CN103343158A - 产气荚膜梭菌检测纸片、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

产气荚膜梭菌检测纸片、制备方法及其应用，属于食品检测技术领域。该检测纸片由主纸片和确证纸片两部分构成，主纸片依次由透明塑料膜、带有镂空区域的PET耐高温塑料中层板、印刷好方格的卡纸和透明PET耐高温塑料底板组成；在PET耐高温塑料中层板镂空区域内填充有产气荚膜梭菌选择性显色培养基，确证纸片为涂有确证培养基的透明塑料膜。产气荚膜梭菌在主纸片上呈现蓝色菌落，加入确证纸片后目标菌在紫外分析仪照射下呈现蓝色荧光。本发明的优点在于使用该检测纸片检测产气荚膜梭菌，目标菌增殖速度快且较好地抑制非目标菌生长，使用该纸片可方便、快速地完成产气荚膜梭菌增菌、鉴定及计数。

Description

产气荚膜梭菌检测纸片、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌检测纸片、制备方法及其在检测产气荚膜梭菌方面的应用。 

背景技术

产气荚膜梭菌是一种重要的食源性疾病病原菌，是革兰氏阳性产芽孢的厌氧梭菌，可引起人食物中毒、家畜气性坏疽、坏死性肠炎等疾病。近年来产气荚膜梭菌引起的猪、牛、羊发病死亡比率逐年升高。猪、牛、羊等家畜“猝死症”与感染产气荚膜梭菌有直接关系。产气荚膜梭菌也是导致鹿发生出血性肠炎的最重要致病菌，严重危害现代养殖业的发展。该菌广泛存在于土壤、污水、粪便、饲料、人和动物肠道中，欧洲已将产气荚膜梭菌作为水质卫生指标的补充条款，WHO也在水质检测中将其作为水质污染微生物检测指标。我国出台的饮用天然矿泉水国家标准中GB8537-2008微生物指标增加了产气荚膜梭菌的检测，作为水质污染指示菌。而产气荚膜梭菌现有国家标准检测方法GB/T4789.13-2012采用的是细菌分离培养、生化鉴定等程序，过程繁琐，检测周期长。研制快速便捷该菌的检测试剂产品能有效解决动物性食品、天然饮用矿泉水生产企业和食品监督检测部门耗时繁琐的检测难题，实现对样品中产气荚膜梭菌高效筛选。 

目前常用的产气荚膜梭菌增菌培养基主要有液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂基础(SPS)以及胰月示-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础（TSC）等，这些培养基用于产气荚膜梭菌选择性培养及特异性显色主要基于其生化特性区分菌落，培养周期长，SPS培养基和TSC培养基中均含有亚硫酸盐，其弊端在于亚硫酸钠容易对细菌产生抑制作用，影响目标菌的生长。故不宜用作产气荚膜梭菌的鉴定培养。胡英等在“食品中产气荚膜梭菌计数培养基及培养方法探讨”论文中（中国卫生检验杂志1991,1（3）：174-175）写到，表面涂抹接种厌氧环境培养不易形成黑色菌落。此外，在前期实验中我们还发现以纸片为载体，产气荚膜梭菌在现有常用培养基菌落特征和显色效果不理想，为加快其特异性显色我们从该菌产酶特性入手，综合其抑菌特性，研制产气荚膜梭菌选择性显色培养基。对各种显色底物进行了研究，找出适用于产气荚膜梭菌检测的特异性酶底物。本发明研制的产气荚膜梭菌显色培养基由于利用酶显色，反应时间较快，能在更短的时间内读取实验结果。 

