CN102713616B - 微生物检测制品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测液体样品中的微生物的制品。该制品包括用于选择性调节样品和检测试剂之间的接触的微孔膜和阻挡层。本发明还提供了一种使用方法。

Description

微生物检测制品
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2009年12月30日提交的美国临时专利申请No.61/291,245的权益，该美国临时专利申请全文以引用的方式并入本文中。
背景技术
当表面被细菌、真菌、酵母、病毒或其他微生物污染时，可能引发疾病（发病），有时甚至导致死亡（致死）。当食品加工厂和医疗卫生场所（如医院）中的表面被微生物污染时，尤其如此。
在食品加工厂中，表面（例如，固体表面、设备表面、防护服等）可能变得被污染。此类污染可能由肉类或其他食物引起，或转移到肉类或其他食物上。在医疗卫生场所中，微生物可能会从被感染的个体或以其他方式释放到表面（如固体表面、设备表面、衣物等）上。一旦表面被微生物污染，与被污染表面接触就会轻易地将微生物转移至其他位置，例如其他表面、个体、设备、食物等。
众所周知，某些环境中的微生物污染和转移可能会引起严重的健康风险。例如，来自受污染的食品加工厂的食品将随后被吃掉，并可能引起疾病，并且可能引起死亡。特别相关的是诸如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)和大肠埃希氏杆菌O157:H7之类的微生物。
微生物污染涉及于医疗卫生场所中，因为这种场所的某些患者常常遭受病原微生物的感染，因而将病原微生物带入这类场所中。另外，处于这类场所中的许多人（例如患者）是患病的，可能会免疫失能。因而，这些个体因受污染微生物的感染而患病的风险增大。
发明内容
本发明涉及用于检测微生物的制品和方法。具体地讲，本发明涉及多层检测制品，该制品可用于在重新定位或去除多层中的一层以将微生物暴露于检测试剂之前允许微生物在有限时间段内生长。
在一个方面，本发明提供了用于检测样品中的微生物并对其进行计数的制品。所述制品可包括基体构件、微孔膜、覆盖片材和阻挡层。所述基体构件可包括具有上主表面和下主表面的水不能透过的自支承基材。基体构件的上主表面可包括含有冷水溶性胶凝剂的第一干涂层。覆盖片材可包括含有检测试剂的第二干涂层。阻挡层可被构造用于在微孔膜和覆盖片材之间形成流体阻挡。微孔膜可设置在基体构件和阻挡层之间。
在前述任一个实施例中，所述制品还可包括垫片。所述垫片可包括孔。所述垫片可连接到所述基体构件，以形成样品接纳凹槽。
在前述任一个实施例中，覆盖片材可附着于基体构件。在前述任一个实施例中，微孔膜可附着于基体构件。在前述任一个实施例中，阻挡层可附着于基体构件。在前述任一个实施例中，阻挡层可以可分离的方式附着于基体构件。
在前述任一个实施例中，所述微孔膜可含有选自以下的材料：聚醚砜、尼龙、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纤维素、混合的纤维素酯、聚偏二氟乙烯、硝化纤维、陶瓷、以上材料中任一种的衍生物以及以上材料中的任意两种或更多种的组合物。
在前述任一个实施例中，所述微孔膜还可包括渗透边界。在前述任一个实施例中，所述制品还可包括营养培养基。在前述任一个实施例中，所述制品还可包括选择剂。在前述任一个实施例中，所述制品还可包括多种检测试剂。在前述任一个实施例中，所述多种检测试剂中的至少两种可区分至少两种类型的微生物。
在前述任一个实施例中，所述覆盖片材还可包括冷水溶性胶凝剂。
在另一个方面，本发明提供了一种检测样品中是否存在微生物的方法。所述方法可包括提供怀疑含有微生物的液体样品和检测制品。所述检测制品可包括基体构件、微孔膜、覆盖片材和阻挡层，该阻挡层在微孔膜和覆盖片材之间形成流体阻挡。所述基体构件可包括含有冷水溶性胶凝剂的第一干涂层。所述覆盖片材可包括含有检测试剂的第二干涂层。微孔膜可设置在基体构件和阻挡层之间。所述方法还可包括使预定量的所述样品接触所述第一干涂层。所述方法还可包括使所述微孔膜接触所述样品。所述方法还可包括将所述制品孵育第一时间段。所述方法还可包括将所述阻挡层重新定位，以在所述覆盖片材和所述微孔膜之间提供接触。所述方法还可包括将所述制品孵育第二时间段并且观察微生物生长是否存在的指征。
在前述任一个方法的实施例中，重新定位所述阻挡层的步骤可包括从所述制品去除所述阻挡层。
在前述任一个方法的实施例中，所述制品还可包括与所述基体构件形成样品接纳凹槽的垫片。在这些实施例中，使预定量的所述样品接触所述第一干涂层的步骤可包括将所述样品转移到所述样品接纳凹槽中。
在前述任一个方法的实施例中，所述方法还可包括将所述样品与营养物质、选择剂、检测试剂或以上物质中的任何两种或更多种的组合物混合的步骤。
在前述任一个方法的实施例中，所述第一时间段可以是约1小时至约48小时。
在前述任一个方法的实施例中，所述第二时间段可以是约15分钟至约96小时。
在前述任一个方法的实施例中，所述第一干涂层的至少一部分可包括多种检测试剂。在这些实施例中，观察微生物生长的指征的步骤可包括检测并区分两种或更多种类型的微生物。
在前述任一个方法的实施例中，观察是否存在微生物生长的指征可包括对至少一种类型的微生物进行计数。在前述任一个方法的实施例中，观察是否存在微生物生长的指征可包括得到所述制品的图像。在前述任一个方法的实施例中，观察是否存在微生物生长的指征还可包括打印、显示或分析所述图像。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些有益效果的本发明的实施例。然而，在相同的情况或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的表述并不暗示其他实施例是不可用的，且并非意图将其他实施例排除在本发明范围之外。
本文所用的“一种（个）”、“所述（该）”、“至少一种（个）”以及“一种或多种（一个或多个）”可互换使用。因此，例如，含有“一种”微生物的样品可被理解为意指该样品可包含“一种或多种”微生物。
术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组合。
还有，本文通过端点表述的数值范围包括该范围内的所有数值（比如，1到5包含1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等）。
本发明的上述发明内容并非意图描述本发明的每一个公开的实施例或每种实施方式。以下具体实施方式更具体地举例说明了示例性实施例。在整个专利申请的若干地方，通过实例列表提供了导引，其中可以按多种组合方式来使用实例。在每一种情形下，所列举的列表仅仅作为代表性群组，而不应被理解为排他性列表。
附图说明
将参照下面列出的附图来进一步说明本发明，其中在全部视图中类似的结构由类似的数字标注。
图1a是根据本发明的包括微孔膜的检测制品的一个实施例的分解侧视图。
图1b是图1a的检测制品的俯视图。
图1c是图1a的检测制品的局部剖视的顶部透视图。
图2是根据本发明的包括连接到膜载体的微孔膜的检测制品的一个实施例的分解侧视图。
