CN103080299B - β‑葡糖苷酶激活剂用于检测和/或鉴定难辨梭菌的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少一种β‑葡糖苷酶底物和不同于所述底物的通式Ar‑β‑D‑葡糖苷的化合物的反应培养基，其中Ar‑表示芳香化合物。根据本发明，这样的培养基可用于检测和/或鉴定难辨梭菌(C.difficile)的方法中。

Description

β-葡糖苷酶激活剂用于检测和/或鉴定难辨梭菌的用途
本发明涉及检测和/或鉴定难辨梭菌(Clostridium difficile)的方法。其还涉及对难辨梭菌具有特异性的包含β葡糖苷酶激活剂的反应培养基。
难辨梭菌(C.difficile)是革兰氏阳性芽孢杆菌，其是完全厌氧的且形成孢子。难辨梭菌是严重程度不定的肠疾病的病因：中度或爆发性腹泻、假膜性结肠炎或中毒性巨结肠，这些病症自身可以成为脓毒症的原因。难辨梭菌通过经口摄入对胃酸耐受且在肠中萌发的孢子来传染。结肠的共生菌落的失衡能使难辨梭菌增殖，这产生成为结肠炎病因的毒素。在许多情况下，共生菌落的失衡归因于服用抗生素。难辨梭菌可以被认为是无害的环境微生物，其在某些条件下变成机会致病菌。难辨梭菌的无症状消化系统携带者在成年人群中估计为3%，但在抗生素治疗或在高流行性单位停留之后达到个体的15%至25%。通常观察到高携带水平，从住院患者的20%至40%高达至幼儿的50%至70%。能够早期且迅速的诊断是预防严重并发症和有效医疗护理的关键要素。
诊断基于对毒素的寻找并基于培养。
毒素直接从粪便的分离是难辨梭菌的产毒菌株存在的优异标记。参考方法在于通过细胞培养来寻找致细胞病变作用(在英语中，CTA表示细胞毒活性)。该方法非常灵敏，但未被标准化，并且需要专门的技术人员和几天的响应时间。已经开发了ELISA型免疫酶试验，其检测单独的毒素A或者毒素A和B。获得结果的时间降低了。然而，推荐将用于检测毒素的免疫学技术与细菌培养组合以分离难辨梭菌菌株。可在由本申请人销售的难辨梭菌琼脂上采用该培养，然后通过生物化学方法（例如20A试条(gallery)或快速ID32A试条）来鉴定难辨梭菌菌落。然而，通过试条鉴定必须使要鉴定的细菌的纯培养物在合适的生长培养基上，以获得足够的生物质(3至4McFarland)，这在最好的情况下耗时48小时(从采样开始24至72小时的分离培养(这仅给出了假定的检测)，然后24至72小时的培养以产生足够的生物质)。然后，对于ID32A试条，在孵育4小时后进行试条的读数，对于20A试条，在孵育24至48小时之后进行试条的读数。
最终，可以使用分子生物技术进行诊断。然而，这些技术并非目前常用的。
通过本申请人为了改善在细菌培养物中直接鉴定难辨梭菌而进行的工作，本申请人证明，β-葡糖苷酶酶底物的使用可以容易且快速地鉴定难辨梭菌。所述β-葡糖苷酶底物的使用在申请WO2009/092982中描述为减少获得难辨梭菌鉴定结果所用的时间。
早期且迅速地鉴定在样品中可能存在的难辨梭菌仍是主要目的，并且本申请人已经通过更特别地寻求加快酶活性的显示来继续从事其工作。因此，本申请人已经出乎预料地证明，包含β-葡糖苷酶底物和通式Ar-β-D-吡喃葡糖苷的β-葡糖苷酶激活剂的反应培养基使难辨梭菌在样品中被迅速鉴定，换言之，这样的培养基使至少一些难辨梭菌菌株的酶活性被更早地检测，在所述通式中，Ar-对应于芳环或多个毗连的芳环。Ar-β-D-葡糖苷化合物的使用使β-葡糖苷酶被激活并且能观察到难辨梭菌菌落的明显更强的着色。有利地，所述Ar-β-D-葡糖苷化合物具有远优于其他β-D-葡糖苷衍生物（例如纤维二糖（4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-葡萄糖）或甲基-β-D-葡萄糖）的难辨梭菌β-葡糖苷酶激活能力。
