactopiranosídeo e os substratos cromogênicos que produzem uma cor verde incluem N-metil-indoxil- B -D-galactopiranosídeo.
Outros corantes precipitáveis incluem 4,6-dicloro-N-acetilindo|-3-ol, 6-cloroindolila- 8 -D-galactosídeo penta acetato, 6-cloroindolila- B -D-galactosídeo, 6-cloro indoxi-1,3- . diacetato, sal de sódio de 5-cloro-2-carbóxifenilglicina, ácido 4-cloroantranílico, metil[6-cloro- N-acetilindo!-3-íla-(2,3,4-tri-O-acetil- 8 -D-glucopiranosídeo)]uronato, sal de 6-cloroindolila- B . -D-glucopiranosídeo uronatomono ciclo hexil amônio, cloroíndigos relatados por Sadler et al,J Am Chem.
Soc. 78:1251-1255, 1956, bem como 4,6-dicloroindolila- B -D-glucuronida, 6,7-dicloroindolita- B -D-glucuronida, 6,7-dicloroindolila- B —-D-glucuronida, 4,6,7- tricloroindolila- B -D-glucuronida, 4,6-dicloroindolila- B -D-galactosídeo, 6,7-dicloroindolila- 8 - D-galactosídeo, e 4,6,7-tricloroindolila- B -D-galactosídeo.
Reagentes de detecção adequados incluem, ainda, corantes indicadores não- precipitadores (isto é, corantes solúveis em água capazes de se difundir em um hidrogel). Os corantes indicadores não-precipitadores incluem indicadores de pH (por exemplo, indicadores de pH de azobenzeno, indicadores de pH de sulfoftaleína, e indicadores de pH de antroquinona, conforme descrito na presente invenção.
Os corantes indicadores não- precipitadores incluem também substratos de enzima cromogênicos que reagem com uma — enzima para liberar um corante solúvel em água (por exemplo, fosfato de p-nitrofenila ou p- nitrofenila-B-D-glicosídeo, sendo que cada um pode ser hidrolisado para p-nitrofenol), e substratos de enzima fluorogênicos, que podem reagir com uma enzima para liberar um corante fluorescente solúvel em água (por exemplo, fosfato de 4-metil umbeliferila ou 4-metil ' umbeliferil-B-D-glicosídeo, sendo que cada um pode ser hidrolisado para p-nitrofenol).
Um problema com o uso de corantes não-precipitadores em artigos e métodos tradicionais (por exemplo, métodos de placa de petri de ágar) é que os corantes indicadores : 5 são tipicamente incorporados no ágar e os microorganismos podem reagir com os corantes : durante todo o período de crescimento. Esse período relativamente extenso de exposição aos corantes indicadores permite uma difusão lateral significativa dos produtos solúveis em água, podendo resultar em grandes zonas de corante indicador que se sobrepõem a duas ou mais colônias. Dessa forma, nos métodos tradicionais, o operador pode não ser capaz de distinguir qual colônia ou colônias reagiram com o corante indicador.
Em contraste, os métodos da presente descrição (descritos a seguir) incluem um primeiro período de incubação durante o qual os microorganismos, caso estejam presentes, não são capazes de reagir com o reagente de detecção. Os métodos da presente descrição incluem, ainda, um segundo período de incubação no qual os microorganismos, caso estejam presentes, são expostos ao reagente de detecção. Como o segundo período de incubação pode ser relativamente curto (por exemplo, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, ou cerca de 10 horas), os corantes indicadores não-precipitadores não têm tempo suficiente para se difundir substancialmente através do gel formado a partir da amostra líquida e do agente gelificante solúvel em água fria. Vantajosamente, isso permite o uso de reagentes indicadores | solúveis em água que seriam difundidos longe demais da adjacência de uma colônia caso o : reagente indicador fosse incubado durante períodos mais longos de tempo (por exemplo, 18 horas, 24 horas, 36 horas, ou 48 horas, por exemplo) com os microorganismos em um hidrogel. - O segundo substrato 122 é, de preferência, transparente ou translúcido, para permitira visualização ou a formação de imagens de colônias bacterianas através do substrato 122, e não absorve água substancialmente. Alguns exemplos não-limitadores de materiais adequados para o segundo substrato 122 incluem poliéster, polipropileno ou filmes de poliestireno. Outros materiais adequados incluem materiais de papel ou papelão que compreendem um revestimento (por exemplo, polimérico) à prova de água. Os materiais usados para construir o segundo substrato 122 devem ser relativamente inertes a microorganismos e, de preferência, devem ser compatíveis com um processo de esterilização (por exemplo, esterilização com óxido de etileno).
Em algumas modalidades, a lâmina de cobertura 120 pode compreender adicionalmente uma segunda camada adesiva opcional 124 colada ao segundo substrato 122.
A segunda camada adesiva 124 pode ser insolúvel em água, deve ser não-inibitória ao crescimento de microorganismos, e deve ser capaz de suportar o processo de esterilização, se for utilizado um processo de esterilização. De preferência, a segunda camada adesiva 124 é suficientemente transparente quando umedecida para permitir a visualização ou formação de ' imagens de colônias bacterianas através da lâmina de cobertura 110. Em algumas modalidades, a segunda camada adesiva 124 pode compreender um adesivo sensível à pressão como um adesivo de copolímero de acrilato de isooctila/ácido acrílico sensível à alta —pressão(96%, em peso, de acrilato de isooctila e 4%, em peso, de ácido acrílico), por exemplo.