图3a是根据本发明的包括垫片和微孔膜的检测制品的一个实施例的分解侧视图。
图3b是图3a的检测制品的俯视图。
图3c是图3a的检测制品的局部剖视的顶部透视图。
图4是根据本发明的包括连接到膜载体的微孔膜和垫片的检测制品的一个实施例的分解侧视图。
图5是根据本发明的用于检测液体样品中的微生物的方法的一个实施例的框图。
具体实施方式
在详细说明本发明的任何实施例之前，应当理解，本发明并不将其应用局限于以下描述所提及的或附图所示出的具体构造和组件布置方式。本发明可具有其他实施例，并且能够以多种方式实践或实施。另外还应理解，本文中所用的用语和术语的目的是为了进行说明，不应被认为是限制性的。本文所用“包括”、“包含”、“含有”或“具有”及其变型形式意指涵盖列在其后的项目及其等同形式以及额外项。除非另外规定或限制，否则术语“支承”和“连接”及其变型形式以其广义使用，并且涵盖直接和间接支承与连接。应理解，其他的实施例也可采用，且可在不偏离本发明范围的情况下作出结构变化或逻辑变化。此外，诸如“前”、“后”、“顶部”、“底部”之类的术语仅用于描述元件彼此的关系，而决不用来描述装置的具体取向，也不用来指示或暗示装置的必要或需要的取向，或用来规定本文所述发明在使用过程中的操作、安装、显示或设置方式。
本发明整体涉及用于检测液体样品中的微生物的方法和制品。多层检测制品提供i)可重新定位或可去除阻挡层，阻挡层被构造用于控制生长的微生物暴露于检测试剂和/或选择剂和ii)微孔膜，其用于防止液体样品中存在的微生物及其后代和阻挡层之间直接接触。通过防止微生物和阻挡层之间直接接触，消除了当阻挡层相对于制品重新定位或者从制品去除阻挡层时微生物在制品内扩散和/或微生物脱离制品的可能性。
本发明的发明多层制品允许使用相对高浓度的检测试剂，以缩短检测微生物所需的时间量。因为在制品中存在阻挡层，所以防止了在第一孵育时间段期间微生物暴露于检测试剂（检测试剂的可能存在量可以对微生物表现出抑制性或毒性）。在第一孵育时间段之后，可以重新定位或去除阻挡层，从而将微生物（如果存在的话）暴露于检测试剂。本发明的制品可包括可选的裂解剂和/或选择剂，阻挡层也可以在第一孵育时间段期间隔绝该裂解剂和/或选择剂与微生物的接触。
本发明的制品和方法允许使用可扩散的检测试剂。当用在传统制品（例如，琼脂培养皿）中时，可扩散的检测试剂（例如，下述的被水解成水溶性可检测产物的生色底物或荧光酶底物）可以横向地扩散通过检测装置，成为大的有色或荧光区。这些区可能叠置两个或更多个微生物菌落，从而难以测定该区只是由一个菌落生成的还是由不止一个菌落生成的。通过提供在微生物暴露于可扩散的检测试剂之前允许其生长的制品，用户可以缩短将微生物暴露于检测试剂的时间量，从而使指示剂的扩散程度最小并且减小对应的有色或荧光区的大小。因此，与传统的制品和方法相比，本发明的制品和方法提高了对不止一个微生物菌落的分辨率。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。与本文所述的方法和材料类似或等同方法和材料可用于实践本发明，并且以下描述了示例性的合适方法和材料。例如，方法可以描述为包括不止两个步骤。在这类方法中，为实现限定的目标，可能并非所有步骤都是需要的，并且本发明设想使用孤立的步骤来实现这些分立的目标。所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献的公开内容都以全文引用方式并入本文中。另外，材料、方法和实例仅是示例性的，并无意于限制本发明。
如本文使用的“靶微生物”是指要检测的特定微生物（即，微生物菌种）或特定微生物组（例如，微生物的特定属、大肠杆菌、耐抗生素细菌）。
样品和微生物
本发明的一个方面是，其可用于检测各种各样的表面上存在的生物体。本发明的装置和方法可用于希望检测样品中是否存在微生物的各种应用；所述样品包括（但不限于）食品样品（例如，原材料、在制食物物料、成品）、表面（例如，环境表面、食品加工表面、设备）、水（例如，表面水、加工水）和饮料（例如，鲜奶、巴氏灭菌牛奶、果汁)。这些样品可基本上由单独的或成多种组合的固体、半固体、凝胶状或液态材料组成。本发明的装置以及本发明的方法可用于定性或定量地测定一种或多种所关注的微生物的存在。
一种示例性的所关注的临床分析物是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。这是一种引起广谱感染的病原体，所述感染包括：浅表损伤，例如小的皮肤脓肿和伤口感染；全身性且致命的病症，例如心内膜炎、肺炎和败血病；以及中毒症，例如食物中毒和中毒性休克综合征。某些菌株（如耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌或MRSA）对除了少数之外的所有选择抗生素有抗性。
要在食品加工区域中检测的示例性的所关注分析物是李斯特菌属的成员。李斯特菌属被分类为革兰氏阳性杆状细菌并且由如下种组成：单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、无害李斯特菌(L.innocua)、威氏李斯特菌(L.welshimeri)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、绵羊李斯特菌(L.ivanovii)和格雷氏李斯特菌(L.grayi)。其中，单核细胞增多性李斯特菌是造成大多数人李斯特菌病例的原因，并且免疫失能的、孕妇、老年人和新生儿具有增加的感染易感性。李斯特菌病的最普通症状是败血病、脑膜炎和流产。
特别关注用于分析目的的其他微生物包括原核生物和真核生物，特别是革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、支原体和酵母。特别相关的生物体包括如下科属的成员：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，或微球菌科(Micrococcaceae)或葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、军团菌属(Legionellaspp.)、志贺杆菌属(Shigella spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、肠埃希杆菌属(Escherichia spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium spp.)、棒杆菌属(Corynebacteria spp.)以及曲霉菌属(Aspergillus spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)和假丝酵母菌属(Candida spp.)。