产气荚膜梭菌产生酸性磷酸酶和β-半乳糖苷酶两种酶，通过筛选磷酸酶和β-半乳糖苷酶的底物作为显色基检测产气荚膜梭菌，选择了两种酶常见的显色底物BCIP、PNPP、X-gal和MU-gal和ONPG进行实验。实验中，BCIP显示出良好的显色性能及灵敏度。属于不扩散型显色剂，被酶分解后，X基能够沉淀在菌落上使整个菌落显色，且不扩散到周围的培养基当中。Mu-gal为荧光显色剂，显色效果好，在紫外分析仪365nm紫外灯照射下显示蓝白色荧光，易于观测，其显色速度快，一般在3～4h内显色，但经长时间培养后荧光物质会发生扩散，无法计数。故应当在加入的酸性磷酸酶显色底物显色后再加入，能快速与酶产生反应。产气荚膜梭菌在该组显色剂作用下首先显示蓝色菌落，加入Mu-gal后目标菌显示蓝白色荧光，通过两步实验确定目标菌的数量，快速简便。另外，在培养基中添加了加强显色的酶促因子硫酸镁，可使显色效果更好，目标菌更易于辨认， 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种产气荚膜梭菌快速检测纸片。该检测纸片（7cm×9cm）由主纸片和确证纸片两部分构成，主纸片依次由透明塑料膜（PET塑料膜，厚度为0.05mm～0.10mm）、带有镂空区域（5cm×5cm）的PET耐高温塑料中层板（PET塑料板，厚度为0.15mm～0.20mm，耐高温的温度为130℃～150℃，与底板材质相同）、印刷好方格的卡纸（纯木浆卡纸，厚度为0.10mm～0.15mm）和透明PET耐高温塑料底板（PET塑料板，厚度为0.15mm～0.20mm，耐高温的温度为130℃～150℃）组成；PET耐高温塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，在镂空区域内填充有产气荚膜梭菌选择性显色培养基，确证纸片为涂有确证培养基的透明塑料膜。 

所述的主纸片用产气荚膜梭菌选择性显色培养基原始重量组份为（在制作及晾干过程中，最终培养基组成中蒸馏水会减少，其余组分不变）： 

胰蛋白胨25～35g，酵母浸粉15～25g，葡萄糖4～6g，丙酮酸钠1～3g，黄原胶10-20g，聚丙烯酸钠2～4g，环丝氨酸0.004～0.006g，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）0.05～0.07g，硫酸镁0.70～0.74g，蒸馏水1000mL。 

确证培养基原始重量组份为（在制作及晾干过程中，最终培养基组成中蒸馏水会减少，其余组分不变）： 

黄原胶1～2g，聚丙烯酸钠0.2～0.4g，4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷（Mu-gal）0.006～0.018g，蒸馏水100mL。 

本发明又一个目的是提供产气荚膜梭菌快速检测纸片的制备方法，其步骤如下： 

1）主纸片培养基的制备 

按上述重量组份，将胰蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、黄原胶、聚丙烯酸钠加入到900mL蒸馏水中，加热、搅拌溶解后，再加入丙酮酸钠及硫酸镁，搅拌；然后用1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HCl溶液调体系pH值至7.0±0.2，121℃高压灭菌15min，冷却至60℃；然后将环丝氨酸、BCIP用100mL蒸馏水溶解后，用一次性过滤器（0.22μm）过滤除菌后加入到前述的培养基中，搅拌混匀。 

2）检测主纸片的制作 

准备好透明塑料膜（PET塑料膜，厚度为0.05mm～0.10mm）、PET耐高温塑料中层板（PET塑料板，厚度为0.15mm～0.20mm）、印刷好方格的卡纸（纯木浆卡纸，厚度为0.10mm～0.15mm）和透明PET耐高温塑料底板（PET塑料板，厚度为0.15mm～0.20mm）；在PET耐高温透明塑料板上制作出镂空区域；将外层透明塑料膜、PET耐高温塑料板、卡纸与PET耐高温塑料底板按顺序排好固定，放入灭菌锅内121℃高压灭菌15min；然后将步骤1）制备的培养基均匀涂在透明塑料膜的里侧表面，并将PET耐高温透明塑料板上的镂空区域填满凉干。 

3）确证纸片的制作 

按上述重量组份，将黄原胶、聚丙烯酸钠按量加入到90mL蒸馏水中溶解后混匀，得到冷水凝胶剂混合物；另取透明塑料膜（PET塑料膜，厚度为0.05mm～0.10mm），将上述冷水凝胶剂混合物2mL均匀涂在透明塑料膜上的一个表面上，121℃高压灭菌15min；然后将显色物质Mu-gal按上述重量组份用10mL去离子水溶解，用一次性过滤器（0.22μm）过滤除菌，在无菌操作台内将显色物质的去离子水溶液500μL加至含有冷水凝胶剂的透明塑料膜上，均匀涂开并晾干。 