已知的是，通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物能用作β-葡糖苷酶底物，在所述通式中，Ar表示至少一种同素环的或杂环的芳环。该用途报道于申请WO2009/092982(如上)中。同样，Hildebrand和Schroth报道了熊果苷或氢醌β-D-吡喃葡糖苷作为碳源以0.5%重量/体积(换言之，5g/l)的浓度与葡萄糖组合用于反应培养基中。由色谱方法测定的熊果苷在氢醌中的水解是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的β-葡糖苷酶活性的标记(Hildebrand和Schroth,Applied Microbiology,1964;12(6):487-491)。这阻碍了本领域技术人员将Ar-β-D-葡糖苷化合物作为β-葡糖苷酶激活剂用于反应培养基中以检测或鉴定难辨梭菌，因为他们会发现其自身与旨在显示靶微生物的酶活性的底物竞争。
最后，现有技术报道了口服给予的熊果苷被排泄和代谢在尿中，并且由于其利尿和抗菌性质可以加以使用(Schindler等人,2002;J.Clin.Pharmacol.;42(8):920-927;Siegers等人,2003,Phytomedicine;10(Suppl4):58-60)。这样的用途也阻碍了将熊果苷用于反应培养基中以检测细菌。
在详细描述本发明之前，给出下列定义以更好地理解本发明。它们不以任何方式进行限制。
反应培养基应理解为包含微生物的代谢表达和/或生长所必须的所有成分的培养基。所述反应培养基可以是固体的、半固体的或液体的。固体培养基应理解为凝胶化的培养基。琼脂是微生物学中常见的用于培养微生物的凝胶剂，但可以使用明胶、琼脂糖或者其他天然或人造的凝胶剂。许多制剂是可商购的，例如Columbia琼脂、Trypcase-大豆琼脂、MacConkey琼脂、Sabouraud琼脂，或更一般来说例如在Handbook of MicrobiologicalMedia(CRC Press)中描述的那些。本发明的反应培养基必须允许难辨梭菌生长。
所述反应培养基可以包含一种或多种组合的成分，例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素等。所述培养基还可以包含着色剂。作为指示，可以例举依文思蓝、中性红、羊血、马血、诸如氧化钛的遮光剂、硝基苯胺、孔雀石绿、亮绿、一种或多种代谢指示剂、一种或多种代谢调节剂等作为着色剂。
所述反应培养基可以为显示培养基、或者培养显示培养基。在第一种情况下，微生物的培养在接种之前进行，在第二种情况下，检测和/或鉴定培养基还构成了培养培养基。
本领域技术人员还可使用鸳鸯平板（bi-biote），其可以容易地比较两种包含不同底物或不同选择性混合物的培养基，并且在其上已沉积了相同的生物样品。
所述反应培养基可以包含难辨梭菌菌株的一种或多种生长激活剂。生长激活剂应理解为刺激微生物生长的一种化合物或一组化合物。特别地，可以例举血液、血清和蛋黄。非限制性地提及，0.1%至10%的浓度特别适于本发明。
所述反应培养基可以包含一种或多种还原剂。还原剂应理解为通过中和在培养基中存在的溶解的氧来促进厌氧细菌生长的一种化合物或一组化合物。特别地，可以例举半胖氨酸、丙酮酸盐、去氧酶(l’Oxyrase)、亚硫酸钠、二硫酸盐、组氨酸和硫化亚铁。非限制性地提及，0.05g/l至50g/l、优选0.1g/l至2g/l的浓度特别适于本发明。
所述反应培养基可以包含一种或多种难辨梭菌孢子萌发诱导剂。孢子萌发诱导剂应理解为促进难辨梭菌从孢子状态到植物状态的一种化合物或一组化合物。特别地，可以例举牛磺胆酸钠。