毒性特别强的生物体包括金黄色葡萄球菌（包括抗性菌株例如耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)）、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(S.agalactiae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)、万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌(VISA)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠埃希氏杆菌、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(A.fumigatus)、棒曲霉(A.clavatus)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、厚孢镰刀菌(F.chlamydosporum)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克鲁斯念珠菌(C.krusei)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、大肠埃希氏杆菌O157、含ESBL的微生物以及多重抗药性的革兰氏阴性杆菌(MDR)。
检测制品
本发明提供了用于检测样品中是否存在微生物的制品。图1a示出根据本发明的检测制品100的一个实施例的分解侧视图。该制品包括基体构件110，该基体构件包括水不能透过的第一基材112、粘附于第一基材112的可选第一粘合剂层114以及第一干涂层116。
第一基材112优选地是自支承的并且基本不吸水。适用于第一基材112的材料的非限制性例子包括聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯膜。其他适用材料包括具有防水（例如，聚合物型）涂层的纸张或硬纸板材料。第一基材112可以是透明的、半透明的或不透明的，这取决于是否想要透过该基材112观察细菌菌落。为了有利于对细菌菌落进行计数，第一基材112可在上面印刷有正方形网格图案，如在美国专利No.4,565,783中所述的，该专利以引用方式并入本文中。用于构造第一基材112的材料应该对微生物具有相对惰性，并且优选地应该与消毒过程（例如，环氧乙烷消毒）相配合。
在一些实施例中，基体构件110还可包括粘附于第一基材112的主表面的可选第一粘合剂层114。第一粘合剂层114可以是水不溶性的，应该对于微生物的生长是非抑制性的，并且应该能够经受住消毒过程（如果用到消毒过程的话）。优选地，第一粘合剂层114在润湿时是充分透明的，以能够透过涂覆有粘合剂层114的第一基材112观察细菌菌落。在一些实施例中，例如，第一粘合剂层114可包括压敏粘合剂，如增粘高压敏感的丙烯酸异辛酯/丙烯酸共聚物粘合剂（96重量%的丙烯酸异辛酯和4重量%的丙烯酸）。
在一些实施例中，第一基材112可包括覆盖基材112的整个主表面的第一粘合剂层114。在一些实施例中，第一基材112可包括只覆盖基材112的一部分主表面的第一粘合剂层114。
第一干涂层116包括冷水溶性胶凝剂（例如，瓜耳胶、黄原胶、刺槐豆胶），如以引用方式全文并入本文的美国专利No.4,565,783中所描述的。可选地，干涂层116还可包括营养培养基、选择剂、检测试剂或以上两种或更多种的任意组合。营养培养基、选择剂和/或检测试剂应该基本不妨碍胶凝剂并且通常将基于要检测的微生物来进行选择。用于检测微生物的适用的营养物质、选择剂和检测试剂的非限制性例子可见于美国专利No.4,575,783、No.5,089,413、No.5,443,963、No.5,462,860、No.5,601,998、No.5,635,367、No.5,681,712和No.5,364,766，这些专利的全文以引用方式并入本文。制备第一干涂层116中的营养培养基、选择剂和/或检测试剂的量，使得当接触预定量的液体样品时，它们有助于微生物的生长和/或检测。
在一些实施例中，例如，通过用第一粘合剂层114粘附涂层116，可将第一干涂层116（例如，干粉胶凝剂；可选地具有干粉营养物质、选择剂和/或检测试剂）连接到第一基材112，如在美国专利No.4,565,783中所描述的。在一些实施例中，例如，通过含有胶凝剂（可选地具有干粉营养物质、选择剂和/或检测试剂）的液体混合物涂覆到第一基材112或第一粘合剂层114上并且之后将混合物干燥，可以将第一干涂层116连接到第一基材112，如在美国专利No.4,565,783中所描述的。在一些实施例中，第一基材112可包括覆盖基材112的整个主表面的第一干涂层116。在一些实施例中，第一基材112可包括只覆盖基材112的一部分主表面的第一干涂层116。
重新参考图1a，制品100还包括微孔膜150。在一些实施例中，微孔膜150或其一部分连接到基体构件110。在图示实施例中，微孔膜150借助双面粘合剂带130的带连接到基体构件110，但是本领域的普通技术人员将认识到其他连接手段（例如，粘合剂、热粘合、超声焊接）可能是合适的。可选地，微孔膜150可包括凸块区151，该凸块区延伸超出基体构件110和/或覆盖片材120的外围边界。
微孔膜150可含有本领域已知的各种水可渗透的微孔膜材料中的任一种，包括（例如）纤维素膜（例如，醋酸纤维素、混合的纤维素酯、硝化纤维）、尼龙、聚碳酸酯、聚醚砜、尼龙、聚酯、聚偏二氟乙烯、陶瓷、以上任何物质的衍生物和以上任何两种或更多种物质的组合。根据要检测的微生物，选择微孔膜150的标称孔尺寸。例如，约0.05μm至约1.2μm（例如，0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.45μm、0.8μm或1.2μm）优选地约0.2μm至约0.45μm的标称孔尺寸可用于检测细菌。在一些实施例中，约0.05μm至约3μm（例如，0.45μm、0.8μm、1.2μm或3μm）优选地约0.45μm至约1.2μm的标称孔尺寸可用于检测酵母和/或霉菌。
在任一个实施例中，微孔膜150应该被构造用于形成阻挡件，用于防止沉积在基体构件110上的液体样品中的微生物传递物接触阻挡层140。在一些实施例中，这可以通过以下步骤实现：选择样品容积和/或确定微孔膜150的尺寸，使得液体样品不能扩散或超出微孔膜150的外缘。在一些实施例（如图1中所示）中，微孔膜150的尺寸可以被设计为与基体构件110的尺寸至少共延。通过如上所述将微孔膜150连接到基体构件110，有利地可以保持微孔膜150正确定位，以避免样品和阻挡层140之间的直接接触。
微孔膜150还可包括可选的横向渗透边界153，用于将液体的横向渗透限定至微孔膜150的选定部分。渗透边界153例如包括微孔膜150的已被处理（例如，已施用某一组分）以限制含水样品移动经过和/或透过微孔膜的区域。例如，疏水性组分（例如，蜡）可以按例如圆形图案（参见图1b）施用，并且被允许渗透微孔膜150。该组分会形成阻挡，以基本防止含水液体横向扩散透过微孔膜150。因此，将基本防止渗透边界153一侧的区域中与微孔膜150接触的液体样品横向扩散透过微孔膜150，到达渗透边界另一侧的区域。
制品100还包括阻挡层140。在一些实施例中，阻挡层140以可分离的方式连接到微孔膜150，如图1中所示。阻挡层140可借助双面粘合剂带130的带连接到微孔膜150。优选地，阻挡层140还包括分离部件（例如，穿孔145），以有助于从制品100分离和去除阻挡层140。可选地，阻挡层140可包括凸块区141，该凸块区延伸超出基体构件110和/或覆盖片材120的外围边界。
