JP4837317B2

JP4837317B2 - 細胞培養器具及びその製造方法

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Publication number: JP4837317B2
Application number: JP2005205404A
Authority: JP
Inventors: 健長崎; 征治新海; 篤宇野
Original assignee: JNC Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 2005-07-14
Filing date: 2005-07-14
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2025-07-14
Also published as: JP2007020444A

Description

本発明は、ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種を細胞培養面にコーティングした細胞培養器具及びその製造方法に関する。

接着性細胞の培養に用いられるシャーレ、チャンバー等の細胞培養器具としては、主として器具の培養面にα−ポリリジン、ポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーをコーティングし細胞接着性を増強したものが開示され（例えば、特許文献１参照）市販されている。また、生体適合性の高いキトサンの利用等も研究されている。これらの細胞培養器具は、比較的安価であり、また簡便に作成することができるため、接着性細胞では、株化細胞、初代細胞を問わず、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、角膜細胞等の培養に広く用いられている。また、血球系細胞等のいわゆる浮遊細胞等にも広く使用されている。

しかし、α−ポリリジン、ポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーは、細胞毒性が強いことが知られている。またこれらの細胞培養器具上では細胞の種類によっては細胞の増殖は認められるものの、細胞の接着が不十分だったり、細胞骨格の発達が悪かったりすることがあり、特に初代培養においてはそれらの現象が顕著である。
そこで、細胞の接着性、増殖性を高めることを目的として、コラーゲン、ゼラチンといった細胞外マトリックスやファイブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンといった生体由来物質を接着因子として培養面にコーティングした細胞培養器具も用いられている（例えば、非特許文献１参照）。

ところが、これら生体由来物質は概して非常に高価であることが多く、またこれらの物質を器具表面にコーティングするには煩雑な作業が必要であり、かつコーティングされた表面の安定性や保存性が乏しい等の短所を伴う。
そのため、容易かつ安価に培養器具表面をコーティングでき、基材表面と細胞との接着性が良好であるとともに、細胞毒性が低く細胞の伸展や増殖に有効な、かつ良好な細胞の形態及び配列が得られる培養手法に対する期待が大きい。

特開平６−１８１７４０号公報 Mochizuki, M., Kadoya, Y., Wakabayashi, Y., Kato, K., Okazaki, I., Yamada, M., Sato, T., Sakairi, N., Nishi, N., and Nomizu, M., FASEB J.,17, 875-877 (2003).

本発明の課題は、コーティング作業が容易で、低コストであり、細胞毒性が低く、かつ良好な細胞接着性を有する細胞培養器具を提供することにある。

本発明者らは、上記の課題を達成するために鋭意研究した。その結果、細胞培養器具の基材表面に、従来のα結合したポリリジンに代えて、リジンのε位のアミノ基が、カルボキシル基と結合したε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種をコーティングすることにより、カチオン性が強いにもかかわらず細胞毒性が低く、細胞接着性の弱い細胞においても良好な接着・増殖能が発現することを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

本発明は下記によって構成される。
（１）基材表面が、ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種によりコーティングされていることを特徴とする細胞培養器具。
（２）ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体の数平均分子量が８，０００〜１００，０００である前記（１）項記載の細胞培養器具。
（３）ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種のコーティング量が１ｎｇ／ｃｍ^２〜５００μｇ／ｃｍ^２である前記（１）または（２）項記載の細胞培養器具。
（４）基材がガラスである前記（１）〜（３）項のいずれか１項記載の細胞培養器具。
（５）基材が合成樹脂である前記（１）〜（３）項のいずれか１項記載の細胞培養器具。
（６）基材表面をε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種の溶液に接触させる工程を含むことを特徴とする、基材表面がε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種によりコーティングされている細胞培養器具の製造方法。
（７）ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体の数平均分子量が８，０００〜１００，０００である前記（６）項記載の細胞培養器具の製造方法。
（８）ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種の溶液に接触させる工程の後に、該表面を乾燥する工程を含む前記（６）または（７）項記載の細胞培養器具の製造方法。
（９）ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種の溶液に接触させる工程の後に、過剰な該溶液を除去する工程を含む前記（６）または（７）項記載の細胞培養器具の製造方法。
（１０）ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種の溶液に接触させる工程の後に、過剰な該溶液を除去する工程を含み、更にその後に該表面を乾燥する工程を含む前記（６）または（７）項記載の細胞培養器具の製造方法。
（１１）ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種の溶液の溶媒がホウ酸緩衝液である前記（６）〜（１０）項のいずれか１項記載の細胞培養器具の製造方法。
（１２）基材がガラスである前記（６）〜（１１）項のいずれか１項記載の細胞培養器具の製造方法。
（１３）基材が合成樹脂である前記（６）〜（１１）項のいずれか１項記載の細胞培養器具の製造方法。