非限制性地提及，0.1g/l至10g/l、优选1g/l至5g/l的浓度特别适于本发明。
所述反应培养基可以包含一种或多种选择性药剂。选择性药剂应理解为能阻止或减缓除靶微生物之外的微生物生长的任何化合物。非限制性地提及，5mg/l至5g/l的浓度特别适于本发明。
可以例举抗生素和抗真菌剂作为选择性药剂。抗生素应理解为能阻止或减缓细菌生长的任何化合物。特别地，它们属于头孢菌素、氨基糖苷、多肽、磺酰胺和喹诺酮。作为指示，特别可以例举抗生素头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、头孢曲松、头孢泊肟、氨曲南、庆大霉素、甲氧苄啶、妥布霉素、拉氧头孢、磷霉素、D-环丝氨酸、多粘菌素、多粘菌素-E和诸如萘啶酸的喹诺酮。
抗真菌剂应理解为能阻止或减缓酵母或霉菌生长的任何化合物。作为指示，可以特别例举两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和环己酰亚胺。
通常，所述反应培养基还可包含可以通过能被直接或间接检测到的信号来检测靶微生物的酶活性或代谢活性的底物。对于直接检测，该底物可与用作荧光或发色标记的部分连接。对于间接检测，本发明的反应培养基还可包含pH指示剂，其对由底物消耗而导致的pH变化敏感并显示靶微生物的生长。所述pH指示剂可以是发色团或荧光团。可以例举中性红、苯胺蓝和溴甲酚蓝作为发色团的实例。所述荧光团包括例如4-甲基伞形酮、羟基香豆素衍生物或试卤灵衍生物。
能鉴定难辨梭菌的β-葡糖苷酶底物应理解为在适合的生长条件下导致难辨梭菌着色的底物。特别地，可以提及2-羟基苯基-β-葡糖苷（邻苯二酚-β-葡糖苷)；品红-β-葡糖苷（5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-葡糖苷）；DHF-β-葡糖苷（二羟基黄酮-β-葡糖苷）；七叶苷（七叶亭-β-葡糖苷）(Esculétine-beta glucoside)；CHE-β-葡糖苷（3,4-环己烯并七叶亭-β-葡糖苷）（3,4Cyclohexénoesculétine-beta glucoside）；8-羟基喹啉-β-葡糖苷；X-β-葡糖苷（5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-葡糖苷）；玫瑰红-β-葡糖苷（Rose-beta glucoside）（6-氯-3-吲哚氧基-β-葡糖苷）；6-溴-3-吲哚氧基-β-葡糖苷；蓝色-β-葡糖苷（Blue-betaglucoside）（5-溴-3-吲哚氧基-β-葡糖苷）；6-氟-3-吲哚氧基-β-葡糖苷；茜素-β-葡糖苷；对硝基苯基-β-葡糖苷；4甲基伞形酮-β-葡糖苷（4Methylumbelliferyl-beta glucoside）、对萘酚苯甲醇-β-葡糖苷、吲哚氧基-N-甲基-β-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-β-葡糖苷、萘基-β-葡糖苷；氨基苯基-β-葡糖苷；二氯氨基苯基-β-葡糖苷、AldolTM-β-葡糖苷(BIOSYNTH,Lukas M.Wick,Alexander Bayer,Christophe Weymuth,Günter Schabert,Vanessa Pfister,Aysel Aslan,Urs P.Spitz,“Novel Chromogenic EnzymeSubstrates”,ASM General Meeting,2009,Philadelphia,I-091/285)。