. O segundo revestimento a seco 126 compreende um reagente de detecção. Opcionalmente, o segundo revestimento a seco 126 pode compreender, ainda, um agente gelificante solúvel em água fria (por exemplo, goma guar, goma de xantana, goma de alfarrobeira), conforme descrito na patente U.S. nº 4.565.783, um nutriente, um agente de lise, um agente seletivo, ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens supracitados. O nutriente, o agente seletivo e/ou o agente de lise serão, em geral, escolhidos com base nos microorganismos a serem detectados. Alguns exemplos não-limitadores de nutrientes, agentes seletivos e reagentes de detecção adequado para detectar microorganismos podem ser encontrados nas patentes U.S. números 4.575.783, 5.089.413, 5.443.963,
5.462.860, 5.601.998, 5.635.367, 5.681.712, e 5.364.766, cada uma das quais está aqui incorporada na íntegra, a título de referência.
O agente de lise opcional pode, parcial ou completamente, causar a lise de um microorganismo, permitindo a detecção de um componente interno (por exemplo, uma enzima) do microorganismo. Os agentes de lise incluem detergentes, enzimas (por exemplo, lisozima, lisostafina) e bacteriófagos.
Em algumas modalidades, o segundo revestimento a seco 126 pode ser acoplado BR ao segundo substrato 122 mediante a adesão do revestimento 126 à segunda camada adesiva 124, conforme descrito na patente U.S. nº 4.565.783, por exemplo. Em algumas - modalidades, o segundo revestimento a seco 126 pode ser acoplado ao segundo substrato 122 aplicando-se como revestimento uma mistura líquida que compreende um reagente de detecção, opcionalmente com um agente gelificante (por exemplo, um agente gelificante solúvel em água fria), um nutriente, um agente seletivo e/ou um reagente de lise, sobre o segundo substrato 122 ou a segunda camada adesiva 124 e a subsequente secagem da mistura, conforme descrito na patente U.S. nº 4.565.783, por exemplo.
O segundo revestimento a seco 126 pode incluir um reagente de detecção que, quando colocado em contato com uma quantidade predeterminada de amostra líquida, atinge uma concentração suficiente para detectar um microorganismo-alvo embora iniba o crescimento do microorganismo-alvo. Em algumas modalidades, a quantidade de reagente de detecção no segundo revestimento a seco 126 é suficiente para detectar um —microorganismo-alvo embora iniba substancialmente o crescimento do microorganismo-alvo.
A Figura 1b mostra uma vista superior do artigo de detecção 100 da Figura 1a. À figura mostra a lâmina de cobertura 120, a região de aba 141 da camada de barreira e a região de aba 151 da membrana microporosa. A figura mostra, também, o contorno de ' : permeação opcional 153 e uma região de dobradiça 105 formada pela fita adesiva de dupla-face 130 alinhada ao longo de uma borda do artigo 100. A Figura 1c mostra uma vista em perspectiva superior do artigo 100 da Figura 1a. ' 5 O artigo100 compreende um elemento de base 110 que inclui um primeiro substrato 112, . uma primeira camada adesiva opcional 114 e um primeiro revestimento a seco 116. À Figura 1c mostra, também, a membrana microporosa 150, a camada de barreira 140 e a lâmina de cobertura 120 que inclui um segundo substrato 122, uma segunda camada adesiva opcional 124 e um segundo revestimento a seco 126. A membrana microporosa 150 inclui um contorno de permeação 153, conforme descrito anteriormente.
A Figura 2 mostra uma vista lateral explodida de uma outra modalidade de um artigo de detecção 200 de acordo com a presente descrição. O artigo 200 compreende um elemento de base 210, uma camada de barreira 240 e uma lâmina de cobertura 220, conforme descrito anteriormente. O artigo 200 compreende adicionalmente um carreador demembrana 255 que inclui uma membrana microporosa 250. ! O carreador de membrana 255 está disposto entre o elemento de base 210 e a camada de barreira 240. Em algumas modalidades, o carreador de membrana 255 é acoplado ao elemento de base 210 e/ou à camada de barreira 240 (por exemplo, via fita adesiva de dupla-face 230). O carreador de membrana 250 pode ser acoplado ao elemento de base 210 e/ouàcamada de barreira 240 por meios alternativos, conforme descrito anteriormente. O carreador de membrana 255 é configurado para suportar uma membrana ' microporosa 250. O carreador de membrana 255 é, de preferência, auto-suportado e não absorve água substancialmente. Alguns exemplos não-limitadores de materiais adequados - para o carreador de membrana 255 incluem poliéster, polipropileno ou filmes de poliestireno. Outros materiais adequados incluem materiais de papel ou papelão que compreendem um revestimento (por exemplo, polimérico) à prova de água. O carreador de membrana 255 pode ser transparente, translúcido ou opaco. O carreador de membrana 255 compreende adicionalmente uma abertura 257 que permite a comunicação fluida entre o elemento de base 210 através da membrana microporosa 250 com a lâmina de cobertura 220, quando a camada de barreira 240 é separada do artigo 200. Opcionalmente, o carreador de membrana 255 pode compreender uma região de aba 251 que se estende além de um contorno periférico do elemento de base 210 e/ou da lâmina de cobertura 220.
A abertura 257 pode ter qualquer formato, como círculo, quadrado, retângulo, hexágono, octógono, oval, ou um formato irregular, por exemplo.
