JP2009034028A - β−グルコシダーゼ及びその製造方法並びにそれを利用したβ型配糖体の製造方法 - Google Patents

β−グルコシダーゼ及びその製造方法並びにそれを利用したβ型配糖体の製造方法 Download PDF

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Shigeharu Fukuda
Tomoyuki Nishimoto
Takanori Okura
隆則 大倉
恵温 福田
博人 茶圓
友之 西本
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Abstract

【課題】 受容体特異性が広く、フェノール性の水酸基への転移反応を優先的に触媒し、且つ、配糖化活性の高い新規な糖転移酵素と、これを用いたβ型配糖体の製造方法を提供することを課題とする。
【解決方法】 新規なβ−グルコシダーゼとその製造方法、並びにこれを用いたβ型配糖体の製造方法であって、アリールβ−グルコシドを供与体として使用し、一段階で且つ選択的に、工業的に利用可能な製造方法を提供することにより上記課題を解決する。
【選択図】なし

Description

本発明は、β−グルコシダーゼ及びその製造方法並びにそれを利用したβ型配糖体の製造方法に関する。詳細には、本発明は、β−グルコシダーゼとそれをコードするDNA、組換えDNA、形質転換体、及び、当該β−グルコシダーゼ産生能を有する微生物又は形質転換体を利用したβ−グルコシダーゼの製造方法、並びに、当該β−グルコシダーゼを用いたβ型配糖体の製造方法に関するものである。

本件出願人は先に、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラ−ゼを用いるL−アスコルビン酸配糖体の製造方法を特許文献1に、また、エラグ酸配糖体の製造方法を特許文献2に開示した。しかしながら、これら配糖体の糖の結合様式はα型であり、該方法では天然界に多く存在するβ型を製造することはできない。

一方、化学合成によりβ型配糖体を作る方法は既に知られているが、一般的に糖の水酸基の保護、脱保護等の工程を含み、合成操作が多段階に及ぶだけではなく、合成過程で多くの副産物を生じ、目的物の分離および精製は非常に困難である。さらに、化学合成における反応特異性は高いものではなく、また、有機溶媒を使用するため特殊な設備が必要である。

各種アルコール配糖体、芳香族アルコール配糖体、ポリフェノール配糖体は天然に広く存在し、配糖体は植物中で様々な役割を担っている。自然界に存在するこれらの配糖体のうちの多くはβ−グルコシドであり、植物などの天然物から抽出する方法も知られているものの、この方法は、植物中のβ−グルコシド含量が少なく、夾雑する物質を多く含んでいるがために、精製に時間とコストを要するという問題があった。

酵素の持つ高い特異性と温和な反応条件を利用した、β型配糖体の酵素的合成法としては一般的に2つが知られている。第一の方法は特許文献3に開示された植物培養細胞を用いた方法、又は、特許文献4に開示された、植物に由来する糖転移酵素、特にグルコース転移酵素の形質転換体を利用する方法(新規転移酵素及びそれを利用したクルクミン配糖体の製造)である。これらは、収率が低い、グルコース供与体として非常に高価なUDP−グルコースを使用する点などの問題があり、工業的製造は困難であった。

第二の方法は、微生物または植物由来のβ−グルコシダーゼによる糖転移反応を利用する方法である。以下、ハイドロキノンを受容体とする場合について例示する。特許文献5では、アスペルギルス属またはトリコデルマ属由来のセルラーゼ剤を利用したβ型ポリフェノール配糖体の製造方法が提案されている。特許文献5は、ハイドロキノンを受容体として作用させた場合、ハイドロキノン−β−D−グルコピラノシド(アルブチン)及び、ハイドロキノン−β−D−セロビオシドが生成することを開示しているものの、後者はアルブチンを受容体とした糖転移産物であり、受容体であるアルブチンの糖部分の水酸基へグルコースが転移した結果によって生成したものであって、受容体であるアルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性水酸基に転移した結果によって得られる1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコピラノシド)の生成は記載されていない。

非特許文献1には、サーモトーガ(Thermotoga)由来のβ−グルコシダーゼを利用した糖転移反応が開示されており、セロビオ−スとアルブチンにβ−グルコシダーゼを作用させた場合、糖転移反応はアルブチンの糖部分の水酸基にβ−(1,6)、β−(1,4)、またはβ−(1,3)結合で起こることが記載されている。しかしながら、非特許文献1には、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性水酸基に転移した結果によって得られる1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコピラノシド)の生成は記載されていない。

特開2004−65098号公報 特開2005−281204号公報 特開平7−82289号公報 特開2005−312325号公報 特開平6−284897号公報 パクら、Appl. Microbiol. Biotechnol.,第69巻、2005年、411−422頁

本発明は、受容体特異性が広く、フェノール性の水酸基への転移反応を優先的に触媒し、且つ、配糖化活性の高い新規な糖転移酵素と、これを用いたβ型配糖体の製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、β型配糖体生成活性を有する微生物を広く自然界より検索し、新規に分離した微生物、セルロモナス・ビアゾテア(Cellulomonas biazotea)に属する微生物N1228株が菌体外に当該作用を有するβ−グルコシダーゼを生産することを見出した。また、該酵素をアルブチンに作用させると、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコシド)を生成することを見出し、これに基づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明は、新規なβ−グルコシダーゼとその製造方法、並びにこれを用いたβ型配糖体の製造方法であって、アリールβ−グルコシドを供与体として使用し、一段階で且つ選択的に、工業的に利用可能な製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。

本発明の、受容体特異性がより広く、フェノール性の水酸基への転移反応を優先的に触媒し、且つ、配糖化活性が高い新規な糖転移酵素を用いれば、天然界に多く存在し、特に食品医薬品分野において有用でありながらも、疎水性、揮発性、または安定性の悪さなどの理由により用途が限られていたフェノール性の水酸基を有する化合物を含むアルコール化合物を配糖化することができ、それによってその水溶性、不揮発性または安定性を増大させ、諸性質を改善することができる。

本発明のβ−グルコシダーゼとは、下記の化学式1に示す構造を有するアルブチンに作用して、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコピラノシド)を生成する酵素を意味する。アルブチン及び1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコピラノシド)は、下記の化学式1及び2にそれぞれ示す構造を有する配糖体である。本発明のβ−グルコシダーゼの特徴は、アルブチンに作用させた場合、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基へ転移反応を触媒することにあり、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコシド)を生成する点において、公知のβ−グルコシダーゼとは異なる酵素である。

化学式1:

化学式2:

本発明のβ−グルコシダーゼの酵素活性は、次のようにして測定することができる。p−ニトロフェニルβ−D−グルコシド(以下、「pNPG」と略称する)を1.25mMとなるよう0.1M酢酸緩衝液(pH6.0)に溶解させ基質液とし、その基質液2mlに酵素液0.5mlを加えて、40℃で30分間反応させた後、反応液1mlに0.1M炭酸ナトリウム4mlを添加し、加水分解により生成するp−ニトロフェノールの400nmの吸光度を測定する。β−グルコシダーゼの活性1単位は、上記の条件下で1分間に吸光度を0.01増加させる酵素量と定義する。

本発明のβ−グルコシダーゼは、下記の理化学的性質を有している。
(1)分子量
SDS−ゲル電気泳動法において、99,000±20,000ダルトン。
(2)至適温度
pH6.0、30分間反応の条件下で、約70℃付近。
(3)至適pH
40℃、30分間反応の条件下で約pH5.6乃至6.3付近。
(4)温度安定性
pH6.0、60分間保持の条件下で約60℃付近まで安定。
(5)pH安定性
4℃、24時間保持の条件下で約pH4.9乃至10.3付近まで安定まで安定。

また、上記理化学的性質を有する本発明のβ−グルコシダーゼは、通常、所定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号1で示されるアミノ酸配列か又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号1で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、アルブチンに作用し、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基への転移反応を触媒することにより、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコピシド)を生成するという酵素活性を保持する範囲で、配列表における配列番号1で示されるアミノ酸配列において1個又は2個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列番号1で示されるアミノ酸配列に対し、通常、60%以上、望ましくは、70%以上、さらに望ましくは、80%以上、よりさらに望ましくは、90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが好適である。

しかしながら、上記アミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼはあくまで一例であって、上記と異なるアミノ酸配列を有する酵素も、アルブチンに作用し、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基への転移反応を触媒することにより、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコシド)を生成し、上記理化学的性質を有するかぎり本発明に包含される。