所述反应培养基还可以包含酶激活剂。酶激活剂应理解为用于激活酶消化过程（换言之，用于降低显示酶活性所用的孵育时间和/或增加所述酶活性）的化合物。
本发明的β-葡糖苷酶激活剂具有通式Ar-β-D-葡糖苷，其中Ar-表示芳环。我们通过芳环表示不饱和化合物，即，具有双键并包含一个或多个毗连的同原子的环或杂原子的环，每个环具有5至7个顶点。以非限制性的方式，可以提及熊果苷（氢醌-β-D-葡糖苷）、4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷、4-氨基苯基-β-葡糖苷、水杨苷（2-(羟基甲基)苯基-β-D-葡糖苷）和七叶苷（6,7-二羟基香豆素-β-葡糖苷）。这些化合物中的一些为β-葡糖苷酶底物。对于本发明，它们被认为是激活剂，因为它们可以降低检测用作底物的化合物的水解所必需的孵育时间，或者它们可以增进这种水解。因此，令人惊讶地，本发明的酶底物和激活剂的组合可以具有比分别使用这些化合物时更早和/或更强的酶活性检测。
可以明显地证明化合物对具有延迟的和/或微弱的β-葡糖苷酶活性的某些难辨梭菌菌株的激活能力，如果所述化合物和所述底物的组合与仅以至少等于组合的底物和激活剂的摩尔浓度总和的摩尔浓度使用激活剂的底物时相比能使检测更早和/或更强的话。
生物样品旨在表示从用于分析的实体分离的一小部分或少量。其可以为得自生物流体样本的临床样品，或得自任何类型的食物的食物样品。因此，该样品可以为液体的或固体的。以非限制性的方式，可以提及全血、血清、血浆、尿或粪便样品、鼻、喉、皮肤、伤口或脑脊液的临床样品；来自水、诸如牛奶或果汁的饮料、酸乳、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等的食物样品；源自动物饲料的食物样品，例如特别是来自骨粉的样品。该样本可以原样使用，或可以在分析之前根据本领域技术人员已知的方法进行富集、提取、浓缩或纯化型的配制。
在接触所述样品之后，使所述反应培养基在合适温度（通常为20°C至50°C、优选为30°C至40°C）下孵育。优选地，所述孵育根据本领域技术人员已知的技术在厌氧生活中(换言之，在不存在氧气的情况下)进行。
因此，本发明涉及反应培养基，其包含至少一种β-葡糖苷酶底物和浓度低于5g/l的不同于所述底物的通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物，其中Ar-表示芳香化合物。
所述化合物Ar-β-D-葡糖苷的浓度优选为0.3g/l至1.5g/l。
所述通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物优选选自熊果苷或氢醌-β-葡糖苷、4-甲基伞形酮-β-葡糖苷、4-氨基苯基-β-葡糖苷、水杨苷或2-(羟基甲基)苯基-β-D-葡糖苷、七叶苷或6,7-二羟基香豆素-β-葡糖苷。
所述化合物Ar-β-D-葡糖苷优选为熊果苷。
根据本发明的一个优选实施方案，所述β-葡糖苷酶底物选自茜素-β-葡糖苷、品红-β-葡糖苷（5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-葡糖苷）、DHF-β-葡糖苷、3HF-β-葡糖苷和CHE-β-葡糖苷（3,4-环己烯并七叶亭-β-葡糖苷）和BIOSYNTH公司的ALDOLTMβ-葡糖苷(Wick等人.2009.ASM General meeting–Philadelphia(PA,USA))。所述β-葡糖苷酶底物的浓度为25mg/l至1000mg/l，优选为50mg/l至400mg/l。
根据本发明，所述酶激活剂为水解产物与所述酶底物的水解产物不同的酶底物。
根据本发明的一个优选实施方案，所述酶激活剂是其产物在所述反应培养基中不能由肉眼检测到的酶底物，而前述酶底物的水解产物则可以。