本発明の細胞培養器具は、少なくとも基材表面の細胞培養に供する部分が、ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種によりコーティングされているため、細胞接着率が高く、細胞も十分伸展し、細胞骨格の形成に優れており、更に細胞毒性が低い。また、本発明の製造方法に従うと、ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種は従来と同様の簡便な操作で細胞培養器具の基材表面にコーティングすることができ、該細胞培養器具を安価に量産し、広く供給することができる。

本発明の細胞培養器具は、基材表面がε−ポリ−Ｌ−リジン（以下、ε−ポリリジンという）の高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種によりコーティングされる。コーティングは基材表面の一部でも全面でも良く、少なくとも基材表面の細胞培養に供する部分がコーティングされていれば良い。
本発明において使用される細胞培養器具の基材の材質は、細胞毒性が無く耐水性を有し、細胞の培養に適したものであれば特に限定しない。一般的にはガラスや、合成樹脂が用いられるが、蛍光顕微鏡観察等を目的とすることを考慮した場合は、ガラス等のような、使用する可視、紫外光の波長に対して測定可能な程度に透明であることが望ましい。ガラス以外の基材としては、透明であることが必要な場合は、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂、ＴＰＸ（メチルペンテンポリマー）樹脂、アクリル樹脂等が挙げられ、不透明の場合は、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ＡＢＳ樹脂等が挙げられる。
また、本発明において使用される細胞培養器具の基材の形状は、特に限定はされないが、プレート状、ビーズ状、繊維状、及び多孔質状の形状が例示できる。

本発明において、使用されるε−ポリリジンは、何れの方法によって得られたものであってもよく、リジンから化学合成により得られたものもでもよいが、この化学合成品は非常に合成が難しく、また非常に高価でもある為、具体的には、特許第１２４５３６１号明細書に記載のストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを、グルコース５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸アンモニウム１重量％、リン酸水素二カリウム０．０８重量％、リン酸二水素カリウム０．１３６重量％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５重量％、硫酸亜鉛・７水和物０．００４重量％、硫酸鉄・７水和物０．０３重量％、ｐＨ６．８に調整した培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリリジンを分離・採取することによって得られるε−ポリリジンを挙げることができる。

また、本発明において使用されるε−ポリリジンの高分子量化誘導体（以下、高分子量化ε−ポリリジンともいう）は、ε−ポリリジンをベースユニットとして高分子量化したものである。高分子量化ε−ポリリジンの製造方法としては、例えば特許第３５０２８７９号公報記載の放射線照射による方法や、特開２００３−１７１４６４号公報記載の架橋剤を用いる方法を例示することができる。
しかし、放射線照射には高価な機器設備を必要とし、高分子量化ε−ポリリジンの製造に当っては高度な作業管理を必要とする。また、架橋剤による高分子量化では反応時間が長時間であるとともに未反応物の除去等煩雑な作業を要する。
簡便で容易な高分子量化ε−ポリリジンの作製方法としては、特開２００３−１７１４６３号公報記載の方法を例示することができる。即ち、ε−ポリリジンを不活性ガス雰囲気または真空中において、１５０℃以上の温度で熱処理し、脱水縮合反応により高分子量化ε−ポリリジンを得ることができる。このとき、処理温度、処理時間を調節することにより、得られる高分子量化ε−ポリリジンの平均分子量を調節することができ、基本的には処理温度が高い程、また処理時間が長い程高分子化が進行する。また、このようにして製造した高分子量化ε−ポリリジンは分子量分布が広くなり易いが、必要に応じてゲルろ過、その他の方法を用いて適当な分子量画分を得ることもできる。
尚、本発明で使用される高分子量化ε−ポリリジンの数平均分子量は、前述の如く種々のものを製造することができるが、８，０００〜１００，０００が安定して製造できるため好ましい。
また、本発明において、ε−ポリリジン、高分子量化ε−ポリリジン及びそれらの塩の分子量はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定される。

本発明において使用される高分子量化ε−ポリリジンの塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸等の無機酸と高分子量化ε−ポリリジンとで形成されるε−ポリリジンの無機酸塩、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、マレイン酸、アジピン酸、グルコン酸、及び乳酸等の有機酸と高分子量化ε−ポリリジンとで形成されるε−ポリリジンの有機酸塩、カプロン酸、ラウリン酸、及びステアリン酸等の中鎖及び長鎖の飽和脂肪酸と高分子量化ε−ポリリジンとで形成されるε−ポリリジンの飽和脂肪酸塩、オレイン酸、リノール酸、及びアラキドン酸等の中鎖及び長鎖の不飽和脂肪酸と高分子量化ε−ポリリジンとで形成される高分子量化ε−ポリリジンの不飽和脂肪酸塩等が挙げられる。

