JP6911660B2 - クロストリジウム属細菌選択分離用培地 - Google Patents
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Description
の指標として用いられる。
Cpはヒトや動物の大腸内常在菌であり、土壌や下水、河川、海等にも広く分布し、食肉、魚介類あるいは野菜などの多くの食品が本菌に汚染されている。さらに、本菌は芽胞を形成時に毒素であるエンテロトキシンを産生するが、芽胞は加熱処理により完全に死滅せず、調理食品や加工食品からも検出される。そのため、しばしば食中毒の原因となり、食品衛生及び安全の点からその検出が重要視されている(非特許文献1、2)。
Cdは病院や高齢者保養施設等での院内感染における日和見感染細菌として知られ、入院患者において抗生物質の投与により腸内のCdが異常増殖したとき、偽膜性大腸炎を引き起こす。近年、欧米では強毒性Cdによる大規模感染が頻発しており、問題となっている(非特許文献1、2)。
寒天培地に検体を塗布後、嫌気培養すると、Cpは亜硫酸塩を還元し、黒色のコロニーを作り、Cdを含む他のクロストリジウム属細菌はほとんど阻止される(非特許文献3、4)。
また、Cdの選択分離培地としては、CCFA培地(Cycloserine Cefoxitin Fructose
Agar)等が知られている。CCFA培地に検体を塗布後、嫌気培養すると、Cdはラフ
(Rough)型のコロニーを形成するが、サイクロセリンとセフォキシチンにより腸内細菌
などの大部分は発育が阻止される(非特許文献5)。
それぞれに適した培地及び培養条件で別々に検査を行う必要があった。しかしながら、食品検体や臨床検体の別に拘らず、検体中に人に危害を与えるおそれのあるCpやCd等クロストリジウム属細菌の存在を迅速かつ確実に検出することは重要である。
このような状況を鑑みて、本発明は、複数種のクロストリジウム属細菌を同一の培地で選択的に検出し、かつ両者を識別可能な培地を提供することを課題とする。
[1](a)サイクロセリン、(b)ポリミキシンB、(c)アミノグリコシド系抗生物質、(d)タウロコール酸ナトリウム、及び(e)有色の色原体化合物を遊離し得るホスファターゼ基質を含有する、クロストリジウム属細菌の検出用培地。
[2]さらに(f)マンニトール、フルクトース、及びメレチトースからなる群から選択される一種以上を含む糖又は糖アルコールを含有する、[1]に記載の培地。
[3]さらに(g)レシチンを含有する、[1]又は[2]に記載の培地。
[4]前記クロストリジウム属細菌が、クロストリジウム パーフリンジェンス、クロス
トリジウム ディフィシル、及びクロストリジウム スポロゲネスからなる群から選択される、[1]〜[3]のいずれかに記載の培地。
[5][1]〜[4]のいずれかに記載の培地に検体を接種する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニーを検出する工程を含む、クロストリジウム属細菌の検出方法。
サイクロセリンの本発明の培地中の含有量は、使用時(微生物の生育時、以降同じ)の濃度として1mg〜1000mg/Lが好ましく、150〜300mg/Lがより好ましい。
ウム属細菌の発育には影響を与えない。
ポリミキシンBの本発明の培地中の含有量は、使用時の濃度として1mg〜100mg/Lが好ましく、5〜50mg/Lがより好ましい。
アミノグリコシド系抗生物質の本発明の培地中の含有量は、使用時の濃度として1mg〜100mg/Lが好ましく、5〜50mg/Lがより好ましい。
タウロコール酸ナトリウムの本発明の培地中の含有量は、使用時の濃度として0.1〜5g/Lが好ましく、0.5〜2g/Lがより好ましい。
有色の色原体化合物を遊離し得るホスファターゼ基質としては、5−ブロモ−3−インドリルリン酸、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルリン酸等が挙げられる。これらの基質を使用する場合には、培養後に好気状態に戻して、遊離した色原体化合物を酸化縮合させて着色させる必要がある。その他に前記ホスファターゼ基質としては、1−(2−(4−ジメチルアミノベンゾイル)フェニル)−1H−インドール−3−イルリン酸(1-{2-[4-(Dimethylamino)benzoyl]phenyl}-1H-indol-3-yl phosphate, disodium salt; Biosynth社製Aldol 515-phospahte)が好ましく挙げられる。これを使用する場合は遊離した色原体化合物の酸化縮合は不要であるため、嫌気条件下での培養中にコロニーを着色させることができる。
前記ホスファターゼ基質の本発明の培地中の含有量は、使用時の濃度として0.01〜0.5g/L含有するのが好ましく、0.05〜0.15g/L含有するのがより好ましい。
糖又は糖アルコールを含有せずとも、本発明の培地はCdを含むクロストリジウム属細菌を生育でき、かつそれぞれ異なる外観性状のコロニーとして識別できるが(Cp:赤色コロニー、Cd:無色コロニー、Cs:肌色コロニー)、糖又は糖アルコールを含有させることにより二者が有色のかつ色調の異なるコロニーとして生育するため(Cp:赤色コロニー、Cd:オレンジ色コロニー、Cs:肌色コロニー)、より検出・識別がしやすくなるため、好ましい。
前記糖又は糖アルコールの本発明の培地中の含有量は、使用時の濃度として1g〜30g/Lが好ましく、1〜10g/Lがより好ましい。
が保有するレシチナーゼによりレシチンが分解され、Cpのコロニーの周囲に白濁(混濁帯)が生じ(いわゆる卵黄反応)、コロニーの視認性及びCdとの識別性が高まる。なお、CdやCsはレシチナーゼを保有しないので、かかる白濁は呈さない。
ここでレシチンは、好ましくは卵黄レシチンである。また、通常は卵黄の態様で本発明の培地に添加される。
レシチンの本発明の培地中の含有量は、使用時の濃度として1〜20g/Lが好ましく、5〜10g/Lがより好ましい。また、レシチンを卵黄の態様で含有させる場合の卵黄の含有量は、使用時の濃度として1〜10質量%が好ましく、1〜3質量%がより好ましい。