根据本发明的另一优选实施方案，所述反应培养基还包含难辨梭菌孢子萌发激活剂，所述激活剂优选为牛磺胆酸钠，浓度为0.1g/l至10.0g/l，优选为1.0g/l至5.0g/l。
本发明涉及检测和/或鉴定难辨梭菌的方法，其包括下列步骤：
a)使可能包含难辨梭菌的样品与包含至少一种β-葡糖苷酶底物和不同于所述底物的通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物的反应培养基接触，其中Ar-表示芳香化合物；
b)孵育，以及
c)检测所述β-葡糖苷酶底物的水解，所述水解指示难辨梭菌的存在。
根据一个优选的实施方案，本发明的方法在步骤a)中采用诸如上文定义的培养基。
根据另一优选的实施方案，在本发明的方法的步骤b)中采用的孵育是在厌氧生活中进行的。
本发明涉及通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物作为β-葡糖苷酶激活剂在反应培养基中的用途。
优选地，所述化合物的浓度低于5g/l，优选为0.3g/l至1.5g/l。
优选地，所述化合物选自：熊果苷或氢醌-β-D-葡糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷、4-氨基苯基-β-葡糖苷、水杨苷或2-(羟基甲基)苯基-β-D-葡糖苷、七叶苷或6,7-二羟基香豆素-β-葡糖苷。更优选地，所述化合物为熊果苷。
优选地，所述反应培养基为用于检测和/或鉴定难辨梭菌的培养基。
以说明的方式给出下列实施例，这些实施例决非限制性的。它们将使本发明能被更好地理解。
实施例1：证明熊果苷对β-葡糖苷酶底物的激活作用
1.培养基和微生物
在存在或不存在CHE-β-葡糖苷的情况下，在包含不同浓度的熊果苷的培养基上试验了由本申请人收集的8种难辨梭菌菌株。然后在24小时时进行培养皿的读数。培养基的组成如下：
所有培养基共用的难辨梭菌基质：
化合物 以g/l计的浓度
蛋白胨、组织和细胞提取物 12.5
氯化钠 6
硫酸镁 0.3
L-精氨酸 1
亚硫酸氢钠 0.1
琼脂 13
柠檬酸铁铵 0.3
葡萄糖 0.2
TRIS 0.1
牛磺胆酸钠 2.5
然后，根据培养基，添加熊果苷和/或CHE-β-葡糖苷：
在下表中指出试验菌株的参考编号和各自的核糖核酸型：
菌株编号 核糖核酸型
06 03 006 O27
08 01 092 O27
08 01 104 O27
08 01 109 O27
08 01 112 O103
08 01 113 O27
08 01 116 O27
08 01 118 O27
2.试验
将培养基分布在皮氏培养皿中。
在厌氧生活中在37°C下预培养48小时后进行接种。
进行0.5McF下的在盐水中的悬浮，然后用10μl接种测量杯来接种菌株。
在厌氧生活中在37°C下孵育24小时后进行读数。
3.结果
酶活性/着色的读数标度
·0=无活性
·0.5=非常浅的着色
·1=明确的低强度着色
·2=明显的中强度着色
·3=存在强着色
·4=存在非常强的着色
由该底物获得的着色直至强度为1都为灰色，对于其它值为黑色。
因此，在孵育24小时后，我们获得以下结果：以在不同培养基上着黑色的菌株数计
4.阐释
在不存在底物时，观察到没有着色。
单独的熊果苷也未使所获得的菌落着色。
相反地，在CHE-β-葡糖苷存在下添加熊果苷时，观察到了β-葡糖苷酶的激活，这由着色的增强(从灰色至黑色)体现。
5.结论
对于难辨梭菌菌株，熊果苷用作β-葡糖苷酶激活剂。
实施例2：熊果苷对不同的难辨梭菌菌株的最佳浓度的试验
1.培养基和微生物