本発明において、細胞培養器具の少なくとも基材表面の細胞培養に供する部分にコーティングされる高分子量化ε−ポリリジン、及びその塩から選ばれた少なくとも１種（以下、総称して「ε−ポリリジン類」ということがある）のコーティング量は、好ましくは１ｎｇ／ｃｍ^２〜５００μｇ／ｃｍ^２、より好ましくは５ｎｇ／ｃｍ^２〜５μｇ／ｃｍ^２、更に好ましくは１０〜５００ｎｇ／ｃｍ^２である。コーティング量が上記の範囲であれば、接着性細胞の培養に適した細胞培養器具が得られる。

本発明の細胞培養器具で培養できる細胞の種類は特に限定されないが、例えば、接着性細胞では、株化細胞、初代細胞を問わず、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、角膜細胞、軟骨細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、神経幹細胞、神経細胞等の培養に広く用いることができる。また、血球系細胞等のいわゆる浮遊細胞等にも広く使用することができる。

細胞の培養の際には、通常、細胞懸濁液、及び細胞培養液（例えば、ＤＭＥ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ１２培地、ＨａｍＦ１０培地）を培養器具の培養面上に添加することができる。細胞の培養条件は培養する細胞の種類に応じて適宜選択が可能である。

本発明の細胞培養器具の製造方法においては、少なくとも基材表面の細胞培養に供する部分にε−ポリリジン類をコーティングするため、該部分をε−ポリリジン類の溶液に接触させる工程が含まれる。
ε−ポリリジン類の溶液に用いる溶媒としては、特に制限はないが、ε−ポリリジン類が溶解し、ε−ポリリジン類を変質させるものでなければ、何でも使用することができる。例えば、水、メチルアルコール、エチルアルコールと水の混合物、イソプロピルアルコールと水の混合物、燐酸緩衝液、ホウ酸緩衝液及びこれらを混合したものを挙げることができるが、例えばガラスへのコーティングに際しては、ホウ酸緩衝液が好ましい溶媒として例示される。

本発明の細胞培養器具を製造するため、少なくとも基材表面の細胞培養に供する部分をε−ポリリジン類の溶液に接触させる方法の例としては、ε−ポリリジン類のコーティング量が目的量となるようにε−ポリリジン類溶液をスピンコート、バーコート等の通常のコーティング方法により基材表面の細胞培養に供する部分に必要量塗工する方法が挙げられる。この場合、塗工後は乾燥させることなく細胞の培養に供することができるが、塗工後に乾燥する場合は、基材の材質に依存するが、室温（２３℃）から１５０℃で実施することができる。

基材表面の細胞培養に供する部分の面積が非常に小さい場合、あるいは形状が複雑で目的量のε−ポリリジン類溶液を通常のコーティング方法で直接均一に塗工することができない場合は、基材表面の少なくとも細胞培養に供する部分をε−ポリリジン類溶液に含浸させるか、あるいはε−ポリリジン類溶液を基材表面の細胞培養に供する部分に滴下する等の方法によって、基材表面の細胞培養に供する部分にε−ポリリジン類溶液を接触させることで、コーティングすることができる。

その場合、ε−ポリリジン類溶液中のε−ポリリジン類の濃度は、特に限定されないが、濃度が薄いとコーティング量が少なくなり、逆に濃すぎても過剰のε−ポリリジン類を除去しない場合には、培養する細胞への影響が懸念されるため、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０．０ｍｇ／ｍｌが好ましく、１．０μｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌがより好ましく、溶液のコストとコーティング量等を考慮した場合、０．０１〜５．０ｍｇ／ｍｌが更に好ましい。

ε−ポリリジン類の溶液と培養器具の基材表面の接触時間は特に限定しないが、該溶液と基材表面の接触角が４０度以下であれば、数分間から数十分間で十分であり、４０度以上の場合は数時間が好ましい。また、接着性の特に乏しい細胞の培養に供する場合は１２時間から２４時間接触させることが好ましい。

本発明においては、基材表面にε−ポリリジン類の溶液に接触させる工程の後に、コーティング量を調整するため、過剰なε−ポリリジン類の溶液を除去することが好ましい。過剰なε−ポリリジン類の溶液を除去するために、ε−ポリリジン類の溶液に接触させた後の基材表面を洗浄してもよい。洗浄する場合は、ε−ポリリジン類の溶液を作製するのに用いたのと同一の溶媒を用いるのが基本であるが、滅菌水や超純水を用いてもよい。
洗浄後は乾燥させることなく細胞の培養に供することができるが、洗浄後に乾燥する場合は、基材の材質に依存するが、室温（２３℃）から１５０℃で実施することができる。

以下，本発明の特徴を更に具体的に示すため、本発明に従うε−ポリリジン類を用いる細胞培養器具の作製に関する実施例を記すが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。