A membrana microporosa 250 pode ser dimensionada para ser coextensiva com a abertura 257. Em algumas modalidades, a membrana microporosa 250 é menor que a abertura 257. Em algumas modalidades, a membrana microporosa 250 é maior que a abertura
257, conforme mostrado na Figura 2. A membrana microporosa pode ser dimensionada para ' fornecer uma área adequada para distribuir uma quantidade predeterminada de amostra líquida. Por exemplo, para distribuir uma amostra de 1 mililitro, a membrana microporosa 250 pode ser de cerca de 20 cm? a cerca de 30 cm?. Por exemplo, para distribuir uma amostra de ' 5 S5miliittos,amembrana microporosa 250 pode ser de cerca de 45 em?. A membrana microporosa 250 é acoplado ao carreador de membrana 255 (de preferência, por um adesivo) de modo que o acoplamento evite a passagem de amostra líquida entre o carreador de membrana 255 e a membrana microporosa 250. Dessa forma, a passagem de líquido de uma superfície principal da membrana microporosa 250 para a outra 10 superfície principal exige substancialmente a passagem do líquido através da membrana 250. A Figura 3a mostra uma vista lateral explodida de uma outra modalidade de um artigo de detecção 300 de acordo com a presente descrição. O artigo 300 compreende uma lâmina de cobertura 320, uma camada de barreira e uma membrana microporosa 350, conforme descrito na presente invenção. A camada de barreira 340 e a membrana microporosa 350 compreendem 15 adicionalmente regiões de aba opcionais 341 e 351, respectivamente, conforme descrito na presente invenção. A membrana microporosa 350 compreende adicionalmente uma barreira de permeação opcional 353, conforme descrito na presente invenção. Nessa modalidade, o elemento de base 310 compreende um substrato 312, uma camada adesiva opcional 314 e um revestimento a seco 316, conforme descrito na presente 20 invenção. O elemento de base compreende adicionalmente um espaçador 318. O espaçador 318, que compreende uma abertura 319, deve ser construído a partir de um : material insolúvel em água. As paredes da abertura 319, juntamente com o elemento de base 310, forma uma cavidade de recepção de amostra de tamanho e formato Í . predeterminados para confinar um volume de amostra líquida depositada no artigo 300. O 25 —espaçador 318 deve ser espesso o suficiente e a abertura 319 grande o suficiente para formar uma cavidade com o volume desejado, por exemplo, 1 mililitro, 2 mililitros, 3 mililitros, mililitros, ou mais. A espuma de polietileno ou espuma poliestireno de célula fechada são materiais adequados para o espaçador 318, mas qualquer material que seja hidrofóbico (que não se molha), inerte a microorganismos, e, de preferência, capaz de suportar um processo de esterilização pode ser usado. O espaçador 318 pode ser acoplado ao elemento de base 310, por exemplo, por um adesivo, conforme descrito na patente U.S. nº 4.565.783. Em algumas modalidades, a membrana microporosa 350 pode ser configurada no artigo 300 com um contorno de permeação 353 que coincide com o formato, o tamanho e a posição da abertura 319. Em algumas modalidades, a área da membrana microporosa — 350 delimitada pelo contorno de permeação 353 pode ser maior que a área da abertura
319. Nessas modalidades, o contorno de permeação 353 pode evitar que o líquido da amostra seja excessivamente difundido no interior da membrana microporosa 350.
A membrana microporosa 350 deve ser posicionada de modo que, durante o uso, Í pelo menos uma porção da membrana microporosa 350 se sobreponha à abertura 319. De preferência, durante o uso, a membrana microporosa 350 é posicionada de modo que a membrana microporosa 350 se sobreponha substancialmente à abertura 319. Em algumas ' 5 modalidades, aáreadamembrana microporosa 350 é maior que a área da abertura 319 e a membrana microporosa 350 estende-se além do perímetro da abertura 319.
Em algumas modalidades, o elemento de base 310, a membrana microporosa 350, a camada de barreira 340 e a lâmina de cobertura 320 podem ser acoplados uns aos outros, conforme mostrado na Figura 3a. Esses itens podem ser acoplados uns aos outros, por exemplo, com segmentos individuais de fita adesiva de dupla-face 330. Entretanto, outros meios de acoplamento, descritos acima, podem ser adequados.
A Figura 3b mostra uma vista superior do artigo de detecção 300 da Figura 3a. À figura mostra a lâmina de cobertura 320, a região de aba 341 da camada de barreira e a região de aba 351 da membrana microporosa. A Figura 3b mostra, também, o contorno de —permeação opcional 353, a abertura 319 e uma região de dobradiça 305 formada pela fita adesiva de dupla-face 330 alinhada ao longo de uma borda do artigo 300. Embora a abertura 319 da Figura 3b seja circular em formato, as aberturas 319 com outros formatos podem ser adequadas. Por exemplo, a abertura 319 pode ter um formato quadrado, oval, : retângulo, hexágono, octógono, ou pode ter um formato irregular. A Figura 3c mostra uma vista em perspectiva superior do artigo 300 da Figura 3a. O artigo 300 compreende um elemento de base 310 que inclui um primeiro substrato 112, . uma primeira camada adesiva opcional 114, um primeiro revestimento a seco 316 e um espaçador 318. A Figura 3c mostra, também, a membrana microporosa 350, a camada de . barreira 340 e a lâmina de cobertura 320 que inclui um segundo substrato 322, uma — segunda camada adesiva opcional 324 e um segundo revestimento a seco 326.
A Figura 4 mostra uma vista lateral explodida de uma outra modalidade de um artigo de detecção 400 de acordo com a presente descrição. O artigo 400 compreende uma camada de barreira 440, uma lâmina de cobertura 420 e um carreador de membrana 455 que suporta uma membrana microporosa 450, todos conforme descrito na presente invenção. O artigo compreende adicionalmente um elemento de base 410 que inclui um espaçador 418 com uma abertura 419, conforme descrito na presente invenção.
A membrana microporosa 450 pode ser configurada no artigo 400 de modo que a área da membrana microporosa 450 seja coextensiva com a abertura 419. Em algumas modalidades, a área da membrana microporosa 450 pode ser menor que a área da abertura 419. Em algumas modalidades, a área da membrana microporosa 450 pode ser menor que a área da abertura 419.