已经认识到，其他连接手段（例如，粘合剂、热粘合、超声焊接）可适于将阻挡层140附着于微孔膜150。还已经认识到，阻挡层140可以直接连接到基体构件110，前提是微孔膜设置在基体构件110和阻挡层140之间。在替代实施例中，可以在双面粘合剂带130的至少一侧使用某些低粘合性的粘合剂混合物，如以引用方式全文并入本文的美国专利No.5,118,750中描述的那些粘合剂混合物，以在阻挡层与微孔膜150和覆盖片材120之间都形成可分离的附着。在又一个替代实施例（未示出）中，在接种制品100之前和/或之后，可以将阻挡层140松弛地设置在微孔膜150和覆盖片材120之间。
阻挡层140应该是防水的。阻挡层140优选地是透明的，以使得能观察位于阻挡层140下面的物体，并且对于细菌、水和水汽基本上不可渗透的。通常，阻挡层140可以与基体构件110具有相同的性质。用于阻挡层140的示例性材料包括（例如）聚丙烯膜（例如1.6密耳的双轴取向聚丙烯(BOPP)）或聚乙烯薄膜。阻挡层140被示出为具有可选延伸部分（凸块141），这有利于抓握阻挡层140并从制品110去除阻挡层。
制品100还包括覆盖片材120。覆盖片材120优选地连接（直接地或间接地）到基体构件110。在图示实施例中，覆盖片材120借助双面粘合剂带130的带连接到阻挡层140。已经认识到，其他连接手段（例如，粘合剂、热粘合、超声焊接）可适于将覆盖片材120附着于微孔膜阻挡层140。还已经认识到，覆盖片材120可以直接连接到基体构件110，前提是微孔膜设置在基体构件110和覆盖片材120之间。覆盖片材120包括水不能透过的第二基材122、可选第二粘合剂层124和第二干涂层126。第二干涂层126包括用于检测微生物的检测试剂。
可以通过目测和/或通过使用自动检测器对检测试剂进行检测。自动检测器可包括成像系统。检测试剂可以是生色底物、荧光底物或产荧光底物。在任一个实施例中，检测试剂在接触预定量的液体样品时到达足以检测靶微生物的浓度。有利地，第二干涂层126中的检测试剂的量可高得足以快速检测是否存在靶微生物，即使液体样品中的高浓度检测试剂也抑制了靶微生物的生长。在一些实施例中，第二干涂层126中的检测试剂的量足以检测靶微生物，即使其基本抑制了靶微生物的生长。第二干涂层126中相对较高量的检测试剂与相对较低量的检测试剂相比，允许更快速地检测靶微生物，即使所述相对较高量基本会抑制微生物的生长。
检测试剂可以是所存在的微生物类型的非特异性指示剂，或者它可以是所存在的微生物类型的特异性指示剂。非特异性检测试剂的非限制性例子包括pH指示剂（例如，偶氮苯pH指示剂（例如，甲基红）、磺酞pH指示剂（例如，溴甲酚紫、氯酚红、溴百里酚蓝、溴甲酚蓝）和蒽醌pH指示剂（例如，茜素红S一水合物、3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸、钠盐）和氧化还原指示剂（例如，氯化三苯基四唑(TTC)、3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MMT)、2,3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺酸苯基]-2H-四唑鎓-5-羟基苯胺内盐(XTT)、硝基蓝四唑鎓）。
检测试剂可以是所存在的微生物类型的特异性指示剂。特异性检测试剂包括（例如）与某些微生物或微生物的群组相关的酶（例如，糖苷酶、蛋白酶、氨肽酶、磷酸酶、酯酶等）的底物。
检测试剂可能能够形成有色沉淀。已知可以参与本发明的方法和装置的各种染料，包括含吲哚基染料，所述含吲哚基染料包括但不限于5-溴代-4-氯吲哚磷酸盐或该化合物的二钠盐、5-溴代-4-氯吲哚吡喃糖苷或该化合物的二钠盐，包括5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-氯代-3-吲哚基磷酸、5-溴代-6-氯代-3吲哚氧基磷酸盐。
优选地，有色沉淀是蓝色的。形成蓝色沉淀的底物包括但不限于5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-β-D-纤维二糖糖苷、5-溴代-4-氯代-3-β-D-岩藻糖、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-α-D-吡喃半乳糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-β-吡喃半乳糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-α-D-吡喃葡萄糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-β-D-葡糖醛酸、环己基铵盐、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-β-D-葡糖醛酸、钠盐和5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-β-D-木吡喃糖苷。
这些染料可用作某些类型的细菌内存在的特定酶的底物。例如，作为酯酶底物的形成蓝色沉淀的染料包括但不限于5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基丁酸盐、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基辛酸盐和5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基棕搁酸盐。磷酸酶的底物包括但不限于5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基磷酸二(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)盐、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基磷酸二钠盐、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基磷酸对甲苯胺盐(p-toluidine salt)、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基磷酸盐和钾盐。
作为糖苷酶底物的生色底物染料包括但不限于3-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷、3-吲哚氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-吲哚氧基-β-D-葡糖醛酸环己胺盐和3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸钠盐。磷酸酶的其他生色底物包括但不限于3-吲哚氧基磷酸二(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)盐和3-吲哚氧基二钠盐、3-吲哚氧基磷酸对甲苯胺盐。硫酸酯酶的底物包括但不限于3-吲哚基硫酸钾盐。