4）检测纸片的包装 

检测主纸片和确证纸片均独立无菌包装，确证纸片用于主纸片出现目标菌特征菌落后需要确证时使用。 

本发明的第三个目的是提供产气荚膜梭菌快速检测纸片在检测产气荚膜梭菌方面的应用。其包括以下步骤： 

1）以无菌操作称取待检样本25g（待检样本可以是动物性食品）均质或待检天然饮用矿泉水25mL加入到225mL、质量分数0.1%蛋白胨水溶液（蛋白胨1g加入到1000mL蒸馏水中加热溶解，调节pH7.0±0.2，121℃高压灭菌15min）， 得到1：10稀释液。 

2）以上述1：10稀释液按1mL稀释液加9mL、质量分数0.1%蛋白胨水溶液的方式，制备得到1：100、1：1000、1：10000、1：100000、1：1000000的系列稀释液。 

3）将阳性菌液（产气荚膜梭菌菌液20CFU～200CFU/mL）、阴性菌液（生孢梭菌菌液20CFU～200CFU/mL）和待检样品稀释液（步骤2得到的五种稀释液或适合稀释度的三种稀释液，含菌量少的液体样品如天然饮用矿泉水可直接使用原液）分别接种在主纸片涂有培养基的镂空区域，于温度36℃±1℃下厌氧培养18h。 

4）将主纸片放入无菌操作台，观察其有无蓝色菌落。 

无蓝色菌落可判定为阴性； 

有蓝色菌落则进行确证实验，将主纸片上层透明塑料膜揭起，将确证纸片（涂有确证培养基的一侧）贴在PET耐高温塑料中层板上，并使镂空区紧贴确证纸片的透明塑料膜，注意不要留有气泡，放回培养箱36℃±1℃继续厌氧培养3-4h； 

5）在紫外分析仪365nm下观察蓝色荧光，具有蓝色荧光的蓝色菌落为阳性。无蓝色菌落生长的纸片则为阴性。 

上述过程设置阳性菌液为产气荚膜梭菌菌液，阴性菌液为生孢梭菌菌液，阳性菌液在主纸片和确证纸片均出现特征目标菌落，阴性菌液未见蓝色菌落及蓝色荧光菌落，表明实验结果有效。 

对于阳性结果，采用产气荚膜梭菌现有国家标准检测方法GB/T4789.13-2012中菌落计数方法。 

a)只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落； 

b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落； 

c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落； 

d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落； 

e）2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU之间，分别计数2个稀释度平板上的典型菌落。 

本发明由于上述的组分及制备方法制备的产气荚膜梭菌显色纸片，培养基研制中进行了基础营养组分的筛选，产气荚膜梭菌能在厌氧培养过程中，形成增殖优势；利用抗生素使其它非目标菌生长受抑制，在分离产气荚膜梭菌与其他梭菌时具有更强的选择性；通过该菌产酶特异性和酶底物显色特性区分其它厌氧梭菌，在培养基中添加了加强显色的酶促因子硫酸镁，可使显色效果更好，目标菌更易于辨认，再利用Mu-gal荧光底物确证实验3～4h，排除背景干扰，利于计数，这样通过两步显色筛选目标菌，即能够产生荧光的蓝色菌落即为产气荚膜梭菌，完成更加准确的鉴定。使用该检测纸片操作简单，耗时较短。目前我国食品卫生标准饮用天然矿泉水国家标准GB8537-2008要求检测产气荚膜梭菌，这种产气荚膜梭菌快检纸片将在天然饮用矿泉水生产企业出厂检验、卫生防疫、市场监督、商检及进出口检疫领域有着较为广阔的应用前景。 

附图说明

图1：主纸片检测结果的光学照片，目标菌在主纸片上呈现蓝色菌落； 

图2：确证纸片检测结果的光学照片，加入确证纸片后目标菌在紫外分析仪照射下呈现蓝色荧光； 

图3：产气荚膜梭菌检测主纸片结构的光学照片； 

图4：产气荚膜梭菌检测主纸片各层分开的结构示意图。 

如图4所示，各部分名称为：透明塑料膜1、带有镂空区域3的耐高温塑料中层板2、原浆卡纸4、耐高温塑料底板5。 

具体实施方式

实施例1 产气荚膜梭菌选择性显色培养基的制备 

通过对培养基的基础成分和促生长因子进行筛选，比较几种抗生素对非目标菌的抑制效果，再根据产气荚膜梭菌特异性酶对显色底物及酶促因子进行筛选与组合，我们确定产气荚膜梭菌选择性显色培养基的重量组分为： 