本発明のβ−グルコシダーゼは、その給源によって制限されないものの、好ましい給源として、微生物が挙げられ、とりわけ本発明者らが土壌より単離した微生物N1228株が好適に用いられる。以下、β−グルコシダーゼ産生能を有する微生物N1228株の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』(長谷川武治編、学会出版センター、1985年)に準じて行った。

また、16S rRNAは多くの微生物でその配列が報告されており、いくつかの保存領域が知られている。すなわち、16S rRNAの塩基配列を解析して同定を行った。方法は、ウィリアムら,Journal of Bacteriology,第173巻,697−703頁(1991年)に準じて行った。解析結果を、『リボソーマルデータベース』(URL:http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)を参考にして、公知菌との異同を検討した。同定試験の結果を表1に示す。

微生物N1228株は、表1に示す菌学的性質を示し、また、N1228株の16s rRNAはセルロモナス・ビアゾテアのタイプカルチャー(DSM20112)の16S rDNAと完全に一致した。したがって、微生物N1228株はセルロモナス・ビアゾテア(Cellulomonas biazotea)に属する微生物であることが判明した。これらの結果より本発明者等は、該菌株を、新規微生物セルロモナス・ビアゾテア N1228と命名し、平成19年6月5日付で日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、受託番号 FERM BP−10833として受託された。本発明のβ−グルコシダーゼ産生能を有する微生物には、上記菌株はもとよりそれらの酵素高生産変異株なども包含される。

本発明のDNAとは、上記β−グルコシダーゼをコードするもの全般を意味する。本発明のDNAは、それが本発明のβ−グルコシダーゼをコードするものである限り、天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、セルロモナス・ビアゾテア N1228を含むセルロモナス属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のDNAを含む遺伝子DNAを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約1乃至7日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該DNAを含む遺伝子DNAを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、SDSなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的の遺伝子DNAが得られる。本発明のDNAを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号1又は2で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該DNAを含む遺伝子DNAを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成DNAを用いてPCR合成することも有利に実施できる。

本発明のDNAは、通常、所定の塩基配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号2で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号2で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有する変異体DNAとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号2で示される塩基配列において1個又は2個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列番号2で示される塩基配列に対し、通常、60%以上、望ましくは、70%以上、さらに望ましくは、80%以上、よりさらに望ましくは、90%以上の相同性を有する塩基配列を有するものが好適である。また、遺伝子コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の1個又は2個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明のDNAに包含される。

本発明のDNAを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えDNAとすることも有利に実施できる。組換えDNAは、通常、DNAと自律複製可能なベクターとからなり、DNAが入手できれば、常法の組換えDNA技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、pBR322、pUC18、pBluescript II KS(+)、pUB110、pTZ4、pC194、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7などのプラスミドベクターやλgt・λC、λgt・λB、ρ11、φ1、φ105などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のDNAを大腸菌で発現させるには、pBR322、pUC18、Bluescript II KS(+)、λgt・λC及びλgt・λBが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1及びφ105が好適である。pHV14、TRp7、YEp7及びpBS7は、組換えDNAを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。DNAを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、DNAを含む遺伝子DNAと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び/又は超音波により切断し、次に、生成したDNA断片とベクター断片とを連結する。遺伝子DNA及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけII型の制限酵素、詳細には、Sau 3AI、Eco RI、Hin dIII、Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I、Pst Iなどを使用すれば、DNA断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でDNAリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えDNAは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。

このようにして得られる組換えDNAは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、菌体内又は菌体外にβ−グルコシダーゼを生成するものを選択すればよい。

本発明のβ−グルコシダーゼ産生能を有する形質転換体も含めた微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明のβ−グルコシダーゼを産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できるものであればよく、例えば、植物由来の澱粉やセルロース、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、デキストラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、セロビオース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。

培養は、通常、温度15乃至37℃でpH5.5乃至10の範囲、好ましくは温度20乃至34℃でpH5.5乃至8.5の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは10時間乃至240時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、0.5乃至20ppmが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養、半連続培養又は連続培養のいずれでもよい。

このようにしてβ−グルコシダーゼ産生能を有する微生物を培養した後、本発明のβ−グルコシダーゼを含む培養物を回収する。β−グルコシダーゼ活性は、培養微生物がセルロモナス・ビアゾテア N1228株の場合は、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには常法の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液をそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。

更に、β−グルコシダーゼ活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、β−グルコシダーゼを斯界において常用されている適宜の方法により固定化することもできる。固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。

上記のように本発明のβ−グルコシダーゼは、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、斯界において常用されている適宜の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。例えば、セルロモナス・ビアゾテア N1228株の培養液の上清を硫安塩析又は平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法により濃縮操作を行った酵素標品を透析後、『DEAE−トヨパール(Toyopearl)650S』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『ブチル−トヨパール(Butyl−Toyopearl)650M』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー、続いて、『DEAE−5PW』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明のセルロモナス・ビアゾテア N1228株由来のβ−グルコシダーゼを、精製酵素として得ることができる。

β−グルコシダーゼが組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。

本発明のβ−グルコシダーゼの基質及びグルコシル供与体となるアリールβ−グルコシド類としては、例えば、アルブチン、ヘリシン、p−ニトロフェニルβ−D−グルコシド、エスクリン、4‐メチルウンベリフェリルβ−D−グルコシド、サリシン、フェニルβ−D−グルコシド、フロリジンなどのアグリコンがアリール基を有する化合物とグルコースがβ−結合した配糖体が挙げられる。

本発明のβ−グルコシダーゼを基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度0.1%(w/v)の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明のβ−グルコシダーゼの反応は進行する。工業的には、基質濃度0.5%(w/v)以上、好ましくは1%(w/v)以上が好適であり、この条件下で、目的とする配糖体を有利に生成できる。反応温度は反応が進行する温度、即ち75℃付近までで行えばよい。好ましくは40乃至70℃付近の温度を用いる。反応pHは、通常、4乃至10の範囲、好ましくはpH4.5乃至9の範囲に調整するのがよい。基質と受容体の種類、酵素の使用量及び反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。

上記のような作用を有する本発明のβ−グルコシダーゼは、アルブチンに作用し、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基への転移反応を触媒することにより、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコピラノシド)を生成するが、フェノール性の水酸基を有する化合物を含むアルコール化合物を受容体として反応系に加えることにより、その化合物を配糖化することができる。

1以上のフェノール性水酸基又はアルコール性水酸基を有する化合物は、本発明において、β型配糖体を調製するための受容体として用いることができる。フェノール性水酸基を有する化合物の例としては、ジメトキシフェノール(例えば、3,4−ジメトキシフェノール、3,5−ジメトキシフェノール)、ハイドロキノン、トリヒドロキシベンゼン(例えば1,2,3−トリヒドロキシベンゼン、1,2,5−トリヒドロキシベンゼン)、オイゲノール、セロトニン、ドーパミン、クロロゲン酸、4−(4−ヒドロキシフェニル)−2−ブタノン、メトキシフェノール(例えば4−メトキシフェノール、2−メトキシフェノール)、ナフトール(例えば1−ナフトール、2−ナフトール)、カテコール、レゾルシノール、ジヒドロキシ安息香酸(例えば3,4−ジヒドロキシ安息香酸、2,3−ジヒドロキシ安息香酸)、トリヒドロキシベンゼン(例えば1,3,5−トリヒドロキシベンゼン、1,2,3−トリヒドロキシベンゼン)、エスクレチン、セサモール、エクオール、L−ドーパ、エピネフリン、5−ヒドロキシトリプトファン、コーヒー酸、モリン、クマル酸(例えば、p−クマル酸、m−クマル酸)、ヒドロキシ安息香酸(例えば、4−ヒドロキシ安息香酸、3−ヒドロキシ安息香酸)、ヒドロキシベンズアルデヒド(例えば、4−ヒドロキシベンズアルデヒド、3−ヒドロキシベンズアルデヒド)、クレゾール(例えば、p−クレゾール、m−クレゾール)、没食子酸、ウンベリフェロン、カプサイシン、バニリン、フェルラ酸およびエラグ酸などが挙げられる。

アルコール性水酸基を有する化合物の例としては、ベンジルアルコール、4−ヒドロキシベンジルアルコール、フェネチルアルコール、コウジ酸、アスコルビン酸、リボフラビン、シクロヘキサノール、メタノール、エタノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−メチル−1−プロパノールおよび1,4−ブタンジオールなどが挙げられる。