针对糖苷酶、酯酶、磷酸酶和硫酸酯酶形成品红色的可沉淀染料包括但不限于作为糖苷酶的底物的5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷、5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷、5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷、5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷和5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基-β-葡糖醛酸环己基铵盐；用作酯酶的底物的5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基丁酸盐、5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基辛酸盐和5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基棕搁酸盐；用作硫酸酯酶的底物的针对磷酸酶的5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基磷酸对甲苯胺盐以及5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基硫酸钾盐。
针对糖苷酶、酯酶和磷酸酶形成橙红色的可沉淀染料包括但不限于6-氯代-3-吲哚氧基-β-吡喃半乳糖苷、6-氯代-3-吲哚氧基-β-D-吡喃葡萄糖苷和6-氯代-3-吲哚氧基-β-D-葡糖醛酸环己基铵盐（针对糖苷酶）；6-氯代-3-吲哚氧基丁酸盐、6-氯代-3-吲哚氧基辛酸盐和6-氯代-3-吲哚氧基棕搁酸盐（针对酯酶）；以及6-氯代-3-吲哚氧基磷酸对甲苯胺盐（针对磷酸酶）。
形成紫色的生色底物包括5-碘代-3-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷并且形成绿色的生色底物包括N-甲基-吲哚氧基-β-D-吡喃半乳糖苷。
其他可沉淀染料包括4,6-二氯-N-乙酰基吲哚-3-醇、6-氯吲哚-β-D-半乳糖五乙酸酯、6-氯吲哚-β-D半乳糖苷、6-氯吲哚氧-1,3-二醋酸盐、5-氯代-2-羧基苯甘氨酸钠盐、4-氯代氨茴酸、甲基[6-氯代-N-乙酰吲哚-3-基-(2,3,4-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷)]糖醛酸、6-氯吲哚-β-D-吡喃葡萄糖苷糖醛酸单环己胺盐、Sadler等人在J.Am Chem.Soc.(78:1251-1255,1956)中报道的氯吲哚(chloroindigo)以及4,6-二氯吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸、6,7-二氯吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸、6,7-二氯吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸、4,6,7-三氯吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸、4,6-二氯吲哚基-β-D-半乳糖苷、6,7-二氯吲哚基-β-D-半乳糖苷和4,6,7-三氯吲哚基-β-D-半乳糖苷。
合适的检测试剂还包括非沉淀指示剂染料（即，能够在水凝胶中扩散的水溶性染料）。非沉淀性指示剂染料包括如本文所描述的pH指示剂（例如，偶氮苯pH指示剂、磺酞pH指示剂和蒽醌pH指示剂。非沉淀性指示剂染料还包括与酶发生反应以释放出水溶性染料的显色酶底物（例如，对硝基酚磷酸钠或对硝基苯基-β-D-葡糖苷，它们都可被水解，形成对硝基苯）以及可与酶发生反应以释放水溶性荧光染料的荧光酶底物（例如，4-甲基伞形酮磷酸酯或4-β-D-葡糖苷，它们都可被水解，形成对硝基苯）。
在传统的制品和方法（例如，琼脂培养皿方法）中使用非沉淀性染料的问题在于，通常将指示剂染料掺入琼脂中并且微生物在整个生长周期期间能够与染料发生反应。通过这种相对长时间段地暴露于指示剂染料，允许水溶性产品的明显横向扩散，这会导致形成叠置两个或更多个菌落的大指示剂染料区。因此，在传统方法中，操作者可能不能区分是哪个或哪些菌落与指示剂染料发生反应。
相比之下，本发明的方法（下述的）包括第一孵育时间段，在第一孵育时间段期间，微生物（如果存在的话）不能够与检测试剂发生反应。本发明的方法还包括第二孵育时间段，在第二孵育时间段中，微生物（如果存在的话）暴露于检测试剂。因为第二孵育时间段可相对短（例如，约15分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时或约10小时），所以非沉淀性指示剂染料没有足够时间完全扩散穿过由液体样品和冷水溶性胶凝剂形成的凝胶。有利地，这样允许使用水溶性指示剂试剂，如果在水凝胶中用微生物较长时间段（例如，18小时、24小时、36小时或48小时）地孵育指示剂试剂，则该试剂将会扩散至离菌落附近太远的地方。
优选地，第二基材122是透明或半透明的，以允许透过基材122观察细菌菌落或对其进行成像，并且第二基材基本不吸水。适用于第二基材122的材料的非限制性例子包括聚酯、丙烯酸或聚苯乙烯。其他合适材料包括具有防水（例如，聚合物型）涂层的纸张或硬纸板材料。用于构造第二基材122的材料应该对微生物具有相对惰性，并且优选地应该与消毒过程（例如，环氧乙烷消毒）相配合。
在一些实施例中，覆盖片材120还可包括粘附于第二基材122的可选第二粘合剂层124。第二粘合剂层124可以是水溶性的，应该对于微生物的生长是非抑制性的，并且应该能够经受住消毒过程（如果用到消毒过程的话）。优选地，第二粘合剂层124在润湿时是充分透明的，以能够透过覆盖片材110观察细菌菌落或对其进行成像。在一些实施例中，例如，第二粘合剂层124可包括压敏粘合剂，如增粘高压敏感的丙烯酸异辛酯/丙烯酸共聚物粘合剂（96重量%的丙烯酸异辛酯和4重量%的丙烯酸）。
第二干涂层126包括检测试剂。可选地，第一干涂层126还可包括冷水溶性胶凝剂（例如，瓜耳胶、黄原胶、刺槐豆胶），如美国专利No.4,565,783中所描述的；营养物质、裂解剂、选择剂或以上两种或更多种的任意组合。通常，将基于要检测的微生物来选择营养物质、选择剂和/或裂解剂。合适的营养物质、选择剂和用于检测微生物的检测试剂的非限制性例子可见于美国专利No.4,575,783、No.5,089,413、No.5,443,963、No.5,462,860、No.5,601,998、No.5,635,367、No.5,681,712、和5,364,766，这些专利的全文都以引用方式并入本文。
可选的裂解剂可以将微生物部分或全部裂解，从而能够检测微生物的内部组分（例如，酶）。裂解剂包括洗涤剂、酶（例如，溶菌酶、溶葡球菌酶）和噬菌体。