胰蛋白胨30g，酵母浸粉20g，葡萄糖5g，丙酮酸钠2g，环丝氨酸0.005g，黄原胶15g，聚丙烯酸钠3g，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）0.06g，硫酸镁0.72g，蒸馏水1000mL。 

产气荚膜梭菌选择性显色培养基制备方法是： 

将胰蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、黄原胶，聚丙烯酸钠，加入到900mL蒸馏水中，加热、搅拌，溶解后，再加入丙酮酸钠及硫酸镁，搅拌；用1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HC1溶液调pH值至7.0±0.2，121℃高压灭菌15min，冷却至60℃。环丝氨酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）用100mL蒸馏水溶解，用一次性过滤器（0.22μm）过滤除菌后加入到前述培养基中，混匀。 

实施例2 产气荚膜梭菌选择性显色培养基的评价 

为了验证本发明的产气荚膜梭菌显色培养基与现有常用培养基相比的检测效果，将产气荚膜梭菌菌液以10^-6～10^-8稀释度加入至上述显色培养基、TSC培养基及SPS培养基上，厌氧培养后对菌落进行计数，三次重复试验后取平均值。计数结果见表1，经SPSS软件对数据进行分析后，三组数据无显著差异（P<0.05），该结果表明该培养基与目前常用培养基（TSC培养基及SPS培养基）对目标菌增殖效果相当。 

而本发明产气荚膜梭菌显色培养基由于利用酶显色，在16～18h内便可很好的显色，这方面优势显著。而TSC培养基和SPS培养基由于是利用生化反应，故反应时间较长，一般需24h才能反应至可辨认的程度，所以显色培养基能够更好的运用于产气荚膜梭菌的快速检测。 

表1：产气荚膜梭菌在各培养基上生长效果对比 

实施例3 产气荚膜梭菌检测纸片的组成 

主纸片主要有四层（7cm×9cm），底层为PET塑料板，中层为纯木浆卡纸，卡纸上印有淡橘色1cm×1cm的方格，方便计数。在纸张的选择上，本实施例选择了无荧光反应淡黄色卡纸，卡纸上层为有镂空区域（为半径是5cm的圆形空区）的PET塑料板，中间的镂空区域用来限制菌落的生长区域，镂空区域内加入培养基。最外层则是透明塑料膜，里侧表面粘附一层实施例1制备的显色培养基，目的是覆盖后获得良好的厌氧培养效果。在主纸片制作的过程中各环节要保证无菌。 

确证纸片（7cm×9cm）使用透明PET塑料膜，将黄原胶0.15g、聚丙烯酸钠0.03g加入到10mL蒸馏水中溶解、混匀制备冷水凝胶剂混合物。将冷水凝胶剂混合物2mL均匀粘附于透明塑料膜上的一个表面，121℃高压灭菌15min后使用；将显色物质Mu-gal1.2mg用10mL蒸馏水溶解，用一次性过滤器（0.22μm）过滤除菌，在无菌操作台内取显色物质溶液500μL加至含有冷水凝胶剂的透明塑料膜上，均匀涂开晾干，由于Mu-gal的灵敏度较高，反应速度快，所以作为单独的一个步骤进行。 

实验结果表明，产气荚膜梭菌在主纸片上生长16～18h之后可出现蓝色点状菌落，此后将主纸片上层揭起，将确证纸片平铺在培养基薄层上继续培养3～4h后，在紫外365nm照射下菌落能够出现特异性蓝色荧光，通过两步显色筛选目标菌，即能够产生荧光的蓝色菌落即为产气荚膜梭菌。采用产气荚膜梭菌国家标准检测方法GB/T4789.13-2012进行验证实验，证明该方法能够检测到产气荚膜梭菌，检测下限是1CFU/mL.。 