（参考例１）
コーティングカバーガラスの作製
ε−ポリリジン塩酸塩（ε−ポリリジン（数平均分子量４，０００）の塩酸塩、チッソ（株）製）を０．１Ｍホウ酸緩衝液にて溶解し、０．２及び１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のε−ポリリジン塩酸塩溶液を調製した。培養前日に１０ｃｍプラスティックシャーレにカバーガラス（岩城硝子（株）製、１８ｍｍ）を並べ、１００％エタノールを入れ室温（２３℃）で３０分静置した。超純水で２回洗った（１回の洗いで１０分間振とう）後、上記のε−ポリリジン塩酸塩溶液２ｍｌに一晩つけて、室温（２３℃）にて静置した。培養当日、滅菌水で２回洗い（１回の洗いで２時間振とう）、コーティングカバーガラスを作製した。

コーティング量の定量
作製したコーティングカバーガラスを砕きガラス管に入れた。砕く時に使用した容器にカバーガラスの破片が残らないように、６ＭＨＣｌ、０．１％ＰｈＯＨ(１００μｌ)で共洗いして、残さずにガラス管に移した。スイングアウトローターの遠心機で２，０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、ガラス管を封管した。
封管したガラス管に乾熱滅菌器で熱をかけ、酸加水分解処理を行った（３０分かけて１２０℃まで温度を上げ、１２０℃で５分間、続いて２０分かけて１５０℃まで温度を上げ、１５０℃で２時間熱処理）。室温（２３℃）まで温度が下がるのを待ち、封管を開けた。ガラス管中の溶液をピペットマン（ギルソン社製）でろ過フィルター付きのエッペドルフチューブ（Millipore社製、 Ultrafree-MC, 0.1μm Filter Unit）に移し、ガラス管の中を５０μｌの滅菌超純水で共洗いし、残さずろ過フィルター付きエッペンドルフチューブに移した。フィルター付きエッペンドルフチューブを２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ろ過した。ろ液をアミノ酸分析に供しリジンの定量を行った。この値から求めたε−ポリリジン塩酸塩量をカバーガラスの表面積で除してコーティング量を求めた。基材表面の細胞培養に供する部分におけるε−ポリリジン塩酸塩のコーティング量は、濃度０．２ｍｇ／ｍｌの溶液でコーティングしたものが１００ｎｇ／ｃｍ^２、及び濃度１．０ｍｇ／ｍｌの溶液でコーティングしたものが１２０ｎｇ／ｃｍ^２であった。

（比較例１）
ε−ポリリジン塩酸塩を、α−ポリリジン臭化水素酸塩（数平均分子量１５，０００、和光純薬工業（株）製）に代えた以外は参考例１と同様にしてコーティングカバーガラスを作製し、コーティング量を定量した。基材表面の細胞培養に供する部分におけるα−ポリリジン臭化水素酸塩のコーティング量は、１３０ｎｇ／ｃｍ^２及び１６０ｎｇ／ｃｍ^２であった。

細胞培養試験（１）
参考例１、及び比較例１に記載の手順で作製したコーティングカバーガラスを３．５ｃｍプラスティックシャーレ内に置き、Ａ５４９細胞（人肺ガン細胞、ＡＴＣＣより入手）用のＤＭＥ培地（牛胎児血清を１０％含む）を１ｍｌ加えた。更に、カバーガラス上からゆっくりとＡ５４９細胞懸濁液（１×１０^５cells／well）１ｍｌを加えた。２０時間後に位相差顕微鏡にて細胞の接着、増殖の様子を観察した。その結果を図１に示す。参考例１のε−ポリリジン類でコーティングされた細胞培養器具は、比較例１の細胞培養器具に比べて、細胞接着率が高く細胞も十分伸展しており、細胞骨格の形成に優れていることが明白である。

（参考例２）
コーティング乾燥カバーガラスの作製
ε−ポリリジン塩酸塩（ε−ポリリジン（数平均分子量４，０００）の塩酸塩、チッソ（株）製）を０．１Ｍホウ酸緩衝液にて溶解し、０．２及び１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のε−ポリリジン塩酸塩溶液を調製した。１０ｃｍプラスティックシャーレにカバーガラス（岩城硝子（株）製、１８ｍｍ）を並べ、１００％エタノールを入れ室温（２３℃）で３０分静置した。超純水で２回洗った（１回の洗いで１０分間振とう）後、上記のε−ポリリジン塩酸塩溶液２ｍｌに一晩つけて、室温（２３℃）にて静置した。滅菌水で２回洗った（１回の洗いで２時間振とう）後、乾熱滅菌器に入れ７０℃で１２時間静置し完全に乾燥させて、コーティングカバーガラスを作製し、参考例１と同様にしてコーティング量を定量した。基材表面の細胞培養に供する部分におけるε−ポリリジン塩酸塩のコーティング量は、９０ｎｇ／ｃｍ^２及び１３０ｎｇ／ｃｍ^２であった。