在一些实施例中，例如，通过将第二干涂层126粘附于第二粘合剂层124，可以将第二干涂层126连接到第二基材122，如在美国专利No.4,565,783中所描述的。在一些实施例中，例如，通过将含有检测试剂（可选地具有胶凝剂（例如，冷水溶性胶凝剂）、营养物质、选择剂和/或裂解剂）的液体混合物涂覆到第二基材122或第二粘合剂层124上并且之后将混合物干燥，可以将第二干涂层126连接到第二基材122，如在美国专利No.4,565,783中所描述的。
第二干涂层126可包括检测试剂，该检测试剂在接触预定量的液体样品时达到足以检测靶微生物的浓度，但却还抑制靶微生物的生长。在一些实施例中，第二干涂层126中的检测试剂的量足以检测靶微生物，但却还基本抑制靶微生物的生长。
图1b示出图1a的检测制品100的俯视图。该图示出覆盖片材120、阻挡层的凸块区141和微孔膜的凸块区151。该图还示出可选的渗透边界153和由沿着制品100边缘对齐的双面粘合剂带130形成的铰接区域(hinge region)105。
图1c示出图1a的制品100的顶部透视图。制品100包括基体构件110，该基体构件包括第一基材112、可选的第一粘合剂层114和第一干涂层116。另外，图1c中示出的是微孔膜150、阻挡层140和覆盖片材120，该覆盖片材包括第二基材122、可选的第二粘合剂层124和第二干涂层126。如上所述，微孔膜150包括渗透边界153。
图2示出根据本发明的检测制品200的另一个实施例的分解侧视图。如上所述，制品200包括基体构件210、阻挡层240和覆盖片材220。制品200还包括具有微孔膜250的膜载体255。
膜载体255设置在基体构件210和阻挡层240之间。在一些实施例中，膜载体255连接到基体构件210和/或阻挡层240（例如，借助双面粘合剂带230）。如上所述，膜载体250可通过替代手段连接到基体构件210和/或阻挡层240。
膜载体255被构造用于支承微孔膜250。膜载体255优选地是自支承的并且基本不吸水。适用于膜载体255的材料的非限制性例子包括聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯膜。其他适用材料包括具有防水（例如，聚合物型）涂层的纸张或硬纸板材料。膜载体255可以是透明的、半透明的或不透明的。膜载体255还包括孔257，当从制品200拆下阻挡层240时，该孔允许从基体构件210穿过微孔膜250直至覆盖片材220的流体连通。可选地，膜载体255可包括凸块区251，该凸块区延伸超出基体构件210和/或覆盖片材220的外围边界。
例如，孔257可以是任何形状，如，圆形、方形、矩形、六边形、八边形、椭圆形或不规则形状。
微孔膜250的尺寸可以被设计为与孔257共延。在一些实施例中，微孔膜250小于孔257。在一些实施例中，如图2中所示，微孔膜250大于孔257。微孔膜的尺寸可以被设计为提供适于分配预定量液体样品的区域。例如，为了分配1毫升的样品，微孔膜250可以是约20cm2至约30cm2。例如，为了分配5毫升的样品，微孔膜250可以是约45cm2。
微孔膜250（优选地，通过粘合剂）连接到膜载体255，使得这种连接防止液体样品经过膜载体255和微孔膜250之间。因此，液体从微孔膜250的一个主表面流至另一个主表面基本上要求液体经过膜250。
图3a示出根据本发明的检测制品300的另一个实施例的分解侧视图。如本文所描述的，制品300包括覆盖片材320、阻挡层和微孔膜350。如本文所描述的，阻挡层340和微孔膜350还分别包括可选的凸块区341和351。如本文所描述的，微孔膜350还包括可选的渗透阻挡件353。
在这个实施例中，如本文所描述的，基体构件310包括基材312、可选粘合剂层314和干涂层316。基体构件还包括垫片318。包括孔319的垫片318应该由水不溶性材料构造。孔319的壁与基体构件310一起形成预定尺寸和形状的样品接纳凹槽，用于限定制品300中沉积的液体样品的体积。垫片318的厚度以及孔319的大小应该足以形成具有所需容积（例如，1毫升、2毫升、3毫升、5毫升或更大体积）的凹槽。闭孔聚乙烯泡沫或聚苯乙烯泡沫是适用于垫片318的材料，但是可以使用为疏水性（不可润湿）的、对微生物惰性的材料，并且优选能够经受住灭菌处理的材料。如美国专利No.4,565,783中所描述的，例如，可以通过粘合剂将垫片318连接到基体构件310。
在一些实施例中，微孔膜350可以被构造在具有渗透边界353的制品300中，该渗透边界与孔319的形状、尺寸和位置相符。在一些实施例中，微孔膜350由渗透边界353限定的面积可以大于孔319的面积。在一些实施例中，渗透边界353可以防止样品液体在微孔膜350内过渡扩散。
微孔膜350应该被设置成使得在使用过程中，微孔膜350的至少一部分覆盖孔319。优选地，在使用过程中，微孔膜350被设置成使得微孔膜350完全覆盖孔319。在一些实施例中，微孔膜350的面积大于孔319的面积并且微孔膜350延伸超出孔319的周边。
在一些实施例中，如图3a中所示，基体构件310、微孔膜350、阻挡层340和覆盖片材320可以彼此连接。例如，它们可以用双面粘合剂带330的单个片段彼此连接。然而，上述的其他连接手段可能是合适的。
图3b示出图3a的检测制品300的俯视图。该图示出覆盖片材320、阻挡层的凸块区341和微孔膜的凸块区351。图3b还示出可选渗透边界353、孔319、由沿着制品300边缘对齐的双面粘合剂带330形成的铰接区305。尽管图3b的孔319的形状为圆形，但具有其他形状的孔319也可能是合适的。例如，孔319的形状可以是方形、椭圆形、矩形、六边形、八边形或它可以是不规则的形状。
图3c示出图3a的制品300的顶部透视图。制品300包括基体构件310，该基体构件包括第一基材112、可选的第一粘合剂层114、第一干涂层316和垫片318。另外，在图3c中示出的是微孔膜350、阻挡层340和覆盖片材320，该覆盖片材包括第二基材322、可选的第二粘合剂层324和第二干涂层326。
图4示出根据本发明的检测制品400的另一个实施例的分解侧视图。制品400包括所有如本文描述的阻挡层440、覆盖片材420和支承微孔膜450的膜载体455。如本文所描述的，该制品还包括基体构件410，该基体构件包括具有孔419的垫片418。
微孔膜450可以构造在制品400中，使得微孔膜450的面积与孔419共延。在一些实施例中，微孔膜450的面积可小于孔419的面积。在一些实施例中，微孔膜450的面积可小于孔419的面积。
微孔膜450应该被设置成使得在使用过程中，微孔膜450的至少一部分覆盖孔419。优选地，在使用过程中，微孔膜450被设置成使得微孔膜450基本覆盖孔419。在一些实施例中，微孔膜450的面积大于孔419的面积并且微孔膜450延伸超出孔419的周边。
检测微生物的方法
本发明提供了一种检测液体样品中的微生物的方法。该方法包括提供被怀疑含有微生物的液体样品和本文描述的检测制品的任一个实施例。该制品包括：基体构件，其包括含有冷水溶性胶凝剂的第一干涂层；微孔膜；覆盖片材，其包括含有检测试剂的第二干涂层；以及可去除阻挡层，其形成微孔膜和覆盖片材之间的流体阻挡。微孔膜设置在基体构件和阻挡层之间。在图5中示出该方法的其他步骤。