实施例4：利用快速检测纸片检测产气荚膜梭菌方法 

1）以无菌操作称取待检样本25g（待检样本可以是动物性食品）均质或待检天然饮用矿泉水25mL加入到225mL、质量分数0.1%蛋白胨水溶液（蛋白胨1g加入到1000mL蒸馏水中加热溶解，调节pH7.0±0.2，121℃高压灭菌15min），得到1：10稀释液。 

2）以上述1：10稀释液按1mL稀释液加9mL、质量分数0.1%蛋白胨水溶液的方式，制备得到1：100、1：1000、1：10000、1：100000、1：1000000的系列稀释液。 

3）在检测纸片上（需要七个检测纸片）分别接种阳性菌液（产气荚膜梭菌菌液20CFU～200CFU/mL）和阴性菌液（生孢梭菌菌液20CFU～200CFU/mL）及待检样品稀释液（步骤2得到的五种稀释液，含菌量少的液体样品如天然饮用矿泉水可直接使用原液），接种在主纸片涂有培养基的镂空区域于温度36℃±1℃、厌氧培养18h。 

4）培养纸片放入无菌操作台，观察其有无蓝色菌落。 

无蓝色菌落可判定为阴性； 

有蓝色菌落则进行确证实验，将上层透明膜揭起，将确证纸片贴在中层塑料板上，镂空区紧贴培养基薄层，注意不要留有气泡，放回培养箱36℃±1℃继续厌氧培养3～4h； 

5）在紫外分析仪365nm下观察蓝色荧光，具有蓝色荧光的蓝色菌落为阳性。无蓝色菌落生长的纸片则为阴性。 

上述过程设置阳性菌液为产气荚膜梭菌菌液，阴性菌液为生孢梭菌菌液，阳性菌液在主纸片和确证纸片均出现特征目标菌落，阴性菌液未见蓝色菌落及蓝色荧光菌落，表明实验结果有效。 

对于阳性结果，采用产气荚膜梭菌现有国家标准检测方法GB/T4789.13-2012中菌落计数方法。 

a)只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落； 

b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落； 

c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落； 

d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落； 

e）2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU之间，分别计数2个稀释度平板上的典型菌落。 

实施例5：产气荚膜梭菌快速检测纸片计数效果评测 

按实施例3制备产气荚膜梭菌检测纸片，备用。 

用产气荚膜梭菌培养液100μL加入到500mL灭菌（121℃高压灭菌15min）市售矿泉水后，分别稀释至10^-1～10^-7得到人工污染的样液，取10^-4～10^-7样液各1mL按照实施例4中的方法使用快速检测纸片进行检测。同时进行营养琼脂平板菌落计数。检测的结果如表2。 

表2：人工污染矿泉水样品检测结果 

注：-表示菌数过多无法进行计数 

由表2结果表明，产气荚膜梭菌检测纸片与营养琼脂平板计数结果一致，两组数据经SPSS软件进行数据分析后无显著差异。 

实施例6：特异性实验 

在制作好的产气荚膜梭菌检测纸片上分别接种产气荚膜梭菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、柯氏库克菌、粪链球菌、藤黄微球菌、生孢梭菌菌液，36℃±1℃厌氧培养18h后放入无菌操作台，观察其有无蓝色菌落。如有蓝色菌落则进行确证实验，将上层透明塑料膜揭起，将确证纸片贴在培养基薄层上，注意不要留有气泡，放回培养箱36℃±1℃继续培养3～4h后，在紫外分析仪365nm下观察蓝色荧光，具有蓝色荧光的蓝色菌落为阳性。无蓝色菌落生长的纸片则为阴性。观察并记录结果。 

各实验菌在纸片上的生长情况如表3。由表可见目标菌产气荚膜梭菌在纸片上生长良好，其它非目标菌都无法在快速检测纸片上生长，只有生孢梭菌能够在纸片上生长，但是为白色菌落在纸片上很难辨认，不会影响产气荚膜梭菌的识别与计数，所以本实验所研究出的产气荚膜梭菌快速检测纸片特异性强，能够在使产气荚膜梭菌增殖期抑制大多数杂菌，并显示特异性的蓝色菌落。 