（比較例２）
ε−ポリリジン塩酸塩を、α−ポリリジン臭化水素酸塩（数平均分子量１５，０００、和光純薬工業（株）製）に代えた以外は参考例２と同様にしてコーティング乾燥カバーガラスを作製しコーティング量を定量した。基材表面の細胞培養に供する部分におけるα−ポリリジン臭化水素酸塩のコーティング量は、１３５ｎｇ／ｃｍ^２及び１５０ｎｇ／ｃｍ^２であった。

参考例２及び比較例２にて作製したコーティングカバーガラスにおけるコーティング量の定量結果を図４に示す。１ｃｍ^２あたりのポリリジン塩の量はε−ポリリジン塩酸塩の方が少ない。本発明におけるε−ポリリジン類でコーティングされた細胞培養器具の優れた細胞接着性はε−ポリリジン類の高い細胞親和性や低い細胞毒性が大きく寄与していることが示唆される。

細胞培養試験（２）
参考例２で作製した乾燥カバーガラスを細胞培養試験（１）の場合と同様に３．５ｃｍプラスティックシャーレ内に置き、Ａ５４９細胞用のＤＭＥ培地（牛胎児血清を１０％含む）を１ｍｌ加えた。更に、カバーガラス上からゆっくりとＡ５４９細胞懸濁液（１×１０^５cells／well）１ｍｌを加えた。２０時間後に位相差顕微鏡にて細胞の接着・増殖の様子を観察した。その結果を図２に示す。本発明におけるε−ポリリジン類でコーティングされた細胞培養器具は、乾燥操作を加えても性能が低下しないことが明白である。

接着細胞数の定量
参考例２、及び比較例２にて作製したコーティング乾燥カバーガラス（０．２ｍｇ／ｍｌポリリジン塩溶液：コーティング量９０ｎｇ／ｃｍ^２及び１３５ｎｇ／ｃｍ^２）を細胞培養試験（１）の場合と同様に３．５ｃｍプラスティックシャーレ内に置き、Ａ５４９細胞用のＤＭＥ培地（牛胎児血清を１０％含む）を１ｍｌ加えた。更に、カバーガラス上からゆっくりとＡ５４９細胞懸濁液（１×１０^５cells／well）を１ｍｌ加えた。

２０時間培養後、細胞を１×ＰＢＳ１ｍｌで２度洗浄した。３．５ｃｍプラスティックシャーレからカバーガラスの表面を傷つけないように取り出し、１×ＰＢＳ１ｍｌで濯ぎ、２well培養チャンバー（Nunc社製、Lab-Tek チェンバースライド177380）に沈め新しい培地を１．１ｍｌ加えた。Cell Counting Kit-8(（株）同仁化学研究所製)を各wellに３００μｌ加え、全体が混ざるように軽く振とうした。３７℃、ＣＯ_２インキュベーターに入れ２時間培養した。Cell Counting Kit-8で呈色反応させた細胞培養培地を２well培養チャンバーから１１０μｌ／well取り、９６well plateに移し変えた。プレートリーダー（Thermo Labsystems社製、Multiskan Ascent BIF）で波長４５０ｎｍと６２０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞数を測定した。その結果を図３に示す。参考例２（図３のepsilon）のε−ポリリジン類でコーティングされた細胞培養器具が、比較例２（図３のalpha）の細胞培養器具に比べて、優れた細胞接着性を有することが明白である。

ε−ポリリジン類の細胞毒性評価
本発明においてコーティング剤として用いるε−ポリリジン類を用いて、Ａ５４９細胞（人肺がん細胞、ＡＴＣＣより入手）に対する細胞毒性評価を行った。評価にはε−ポリリジン塩酸塩（チッソ（株）製）を用い、比較化合物としてα−ポリリジン臭化水素酸塩（平均分子量１５０００、和光純薬工業（株）製）を用いた。

９６wellマイクロプレートにＡ５４９細胞１×１０^４cells／wellを播種し、ＤＭＥ培地（牛胎児血清を１０％含む）を用い３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養した細胞の培地をアスピレーターで取り除き、新たに１well当り４０μｌずつ通常の濃度より１．２５倍濃い培地を加えた。最終的に所定の濃度となるポリリジン塩溶液（１０μｌ）を加え、３７℃で３時間細胞を培養した。

３時間培養後、アスピレーターで培地を取り除いて、新たに培地を１well当り１００μｌずつ加え４６時間培養した。１１０μｌのフレッシュな培地に交換後、Cell Counting Kit-8(（株）同仁化学研究所製)を１０μｌずつ加え３７℃で２時間培養し呈色反応を行った。プレートリーダー（Thermo Labsystems社製、Multiskan Ascent BIF）を用い、波長４５０ｎｍ（リファレンス６５０ｎｍ）の吸光度を測定し細胞生存率を算出した。その結果を図５に示した。低濃度領域では相違はみられないが、３００ｍｇ／ｌ以上の高濃度領域ではα−ポリリジン臭化水素酸塩における細胞生存率がε−ポリリジン塩酸塩の場合より有意に低く、ε−ポリリジン類の細胞毒性が低いことが確認できた。