ゲル化剤は、通常は高分子化合物であり、増粘性多糖類や吸水性ポリマー等、一般に微生物培養用の固体培地に用いられるものでよい。例えば、寒天、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ジェランガム、ポリビニルアルコール、メチルセルロースやエチルセルロース等のアルキルセルロース、カルボキシメチルセルロースやカルボキシエチルセルロース等のカルボキシアルキルセルロース、及びヒドロキシメチルセルロースやヒドロキシエチルセルロース等のヒドロキシアルキルセルロースが挙げられ、これらから一種又は二種以上を組み合わせた混合物を使用することができる。またこれらの高分子化合物の大きさ(平均分子量、重合度等)は、微生物培養用の固体培地に用いられるときの一般的な範囲のものを用いればよい。例えば、重量平均分子量が好ましくは5000〜200000、また鹸化度が好ましくは75〜99%、より好ましくは85〜90%のポリビニルアルコールを用いることができる。
抗菌性物質としては、例えば、ポリリジン、プロタミン硫酸塩、グリシン、ソルビン酸等が挙げられる。
栄養成分としては、例えば、ペプトン、獣肉エキス、酵母エキス、魚肉エキスが好ましい。
無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩、ピルビン酸ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩が挙げられる。
他の糖類としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、キシロース、セロビオース、マルトースが挙げられる。
増粘剤としては、例えば、デンプン及びその誘導体、ヒアルロン酸、アクリル酸誘導体、ポリエーテル、コラーゲン等が挙げられる。
pH調整剤としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムが挙げられる。
性剤は、クロストリジウム属細菌の生育を妨げる場合があるため、本発明の培地に実質的に含有させない方が好ましい。特に、セフォキシチンは、Cpがセフォキシチン感受性であるため、実質的に含有しないことが好ましい。ここで実質的に含有しないとは、使用時の濃度として好ましくは0.1mg/L以下、より好ましくは0.001mg/L以下、さらに好ましくは0mg/Lである。
また、本発明の培地は、通常、鉄イオンと亜硫酸イオンとを併用して含有しない。これは、該組合せの存在下ではコロニーが黒色になり二種のコロニーを識別し難くなるためである。
シート状の乾燥簡易培地としては、例えば国際公開97/24432号公報に記載の、多孔質材料を含有する層とゲル化剤を含有する層とを積層して含む構成のシート形態のものが挙げられる。この場合、ゲル化剤を含有する層を本発明の培地とすればよい。
本発明の方法は、本発明の培地に検体を接種する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニーを検出する工程を含む。ここで、前記培養工程は、33〜45℃で、24〜48時間嫌気培養することが好ましい。
表1に示す組成成分の1リットル使用量を970ミリリットルの精製水に加え、121℃、15分間加温溶解し、約50℃になるまで冷却してベース培地とし、加熱滅菌した。そこに、精製水に溶解したサイクロセリン、カナマイシンをろ過滅菌してから加え、よく混合した。さらに、ジメチルスルホキシドで溶解したAldol(登録商標)−515 phosphate(Biosynth社)を加えよく混和した(表2)。その後、無菌的に採取した卵黄を終濃度
3質量%になるように加え、よく混和した。プラスチックシャーレ(90φmm)に15mLずつ分注して培地が固まるまで静置し、本発明の培地を作製した。作製した培地は培地表面を還元化するために2日以上嫌気下で保管してから後述の供試試験に用いた。
供試菌株のうちCp、Cd及びCsは、ヒツジ血液寒天培地で24時間、嫌気条件下で前培養したものを供試菌として使用した。それ以外の菌株は、ヒツジ血液寒天培地で24時間、好気条件下で前培養したものを供試菌として使用した。各供試菌株は、白金耳により(1)で作製した培地に画線塗抹し、35℃、48時間嫌気培養後、発育及びコロニーの外観性状を確認した。
結果を表3並びに図1〜3に示す。
また、表1組成からマンニトールのみを除いた他は同様にしてCp及びCdを供試した場合は、Cpは赤色コロニーとして発育し、Cdは無色コロニーとして発育し、Csは肌色コロニーとして発育した。
Claims (5)
- (a)サイクロセリン、(b)ポリミキシンB、(c)アミノグリコシド系抗生物質、(d)タウロコール酸ナトリウム、及び(e)有色の色原体化合物を遊離し得るホスファターゼ基質を含有する、クロストリジウム属細菌の検出用培地。
- さらに(f)マンニトール、フルクトース、及びメレチトースからなる群から選択される一種以上を含む糖又は糖アルコールを含有する、請求項1に記載の培地。
- さらに(g)レシチンを含有する、請求項1又は2に記載の培地。
- 前記クロストリジウム属細菌が、クロストリジウム パーフリンジェンス(Clostridium
perfringens)、クロストリジウム ディフィシル(Clostridium difficile)、及びクロストリジウム スポロゲネス(Clostridium sporogenes)からなる群から選択される、請
求項1〜3のいずれか一項に記載の培地。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の培地に検体を接種する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物のコロニーを検出する工程を含む、クロストリジウム属細菌の検出方法。
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