可选地，可用营养物质混合或稀释液体样品，以有助于微生物（未示出）的生长。可选地，可以用选择剂或检测试剂（未示出）混合或稀释液体样品。在一些实施例中，可以用营养物质、选择剂和检测试剂的任何组合来混合或稀释液体样品。在一些实施例中，当检测制品不含有营养物质、选择剂和/或检测试剂时，可以向液体样品中添加营养物质、选择剂和/或检测试剂。在一些实施例中，即使检测制品含有营养物质、选择剂和/或检测试剂，也可以向液体样品中添加营养物质、选择剂和/或检测试剂。
该方法还包括使预定量的液体样品接触基体构件的过程581。最开始，暴露基体构件的第一干涂层。这可以通过（例如）将制品（参见，例如图1a和图1c的制品100）放置在相对水平的表面上并且抬起微孔膜来暴露第一干涂层来实现。可以通过凸块区（如果存在的话）抓握微孔膜。
在抬起微孔膜从而暴露第一干涂层之后，将预定量（例如，1毫升、2毫升、3毫升、5毫升）的液体样品转移（例如，倾倒或移取）到第一干涂层上，从而接触第一干涂层。在一些实施例中，液体样品可以沉积到通过垫片中的孔形成的样品接纳凹槽中，该垫片连接到包括第一干涂层的基体构件。
该方法还包括使微孔膜接触样品的过程582。微孔膜接触液体样品使得至少一部分液体样品迁移到微孔膜中，从而形成水合物区域。例如，可以简单通过将被抬起以暴露干涂层的微孔膜放低来实现微孔膜与液体样品的接触。过程582可选地还可包括使用种菌撒布装置（例如，用于接种PETRIFILM板的撒布机，可得自3M公司(St.Paul,MN)）将液体样品分配到第一干涂层和微孔膜的选定部分（例如，预测量区域）上。
该方法还包括在第一时间段期间孵育制品的过程583。第一孵育提供了有助于微生物生长的条件（即，时间、温度）。相关领域的普通技术人员将认识到，可以根据要检测的微生物来选择孵育时间。例如，如果要检测的是酵母或霉菌，则第一孵育温度通常可以是从约室温（大约23℃）至约32℃。例如，如果要检测的是细菌，则第一孵育温度通常可以是约室温至约45℃。
根据本发明，第一孵育时间段可以短至约1小时。在一些实施例中，第一孵育少于约4小时（例如，少于约2小时、少于约3小时或少于约4小时）。在一些实施例中，第一孵育时间段少于约8小时（例如，少于约5小时、少于约6小时、少于约7小时或少于约8小时）。在一些实施例中，第一孵育少于约12小时（例如，约9小时、约10小时、约11小时或约12小时）。在一些实施例中，第一孵育时间段少于或等于约15小时（例如，少于13小时、少于约14小时或少于约15小时）。在一些实施例中，第一孵育时间段长达48小时（例如，少于约24小时、少于约36小时或少于约48小时）。
该方法还包括重新定位阻挡层的过程584。阻挡层被重新定位成提供微孔膜的水合物区域的至少一部分和第二干涂层的至少一部分之间的接触。优选地，阻挡层被重新定位成提供微孔膜的整个水合物区域和第二干涂层之间的接触。例如，可以通过扭曲或折叠阻挡层来提供水合物区域和第二干涂层之间的接触，从而将阻挡层重新定位。在一个优选的实施例中，可以从检测制品去除阻挡层（即，阻挡层松弛地插入制品中或者以可分离的方式附着于制品），以提供微孔膜的水合物区域和第二干涂层之间的接触。
微孔膜的水合物区域和第二干涂层之间的接触允许第二干涂层进行水合作用，由此允许第二干涂层中的检测试剂、裂解剂或选择剂与微生物、微生物的组分和/或微生物的代谢副产物的相互作用。这种相互作用可以提供可检测信号。
该方法还包括在第二时间段内孵育制品的过程585。在一些实施例中，第二时间段内的孵育温度可以与用于第一时间段的温度相同。在一些实施例中，第二时间段内的孵育温度可以与用于第一时间段的温度不同。有利地，第二时间段内的孵育温度可以高于用于第一时间段的温度，从而缩短观察可检测信号所需的时间。
根据本发明，第二孵育时间段应该是足以观察可检测信号的时间量。在一些实施例中，优选地，第二孵育时间段比第一孵育时间段短。与以上的第一孵育时间段中的任一个结合，第二孵育时间段可以为短至约15分钟。与以上的第一孵育时间段中的任一个结合，第二孵育时间段少于约30分钟。与以上的第一孵育时间段中的任一个结合，第二孵育时间段少于或等于4小时（例如，少于或等于约1小时、少于或等于约2小时、少于或等于约3小时或少于或等于约4小时）。与以上的第一孵育时间段中的任一个结合，第二孵育时间段少于或等于8小时（例如，少于或等于约5小时、少于或等于约6小时、少于或等于约7小时或少于或等于约8小时）。与以上的第一孵育时间段中的任一个结合，第二孵育时间段少于或等于12小时（例如，少于或等于约9小时、少于或等于约10小时、少于或等于约11小时或少于或等于约12小时）。与以上的第一孵育时间段中的任一个结合，第二孵育时间段长达约96小时（例如，少于或等于约48小时、少于或等于约72小时、少于或等于约96小时）。
该方法还包括观察是否存在微生物生长的指征的过程586。可以用目测和/或通过仪器（例如，成像系统）观察这种指征，并且这两种类型（人工和自动的）检测手段都是本发明料想到的。
微生物生长指征的性质取决于制品中的检测试剂（或多种检测试剂）。例如，某些检测试剂（例如，酶底物）当其与微生物或其组分相互作用时产生可检测的有色或荧光产物。例如，某些检测试剂（例如，PH指示剂）在存在酸性或碱性的微生物代谢副产物时用颜色或荧光产生可检测的变化。例如，某些检测试剂（例如，多糖或多肽聚合物）在其实质状态下是相对不透明的，并且当被微生物或其组分降解时变得相对透明。
在一些实施例中，存在微生物生长的指征包括存在可检测微生物菌落。可通过目测检测微生物菌落。可使用成像系统检测微生物菌落。适用于检测微生物菌落的系统在全文都以引用方式并入本文的例如2009年6月15日提交的国际专利公开No.WO 2005/024047、美国专利申请公开No.US 2004/0101954和US 2004/0102903以及美国专利申请No.61/187,107（代理人案卷号65250US002）中有所描述。合适的成像系统的非限制性例子包括可获自3M公司(St.Paul,MN)的PETRIFILM读板机(PPR)，可获自Spiral Biotech(Norwood,MA)的PETRISCAN菌落计数器和可获自Synbiosis（英国剑桥）的PROTOCOL和ACOLYTE板扫描机。
在一些实施例中，存在微生物生长的指征包括存在通过目测或与用目测不可检测的微生物菌落相关的通过仪器检测到的反应。
在任何一个上述实施例中，该方法还可包括对微生物进行计数的步骤。在一些实施例中，可以通过对制品中离散菌落的数量进行计数，对微生物进行计数。在一些实施例中，可以通过对制品中与用目测不可检测的菌落相关的离散反应（例如，有色区、荧光区、透光区）的数量进行计数，对微生物进行计数。对微生物进行计数的步骤可包括使用成像系统对微生物进行计数。
观察是否存在微生物生长的指征可包括得到制品的图像。观察是否存在微生物生长的指征还可包括打印、显示或分析图像。
现将参考以下非限制性实例对本发明作进一步说明。所有的份数和百分数均以重量份表示，除非另有指明。
实例
除非另外指明，否则实例中的所有份数、百分数、比率等均按重量计。除非另外指明，否则所使用的溶剂和其他试剂均得自Sigma-AldrichChemical公司(Milwaukee,WI)。