細胞培養試験（３）
参考例１で作製したε−ポリリジンコーティングカバーグラス（コーティング量：１２０ｎｇ／ｃｍ^２）、及び対照品となるノンコート（コーティングしていないことを意味する。以下同様）カバーグラスを２４well plateに入れ、２×１０^４cells／ｍｌに調製したラット大脳皮質ニューロン初代培養細胞懸濁液を１ｍｌ／wellずつ加えた。２４時間、５日、１４日後に位相差顕微鏡にて細胞の接着や軸索の伸張を観察した。その結果を図６に示した。ε−ポリリジンを用いた場合、ノンコートカバーグラスと比較して明らかに細胞接着性が増大し、接着した細胞から軸索がより多く伸張していることがわかり、本発明のε−ポリリジン類でコーティングされた細胞培養器具は初代神経細胞の接着、培養に優れることが分かる。

（参考例３）
コーティング乾燥プラスティックディッシュの作製
ε−ポリリジン塩酸塩（ε−ポリリジン（数平均分子量４，０００）の塩酸塩、チッソ（株）製）を０．１Ｍホウ酸緩衝液にて溶解し、０．２及び１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のε−ポリリジン塩酸塩溶液を調製した。３．５ｃｍプラスティックディッシュ（Greiner Bio-One社製、Petri Dish、ポリスチレン製、接触角６５〜７０°）に１００％エタノールを入れ室温（２３℃）で３０分間静置した。超純水で２回洗浄（１回の洗浄で１０分間振とう）後、ε−ポリリジン塩酸塩溶液２ｍｌにつけて、室温（２３℃）にて一晩静置した。滅菌水で２回洗浄（１回の洗浄で２時間振とう）後、乾熱滅菌器に入れ７０℃で１２時間静置し完全に乾燥させて、コーティング乾燥プラスティックディッシュを作製した。

コーティング量の定量
コーティングしたプラスティックディッシュに６ＭＨＣｌを加え、ディッシュをシーリングテープで覆った後、乾熱滅菌器にて７０℃で１時間加熱し、コーティングしたポリリジンを溶解させた。放冷後６ＭＨＣｌを完全にガラス管に移し、６ＭＨＣｌ、２０％ＰｈＯＨ溶液を加えて、溶液を６ＭＨＣｌ０．１％ＰｈＯＨ溶液に調整した。ガスバーナーを用いて、ガラス管を封管した後、乾滅菌器で熱をかけ酸加水分解を行った（３０分かけて１２０℃まで温度を上げ、１２０℃で５分間、続いて２０分かけて１５０℃まで温度を上げ、１５０℃で２時間加熱処理）。室温（２３℃）まで冷めてから、ガラス管の封管を開けて、口をパラフィルムで覆い注射針で２つ穴を開けてデシケーターに入れ、真空ポンプで減圧しＨＣｌを飛ばした。ＨＣｌを飛ばしたガラス管に０．０２ＭＨＣl溶液を１００μl加えアミノ酸を溶解し、濾過フィルター付きのエッペンドルフチューブ（Millipore社製、Ultrafree-MC 0.1μm Filte Unit）に滴下し、続いて０．０２ＭＨＣｌ溶液５０μlでガラス管内をもう一度すすぎ、濾過フィルターに入れ、最終的には１５０μlで溶解した。フィルター付きエッペンドルフチューブを２０００ｒｐｍで５分間遠心し、濾過後、濾液をアミノ酸分析に供しリジンの定量を行った。この値から求めたε−ポリリジン塩量をプラスティックディッシュの表面積で除してコーティング量を求めた。ε−ポリリジン塩酸塩のコーティング量は、濃度０．２ｍｇ／ｍｌの溶液でコーティングしたものが７０ｎｇ／ｃｍ^２、及び濃度１．０ｍｇ／ｍｌの溶液でコーティングしたものが１３５ｎｇ／ｃｍ^２であった。

（比較例３）
ε−ポリリジン塩酸塩を、α−ポリリジン臭化水素酸塩（数平均分子量１５，０００、和光純薬工業（株）製）に代えた以外は参考例３と同様にしてコーティング乾燥プラスティックディッシュを作製しコーティング量を定量した。０．２及び１．０ｍｇ／ｍｌのα−ポリリジン臭化水素酸塩溶液で調製したときのコーティング量はそれぞれ５０及び１１０ｎｇ／ｃｍ^２であった。