A membrana microporosa 450 deve ser posicionada de modo que, durante o uso, ' pelo menos uma porção da membrana microporosa 450 se sobreponha à abertura 419. De preferência, durante o uso, a membrana microporosa 450 é posicionada de modo que a membrana microporosa 450 se sobreponha substancialmente à abertura 419. Em algumas ' 5 —modalidades,aáreadamembrana microporosa 450 é maior que a área da abertura 419 e a membrana microporosa 450 estende-se além do perímetro da abertura 419. Método de detecção de um microorganismo: A presente descrição fornece um método para detectar um microorganismo em uma amostra líquida.
O método compreende fornecer uma amostra líquida suspeita de conter um microorganismo e qualquer modalidade de um artigo de detecção aqui descrito.
O artigo compreende um elemento de base que compreende um primeiro revestimento a seco que inclui um agente gelificante solúvel em água fria, uma membrana microporosa, | uma lâmina de cobertura que compreende um segundo revestimento a seco que inclui um reagente de detecção, e uma camada de barreira removível que forma uma barreira de fluido entre a membrana microporosa e a lâmina de cobertura.
A membrana microporosa está disposta entre o elemento de base e a camada de barreira.
Etapas adicionais do método são mostradas na Figura 5. Opcionalmente, a amostra líquida pode ser misturada ou diluída com um nutriente para facilitar o crescimento de um microorganismo (não mostrado). Opcionalmente, a amostra líquida pode ser misturada ou diluída com um agente seletivo ou um reagente de detecção (não mostrado). Em algumas modalidades, a amostra líquida pode ser misturada ou diluída com ' qualquer combinação de um nutriente, um agente seletivo e um reagente de detecção.
Em algumas modalidades, o nutriente, o agente seletivo e/ou o reagente de detecção podem ser . adicionados à amostra líquida quando o artigo de detecção não compreende um nutriente, um agente seletivo e/ou um reagente de detecção.
Em algumas modalidades, o nutriente, o agente seletivo e/ou o reagente de detecção podem ser adicionados à amostra líquida embora o artigo de detecção compreenda um nutriente, um agente seletivo e/ou um reagente de detecção.
O método compreende adicionalmente o processo 581 de colocar uma quantidade predeterminada da amostra líquida em contato com o elemento de base.
Inicialmente, é exposto o primeiro revestimento a seco do elemento de base. isso pode ser feito, por exemplo, colocando-se um artigo (vide, por exemplo, o artigo 100 das Figuras 1a e 1c) sobre uma superfície relativamente plana e levantando-se a membrana microporosa para expor o primeiro revestimento a seco.
A membrana microporosa pode ser preso pela região de aba, caso esteja presente.
Após o levantamento da membrana microporosa para expor o primeiro revestimento a seco, um volume predeterminado (por exemplo, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 5 mL) de amostra líquida é transferido (por exemplo, vertido ou pipetado) sobre o primeiro revestimento a seco, entrando, dessa forma, em contato com o primeiro revestimento a ' seco. Em algumas modalidades, a amostra líquida pode ser depositada em uma cavidade de recepção de amostra formada pela abertura em um espaçador que é acoplado ao elemento de base que compreende o primeiro revestimento a seco. : 5 O método compreende adicionalmente o processo 582 de colocar a membrana microporosa em contato com uma amostra. O contato da membrana microporosa com a amostra líquida faz com que pelo menos uma porção da amostra líquida migre para a membrana microporosa, formando uma região hidratada. O contato da membrana microporosa com a amostra líquida pode ser feito, por exemplo, simplesmente abaixando- sea membrana microporosa que foi levantada para expor o revestimento a seco. O processo 582 pode compreender, ainda, opcionalmente o uso de um dispositivo de espalhamento de inóculo (por exemplo, um espalhador usado para inocular placas de PETRIFILM, disponíveis junto à 3M Company, St. Paul, MN, EUA) para distribuir a amostra líquida em uma porção selecionada (por exemplo, uma área previamente medida) do primeiro revestimento a seco e a membrana microporosa.
O método compreende adicionalmente o processo 583 de incubar o artigo durante um primeiro período de tempo. A primeira incubação fornece as condições (isto é, tempo, temperatura) para facilitar o crescimento de um microorganismo. Um versado na técnica relevante reconhecerá que a temperatura de incubação pode ser selecionada de acordo como microorganismo a ser detectado. Por exemplo, de se for preciso detectar uma ' levedura ou um fungo, a temperatura da primeira incubação pode ser, tipicamente, de ' cerca da temperatura ambiente (cerca de 23ºC) a cerca de 32ºC. Por exemplo, se for preciso detectar uma bactéria, a temperatura da primeira incubação pode ser, tipicamente, . de cerca da temperatura ambiente a cerca de 45ºC. De acordo com a presente descrição, o primeiro período de incubação pode ser de apenas cerca de uma hora. Em algumas modalidades, o tempo da primeira incubação é menor que cerca de 4 horas (por exemplo, menos que cerca de 2 horas, menos que cerca de 3 horas, ou menos que cerca de 4 horas. Em algumas modalidades, o primeiro período de incubação é menor que cerca de 8 horas (por exemplo, menos que cerca de 5 horas, menos que cerca de 6 horas, menos que cerca de 7 horas, ou menos que cerca de 8 horas). Em algumas modalidades, o tempo da primeira incubação é menor que cerca de 12 horas (por exemplo, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, ou cerca de 12 horas. Em algumas modalidades, o primeiro período de incubação é menor que ou igual a cerca de 15 horas (por exemplo, menos que cerca de 13 horas, menos que cerca de 14 horas, ou menos que cerca de 15 horas. Em algumas modalidades, o primeiro período de incubação é de até 48 horas (por exemplo, menos que cerca de 24 horas, menos que cerca de 36 horas, ou menos que cerca de 48 horas.