在各自包含不同熊果苷浓度的5种培养基上试验本申请人收集的24种难辨梭菌菌株。然后在24小时时进行培养皿的读数。
基于以上实施例1所示的难辨梭菌培养基来制备所用的培养基，向其添加0.016g/l的头孢噻肟、0.005g/l的两性霉素B和0.25g/l的D-环丝氨酸(最终浓度)和下表的熊果苷：
在下表中指出试验菌株的参考编号和各自的核糖核酸型：
菌株编号 核糖核酸型
02 01 042 ND
02 01 043 ND
02 06 146 ND
02 06 148 ND
06 03 006 027
08 01 078 027
08 01 080 O27
08 01 084 O27
08 01 088 010
08 01 092 027
08 01 094 078
08 01 095 027
08 01 096 027
08 01 098 027
08 01 100 027
08 01 102 001
08 01 103 014
08 01 104 027
08 01 109 027
08 01 111 027
08 01 113 027
08 01 114 002
08 01 116 027
08 01 118 027
ND=未测定
2.试验
将培养基分布在皮氏培养皿中。
在厌氧生活中在37°C下预培养48小时后进行接种。
进行0.5McF下的在盐水中的悬浮，然后用10μl接种测量杯来接种菌株。
在厌氧生活中孵育24小时后进行读数。
3.结果
酶活性/着色的读数标度
·0=无活性
·0.5=非常浅的着色
·1=明确的低强度着色
·2=明显的中强度着色
·3=存在强着色
·4=存在非常强的着色
由该底物获得的着色直至强度为1都为灰色，对于其它值为黑色。
此处观察到的对于不同培养基的结果是在厌氧生活中在37°C下孵育24小时之后获得的。
因此，在孵育24小时后，我们获得以下结果：以在不同培养基上着黑色的菌株数计
4.阐释
当向培养基添加熊果苷时，明显地改善了着色。在24小时时，在没有熊果苷的培养基上，24个菌株中仅12个菌株具有大于或等于1的着色，而在750mg/L熊果苷存在下，24个菌株/24个菌株均着色，最小强度为1。
如果未超过1g/l，则在对照中具有强着色的菌株似乎很少受或不受熊果苷存在的影响。超过该值，对于某些菌株，观察到着色强度稍微降低。
5.结论
熊果苷在此确定用作β-葡糖苷酶激活剂，并且其作用对于难辨梭菌的早期检测、特别是对核糖核酸型O27是重要的。
实施例3：熊果苷对多种β-葡糖苷酶底物的激活作用的试验
1.培养基和微生物
在包含DHF-β-葡糖苷(培养基A)、茜素-β-葡糖苷(培养基B)或3HF-β-葡糖苷(培养基C)和增加浓度的熊果苷的培养基上试验了实施例1所试验的8种难辨梭菌菌株。
然后在24小时和48小时时进行培养皿的读数。
基于以上实施例1所示的难辨梭菌培养基来制备所用的培养基，向其添加下表的熊果苷：
根据底物，培养基因此如下：
·400mg/L的DHF-β-葡糖苷(培养基TA、1A、2A和3A)
·50mg/L的茜素-β-葡糖苷(培养基TB、1B、2B和3B)
·300mg/L的3HF-β-葡糖苷(培养基TC、1C、2C和3C)
2.试验
将培养基分布在皮氏培养皿中。
在厌氧生活中在37°C下预培养48小时后进行接种。
进行0.5McF下的在盐水中的悬浮，然后用10μl接种测量杯来接种菌株。
在厌氧生活中在37°C下孵育24小时和48小时后进行读数。
3.结果
酶活性/着色的读数标度
·0=无活性
·0.5=非常浅的着色
·1=明确的低强度着色
·2=明显的中强度着色
·3=存在强着色
·4=存在非常强的着色
菌落的颜色：
培养基A：棕色
培养基B：淡紫色
培养基C：棕色
4.阐释