細胞培養試験（４）
参考例３、及び比較例３の手順で作成したコーティング乾燥プラスティックディッシュ、及び対照品となるノンコートプラスティックディッシュ内に、Ａ５４９細胞（人肺ガン細胞、ＡＴＣＣより入手）用のＤＭＥ培地（牛胎児血清を１０％含む）を１ｍｌ加えた。更に、ゆっくりとＡ５４９細胞懸濁液（1×１０^５ cells／well）１ｍｌを加え、２０時間後に位相差顕微鏡にて細胞の接着、増殖の様子を観察した。その結果を図７に示した。ε−ポリリジン塩酸塩を用いたコーティング乾燥プラスティックディッシュの場合、ノンコートプラスティックディッシュ及びα−ポリリジン臭化水素酸塩を用いたコーティング乾燥プラスティックディッシュと比較して明らかに細胞接着性が増大し、接着した細胞骨格が良好となっており、本発明のε−ポリリジン類でコーティングされた細胞培養器具は、プラスティック製品においても優れた細胞接着性、培養性能を示す事が明白である。

（参考例４）
コーティング乾燥プラスティックプレートの作製
ε−ポリリジン塩酸塩（ε−ポリリジン（数平均分子量４，０００）の塩酸塩、チッソ（株）製）を０．１Ｍホウ酸緩衝液にて溶解し、０．２及び１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のε−ポリリジン塩酸塩溶液を調製した。２４well plate（FALCON polystyrene ノントリートメントプレート、接触角８０〜８４°）に１００％エタノールを入れ室温（２３℃）で３０分静置した。超純水で２回洗った（１回の洗いで１０分間振とう）後、ε−ポリリジン塩酸塩溶液１ｍｌにつけて、室温（２３℃）にて一晩静置した。滅菌水で２回洗浄（１回の洗いで２時間振とう）後、乾熱滅菌器に入れ７０℃で１２時間静置して完全に乾燥させて、コーティング乾燥プラスティックプレートを作製した。コーティングプラスティックディッシュをコーティング乾燥プラスティックプレートに置き換えた以外は参考例３と同様にしてコーティング量を定量した。０．２及び１．０ｍｇ／ｍｌのε−ポリリジン塩酸塩溶液で調製したときのコーティング量はそれぞれ５０及び１４０ｎｇ／ｃｍ^２であった。

（比較例４）
ε−ポリリジン塩酸塩を、α−ポリリジン臭化水素酸塩（数平均分子量１５，０００、和光純薬工業（株）製）に代えた以外は参考例４と同様にしてコーティング乾燥プラスティックプレートを作製しコーティング量を定量した。０．２及び１．０ｍｇ／ｍｌのα−ポリリジン臭化水素酸塩溶液で調製したときのコーティング量はそれぞれ３５及び１００ｎｇ／ｃｍ^２であった。

細胞培養試験（５）
参考例４、及び比較例４の手順で作製したコーティング乾燥プラスティックプレート、及び対照品となるノンコートプレート内に、ＨｅＬａＤ９８細胞（人子宮癌細胞）用のＤＭＥ培地（牛胎児血清を１０％含む）を含む細胞懸濁液（１×１０^５ cells／well）１ｍｌを加えた。２０時間後に位相差顕微鏡にて細胞の接着、増殖の様子を観察した。結果を図８に示した。ε−ポリリジン塩酸塩を用いたコーティング乾燥プラスティックプレートの場合、Ａ５４９細胞の場合と同様にＨｅＬａＤ９８細胞でも、ノンコートプレート及びα−ポリリジン臭化水素酸塩を用いたコーティング乾燥プラスティックプレートと比較して明らかに細胞接着性が増大し、接着した細胞骨格が良好であり、本発明のε−ポリリジン類でコーティングされた細胞培養器具は、プラスティックプレートにおいても優れた細胞接着、培養性能を示す事が明白である。

（実施例１）
高分子量化ε−ポリリジンの製造
ε−ポリリジン（数平均分子量４，０００、チッソ（株）製）１００ｍｇをガラスマイクロチューブに入れ、ガラスチューブオーブン（柴田科学（株）製、Shibata GTO-350-RD）を用い、真空中１８５℃で４０分間脱水縮合を行ない、分子量の範囲が２０，０００〜７０，０００の高分子量化ε−ポリリジンを製造した。尚、分子量の測定はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって行った。