实例1
微孔膜载体的制备
将用水溶性粘合剂（96重量%的丙烯酸异辛酯和4重量%的丙烯酸）的薄层涂覆的双轴取向聚丙烯（BOPP,1.6mil(0.04mm)厚度）膜冲切成环状垫圈。垫圈的外径是大约52.5mm并且垫圈的内径是大约45mm。
从BOPP（0.04mm厚）的矩形片材（大约75mm×95mm）冲切出圆形孔（大约44mm的直径）。尼龙膜过滤器（47mm，0.45mm标称孔径，得自Alltech Associates(Deerfield,IL)）在BOPP片材的粘合剂涂布面上的孔上方保持居中。垫圈的粘合剂面在膜过滤器的外边缘上方保持居中并且被压向过滤器和BOPP片材，从而将膜过滤器的边缘密封至BOPP片材。
检测制品的制备
如下地制备基体构件。用比率为2:1的Meyprogat Guar(M150)和标准方法营养物质肉汤制剂(Standard Methods Nutrients Broth)的组合物粉末涂布一个主表面上（粘合剂表面上）包括有机硅粘合剂的塑料膜（Microamp Optical Adhesive Film，编号4311971，得自AppliedBiosystems(Foster City,CA)），如美国专利No.4,565,783中所描述的。在表1中列出标准方法营养物质肉汤制剂的组分。粉末的涂层重量为每24平方英寸大约8粒。将一侧具有水溶性粘合剂薄层和约5cm的圆形孔的泡沫垫片（聚苯乙烯夹板衬垫泡沫(capliner foam)，0.5mm厚，American Fuji Seal Inc.(Bardstown,KY)）层合至基体构件的涂布面。
表1.标准方法营养物质肉汤制剂所有组分被作为粉末添加并且在 使用前彻底混合。
制备覆盖片材。用标准方法营养物质肉汤和0.2%重量/重量三苯基氯化四氮唑的混合物粉末涂布具有转移粘合剂薄层的微安光学粘合剂膜(Microamp Optical Adhesive Film)。这个混合物的涂层重量为每24平方英寸大约8粒。
如下地制备多层检测制品。将基体构件放置在水平表面上，使涂布面面向上。将微孔膜载体放置在基体构件上，使垫圈面背对基体构件。将微孔膜在营养物质膜的垫片中的圆形孔上方保持居中。将BOPP（大约75mm×95mm×0.4mm厚）的阻挡层放置在膜层上方。将覆盖片材布置在阻挡层上方，使覆盖片材的涂布面面向阻挡层。然后，沿着一面钉住膜的四层堆叠。
实例2
如实例1中一样制成检测制品，不同之处在于，由一面不包括粘合剂薄层的BOPP膜制成膜载体。
实例3
用金黄色酿脓葡萄球菌ATCC 6538（1毫升的100CFU/mL溶液）接种检测制品并且在37℃下孵育6小时。然后，去除阻挡膜并且在37℃下继续进行孵育，直到接种后的24小时。透过基体构件能看到单个红色菌落。透过覆盖片材也能看到生长的红色区域，但是菌落的边界没有像当透过基体构件观察时那么清楚。观察到微孔膜被液体样品润湿。用数码相机拍摄菌落的照片。
实例4
用金黄色酿脓葡萄球菌(ATCC 6538)的100个菌落形成单元孵育实例2的检测制品并且在37℃下进行接种。在孵育6小时和8小时之后，分别从培养箱取出各个制品并且去除阻挡膜。在去除阻挡膜之后，在37℃下孵育制品，直到接种后的24小时。在制品中观察到红色的菌落。
实例5
用绿脓杆菌(ATCC 9027)的100个菌落形成单元(CFU)接种实例1的检测制品并且分别在37℃下孵育6至8小时。去除阻挡层并且继续在37℃下进行孵育，直到接种后的24小时。在制品中观察到红色的菌落。
实例6-7和比较例C-1和C-2
如实例2中一样地构造检测制品并且用莓实假单胞菌(ATCC51821)以约100个菌落形成单元的浓度进行接种（实例6）。如实例2中一样地构造第二检测制品并且用微杆菌属细菌(Microbacteriumesteraromaticum)(ATCC 51822)以约100个菌落形成单元的浓度进行接种（实例7）。为了进行对比，针对每个板，还用莓实假单胞菌和微杆菌属细菌（分别对应对比例C-1和C-2）以约100个菌落形成单元的浓度接种3M PETRIFILM Aerobic Count plate（得自3M公司(St.Paul,MN)）。
在28℃下将样品孵育6小时。然后，从实例6和7中去除阻挡膜，并且在28℃下继续孵育。在接种后的20小时，对于实例6和7，菌落隐约可见，但是对于比较例C-1和C-2，并非如此。在接种后的24小时，对于实例6和7，菌落清晰可见，但是对于比较例C-1和C-2，菌落不可见。在接种后的48小时，对于比较例C-1和C-2，菌落可见。这些实例表明，通过在细胞暴露于检测试剂(TTC)之前允许出现一段时间的生长，可导致检测的时间更短。
本发明现已结合本发明人可预见的可给出实施性描述的几个具体实施例，对本发明进行了描述。但本发明的非实质性的修改形式（包括目前没有预见的修改形式）可构成本发明的等价形式。因而，本发明的范围不应受限于本文所述的细节和结构，而是仅受下面的权利要求书以及其等价形式限制。

Claims (10)

1.一种用于对样品中的微生物进行检测或计数的制品，所述制品包括：
基体构件，其包括具有上主表面和下主表面的水不能透过的自支承基材，其中所述上主表面包括含有冷水溶性胶凝剂的第一干涂层；
微孔膜；以及
覆盖片材，其包括含有检测试剂的第二干涂层；
其特征在于
所述制品还包括阻挡层，其被构造用于在所述微孔膜和所述覆盖片材之间形成流体阻挡；并且
其中所述微孔膜设置在所述基体构件和所述阻挡层之间。
2.根据权利要求1所述的制品，其中所述微孔膜还包括样品容纳区。
3.根据权利要求1所述的制品，还包括多种检测试剂。
4.根据权利要求1所述的制品，还包括裂解剂。
5.根据权利要求1所述的制品，其中所述检测试剂包括非沉淀性检测试剂。
6.一种检测样品中是否存在微生物的方法，所述方法包括：
提供：
怀疑含有微生物的液体样品；
检测制品，所述检测制品包括：
基体构件，其包括含有冷水溶性胶凝剂的第一干涂层；
微孔膜；
覆盖片材，其包括含有检测试剂的第二干涂层；
阻挡层，其在所述微孔膜和所述覆盖片材之间形成流体阻挡；
其中所述微孔膜设置在所述基体构件和所述阻挡层之间；
使预定量的所述样品接触所述第一干涂层；
使所述微孔膜接触所述样品；
将所述制品孵育第一时间段；
将所述阻挡层重新定位，以在所述覆盖片材和所述微孔膜之间提供接触；
将所述制品孵育第二时间段；和
观察微生物生长是否存在的指征。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述制品还包括与所述基体构件形成样品接纳凹槽的垫片，其中使预定量的所述样品接触所述第一干涂层的步骤包括将所述样品转移到所述样品接纳凹槽中。
8.根据权利要求6所述的方法，还包括将所述样品与营养物质、选择剂、检测试剂或以上物质中的任何两种或更多种的组合物混合的步骤。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一时间段为约1小时至约48小时。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二时间段为约15分钟至约96小时。
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