在熊果苷的存在下，不论是否使用底物都观察到了着色强度的提高。这种提高在DHF-β-葡糖苷的使用期间，从在前24小时开始并且主要在1g/l熊果苷存在下是尤其明显的。对于茜素-β-葡糖苷，所述提高在24小时较不明显，但对包含熊果苷的所有培养基而言在48小时时更明显。最后，对于3HF-β-葡糖苷，该化合物的作用仅在48小时时明显，但无论使用何种浓度并且无论是何种菌株，都观察到了真实的β-葡糖苷酶活性激活。
然而，理想浓度根据所用底物而变化，并且对于DHF-β-葡糖苷和3HF-β-葡糖苷而言为约1g/l，并且对于茜素-β-葡糖苷而言为500mg/l。
5.结论
该试验表明熊果苷对难辨梭菌菌株中的β-葡糖苷酶活性的激活的重要性。
实施例4：Ar-β-葡糖苷化合物对β-葡糖苷酶活性的激活作用的试验
1.培养基和微生物
在包含化合物的培养基上试验了6种难辨梭菌菌株，所述化合物能在这些菌株中用作β-葡糖苷酶激活剂。这些菌株的核糖核酸型在上表中示出。具有参考编号08 01 091的菌株为056。所试验的用作β-葡糖苷酶激活剂的化合物如下：
·熊果苷；
·O-甲基-β-葡糖苷；
·纤维二糖；
·水杨苷；
·4-氨基苯基-β-葡糖苷；
·4-甲基伞形酮-β-葡糖苷；
·七叶苷。
在使每一化合物具有相同摩尔浓度的浓度下对其进行试验。
基于以上实施例1所示的难辨梭菌培养基来制备所用的培养基，向其添加0.3g/l的CHE-β-葡糖苷底物并分别添加下表的化合物之一：
2.试验
将培养基分布在皮氏培养皿中。
在厌氧生活中在37°C下预培养48小时后进行接种。
进行0.5McF下的在盐水中的悬浮，然后用10μl接种测量杯来接种菌株。
在37°C下在厌氧生活中孵育24小时后进行读数。
3.结果
酶活性/着色的读数标度
·0=无活性
·0.5=非常浅的着色
·1=明确的低强度着色
·2=明显的中强度着色
·3=存在强着色
·4=存在非常强的着色
由该底物获得的着色直至强度为1都为灰色，对于其它值为黑色。
*=显示不均匀颜色的菌落的菌株；以分数x/y形式表示的结果表示某些菌株显示强度x并且其他的显示强度y。
4.阐释
O-甲基-β-葡糖苷和纤维二糖对难辨梭菌的β-葡糖苷酶不具有激活作用。相反地，观察到在对照中显示着色的菌株的着色降低。
相反地，对于熊果苷，在水杨苷、4-氨基苯基-β-葡糖苷、4-甲基伞形酮或七叶苷的存在下，观察到β-葡糖苷酶的激活和由此导致的菌落着色增加。在这些化合物中的一种的存在下，观察到颜色不均匀的菌株的着色均匀化。对于包含七叶苷的培养基，在琼脂中观察到黑色着色的强扩散，这有时难以对该培养基进行读数。
5.结论
该试验表明具有至少一个芳环的化合物，例如熊果苷、水杨苷、4-氨基苯基-β-葡糖苷、4-甲基伞形酮或七叶苷对难辨梭菌的β-葡糖苷酶的激活作用。
实施例5：基于ALDOL TM (ALDOL TM 455-β-葡糖苷和ALDOL TM 484-β-葡糖苷-BIOSYNTH) 的两种β-葡糖苷酶底物的试验
1.培养基和微生物
在4种不同的培养基上测试8种难辨梭菌菌株，所述培养基分别为对照生长培养基(T)、包含75mg/L的ALDOLTM455-β-葡糖苷的培养基(1)、包含75mg/L的ALDOLTM484-β-葡糖苷的培养基(2)，以及包含300mg/L水平的CHE-β-葡糖苷和柠檬酸铁铵(300mg/L)的培养基(3)。
所有培养基共用的营养基质的组成如下所示。其为不具有柠檬酸铁铵的难辨梭菌基质，但补充有1g/L的熊果苷。
化合物 以g/l计的浓度
组织和细胞提取物 12.5
氯化钠 6
硫酸镁 0.3
L-精氨酸 1
亚硫酸氢钠 0.1
琼脂 13
熊果苷 1
葡萄糖 0.2
TRIS 0.1
牛磺胆酸钠 2.5