コーティング乾燥カバーガラスの作製
実施例１で製造した高分子量化ε−ポリリジンを０．１Ｍホウ酸緩衝液に溶解し、０．０５及び０．２ｍｇ／ｍｌの濃度の高分子量化ε−ポリリジン溶液を調製した。１０ｃｍプラスチックシャーレに丸型カバーガラス（松浪硝子工業（株）製、１２ｍｍ）を並べ、１００％エタノールを約１５ｍｌ入れ、室温（２３℃）で３０分静置した。超純水で２回洗った（１回の洗いで１０分間振盪）後、２４well plate（FLCON polystyrene、ノントリートメントプレート）に移し、上記の高分子量化ε−ポリリジン溶液1ｍｌを加えて室温（２３℃）で２０時間静置した。滅菌水で２回洗った（１回の洗いで２時間振盪）後、乾熱滅菌器に入れ７０℃で１２時間静置し完全に乾燥させて、コーティング乾燥カバーガラスを作製した。参考例１と同様にしてコーティング量を定量した。基材表面の細胞培養に供する部分における高分子量化ε−ポリリジンのコーティング量は、１３０ｎｇ／ｃｍ^２及び１４０ｎｇ／ｃｍ^２であった。

（参考例５）
高分子量化ε−ポリリジンを、ε−ポリリジン塩酸塩（ε−ポリリジン（数平均分子量４，０００）の塩酸塩、チッソ（株）製）に代えた以外は実施例１と同様にしてコーティング乾燥カバーガラスを作製した。参考例１と同様にしてコーティング量を定量した。基材表面の細胞培養に供する部分におけるε−ポリリジン塩酸塩のコーティング量は、６１０ｎｇ／ｃｍ^２及び９２０ｎｇ／ｃｍ^２であった。

細胞培養試験（６）
実施例１及び参考例５で作製したコーティング乾燥カバーガラスに２×１０⁴ cells/ｍｌに調製したラット大脳皮質ニューロン初代培養細胞懸濁液を１ｍｌ/wellずつ加えた。３７℃で培養を行い、１０及び２０日後に位相差顕微鏡にて細胞の接着や軸索の伸張を観察した。結果を図９に示す。図より、培養１０日目では高分子量化ε−ポリリジンよりもε−ポリリジン塩酸塩をコーティングしたカバーガラスの方が細胞の接着性、軸索のネットワークともに良好であるが、培養２０日目では逆に高分子量化ε−ポリリジンをコーティングしたカバーガラスの方が細胞の成育、軸索ネットワークの形成が良好であった。本試験結果より、ニューロン細胞を長期的に培養するような場合には高分子量化ε−ポリリジンが細胞接着性や軸索ネットワークの形成に適していることが分かる。

本発明の細胞培養器具（ガラス未乾燥品）におけるＡ５４９細胞培養観察。本発明の細胞培養器具（ガラス乾燥品）におけるＡ５４９細胞培養観察。ポリリジン塩コーティング細胞培養器具における生Ａ５４９細胞数評価。ポリリジン塩コーティング細胞培養器具におけるポリリジン塩吸着量。 Cell Counting Kit-8により評価したポリリジン塩溶液処理後のＡ５４９細胞生存率。本発明の細胞培養器具（ガラス未乾燥品）における神経細胞培養観察。本発明の細胞培養器具（プラスティックディッシュ）におけるＡ５４９細胞培養観察。本発明の細胞培養器具（プラスティックプレート）におけるＨｅＬａＤ９８細胞培養観察。本発明の細胞培養器具（ガラス乾燥品）における初代神経細胞培養観察。

Claims

基材表面が、ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種を水を含む溶媒に溶解した溶液によりコーティングされていることを特徴とする細胞培養器具。
ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体の数平均分子量が８，０００〜１００，０００である請求項１記載の細胞培養器具。
ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種のコーティング量が１ｎｇ／ｃｍ²〜５００μｇ／ｃｍ²である請求項１または２記載の細胞培養器具。
基材がガラスである請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞培養器具。
基材が合成樹脂である請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞培養器具。
基材表面をε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種を水を含む溶媒に溶解した溶液に接触させる工程を含むことを特徴とする、基材表面がε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種によりコーティングされている細胞培養器具の製造方法。
ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体の数平均分子量が８，０００〜１００，０００である請求項６記載の細胞培養器具の製造方法。
ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種を水を含む溶媒に溶解した溶液に接触させる工程の後に、該表面を乾燥する工程を含む請求項６または７記載の細胞培養器具の製造方法。
ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種を水を含む溶媒に溶解した溶液に接触させる工程の後に、過剰な該溶液を除去する工程を含む請求項６または７記載の細胞培養器具の製造方法。
ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種を水を含む溶媒に溶解した溶液に接触させる工程の後に、過剰な該溶液を除去する工程を含み、更にその後に該表面を乾燥する工程を含む請求項６または７記載の細胞培養器具の製造方法。
ε−ポリ−Ｌ−リジンの高分子量化誘導体、及びその塩から選ばれた少なくとも１種を水を含む溶媒に溶解した溶液の溶媒がホウ酸緩衝液である請求項６〜１０のいずれか１項記載の細胞培養器具の製造方法。
基材がガラスである請求項６〜１１のいずれか１項記載の細胞培養器具の製造方法。
基材が合成樹脂である請求項６〜１１のいずれか１項記載の細胞培養器具の製造方法。