アルコールの1つの好ましい実施形態では、水溶性のアルコールである。水溶性とは、室温で水1リットルに好ましくは約10g以上、さらに好ましくは約100g以上溶解することをいう。水溶性であれば、均一な一相での糖転移反応が可能となる。

別の実施形態では、アルコールは水に難溶性または不溶性である。水に難溶性または不溶性とは、室温で水1リットルに、例えば、約10g未満または約0.1g未満しか溶解しないことをいう。水に難溶性または不溶性であって、かつ有機溶媒に可溶性のアルコールについては、有機溶媒に溶解して有機相を形成させ、他の反応成分を含有する水溶液との、有機相/水相の2相状態で、その界面付近で反応を進行させることが可能である。また、有機溶媒が水と容易に混ざり合う場合は、均一な一相での反応が可能である。

本発明のβ型配糖体は必要に応じて精製することができる。精製方法としては、糖または配糖体の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、H型、OH型イオン交換樹脂による脱塩、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、イオン交換、逆相または順相カラムクロマトグラフィーによる分離などの1種または2種以上の精製方法が適宜採用できる。

本発明の酵素を用いることにより、天然界に多く存在し、特に食品医薬品分野において有用でありながらも、疎水性、揮発性、または安定性の悪さなどの理由により用途が限られていた化合物の水溶性、不揮発性または安定性を増大させ、諸性質を改善したβ型配糖体を調製することができる。

以下、実験により本発明を詳細に説明する。

<実験1:β−グルコシダーゼの調製>
澱粉部分分解物(商品名『パインデックス#4』、松谷化学工業株式会社製造)1.5w/v%、酵母抽出物(商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造)0.5w/v%、酵母抽出物(商品名『酵母エキスS』、日本製薬株式会社製造)0.1w/v%、リン酸二カリウム0.1w/v%、リン酸一ナトリウム・2水和物0.06w/v%、硫酸マグネシウム・7水和物0.05w/v%、硫酸第一鉄・7水和物0.001w/v%、硫酸マンガン・n水和物0.001w/v%、及び水からなる液体培地を、500ml容三角フラスコに100ml入れ、オートクレーブで121℃、20分間滅菌し、冷却して、セルロモナス・ビアゾテア N1228株を接種し、27℃、230rpmで72時間回転振盪培養したものを種培養とした。

種培養の組成から澱粉部分分解物を含まない液体培地を500ml容三角フラスコ70本に100mlずつ入れて、オートクレーブで121℃、20分間滅菌し、冷却して温度27℃とした後、種培養液1mlを接種し、温度27℃、pH5.5乃至8.5に保ちつつ、168時間回転振盪培養した。培養後、遠心分離(8,000rpm、20分間)して菌体を除き、培養上清約7Lを得た。培養液及び培養上清について、β−グルコシダーゼ活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約8.0単位/ml、培養上清の該酵素活性は約7.9単位/mlであった。セルロモナス・ビアゾテア N1228株によって生産される本発明のβ−グルコシダーゼはその大部分が菌体外に存在することがわかった。β−グルコシダーゼの酵素活性は、以下の方法で測定した。p−ニトロフェニルβ−D−グルコピラノシドを1.25mMとなるよう0.1M酢緩衝液(pH6.0)に溶解させ基質液とし、その基質液2mlに酵素液0.5mlを加えて、40℃で30分間酵素反応させた後、反応液1mlに0.1M炭酸ナトリウム4mlを添加し、400nmの吸光度を測定する。β−グルコシダーゼの活性1単位は、上記の条件下で1分間に吸光度を0.01増加させる酵素量と定義した。

<実験2:β−グルコシダーゼの精製>
実験1で得た培養上清約7Lを限外ろ過モジュール(AIP−1010、旭化成製造)にて約10倍に濃縮した。これを20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)に対して透析し、粗酵素液約700mlを得た。粗酵素液中のβ−グルコシダーゼ活性は約58単位/mlであった(総活性約40,000単位)。この粗酵素液を東ソー株式会社製『DEAE−トヨパール(Toyopearl) 650S』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー(ゲル容量350ml)に供した。本発明のβ−グルコシダーゼ活性は、20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化した『DEAE−トヨパール(Toyopearl) 650S』ゲルに吸着し、食塩濃度0Mから0.7Mのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約0.3M付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度1Mとなるように硫安を添加して4℃、24時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール(Butyl−Toyopearl) 650M』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー(ゲル容量105ml)に供した。本発明のβ−グルコシダーゼ活性は、1M硫安を含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化した『ブチル−トヨパール(Butyl−Toyopearl) 650M』ゲルに吸着し、硫安濃度1Mから0Mのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約0.7M付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)に対して透析した。東ソー株式会社製『DEAE−5PW』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー(ゲル容量3.3ml)に供した。本発明のβ−グルコシダーゼ活性は、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で平衡化した『DEAE−5PW』ゲルに吸着し、リン酸濃度10mMから0.4Mのリニアグラジエントで溶出させたところ、リン酸濃度約0.2M付近に溶出した。精製の各工程におけるβ−グルコシダーゼ活性、β−グルコシダーゼの比活性及び収率を表2に示す。

<実験3:β−グルコシダーゼの性質>

<実験3−1:分子量>
実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(5乃至20w/v%濃度勾配)に供し、同時に泳動した分子量マーカー(日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製)と比較して分子量を測定したところ、本発明のβ−グルコシダーゼの分子量は約99,000±20,000ダルトンであることが判明した。

<実験3−2:酵素反応の至適温度及び至適pH>
実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、pHの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図1(至適温度)、図2(至適pH)に示した。本発明のβ−グルコシダーゼの至適温度はpH6.0、30分間反応の条件下で約70℃付近であり、至適pHは40℃、30分間反応の条件で約pH5.6乃至6.3付近であることが判明した。

<実験3−3:酵素の温度安定性及びpH安定性>
実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びpH安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液(100mM酢酸緩衝液、pH6.0)を各温度に60分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。pH安定性は、本酵素を各pHの100mM緩衝液中で4℃、24時間保持した後、pHを6.0に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図3(温度安定性)、図4(pH安定性)に示した。図3から明らかなように、本発明のβ−グルコシダーゼの温度安定性は、約60℃付近までであることが判明し、また、図4から明らかなように、本発明のβ−グルコシダーゼのpH安定性は約pH4.9乃至10.3付近の範囲であることが判明した。

<実験3−4:酵素活性に及ぼす金属塩の影響>
実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を濃度1mMの各種金属塩の塩化物存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表3に示す。表3の結果から明らかなように、本発明のβ−グルコシダーゼの活性は、Hg2+イオンで著しく阻害され、Cu2+イオンで阻害されることが判明した。

<実験3−5:部分アミノ酸配列>
実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を適量とり、常法によりSDS−ゲル電気泳動を行い、β−グルコシダーゼの蛋白バンドを切り出し0.2M炭酸水素アンモニウム溶液(pH8.0)に浸漬した。これに修飾トリプシン(プロメガ株式会社販売)0.5μgを加えて、37℃、18時間保持して酵素蛋白を加水分解した。加水分解物をアセトニトリルにて抽出した後、予め0.065%(v/v)トリフルオロ酢酸で平衡化させておいたHPLC用カラム(商品名『μRPC C2/C18 SC2.1/10』、直径2.1mm×長さ100mm、アマシャム・バイオサイエンス株式会社製)に注入し、流速0.1ml/分、室温の条件下、0.065%(v/v)トリフルオロ酢酸溶液から0.055%(v/v)トリフルオロ酢酸−80%(v/v)アセトニトリル溶液の160分間のリニアグラジエントで通液し、ペプチド断片を分画した。カラムから溶出したペプチド断片は波長214nmの吸光度を測定することにより検出した。グラジエント開始から約42分、約50分、約54分及び約82分に溶出した4種のペプチド断片のアミノ酸配列を、それぞれプロテインシーケンサー モデル492HT(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて分析したところ、それぞれ配列表における配列番号3乃至6に示されるアミノ酸配列を有していた。

<実験4:セルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)由来β−グルコシダーゼをコードするDNAのクローニング及びこれを含む組換えDNAと形質転換体の調製>
β−グルコシダーゼをコードするDNAをセルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)からクローニングし、自律複製可能な組換えDNAの作製、当該酵素をコードするDNAの塩基配列の決定、及び形質転換体の調製を行った。