表3：特异性实验结果 

	主纸片测试结果	确证纸片测试结果
			产气荚膜梭菌	蓝色菌落	蓝色荧光
生孢梭菌	白色菌落	--------
			藤黄微球菌	未见明显生长	--------
沙门氏菌	未见明显生长	--------
			金黄色葡萄球菌	未见明显生长	--------
大肠杆菌	未见明显生长	--------
			柯氏库克菌	未见明显生长	--------
福氏志贺菌	未见明显生长	--------
			痢疾志贺菌	未见明显生长	--------
阪崎肠杆菌	未见明显生长	--------
			绿脓杆菌	未见明显生长	--------
粪链球菌	未见明显生长	--------

注：-----表示未见反应。 

Claims (5)

1.一种产气荚膜梭菌快速检测纸片，其特征在于：该检测纸片由主纸片和确证纸片两部分构成，主纸片依次由透明塑料膜、带有镂空区域的PET耐高温塑料中层板、印刷好方格的卡纸和透明PET耐高温塑料底板组成；在PET耐高温塑料中层板镂空区域内填充有产气荚膜梭菌选择性显色培养基，确证纸片为涂有确证培养基的透明塑料膜；

产气荚膜梭菌选择性显色培养基原始重量组份为：胰蛋白胨25～35g，酵母浸粉15～25g，葡萄糖4～6g，丙酮酸钠1～3g，黄原胶10-20g，聚丙烯酸钠2-4g，环丝氨酸0.004～0.006g，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐0.05～0.07g，硫酸镁 0.70～0.74g，蒸馏水1000mL；

确证培养基原始重量组份为：黄原胶1～2g，聚丙烯酸钠0.2～0.4g，4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷0.006～0.018g，蒸馏水100mL。

2.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌快速检测纸片，其特征在于：PET耐高温塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构。

3.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌快速检测纸片，其特征在于：透明塑料膜为PET塑料膜，厚度为0.05mm～0.10mm；带有镂空区域的PET耐高温塑料中层板为PET塑料板，厚度为0.15mm～0.20mm，耐高温的温度为130℃～150℃；印刷好方格的卡纸为纯木浆卡纸，厚度为0.10mm～0.15mm；透明PET耐高温塑料底板为PET塑料板，厚度为0.15mm～0.20mm，耐高温的温度为130℃～150℃。

4.一种权利要求1所述的产气荚膜梭菌快速检测纸片的制备方法，其步骤如下：

1）主纸片培养基的制备

按上述重量组份，将胰蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、黄原胶、聚丙烯酸钠加入到900mL蒸馏水中，加热、搅拌溶解后，再加入丙酮酸钠及硫酸镁，搅拌；然后用1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HCl溶液调体系pH值至7.0±0.2，121℃高压灭菌15min，冷却至60℃；然后将环丝氨酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐用100mL蒸馏水溶解后，用一次性过滤器过滤除菌后加入到前述的培养基中，搅拌混匀；

2）检测主纸片的制作

准备好透明塑料膜、PET耐高温塑料中层板、印刷好方格的卡纸和透明PET耐高温塑料底板；在PET耐高温透明塑料板上制作出镂空区域；将外层透明塑料膜、PET耐高温塑料板、卡纸与PET耐高温塑料底板按顺序排好固定，放入灭菌锅内121℃高压灭菌15min；然后将步骤1）制备的培养基均匀涂在透明塑料膜的里侧表面，并将PET耐高温透明塑料板上的镂空区域填满；

3）确证纸片的制作

按上述重量组份，将黄原胶、聚丙烯酸钠按量加入到90 mL蒸馏水中溶解后混匀，得到冷水凝胶剂混合物；另取透明塑料膜，将上述冷水凝胶剂混合物均匀涂在透明塑料膜上的一个表面上，121℃高压灭菌15min；然后将显色物质4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷按上述重量组份用10mL去离子水溶解，用一次性过滤器过滤除菌，在无菌操作台内将显色物质的去离子水溶液加至含有冷水凝胶剂的透明塑料膜上，均匀涂开并晾干；

4）检测纸片的包装

检测主纸片和确证纸片均独立无菌包装，确证纸片用于主纸片出现目标菌特征菌落后需要确证时使用。

5.权利要求1所述的产气荚膜梭菌快速检测纸片在检测产气荚膜梭菌方面的应用。

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