É InaASIARRMLRSARAA ASLAN ARARAS ANA aaa Aa n Ah deaiAinidaeatiats Laika NA ALA 22/27 O método compreende adicionalmente o processo 584 de reposicionar a camada de Í barreira. A camada de barreira é reposicionada para proporcionar o contato entre pelo menos uma porção da região hidratada da membrana microporosa e pelo menos uma porção do segundo revestimento a seco. De preferência, a camada de barreira é reposicionada para proporcionar o contato entre toda a região hidratada da membrana microporosa e o segundo ' revestimento a seco. A camada de barreira pode ser reposicionada, por exemplo, torcendo-se ou dobrando-se a camada de barreira para proporcionar o contato entre a região hidratada e o segundo revestimento a seco. Em uma modalidade preferencial, a camada de barreira pode ser removida do artigo de detecção (isto é, a camada de barreira é inserida de maneira frouxa noartigoou é fixada de modo separável ao artigo) para proporcionar o contato entre a região hidratada da membrana microporosa e o segundo revestimento a seco.
O contato entre a região hidratada da membrana microporosa e o segundo revestimento a seco permite a hidratação do segundo revestimento a seco e, por meio disso, a interação de um reagente de detecção, um agente de lise ou um agente seletivo no segundo revestimento a seco com um microorganismo, um componente de um microorganismo e/ou um subproduto metabólico de um microorganismo. A interação pode fornecer um sinal detectável.
O método compreende adicionalmente o processo 585 de incubar o artigo durante um segundo período de tempo. Em algumas modalidades, a temperatura de incubação para o segundo período de tempo pode ser a mesma temperatura usada para o primeiro período de tempo. Em algumas modalidades, a temperatura de incubação para o segundo período de tempo pode ser diferente da temperatura usada para o primeiro período de , tempo. Vantajosamente, a temperatura de incubação para o segundo período de tempo pode ser mais alta que a temperatura usada para o primeiro período de tempo, reduzindo, . desse modo, o tempo necessário para se observar um sinal detectável.
De acordo com a presente descrição, o segundo período de incubação deve ser uma quantidade de tempo suficiente para se observar um sinal detectável. Em algumas modalidades, o segundo período de incubação é, de preferência, um período mais curto que o primeiro período de incubação. Em combinação com qualquer um dos primeiros períodos de incubação acima, o segundo período de incubação pode ser de apenas cerca de 15 minutos.
Em combinação com qualquer um dos primeiros períodos de incubação acima, o segundo período de incubação é menor que cerca de 30 minutos. Em combinação com qualquer um dos primeiros períodos de incubação acima, o segundo período de incubação é menor que ou igual a 4 horas (por exemplo, menor que ou igual a cerca de 1 hora, menor que ou igual a cerca de 2 horas, menor que ou igual a cerca de 3 horas, ou menor que ou igual a cerca de 4 horas) Em combinação com qualquer um dos primeiros períodos de incubação acima, o segundo período de incubação é menor que ou igual a 8 horas (por exemplo, menor que ou igual a cerca de 5 horas, menor que ou igual a cerca de 6 horas, menor que ou igual a cerca
É RURMRAMANINALRALASAaRLNARALRALa IRAN AAA ALALAA SANA: aaa a) nanda anna dAL ALAN ALAN 23/27 de 7 horas, ou menor que ou igual a cerca de 8 horas). Em combinação com qualquer um dos ' primeiros períodos de incubação acima, o segundo período de incubação é menor que ou igual a 12 horas (por exemplo, menor que ou igual a cerca de 9 horas, menor que ou igual a cerca de 10 horas, menor que ou igual a cerca de 11 horas, ou menor que ou igual a cerca de : 5 12 horas) Em combinação com qualquer um dos primeiros períodos de incubação acima, o R segundo período de incubação é de até a cerca de 96 horas (por exemplo, menor que ou igual a cerca de 48 horas, menor que ou igual a 72 horas, menor que ou igual a cerca de 96 horas).
O método compreende adicionalmente o processo 586 de observar uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano. A indicação pode ser observável visualmente e/ou por meio de um instrumento (por exemplo, um sistema de formação de imagens) e ambos os tipos (manual e automatizado) de detecção são contemplados pela presente descrição.
A natureza da indicação de crescimento microbiano depende, em geral, do reagente de detecção (ou pluralidade de reagentes de detecção) no artigo. Por exemplo, certos reagentes de detecção (por exemplo, substratos de enzima) produzem um produto colorido ou fluorescente detectável quando interagem com um micróbio ou um componente do mesmo. Por exemplo, certos reagentes de detecção (por exemplo, indicadores de pH) produzem uma alteração detectável de cor ou fluorescência na presença de produtos metabólicos ácidos ou básicos de microorganismos. Por exemplo, alguns reagentes de detecção (por exemplo, polímeros de polipeptídeo ou polissacarídeo) | são relativamente opacos em seu estado original e tornam-se relativamente transparentes quando degradados por microorganismos ou componentes dos mesmos.
. Em algumas modalidades, uma indicação da presença de crescimento microbiano compreende a presença de uma colônia microbiana detectável. A colônia microbiana pode . ser detectada visualmente. A colônia microbiana pode ser detectada com o uso de um sistema de formação de imagens. Sistemas adequados para a detecção de colônias microbianas são descritos, por exemplo, na publicação de patente internacional nº WO 2005/024047, nas publicações de pedido de patente U.S. números US 2004/0101954 e US 2004/0102903, e no pedido de patente U.S. nº 61/187.107 (número da Súmula do Advogado 65250US002) depositado em 15 de junho de 2009, cada uma das quais está aqui incorporada na íntegra, a título de referência. Alguns exemplos não-limitadores de sistemas de formação de imagens adequados incluem o leitor de placa PETRIFILM (PPR), disponível junto à 3M Company (St. Paul, MN), o contador de colônias PETRISCAN disponível junto à Spiral Biotech (Norwood, MA), e os scanners de placas PROTOCOL e ACOLYTE disponíveis junto à Synbiosis (Cambridge, Reino Unido).