<実験4−1:染色体DNAの調製>
実験1で使用した液体培地100mlに、セルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)を接種し、27℃で2日間回転振盪培養した。
培養物を遠心分離して菌体を分離し、適量のTES緩衝液(pH8.0)に浮遊させ、リゾチームを0.05%(w/v)加え、37℃で30分間インキュベートし、−80℃で1時間凍結した後、TSS緩衝液(pH9.0)を加え、60℃に予温したTES緩衝液/フェノール混液を加え、冷却し、遠心分離して上清を採取した。この上清に2倍容の冷エタノールを加え、染色体DNAを含む沈澱部を採取し、SSC緩衝液(pH7.1)に溶解し、リボヌクレアーゼ7.5μgとプロテアーゼ125μgをそれぞれ加え、37℃で1時間反応させた。反応物にクロロホルム/イソアミルアルコール混液を加えて染色体DNAを抽出し、抽出物に冷エタノールを加え、静置したところ、精製染色体DNAを含む沈澱が得られた。この沈澱を濃度約1mg/mlになるようにSSC緩衝液(pH7.1)に溶解し、−80℃で凍結した。

<実験4−2:コロニーハイブリダイゼーションによるβ−グルコシダーゼ遺伝子のクローニング>
実験4−1の方法により得た精製染色体DNA20μgに、制限酵素Kpn Iを200単位加え、37℃で24時間反応させて染色体DNAを完全に切断した後、アガロースゲル電気泳動法により約7,000乃至8,000塩基対からなるDNA断片を回収した。別途、プラスミドベクターpBluescript SK(+)を制限酵素Kpn Iにより切断し、そのベクター断片0.05μgとDNA断片0.125μgを市販のキット(商品名『DNA Ligation Kit』、タカラバイオ製)を用いて連結した。得られた組換えDNAを含む反応液にコンピテントセル(E.coli JM109、タカラバイオ製)を50μl加え、42℃で45秒間処理することによりに組換えDNAを大腸菌に導入し、ゲノミックライブラリーを作製した。このようにして得た遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン10g/l、酵母エキス5g/l、塩化ナトリウム5g/l、アンピシリンナトリウム塩100mg/l、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド50mg/lを含む寒天平板培地(pH7.0)に植菌し、37℃で18時間培養後、培地上で形成された白色コロニー約600個をナイロン膜(商品名『Hybond−N+』、アマシャム製)上に固定した。

別途、実験3−6の方法で明らかにした、β−グルコシダーゼの内部部分アミノ酸配列である配列表における配列番号3で表されるアミノ酸配列における第2乃至第9番目のアミノ酸配列に基づき配列表における配列番号7に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成した。さらに、配列表における配列番号4で表されるアミノ酸配列における第1乃至第7番目のアミノ酸配列に基づき配列表における配列番号8に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成した。これら2つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、鋳型として実験4−1の方法により得た染色体DNA0.05μgを用いて、PCRを行った。その結果、得られた約900塩基対の増幅断片を、DIG DNA標識および検出キット(ロッシュダイアグノスティックス)の説明書に従い、DIG標識プローブを作製した。

ナイロン膜上に固定した形質転換体について、DIG標識プローブと顕著な会合を示すコロニーをコロニーハイブリダイゼーション法によって選択した。選択した1株の形質転換体をアンピシリン100μg/mlを含むL−ブロス培地(pH7.0)に植菌し、37℃で24時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を採取し、アルカリ法により組換えDNAを菌体外に溶出させ、これを常法により精製し分析したところ、約7,000塩基対の挿入DNA断片を有する組換えDNAを有していた。この組換えDNAを「pBG122」と命名し、これを保持する形質転換体を「BG122」と命名した。組換えDNA、pBG122を図5に示した。

<実験4−3:β−グルコシダーゼをコードするDNAの塩基配列の決定>
ベックマン・コールター製DTCS『クイック・スタート・キット』と『遺伝子解析システムCEQ8000』を用いて塩基配列決定を行った。塩基配列解析には市販のソフトウェア(商品名『GENETYX−WIN』、ジェネティクス社販売』を用いた。組換えDNA、pBG122における挿入DNA断片の塩基配列を分析したところ、当該組換えDNAは、セルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)に由来する、配列表における配列番号2で示される鎖長2,745塩基対の塩基配列を有するDNAを含んでいた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、配列表における配列番号2で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験3−6の方法で明らかにされた部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号3乃至6で示されるアミノ酸配列と比較したところ、配列表における配列番号3で示されるアミノ酸配列は、配列表における配列番号2で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第486乃至502番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号4、5及び6に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号2で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第767乃至786番目、第182乃至201番目、第及び第443乃至462番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、本発明のβ−グルコシダーゼが、配列表における配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むことがあり、当該酵素はセルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)においては、配列表における配列番号2で示される塩基配列のDNAによりコードされていることを示している。分泌シグナル配列の予測をSignalP
3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)で実施した。その結果、配列表における配列番号2で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第1乃至32番目のアミノ酸配列は、当該酵素の分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該酵素の分泌前の前駆体は、配列表における配列番号2の塩基配列に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号2に示す塩基配列にコードされていることが判明した。

<実験5:発現用組換えDNA、pQBG122の作製とその形質転換体QBG122による組換え型β−グルコシダーゼの産生>
組換えDNA『pBG122』中のβ−グルコシダーゼ遺伝子を発現用ベクターに挿入し、組換え型β−グルコシダーゼの大腸菌における発現を検討した。

<実験5−1:発現用組換えDNA、pQBG122の作製及び形質転換体QBG122の調製>
組換えDNA、pBG122中のβ−グルコシダーゼを発現用ベクターに組込むに際し、β−グルコシダーゼの構造遺伝子より分泌シグナルをコードする領域を除き、開始コドンを付加した後、上流に制限酵素Eco RI認識部位を、下流にHin dIII認識部位を導入する目的でPCRを行った。pBG122を鋳型として用い、合成した配列表における配列番号9で示される塩基配列を有するセンスプライマーと配列表における配列番号10で示される塩基配列を有するアンチセンスプライマーの組合せでPCRを行い、目的とするβ−グルコシダーゼ遺伝子を増幅した。常法により、制限酵素Eco RI及びHin dIIIで消化した発現用ベクターpQE−16(キアゲン社製)に、上記で増幅した後、Eco RI及びHin dIIIで消化したDNAを組込んで得られた組換えDNAの挿入配列を実験4−3の方法に準じて確認し、組換えDNAを『pQBG122』と命名した。pQBG122を図6に示す。得られたpQBG122を用いて宿主大腸菌BL21(ノバジェン社製)を形質転換して形質転換体『QBG122』を調製した。

<実験5−2:形質転換体QBG122による組換え型β−グルコシダーゼの産生>
トリプトン(商品名『Bacto−tryptone』、Difco社販売)10g/l、酵母エキス(商品名『Bacto−yeast extract』、Difco社販売)5g/l、食塩10g/l、ソルビトール0.5乃至1.0M及び水からなる液体培地を、500ml容三角フラスコに50mlずつ入れ、オートクレーブで121℃、20分間滅菌し、冷却後、アンピシリンを100μg/mlの濃度で添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験5−1の方法で得た形質転換体QBG122を接種し、27℃で30時間回転振盪培養した。得られた培養物を、遠心分離して菌体を回収し、超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調製した。超音波破砕法は、菌体を10mM EDTA及び0.5M NaClを含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で超音波ホモジナイザー(モデルUH−600、株式会社エスエムテー製)により細胞破砕することによって行い、破砕後の遠心分離上清を全細胞抽出物とした。
このようにして調製した全細胞抽出物について、β−グルコシダーゼ活性を測定し、それぞれの活性値を培養物1ml当りに換算した。なお、対照としてプラスミドpQE−16を保持する大腸菌BL21を上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から全細胞抽出物を調製し、同様にβ−グルコシダーゼ活性を測定した。これらの結果を表4に示す。

表4の結果から明らかなように、形質転換体QBG122は、本発明のβ−グルコシダーゼを細胞内に産生することが判明した。宿主である対照の大腸菌では当該酵素活性は全く認められなかった。この実験5の方法で得た全細胞抽出物を、さらに実験2に示した方法に準じて、塩析、透析し、DEAE−トヨパール 650Sゲル、ブチル−トヨパール 650Mゲル、DEAE−5PWを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素標品を実験3に示した方法に準じて分析した。その結果、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は約100,000±10,000ダルトン、β−グルコシダーゼ活性の至適温度は、pH6.0、30分間反応の条件で約70℃付近であり、至適pHは40℃、30分間反応の条件で約pH5.6乃至6.3付近、温度安定性は、pH6.0、60分間保持の条件で約60℃付近まで安定であり、pH安定性は、4℃、24時間保持の条件で約pH4.9乃至10.3付近の範囲で安定であった。これらの理化学的性質は、実験2に示された方法で調製された当該酵素のそれと実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のβ−グルコシダーゼは、組換えDNA技術によって良好に製造できることを示している。