在熔化琼脂后，将基质分为4×80mL，分配入烧瓶T、1、2和3中。300mg/L的CHE-β-葡糖苷和300mg/L的柠檬酸铁铵预先称重放入烧瓶3中。高压灭菌循环(autoclaving cycle)将培养基灭菌。在培养基返回至过冷之后，来自浓缩母液的ALDOLTM系底物以添加剂形式添加，并溶解在诸如DMSO(二甲亚砜)的溶剂中。
2.试验
将培养基分布在皮氏培养皿中。
在厌氧生活中在37°C下预培养48小时后进行接种。
进行0.5McF下的在盐水中的悬浮，然后用10μl接种测量杯来接种菌株。
在37°C下在厌氧生活中孵育24小时后进行读数。结果如下所列。
3.结果
在各种底物被难辨梭菌菌株酶水解之后，在培养基1、2和3上获得的分离的菌落的着色分别为黄色、橙色和棕色。
酶活性的表达的读数标度(着色强度)
·0=无活性
·0.5=非常浅的着色
·1=明确的低强度着色
·2=明显的中强度着色
·3=存在强着色
·4=存在非常强的着色
4.阐释
ALDOLTM455-β-葡糖苷和ALDOLTM484-β-葡糖苷(BIOSYNTH)底物能优异地检测难辨梭菌。从孵育24小时开始，获得的着色强度(分别为黄色和橙色)是高的。由这两种底物获得的表现基本与用CHE-β-葡糖苷获得的表现相同。

Claims (14)

1.反应培养基，其包含至少一种β-葡糖苷酶底物和浓度低于5g/l的不同于所述底物的通式Ar-β-D-葡糖苷的β-葡糖苷酶激活剂，其中Ar-表示芳香化合物，所述β-葡糖苷酶激活剂选自氢醌-β-D-吡喃葡糖苷、4-甲基伞形酮-β-葡糖苷、4-氨基苯基-β-葡糖苷或2-(羟基甲基)苯基-β-D-葡糖苷。
2.权利要求1的反应培养基，其中所述β-葡糖苷酶激活剂的浓度为0.3g/l至1.5g/l。
3.权利要求1的反应培养基，其中所述β-葡糖苷酶激活剂为氢醌-β-D-吡喃葡糖苷。
4.权利要求1的反应培养基，其中所述β-葡糖苷酶底物选自茜素-β-葡糖苷、品红-β-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-葡糖苷)、DHF-β-葡糖苷、3HF-β-葡糖苷和CHE-β-葡糖苷(3,4-环己烯并七叶亭-β-葡糖苷)以及ALDOLTMβ-葡糖苷。
5.权利要求1的反应培养基，其中所述β-葡糖苷酶底物的浓度为25mg/l至1000mg/l。
6.权利要求5的反应培养基，其中所述β-葡糖苷酶底物的浓度为50mg/l至400mg/l。
7.权利要求1至6中任一权利要求的反应培养基，其还包含难辨梭菌(Clostridiumdifficile)孢子萌发激活剂。
8.权利要求7的反应培养基，其中所述难辨梭菌孢子萌发激活剂为牛磺胆酸钠。
9.权利要求8的反应培养基，其中牛磺胆酸钠的浓度为0.1g/l至10g/l。
10.权利要求9的反应培养基，其中牛磺胆酸钠的浓度为1g/l至5g/l。
11.检测和/或鉴定难辨梭菌的方法，其包括下列步骤：
a)使可能包含难辨梭菌的样品与包含至少一种β-葡糖苷酶底物和不同于所述底物的通式Ar-β-D-葡糖苷的β-葡糖苷酶激活剂的反应培养基接触，其中Ar-表示芳香化合物，所述β-葡糖苷酶激活剂选自氢醌-β-D-吡喃葡糖苷、4-甲基伞形酮-β-葡糖苷、4-氨基苯基-β-葡糖苷或2-(羟基甲基)苯基-β-D-葡糖苷；
b)孵育；
c)检测所述β-葡糖苷酶底物的水解，所述水解指示难辨梭菌的存在。
12.权利要求11的方法，其中在步骤a)中采用的培养基为权利要求1至10中任一权利要求的培养基。
13.权利要求11或12的方法，其中在步骤b)中采用的孵育是在厌氧生活中进行的。
14.氢醌-β-D-吡喃葡糖苷作为β-葡糖苷酶激活剂在制备难辨梭菌检测和/或鉴定培养基中的用途。
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