Em algumas modalidades, uma indicação da presença de crescimento microbiano compreende a presença de uma reação, detectada visualmente ou por instrumentos, associada a uma colônia microbiana detectável não-visualmente.
Em qualquer uma das modalidades acima, o método pode compreender ' adicionalmente a enumeração de microorganismos.
Em algumas modalidades, os microorganismos podem ser enumerados pela contagem do número de colônias distintas no artigo.
Em algumas modalidades, os microorganismos podem ser enumerados pela | 5 contagem do número de reações distintas (por exemplo, zonas coloridas, zonas fluorescentes, zonas límpidas) que estão associadas a colônias detectadas não- ] visualmente no artigo.
A enumeração de microorganismos pode compreender o uso de um sistema de formação de imagens para enumerar microorganismos.
A observação de uma indicação da presença ou ausência de crescimento —microbiano pode compreender a obtenção de uma imagem do artigo.
A observação de uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano pode compreender, ainda, a impressão, a exibição ou a análise da imagem. i A invenção será adicionalmente ilustrada por referência a alguns exemplos não limitadores.
Todas as partes e porcentagens são expressas como partes, em peso, exceto onde indicado em contrário.
Exemplos Todas as partes, porcentagens, razões, etc. nos exemplos são expressas em peso, salvo se indicado de outra maneira.
Os solventes e outros reagentes usados foram obtidos junto à Sigma-Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, EUA, a menos que especificado de outro modo.
Exemplo 1 . Preparação de carreador de membrana microporosa: . Uma guarnição anular foi submetida a corte por matriz a partir de um filme de , polipropileno biaxialmente orientado (BOPP, com espessura de 0,04 mm (1,6 mil)) revestido com uma camada fina de adesivo insolúvel em água (96%, em peso, de acrilato de isooctila e 4%, em peso, de ácido acrílico). O diâmetro externo da guarnição é de aproximadamente 52,5 mm e o diâmetro interno da guarnição é de aproximadamente 45 mm.
Um orifício circular (aproximadamente 44 mm de diâmetro) submetida a corte por matriz a partir de uma lâmina retangular (aproximadamente 75 mm por 95 mm) de BOPP (espessura de 0,04 mm). Um filtro de membrana de náilon (tamanho de poro nominal de 47 mm, 0,45 mm, obtido junto à Alltech Associates (Deerfield, IL, EUA) foi centralizado sobre o orifício no lado revestido com adesivo da lâmina de BOPP.
O lado adesivo da guarnição foi centralizado sobre a borda externa da membrana filtrante e foi pressionado contra o filtro e a lâmina de BOPP, vedando a borda da membrana filtrante para a lâmina de BOPP.
Preparação do artigo de detecção: Um elemento de base foi preparado da seguinte forma.
Um filme de plástico (Microamp Optical Adhesive Film, número de peça 4311971 obtido junto à Applied Biosystems, Foster City,
CA, EUA) compreendendo adesivo de silicone sobre uma superfície principal foi revestido com ' pó (sobre a superfície adesiva) com uma combinação de goma guar Meyprogat (M150) e caldo de nutrientes de métodos-padrão a uma razão de 2:1, conforme descrito na patente U.S. nº
4.565.783. A composição do caldo de nutrientes de métodos-padrão está relacionada na Tabela ] 5 1.0 peso de revestimento do pó é de aproximadamente 20,1 mg/cm? (8 grãos por 24 polegadas quadradas). Um espaçador de espuma (espuma de revestimento de poliestireno, com 0,5 mm ] de espessura, disponível junto à American Fuji Seal Inc., Bardstown, KY, EUA) com uma camada fina de adesivo insolúvel em água sobre um lado e uma abertura circular de cerca de cm foi laminado no lado revestido do elemento de base.
Tabela 1. Formulação do caldo de nutrientes de métodos-padrão. Todos os componentes foram adicionados como pós e cuidadosamente misturados antes do uso. (Prvetodesdo fas [Fosfato de potássio díbésico [o sódio foi adicionada de modo que, quando dissolvida em água desionizada, a mistura tinha um pH de aproximadamente 7,0. - Foi preparada uma lâmina de cobertura. Um filme adesivo óptico (Microamp - Optical Adhesive Film) com uma camada fina de adesivo de transferência foi revestido - com pó com uma mistura de caldo de nutrientes de métodos-padrão e 0,2%, em peso, de cloreto de trifenil tetrazólio. O peso de revestimento dessa mistura é de aproximadamente 20,1 mg/cm? (8 grãos por 24 polegadas quadradas).
Um artigo de detecção multicamada foi preparado da seguinte forma. O elemento de base foi colocado sobre uma superfície plana com o lado revestido voltado para cima. O carreador de membrana microporosa foi colocado sobre o elemento de base com o lado de guarnição voltada para o lado oposto do elemento de base. A membrana foi centralizada sobre a abertura circular no espaçador do filme de nutrientes. Uma camada de barreira de BOPP (aproximadamente 75 mm por 95 mm por 0,4 mm de espessura) foi colocada sobre a camada de membrana. A lâmina de cobertura foi colocada sobre a camada de barreira com o lado revestido da lâmina de cobertura voltado para a camada de barreira. A pilha de —quatrocamadas de filmes foi, então, grampeada ao longo de um lado.