<実験7:基質特異性>
実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、本酵素の基質特異性を調べた。最終濃度10mMの各基質に、最終濃度10mM酢酸緩衝液(pH6.0)を加えた後、実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を、基質である基質1ミリモル当たり150単位加え、この混液を50℃にて18時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液の糖組成を高速液体クロマトグラフィー(以下、HPLCと略称する。)又はガスクロマトグラフィー(以下、GCと略称する。)を用いて測定した。

<HPLC分析条件>
カラム:YMC−PAC ODS−AQ−313−15
(内径6mm×長さ250mm、株式会社ワイエムシィ製造)
カラム温度:40℃
流速:0.5ml/分
移動相:1%(v/v)酢酸を含む30乃至60%(v/v)メタノール水溶液
検出:250乃至320nmにおける各基質の最大吸収波長

<GC分析条件>
カラム:2%シリコンOV−17 Chromosorb W/AW−DMS(株式会社ジー・エル・サイエンス製造)
キャリアーガス:窒素ガスGC
昇温プログラム:1分間当り7.5℃の昇温速度で温度160℃から320℃まで昇温
検出:FID法
サンプル:常法に従ってTMS化

これらの結果を表5に示した。表5から明らかなように、本発明のβ−グルコシダーゼはアルブチン、へリシン、p−ニトロフェニルβ−D−グルコシド、エスクリン、4−メチルウンベリフェリルβ−D−グルコシド、サリシン、フェニルβ−D−グルコシド、フロリジンに作用し、セロビオ−ス、ゲンチオビオ−ス、ラミナリビオ−ス、ソホロ−ス、ネオトレハロ−スには実質的に作用しないことが分かった。

<実験8:受容体特異性>
実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を用いて、本酵素の糖転移反応における受容体特異性を調べた。最終濃度10mMのフェニルβ−D−グルコシドに、最終濃度10mM酢酸緩衝液(pH6.0)を加え、アセトニトリルまたはジメチルスルホキシド(最終濃度20%)に溶解した最終濃度1mMの受容体化合物を加えた後、実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を、基質である基質1ミリモル当たりあたり50単位加え、この混液を50℃にて18時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液に含まれる配糖体生成量を薄相クロマトグラフィー(以下、TLCと略称する。)またはHPLCにより分析した。なお、反応前の受容体化合物に対する反応後の生成した配糖体の割合を配糖化率とした。結果を表6に示した。

<TLC分析条件>
プレート:メルク社製『キーゼルゲル60F254』アルミプレート(10×20cm)
移動相:クロロホルム/酢酸/水=6/7/1(体積比)
検出:硫酸/メタノール=20/80(体積比)を噴霧し、110℃で5分間加熱

<HPLC分析条件>
カラム: YMC−PAC ODS−AQ−303 内径4.6mm×長さ250mm(株式会社ワイエムシィ製造)
カラム温度:40℃
流速:0.5ml/分
移動相:5乃至45%(v/v)メタノール水溶液、リン酸でpH2.5に調整
検出:214乃至349nmにおける各受容体の最大吸収波長

表6から明らかなように、3,4−ジメトキシフェノール、3,5−ジメトキシフェノール、ハイドロキノン、1,2,3−トリヒドロキシベンゼン、1,2,5−トリヒドロキシベンゼン、オイゲノール、セロトニン、ドーパミン、クロロゲン酸、4−(4−ヒドロキシフェニル)−2−ブタノン、4−メトキシフェノール、3−メトキシフェノール、2−メトキシフェノール、1−ナフトール、2−ナフトール、カテコール、レゾルシノール、3,4−ジヒドロキシ安息香酸、2,3−ジヒドロキシ安息香酸、1,3,5−トリヒドロキシベンゼン、1,2,3−トリヒドロキシベンゼン、エスクレチン、セサモール、エクオール、L−ドーパ、エピネフリン、5−ヒドロキシトリプトファン、コーヒー酸、モリン、o−クマル酸、p−クマル酸、m−クマル酸、4−ヒドロキシ安息香酸、3−ヒドロキシ安息香酸、4−ヒドロキシベンズアルデヒド、3−ヒドロキシベンズアルデヒド、p−クレゾール、m−クレゾール、没食子酸、ウンベリフェロン、カプサイシン、バニリン、フェルラ酸およびエラグ酸などのフェノール性水酸基を有する化合物に効率よく転移反応を行った。ベンジルアルコール、4−ヒドロキシベンジルアルコール、フェネチルアルコール、コウジ酸などのアルコール性水酸基を有する化合物にも効率よく転移反応を行った。

<実験9:アルブチンからの生成物>
本発明のβ−グルコシダーゼをアルブチンに作用させた際、得られる生成物の構造を調べた。

<実験9−1:アルブチンからの生成物の単離>
最終濃度5w/v%のアルブチン水溶液に、最終濃度10mM酢酸緩衝液(pH6.0)を加えた後、実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品を、基質であるアルブチン1ミリモル当たり100単位加え、この混液を40℃にて18時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液をTLC及びHPLCにより分析した。

<TLC分析の条件>
プレート:メルク社製『キーゼルゲル60F254』(アルミプレート、10×20cm)
移動相:1−ブタノール/ピリジン/水=6/4/1(体積比)
検出:硫酸/メタノール=20/80(体積比)を噴霧し、110℃で5分間加熱

図7にTLC分析の結果を示す。図7に示すように、TLCクロマトグラムにおいて、反応液中にアルブチンと比較して移動度の小さい生成物が認められた。このことから、反応終了液中にはアルブチン、グルコースとは異なる新たな糖質が生成されたことが確認された。

<HPLC分析の条件>
カラム:YMC−PAC ODS−AQ−313−15 内径6mm×長さ250mm(株式会社ワイエムシィ製造)
カラム温度:40℃
流速:0.5ml/分
移動相:メタノール/水/酢酸=10/90/1(体積比)
検出波長:280nm

図8にHPLC分析の結果を示す。15分にアルブチンのピーク(図8における符号b)が、20分にアルブチンから遊離したヒドロキノン(図8における符号c)のピークが認められ、11分にアルブチンへグルコース残基が転移することにより生成したと考えられる生成物Aのピーク(図8における符号a)が認められた。反応液100mlを予め0.1%(v/v)酢酸水溶液で平衡化したオルガノ製ODS『FS―1830カラム』に通液し、目的画分を回収、精密濾過したものを分画原料とした。HPLCに30回に分けて供して精製し、凍結乾燥した結果、上記のアルブチン反応終了液100mlから、純度約99.5%以上の生成物A標品を約0.7g得た。

<HPLCによる精製条件>
カラム:YMC−PAC ODS−A 内径20mm×長さ250mm(株式会社ワイエムシィ製造)
カラム温度:40℃
流速:4ml/分
移動相:メタノール/水=5/95(体積比)
検出波長:280nm

<実験9−2:生成物Aの構造解析>
実験9−1で得た生成物Aの精製標品を用いて生成物Aの構造解析を行った。

<実験9−2−1:質量分析>
実験9−1の方法で得た生成物A精製標品について、質量分析装置『LCQ−Advantage』(サーモエレクトロン社製)を用いて質量分析したところ、質量数457のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、生成物Aの質量数が434であることが判明した。この質量数から、生成物Aは1分子のアルブチンが1分子のグルコースと結合していることが示唆された。

<実験9−2−2:核磁気共鳴(NMR)分析>
実験9−1の方法で得た生成物A精製標品について、NMR装置『JMN−AL300型』(JEOL製)を用い、重水溶媒中でH−NMR及び13C−NMR分析を行った。13C−NMRにおいて、8本のシグナルが62.9ppmから154.8ppmの間に確認された。グルコースに由来すると考えられるシグナルが103.3、78.5、78.0、75.4、71.8及び62.9ppmに、ベンゼン環に由来すると考えられるシグナルが154.8ppmと120.4ppmにそれぞれ確認され、120.4ppmのシグナルは、他のシグナルと比較して非常に強いシグナルとして確認された。よって、9個の炭素原子の存在が考えられたが、実験9−2−1における分子量分析の結果より生成物Aは18個の炭素原子から構成されていると考えられた。これらの結果より、得られた精製標品はアルブチンのアグリコン部分の水酸基、即ち、フェノール性の水酸基にグルコースが結合した物質であることが確認できた。H−NMRにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル(4.89ppm、J=7.4Hz)の結合定数がβ型のみであることを示していることから、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、即ち、フェノール性の水酸基にグルコースの1位の水酸基がβ結合していることが確認された。以上の分析結果より、生成物Aは、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、即ち、フェノール性の水酸基にグルコースがβ結合した配糖体、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコピラノシド)であることが分かった。

<実験10:市販β−グルコシダーゼの転移反応特性との比較>
市販のβ−グルコシダーゼ活性を有する酵素剤は、糖転移活性を有していることが知られている。本発明のβ−グルコシダーゼと市販の酵素剤を比較するために、次に示す3種類の市販酵素剤をアルブチンに作用させ、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコピラノシド)の生成が認められるかどうか調べた。
(1)トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)由来セルラーゼ(Onozuka
RS、ヤクルト製造)
(2)アスベルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来セロビアーゼ(ノボザイム188、ノボザイム製造)
(3)アーモンド由来β−グルコシダーゼ(オリエンタル酵母製造)

最終濃度20mMのアルブチン水溶液に、最終濃度10mM酢酸緩衝液(pH6.0)を加えた後、実験2の方法で得たβ−グルコシダーゼ精製標品または、市販の酵素剤を、基質であるアルブチン1ミリモル当たり2単位乃至6,250単位加えこの混液を40℃にて15時間反応させた。反応液を実験8−1記載のHPLCによる分析法に従い分析した。結果を表7に示す。

表7の結果より明らかなように、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコシド)を生成することができる酵素は本発明のβ−グルコシダーゼのみであった。したがって、当該酵素は、アルブチンに作用させた場合、アルブチンのアグリコン部分の水酸基、すなわちフェノール性の水酸基へ転移反応を触媒し、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコシド)を生成する点で、公知のβ−グルコシダーゼとは異なる酵素である。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に例示するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。本発明のβ−グルコシダーゼの製造法を実施例1に、本発明のβ−グルコシダーゼを用いたβ型配糖体の製造方法を実施例2乃至6に示す。

<β−グルコシダーゼ酵素剤の製造>
セルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)を実験1の方法に準じて、三角フラスコにて168時間回転振盪培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、限外ろ過モジュール(AIP−1010、旭化成製造)にて濃縮、20mM酢酸緩衝液(pH6.0)に緩衝液を交換した。約20倍に濃縮して濃縮酵素液を調製した。本濃縮酵素液のβ−グルコシダーゼ活性は244単位/mlであった。本酵素剤はアリールβ−グルコシドを供与体とした、フェノ−ル性化合物を含むアルコ−ル類のβ型配糖体の製造に有利に利用できる。

<アルブチン配糖体の合成>
セルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)を実験1の方法に準じて、三角フラスコにて168時間回転振盪培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、pHを6.0に調整後、除菌ろ過を行った。この培養上清7.5mlを、アルブチン0.15gを7.5mlの0.1M酢酸緩衝液(pH6.0)に溶解させた液に混合し、40℃で24時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を実験9−1と同じ条件でHPLCにより分析した。その結果、反応終了液中に実験9で生成が確認された1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコシド)のピークが確認された。得られた生成物の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンSK−1B』とオルガノ製アニオン交換樹脂『IRA411S』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、分画原料とした。分析と同じ条件でHPLCに複数回に分けて供し配糖体を含む画分を集め、濃縮、乾固することにより、アルブチン配糖体(精製標品)を約0.03g得た。この精製標品の構造を実験9−2と同様の方法によりNMRで確認したところ、実験9−2−2と同じ結果を得た。アルブチンのアグリコン部分の水酸基、即ち、フェノール性の水酸基にグルコースの1位の水酸基がβ結合している化合物、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコシド)であることが確認された。

<セロトニン配糖体の合成>
セロトニン1gとフェニルβ−D−グルコシド12gを460mlの脱イオン水に溶解し、pHを6.0に調整して混合液を得た後、実施例1で調製したβ−グルコシダーゼ酵素剤2,340単位(9.6ml)を加え、この混合液を40℃にて15時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を以下の条件でHPLCにより分析した。
<HPLC分析の条件>
カラム:YMC−PAC ODS−AQ−303 内径4.6mm 長さ250mm(株式会社ワイエムシィ製造)
カラム温度40℃
流速:0.5ml/分
移動相:メタノール/水=5/95(体積比)リン酸でpH2.7に調整
検出波長:276nm

図9にHPLCの結果を示す。この結果、対照反応液と反応終了液との比較から、セロトニンが減少し、反応後の混合液中にフェノール及びセロトニンよりも早く流出する生成物が出現したことが確認された。すなわち、基質であるフェニルβ−D−グルコシドのグルコース部分がセロトニンに転移してセロトニン配糖体が形成された。セロトニンの配糖化率は約86%であった。得られたセロトニン配糖体の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。脱イオン水で平衡化した三菱化学製『ダイヤイオンHP−20』(600ml)カラムに反応終了液を通液することにより、未反応の基質であるフェニルβ−D−グルコシド及び生成したフェノールを吸着させ、非吸着画分を回収した。次いで、0.1%(v/v)ギ酸を含む5%(v/v)メタノール水溶液で平衡化したYMC−Pack ODS−A(内径20mm 長さ250mm、株式会社ワイエムシィ製造)カラムクロマトグラフィーに複数回に分けて供した。配糖体を含む画分を集め、濃縮後、更に5%(v/v)メタノール水溶液で平衡化した同カラムクロマトグラフィーに複数回に分けて供した。配糖体を含む画分を集め、濃縮、凍結乾燥することにより純度約99.5%以上のセロトニン配糖体(精製標品)を、約1.2g得た。この精製標品の構造を実験9−2と同様の方法によりNMRおよび質量分析により確認した。NMRは、重水溶媒中でH−NMR及び13C−NMR分析を行った。13C−NMRにおいて、グルコース由来のシグナル(102.7、77.0、76.5、73.9、70.4、61.5(ppm))及びセロトニン由来のシグナル(151.4、133.8、127.5、126.4、114.2、113.6、109.8、106.0、40.4、23.4(ppm))が検出された。1H−NMRにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル(4.76ppm、J=7.2Hz)の結合定数がβ型であることが確認された。質量分析及びNMRの結果より、得られた配糖体の分子量は338であり、1分子のセロトニンが1分子のグルコースの1位の水酸基にβ結合した配糖体であることが分かった。

<5−ヒドロキシトリプトファン配糖体の合成>
5−ヒドロキシトリプトファン0.7gとフェニルβ−D−グルコシド7.4gを300mlの脱イオン水に溶解し、pHを5.7に調整して混合液を得た後、実施例1で調製したβ−グルコシダーゼ酵素剤2,900単位(11.9ml)を加え、この混合液を40℃にて16時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液は実施例3と同様の条件によりHPLCで分析した。その結果、対照反応液と反応終了液との比較から、基質であるフェニルβ−D−グルコシド及び5−ヒドロキシトリプトファンが減少し、反応後の混合液中にフェノール及び5−ヒドロキシトリプトファンよりも早く流出する生成物が出現したことが確認された。すなわち、基質であるフェニルβ−D−グルコシドのグルコース部分が5−ヒドロキシトリプトファンに転移して5−ヒドロキシトリプトファン配糖体が形成された。得られた5−ヒドロキシトリプトファン配糖体の構造をより詳細に確認するために、実施例3と同様の方法で精製を行うことにより、純度約99.5%以上の5−ヒドロキシトリプトファン配糖体(精製標品)を約0.22g得た。この精製標品の構造を実験9−2と同様の方法によりNMRおよび質量分析により確認した。NMRは、ジメチルスルホキシド−d6溶媒中でH−NMR及び13C−NMR分析を行った。13C−NMRにおいて、グルコース由来のシグナル(102.6、77.3、77.1、73.6、70.4、61.2(ppm))及び5−ヒドロキシトリプトファン由来のシグナル(171.2、151.3、132.6、127.7、125.3、112.8、111.6、109.2、105.7、54.7、27.2(ppm))が検出された。H−NMRにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル(4.68ppm、J=6.6Hz)の結合定数がβ型であることが確認された。質量分析及びNMRの結果より、得られた配糖体の分子量は382であり、1分子のグルコースが1分子の5−ヒドロキシトリプトファンの水酸基にβ結合した配糖体であることが分かった。