Exemplo 2
| MONS andado oito ia ads aaa saio aaaaáasa sambas aaa ana sas ssa saia aa NAL sssLs— 26/27 | Um artigo de detecção foi produzido conforme o Exemplo 1, com a exceção de ' que o carreador de membrana foi produzido a partir de um filme de BOPP que não incluiu uma camada fina de adesivo sobre um lado.
Exemplo 3 BR 5 O artigo de detecção foi inoculado com ATCC 6538 de Staphylococcus aureus (1 mL de solução de 100 UFC/mL) e incubado a 37ºC durante 6 horas.
O filme de barreira | foi, então, removido e a incubação continuou a 37ºC até 24 horas após a inoculação.
Colônias vermelhas individuais eram visíveis através do elemento de base.
Uma área avermelhada de crescimento era também visível através da lâmina de cobertura, embora as colônias não fossem definidas tão claramente como quando visualizadas através do elemento de base.
Foi observado o umedecimento da membrana microporosa pela amostra líquida.
As colônias foram fotografadas com uma câmara digital.
Exemplo 4 Os artigos de detecção do Exemplo 2 foram inoculados com 100 unidades formadoras decolôniade Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e incubados a 37ºC.
Após 6 horas e 8 horas de incubação, respectivamente, os artigos individuais foram removidos do incubador e o filme de barreira foi, então, removido.
Após a remoção dos filmes de barreira, os artigos foram incubados a 37ºC até 24 horas após a inoculação.
Foram observadas colônias vermelhas nos artigos.
Exemplo 5 Os artigos de detecção do Exemplo 1 foram inoculados com 100 unidades formadoras de colônia (UFC) de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e incubados a 37ºC durante 6 a 8 . horas, respectivamente.
O filme de barreira foi removido e a incubação continuou a 37ºC até 24 - horas após a inoculação.
Foram observadas colônias vermelhas nos artigos.
Exemplos 6 a 7 e exemplos comparativos C-1 e C-2 Um artigo de detecção foi construído conforme o Exemplo 2 e foi inoculado com Pseudomonas fragi (ATCC 51821) a uma concentração de cerca de 100 unidades formadoras de colônia (Exemplo 6). Um segundo artigo de detecção foi construído conforme o Exemplo 2 e foi inoculado com Microbacterium esteraromaticum (ATCC 51822) a uma concentração de cerca de 100 unidades formadoras de colônia (Exemplo 7). Para comparação, placas de contagem aeróbica 3M PETRIFILM (disponíveis junto à 3M Company, St.
Paul, MN, EUA) também foram inoculadas com Pseudomonas fragi e Microbacterium esteraromaticum (Exemplos comparativos C-1 e C-2, respectivamente) a uma concentração de cerca de 100 unidades formadoras de colônia para cada placa.
As amostras foram incubadas a 28ºC durante 6 horas.
Os filmes de barreira foram entãoremovidos dos exemplos 6 e 7 e a incubação continuou a 28ºC.
Vinte horas após a inoculação, as colônias eram fracamente visíveis para os exemplos 6 e 7, mas não para os exemplos comparativos C-1 e C-2. Vinte e quatro horas após a inoculação, as colônias
RN A 27/27 eram claramente visíveis para os exemplos 6 e 7, mas não eram visíveis para os exemplos comparativos C-1 e C-2. Quarenta e oito horas após a inoculação, as colônias eram visíveis para os exemplos comparativos C-1 e C-2. Esses exemplos mostram que permitir que o crescimento ocorra durante um período de tempo antes da exposição das células a í 5 umreagente de detecção (TTC) pode resultar em um tempo mais curto de detecção. ] A presente invenção foi descrita, até aqui, com referência a várias realizações ' específicas previstas pelo inventor para as quais descrições capacitadoras estão disponíveis.
Modificações insubstanciais da invenção, incluindo modificações que não foram previstas presentemente, podem, não obstante, constituir equivalentes da mesma.
Dessa forma, o escopo da presente invenção não deveria ser limitado pelos detalhes e estruturas aqui descritos, mas, em vez disso, apenas pelas reivindicações a seguir, e equivalentes das mesmas. í | . o ; | i REIVINDICAÇÕES
1. Artigo para detectar ou enumerar micro-organismos em uma amostra, ' CARACTERIZADO por compreender: um elemento de base que compreende um substrato impermeável à água auto- suportado com superfícies principais superiores e inferiores, sendo que a superfície principal superior compreende um primeiro revestimento a seco que inclui um agente gelificante solúvel em água fria, uma membrana microporosa, 2 uma lâmina de cobertura que compreende um segundo revestimento a seco que inclui um reagente de detecção, * uma camada de barreira configurada para formar uma barreira de fluido entre a membrana microporosa e a lâmina de cobertura, e sendo que a membrana microporosa está disposta entre o elemento de base e a camada de barreira.
2. Artigo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a membrana microporosa compreende adicionalmente uma zona de confinamento de amostra.
3. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 ou 2, CARACTERIZADO por compreender, ainda, uma pluralidade de reagentes de detecção.
4. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1, 2 ou 3, CARACTERIZADO por compreender, ainda, um agente de lise.
5. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1, 2, 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de detecção compreende um reagente de detecção não precipitante.
6. Método para detectar a presença ou ausência de um micro-organismo em uma amostra, CARACTERIZADO por compreender: fornecer: um amostra líquida suspeita de conter um micro-organismo, ; um artigo de detecção que compreende: um membro de base que compreende um primeiro revestimento a seco que inclui . um agente gelificante solúvel em água fria, uma membrana microporosa, uma lâmina de cobertura que compreende um segundo revestimento a seco que inclui um reagente de detecção, uma camada de barreira que forma uma barreira de fluido entre a membrana microporosa e a lâmina de cobertura, | [——««——-——«—<—-—.—————m—————E—E——EE E ——==—————— À ÂÀ" "
: sendo que a membrana microporosa está disposta entre o elemento de base e a ' camada de barreira, ' colocar uma quantidade predeterminada da amostra em contato com o primeiro revestimento a seco, colocar a membrana microporosa em contato com a amostra, incubar o artigo por um primeiro período de tempo, reposicionar a camada de barreira para fornecer contato entre a lâmina de cobertura e a membrana microporosa, z incubar o artigo por um segundo período de tempo, e : 10 observar uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano.