<オイゲノール配糖体の合成>
オイゲノール0.985gをアセトニトリル150mlに溶解した液と、フェニルβ−D−グルコシド7.69gを脱イオン水1350mlに溶解した液を混合し、pHを5.8に調整して混合液を得た後、実施例1で調製したβ−グルコシダーゼ酵素剤760単位(3.1ml)を加え、この混合液を40℃にて15時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を以下の条件でHPLCにより分析した。
[HPLC分析の条件]
カラム:YMC−PAC ODS−AQ−303 内径4.6mm 長さ250mm(株式会社ワイエムシィ製造)
カラム温度:40℃
流速:0.5ml/分
移動相:メタノール/水/酢酸=50/50/1(体積比)
検出波長:275nm
その結果、対照反応液と反応終了液との比較から、基質であるフェニルβ−D−グルコシド及びオイゲノールが減少し、反応後の混合液中にオイゲノールよりも早く流出する生成物が出現したことが確認された。すなわち、基質であるフェニルβ−D−グルコシドのグルコース部分がオイゲノールに転移してオイゲノール配糖体が形成された。得られたオイゲノール配糖体の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。反応終了液を濃縮乾固し、未反応のオイゲノール及び生成したフェノールを除去した後、脱イオン水に溶解させ、脱イオン水で平衡化した三菱化学製『ダイヤイオンHP−20』(400ml)カラムに吸着させた。20%エタノールを通液することにより未反応の基質であるフェニルβ−D−グルコシドを溶出した後、50%エタノールを通液して配糖体を溶出させた。濃縮後、50%(v/v)メタノール水溶液で平衡化したYMC−Pack ODS−A(内径20mm×長さ250mm、株式会社ワイエムシィ製造)カラムクロマトグラフィーに3回に分けて供した。配糖体を含む画分を集め、濃縮、凍結乾燥することにより、純度約99.5%以上のオイゲノール配糖体(精製標品)を約0.26g得た。この精製標品の構造を実験9−2と同様の方法によりNMRおよび質量分析により確認した。NMRは、ジメチルスルホキシド−d6溶媒中でH−NMR及び13C−NMR分析を行った。13C−NMRにおいて、グルコース由来のシグナル(100.4、77.1、77.0、73.3、69.8、60.8(ppm))及びオイゲノール由来のシグナル(149.0、145.0、138.0、133.6、120.4、115.6、115.6、113.1、55.8、39.2(ppm))が検出された。H−NMRにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル(4.85ppm、J=7.3Hz)の結合定数より結合様式はβ型であることが確認された。また、質量分析の結果、この配糖体の分子量は326であることが分かった。これらの結果から、得られた配糖体は、1分子のグルコースが1分子のオイゲノールの水酸基にβ結合した構造を有することが分かった。

<バニリン配糖体の合成>
セルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)を実験1の方法に準じて、三角フラスコにて168時間回転振盪培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、pHを6.0に調整後、除菌ろ過を行った。この培養上清7.5mlを、バニリン0.15gとアルブチン0.15gを7.5mlの0.1M酢酸緩衝液(pH6.0)に溶解させた液と混合し、40℃で48時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を以下の条件でHPLCにより分析した。
<HPLC分析の条件>
カラム:YMC−PAC ODS−AQ−313−15 内径6.0mm×長さ250mm(株式会社ワイエムシィ製造)
カラム温度:40℃
流速:0.5ml/分
移動相:メタノール/水/酢酸=25/75/1(体積比)
検出波長:280nm
その結果、反応後の混合液中にバニリンよりも早く溶出する生成物が認められた。得られた生成物の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンSK−1B』とオルガノ製アニオン交換樹脂『IRA411S』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、分画原料とした。分析と同じ条件でHPLCに複数回に分けて供し配糖体を含む画分を集め、濃縮、乾固することにより、純度約99.5%以上のバニリン配糖体(精製標品)を約0.01g得た。この精製標品の構造を実験9−2と同様の方法によりNMRおよび質量分析により確認した。NMRは、重水溶媒中でH−NMR及び13C−NMR分析を行った。13C−NMRにおいて、グルコース由来のシグナル(102.0、78.7、77.8、75.1、71.6、62.8(ppm))及びバニリン由来のシグナル(197.1、153.5、151.2、133.4、129.2、117.2、113.6、58.2(ppm))が検出された。H−NMRにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル(5.07ppm、J=7.5Hz)の結合定数よりグルコースの結合様式はβ型であることが確認された。質量分析及びNMRの結果より、得られた配糖体の分子量は314であり、グルコース1分子が1分子のバニリンにβ結合した配糖体であることが分かった。

<エクオール配糖体の合成>
0.1gエクオールをエタノール10mlに溶解した液と、アルブチン1.0gを90mlの50mM酢酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた液を混合し、実施例1で調製したβ−グルコシダーゼ酵素剤320単位(1.3ml)を加え、この混合液を40℃にて15時間反応させた。100℃で10分間保持して反応を停止し、反応終了液とした。反応終了液を以下の条件でHPLCにより分析した。
<HPLC分析の条件>
カラム:YMC−PAC ODS−AQ−303 内径4.6mm×長さ250mm(株式会社ワイエムシィ製造)
カラム温度:35℃
流速:0.8ml/分
移動相:(A)アセトニトリル/水/酢酸=20/80/0.1(体積比)
(B)アセトニトリル/水/酢酸=40/60/0.1(体積比)
グラジエント:0−25分 %B=0 25−35分 %B=0−100
検出波長:280nm

その結果、反応後の混合液中にエクオールよりも早く溶出する2本の生成物のピークが認められた(それぞれ、EQ−Ga、EQ−Gbとする)。得られた生成物の構造をより詳細に確認するために、反応終了液を以下のように精製した。エバポレーターで濃縮乾固後、50%メタノール13mlに溶解させ、室温に放置し沈殿を形成させた。上清を回収し、精密濾過した後、以下に示す条件でHPLCに複数回に分けて供し配糖体を含む画分をそれぞれ集め、濃縮、乾固することにより、純度約89%(EQ−Ga)と約97%(EQ−Gb)の2種類のエクオール配糖体(精製標品)を約0.02gずつ得た。
<HPLCによる精製の条件>
カラム:YMC−PAC ODS−AQ−313 内径6.0mm×長さ250mm(株式会社ワイエムシィ製造)
カラム温度:35℃
流速:1.0ml/分
移動相:(A)アセトニトリル/水/酢酸=16/84/0.1(体積比)
(B)アセトニトリル/水/酢酸=40/60/0.1(体積比)
グラジエント:0−50分 %B=0 50−62分 %B=0−100
検出波長:280nm

EQ−Ga及びEQ−Gb精製標品の構造を実験9−2と同様の方法によりNMRおよび質量分析により確認した。NMRは、メタノール−d溶媒中でH−NMR及び13C−NMR分析を行ったところ、EQ−Gaは13C−NMRにおいて、グルコース由来のシグナル(102.3、78.1、77.9、74.9、71.3、62.5(ppm))及びエクオール由来のシグナル(158.0、157.6、156.2、131.2、137.0、129.4、118.0、114.4、109.2、103.8、71.9、34.9、32.9(ppm))が検出された。H−NMRにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル(4.78ppm、J=7.5Hz)の結合定数よりグルコースの結合様式はβ型であることが確認された。質量分析及びNMRの結果より、EQ−Gaの分子量は404であり、グルコース1分子が1分子のエクオールの4’位にβ結合した配糖体であることが分かった。一方、EQ−Gbは13C−NMRにおいて、グルコース由来のシグナル(102.4、78.0、77.9、74.9、71.3、62.5(ppm))及びエクオール由来のシグナル(158.4、157.4、156.2、133.6、131.2、129.4、117.6、116.4、110.3、105.6、72.2、39.1、33.0、(ppm))が検出された。H−NMRにおけるグルコースのアノメリックプロトンのシグナル(4.77ppm、J=7.3Hz)の結合定数よりグルコースの結合様式はβ型であることが確認された。質量分析及びNMRの結果より、EQ−Gbの分子量は404であり、グルコース1分子が1分子のエクオールの7位にβ結合した配糖体であることが分かった。