: 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o artigo compreende adicionalmente um espaçador que forma uma cavidade de recepção de amostra com o elemento de base, sendo que o contato de uma quantidade predeterminada da amostra com o primeiro revestimento a seco compreende transferir a amostra para a cavidade de recepção de amostra.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, CARACTERIZADO por compreender, ainda, misturar a amostra com um nutriente, um agente seletivo, um reagente de detecção, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos anteriores.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro período de tempo é de cerca de 1 hora a cerca de 48 horas.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7, 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo período de tempo é de cerca de 15 —minutosacercade 96 horas ou menos.
.
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Claims (28)

: 18 REIVINDICAÇÕES
1. Artigo para detectar ou enumerar micro-organismos em uma amostra, CARACTERIZADO por compreender; um elemento de base que compreende um substrato impermeável de água auto- suportado com superfícies principais superior e inferior, sendo que a superfície principal superior compreende um primeiro revestimento a seco que inclui um agente gelificante solúvel em água fria.
uma membrana microporosa; uma lâmina de cobertura que compreende um segundo revestimento a seco que inclui um reagente de detecção; uma camada de barreira configurada para formar uma barreira de fluido entre a membrana microporosa e a lâmina de cobertura; e sendo que a membrana microporosa está disposta entre o elemento de base e a camada de barreira.
2. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO por compreender, adicionalmente, um espaçador com uma abertura, sendo que o espaçador é acoplado ao elemento de base, sendo que o elemento de base % forma uma cavidade de recepção de amostra. 2
3. Artigo, de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a lâmina de cobertura é fixada ao elemento de base.
4, Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a membrana microporosa é fixada ao elemento de base.
5. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a camada de barreira é fixada ao elemento de base.
6. Artigo, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a camada de barreira é fixada de modo separável ao elemento de base.
7. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a membrana microporosa compreende um material selecionado do grupo consistindo em poliéter sulfona, náilon, policarbonato, poliéster, acetato de celulose, ésteres de celulose misturados, fluoreto de polivinilideno, nitro celulose, uma cerâmica, um derivado de qualquer um dos anteriormente mencionados, e uma combinação de quaisquer duas ou mais dos anteriores.
8. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a membrana microporosa compreende — adicionalmente uma zona de confinamento de amostra.
9. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO por compreender, ainda, um meio de nutriente.
DR
' 28
10. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO por compreender, ainda, um agente seletivo.
11. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO por compreender, ainda, uma pluralidade de reagentes de detecção.
12. Artigo, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos dois da pluralidade de reagentes de detecção diferenciam pelo menos dois tipos de micro-organismos.
13. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a lâmina de cobertura compreende, ainda, um agente gelificante solúvel em água fria.
14. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO por compreender, ainda, um agente de lise.
15. Artigo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de detecção compreende um reagente de detecção não precipitante.
16. Método para detectar a presença ou ausência de um micro-organismo em uma amostra, CARACTERIZADO por compreender: i fornecer: . um amostra líquida suspeita de conter um micro-organismo; um artigo de detecção que compreende: um membro de base que compreende um primeiro revestimento a seco que incldui um agente gelificante solúvel em água fria; uma membrana microporosa; uma lâmina de cobertura que compreende um segundo revestimento a seco que inclui um reagente de detecção; uma camada de barreira configurada para formar um barreira de fluido entre a membrana microporosa e a lâmina de cobertura; sendo que a membrana microporosa está disposta entre o elemento de base e a camada de barreira; colocar uma quantidade predeterminada da amostra em contato com o primeiro revestimento a seco; colocar a membrana microporosa em contato com a amostra; incubar o artigo por um primeiro período de tempo; reposicionar a camada de barreira para fornecer contato entre a lâmina de —coberturaeamembrana microporosa; incubar o artigo por um segundo período de tempo; e observar uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano.
' 33
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o reposicionamento da camada de barreira compreende remover a camada de barreira do artigo.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o artigo compreende adicionalmente um espaçador que forma uma cavidade de recepção de amostra com o elemento de base, sendo que contactar uma quantidade predeterminada da amostra com o primeiro revestimento a seco compreende transferir a amostra para a cavidade de recepção de amostra.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, CARACTERIZADO por compreender, ainda, misturar a amostra com um nutriente, um agente seletivo, um reagente de detecção, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos anteriores.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro período de tempo é cerca de 1 hora a cerca de 48 horas.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro período de tempo é cerca de 4 horas a cerca de 6 horas.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo período de tempo é cerca de 15 minutos a . cerca de 968 horas ou menos.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo período de tempo é cerca de 15 minutos a cerca de 6 horas.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo período de tempo é cerca de 2 horas a cerca de 4 horas.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma porção do primeiro revestimento a seco compreende uma pluralidade e reagentes de detecção, sendo que observar uma indicação de crescimento microbiano compreende detectar e diferenciar dois ou mais tipos de micro-organismos.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 25, “CARACTERIZADO pelo fato de que observar uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano compreende enumerar pelo menos um tipo de micro-organismo.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que observar uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano compreende obter uma imagem do artigo.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que observar uma indicação da presença ou ausência de crescimento microbiano compreende adicionalmente imprimir, apresentar ou analisar a imagem.
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