本発明のβ−グルコシダーゼの至適温度を示す図である。 本発明のβ−グルコシダーゼの至適pHを示す図である。 本発明のβ−グルコシダーゼの温度安定性を示す図である。 本発明のβ−グルコシダーゼのpH安定性を示す図である。 組換えDNA、pBG122を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、セルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)由来の本発明のβ−グルコシダーゼをコードするDNAである。 組換えDNA、pQBG122を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、セルロモナス・ビアゾテア N1228(FERM BP−10833)由来の本発明のβ−グルコシダーゼをコードするDNAである。 本発明のβ−グルコシダーゼをアルブチンに作用させた反応液の薄層クロマトグラムを示す図である。 本発明のβ−グルコシダーゼをアルブチンに作用させた反応液のHPLCクロマトグラムを示す図である。 本発明のβ−グルコシダーゼを受容体としてのセロトニン存在下でグルコシル供与体としてのフェニルβ−D−グルコシドに作用させた反応液のHPLCクロマトグラムを示す図である。

符号の説明

図5及び6において
f1(+) origin:f1(+)複製開始点
Ampicillin:アンピシリン耐性遺伝子
Col E1 origin:コリシンE1遺伝子複製開始点
PT5:T5プロモーター
T0:ラムダt0ターミネーター
β−GLU:本発明のβ−グルコシダーゼをコードするDNA
図7において
1:グルコース及びマルトオリゴ糖マーカー
2:アルブチン
3:アルブチン1ミリモル当たり2単位のβ−グルコシダーゼ精製標品を作用させた反応液
4:アルブチン1ミリモル当たり100単位のβ−グルコシダーゼ精製標品を作用させた反応液
a:生成物Aのスポット
b:アルブチンのスポット
c:ハイドロキノンのスポット
図8において、
a:生成物Aのピーク
b:アルブチンのピーク
c:ハイドロキノンのピーク
図9において、
a:セロトニン配糖体のピーク
b:セロトニンのピーク
c:フェニルβ−D−グルコシドのピーク
d:フェノールのピーク

Claims (13)

  1. 下記の理化学的性質を有するβ−グルコシダーゼ。
    (1)基質特異性
    アルブチンに作用して、アルブチンβ−グルコシド(1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコシド))を生成する。ヘリシン、p−ニトロフェニルβ−D−グルコシド、エスクリン、4−メチルウンベリフェリルβ−D−グルコシド、サリシン、フェニルβ−D−グルコシド、フロリジンに作用する。セロビオ−ス、ゲンチオビオ−ス、ラミナリビオ−ス、ソホロ−ス、ネオトレハロ−スには実質的に作用しない。
    (2)分子量
    SDS−ゲル電気泳動法において99,000±20,000ダルトン。
    (3)至適温度
    p−ニトロフェニルβ−D−グルコシドの加水分解活性として、pH6.0、30分間反応の条件で約70℃付近。
    (4)至適pH
    p−ニトロフェニルβ−D−グルコシドの加水分解活性として、40℃、30分間反応の条件で約pH5.6乃至6.3付近。
    (5)pH安定性
    p−ニトロフェニルβ−D−グルコシドの加水分解活性として、4℃、24時間保持の条件で約pH4.9乃至10.3付近。
    (6)温度安定性
    p−ニトロフェニルβ−D−グルコシドの加水分解活性として、pH6.0、60分間保持の条件で約60℃付近まで安定。
    (7)金属イオンによる阻害
    p−ニトロフェニルβ−D−グルコシドの加水分解活性は、銅イオン、水銀イオンにより阻害される。
  2. 配列表における配列番号1で示されるアミノ酸配列か、又は、配列番号1で示されるアミノ酸配列において、その酵素活性を保持する範囲で1個または2個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求項1記載のβ−グルコシダーゼ。
  3. セルロモナス(Cellulomonas)属に属する微生物由来である請求項1又は2記載のβ−グルコシダーゼ。
  4. セルロモナス(Cellulomonas)属に属する微生物が、セルロモナス・ビアゾテア(Cellulomonas biazotea) N1228(FERM BP−10833)である請求項3記載のβ−グルコシダーゼ。
  5. 請求項2記載のβ−グルコシダーゼをコ−ドするDNA。
  6. 配列表における配列番号2で示される塩基配列か、又は、配列表における配列番号2で示される塩基配列において、コ−ドするβ−グルコシダーゼの活性を保持する範囲で1個または2個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有する請求項5記載のDNA。
  7. 遺伝子コ−ドの縮重に基づき、コ−ドするβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号2で示される塩基配列における塩基の1個または2個以上を他の塩基で置換した請求項5又は6記載のDNA。
  8. 請求項5乃至7のいずれかに記載のDNAと自律複製可能なベクターとからなる組換えDNA。
  9. 請求項8記載のDNAを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
  10. 請求項1又は2記載のβ−グルコシダーゼ生産能を有するセルロモナス(Cellulomonas)属に属する微生物か、又は、請求項9記載の形質転換体を栄養培地中で培養し、培養物から請求項1又は2記載のβ−グルコシダーゼを採取することを特徴とするβ−グルコシダーゼの製造方法。
  11. セルロモナス(Cellulomonas)属の微生物が、セルロモナス・ビアゾテア(Cellulomonas biazotea) N1228(FERM BP−10833)である請求項10記載のβ−グルコシダーゼの製造方法。
  12. アルブチンに作用して、1,4−フェニレン ビス(β−D−グルコピラノシド)を生成するβ−グルコシダーゼを、糖供与体としてのアリールβ−グルコシドと、受容体としての水酸基を有する有機化合物に作用させることを特徴とするβ型配糖体の製造方法。
  13. β−グルコシダーゼが、請求項1乃至4のいずれかに記載のβ−グルコシダーゼである請求項12記載のβ型配糖体の製造方法。
JP2007200296A 2007-08-01 2007-08-01 β−グルコシダーゼ及びその製造方法並びにそれを利用したβ型配糖体の製造方法 Pending JP2009034028A (ja)

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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2013536680A (ja) * 2010-09-01 2013-09-26 ビオメリューBiomerieux C.difficileを検出および/または同定するための、β−グルコシダーゼ活性化剤の使用
CN104447907A (zh) * 2015-01-14 2015-03-25 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含硝基联苯双葡萄糖苷结构化合物、其制备方法和用途
CN104478964A (zh) * 2015-01-15 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含丙烯腈结构的苯o-葡萄糖苷衍生物、其制备方法和用途
CN104478959A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含腈基联苯双葡萄糖苷结构化合物、其制备方法和用途
CN104478957A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 一种含腈基苯和双o-葡萄糖苷衍生物、其制备方法和用途
CN104478970A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含苯基噻唑基的o-半乳糖苷衍生物、其制备方法和用途
CN104478958A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含卤代联苯双葡萄糖苷结构化合物、其制备方法和用途
CN104478956A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 苯基双o-葡萄糖苷衍生物、其制备方法和用途
KR20160002116A (ko) 2014-06-30 2016-01-07 선문대학교 산학협력단 페녹소다이올 글루코사이드 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물
JP2018061517A (ja) * 2011-02-04 2018-04-19 天野エンザイム株式会社 マルトトリオシル転移酵素の新規用途

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013536680A (ja) * 2010-09-01 2013-09-26 ビオメリューBiomerieux C.difficileを検出および/または同定するための、β−グルコシダーゼ活性化剤の使用
JP2018061517A (ja) * 2011-02-04 2018-04-19 天野エンザイム株式会社 マルトトリオシル転移酵素の新規用途
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CN104447907A (zh) * 2015-01-14 2015-03-25 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含硝基联苯双葡萄糖苷结构化合物、其制备方法和用途
CN104478957A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 一种含腈基苯和双o-葡萄糖苷衍生物、其制备方法和用途
CN104478970A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含苯基噻唑基的o-半乳糖苷衍生物、其制备方法和用途
CN104478958A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含卤代联苯双葡萄糖苷结构化合物、其制备方法和用途
CN104478956A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 苯基双o-葡萄糖苷衍生物、其制备方法和用途
CN104478959A (zh) * 2015-01-14 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含腈基联苯双葡萄糖苷结构化合物、其制备方法和用途
CN104478964A (zh) * 2015-01-15 2015-04-01 佛山市赛维斯医药科技有限公司 含丙烯腈结构的苯o-葡萄糖苷衍生物、其制备方法和用途

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