JP2001128659A - 細胞培養用粒状マイクロキャリア - Google Patents
細胞培養用粒状マイクロキャリアInfo
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- JP2001128659A JP2001128659A JP31877399A JP31877399A JP2001128659A JP 2001128659 A JP2001128659 A JP 2001128659A JP 31877399 A JP31877399 A JP 31877399A JP 31877399 A JP31877399 A JP 31877399A JP 2001128659 A JP2001128659 A JP 2001128659A
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- Japan
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- microcarrier
- cell culture
- polylysine
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】付着依存性細胞を効率よく大量に培養すること
を可能とする細胞培養用粒状マイクロキャリアの提供。 【解決手段】架橋剤でポリリジンを架橋してなる細胞培
養用粒状マイクロキャリア。
を可能とする細胞培養用粒状マイクロキャリアの提供。 【解決手段】架橋剤でポリリジンを架橋してなる細胞培
養用粒状マイクロキャリア。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は細胞培養用の粒状マ
イクロキャリアに関する。さらに詳しくは、架橋剤でポ
リリジンを架橋してなる細胞培養用粒状マイクロキャリ
アに関する。
イクロキャリアに関する。さらに詳しくは、架橋剤でポ
リリジンを架橋してなる細胞培養用粒状マイクロキャリ
アに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、ワクチン、酵素、ホルモン、抗
体、インターフェロン、および核酸などの生化学物質の
生産を目的として、細胞培養が盛んに行われている。
体、インターフェロン、および核酸などの生化学物質の
生産を目的として、細胞培養が盛んに行われている。
【０００３】細胞培養の手法の中でも、粒子の表面に細
胞を付着させ、該細胞を単層で生育させる方法は、他の
細胞培養法と比べ容量に対して非常に広い培養表面が
得られることから、コンパクトな設備で細胞の大量培養
が可能、培養条件の調節が容易、他の単層培養法に
比べ少量の培地で培養可能、他の細胞培養法に比べ操
作段階数が少なく、操作時の汚染の可能性が低い、など
の利点がある。
胞を付着させ、該細胞を単層で生育させる方法は、他の
細胞培養法と比べ容量に対して非常に広い培養表面が
得られることから、コンパクトな設備で細胞の大量培養
が可能、培養条件の調節が容易、他の単層培養法に
比べ少量の培地で培養可能、他の細胞培養法に比べ操
作段階数が少なく、操作時の汚染の可能性が低い、など
の利点がある。
【０００４】該粒子としては、多孔質ガラス、多糖類な
どの天然物質、ポリスチレンなどのポリマー合成品、更
にそれらの表面に陰イオン交換基や天然物質を結合（コ
ーティング）させたものなどが用いられており、その中
でも多糖類などの天然物質、具体的にはデキストラン、
セルロースなどが比較的細胞の増殖率が高いため、広く
一般に用いられてきた。粒子の表面に細胞を付着させ、
該細胞を単層で生育させる方法に使用される上記粒子
は、通常マイクロキャリアと呼ばれている。
どの天然物質、ポリスチレンなどのポリマー合成品、更
にそれらの表面に陰イオン交換基や天然物質を結合（コ
ーティング）させたものなどが用いられており、その中
でも多糖類などの天然物質、具体的にはデキストラン、
セルロースなどが比較的細胞の増殖率が高いため、広く
一般に用いられてきた。粒子の表面に細胞を付着させ、
該細胞を単層で生育させる方法に使用される上記粒子
は、通常マイクロキャリアと呼ばれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
マイクロキャリアを用いた細胞培養では、充分に高い増
殖率が得られているとは云い難かった。
マイクロキャリアを用いた細胞培養では、充分に高い増
殖率が得られているとは云い難かった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前述の従来
技術の問題点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、架橋剤で
ポリリジンを架橋してなる粒状マイクロキャリアを用い
て細胞培養を行えば、従来のマイクロキャリアを用いて
細胞培養した場合よりも、細胞の増殖率が高く、付着依
存性動物細胞を効率よく大量に培養することが可能であ
ることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させ
た。
技術の問題点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、架橋剤で
ポリリジンを架橋してなる粒状マイクロキャリアを用い
て細胞培養を行えば、従来のマイクロキャリアを用いて
細胞培養した場合よりも、細胞の増殖率が高く、付着依
存性動物細胞を効率よく大量に培養することが可能であ
ることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させ
た。
【０００７】本発明は以下に記載の（１）〜（４）の構
成を有する。 （１）架橋剤でポリリジンを架橋してなる細胞培養用粒
状マイクロキャリア。 （２）架橋剤がエピクロロヒドリンである前記第１項に
記載の細胞培養用粒状マイクロキャリア。 （３）ポリリジンがポリ（ε-リジン）である前記第１
項または第２項に記載の細胞培養用粒状マイクロキャリ
ア。 （４）ポリリジンがストレプトマイセス属細菌により生
産された微生物由来のものである前記第１項〜第３項い
ずれか１項に記載の細胞培養用粒状マイクロキャリア。
成を有する。 （１）架橋剤でポリリジンを架橋してなる細胞培養用粒
状マイクロキャリア。 （２）架橋剤がエピクロロヒドリンである前記第１項に
記載の細胞培養用粒状マイクロキャリア。 （３）ポリリジンがポリ（ε-リジン）である前記第１
項または第２項に記載の細胞培養用粒状マイクロキャリ
ア。 （４）ポリリジンがストレプトマイセス属細菌により生
産された微生物由来のものである前記第１項〜第３項い
ずれか１項に記載の細胞培養用粒状マイクロキャリア。
【０００８】以下、発明を詳細に説明する。本発明に用
いるポリリジンは構造上α型、ε型のどちらでも良い
が、ε型はα型に比べカチオン性（pKa7.6）であること
から、好ましく本発明に使用することができる。また、
ポリリジンはストレプトマイセス属細菌により生産され
た微生物由来の物であっても、化学合成によって得られ
たものであっても構わない。しかしながら、ストレプト
マイセス属細菌により生産された微生物由来のものはε
型であり、細胞の付着にも好ましく、また生分解性があ
ることから生体適合性が高く、さらに安価に大量入手す
ることが可能であることから、本発明に使用するポリリ
ジンは、ストレプトマイセス属細菌により生産された微
生物由来のものであることが好ましい。
いるポリリジンは構造上α型、ε型のどちらでも良い
が、ε型はα型に比べカチオン性（pKa7.6）であること
から、好ましく本発明に使用することができる。また、
ポリリジンはストレプトマイセス属細菌により生産され
た微生物由来の物であっても、化学合成によって得られ
たものであっても構わない。しかしながら、ストレプト
マイセス属細菌により生産された微生物由来のものはε
型であり、細胞の付着にも好ましく、また生分解性があ
ることから生体適合性が高く、さらに安価に大量入手す
ることが可能であることから、本発明に使用するポリリ
ジンは、ストレプトマイセス属細菌により生産された微
生物由来のものであることが好ましい。
【０００９】本発明に好ましいポリリジンの平均分子量
は、５００〜１，０００，０００の範囲である。その中
でも粒子化の容易さの面から、本発明においては１，０
００〜１０，０００の範囲であるポリリジンを好ましく
使用することができる。
は、５００〜１，０００，０００の範囲である。その中
でも粒子化の容易さの面から、本発明においては１，０
００〜１０，０００の範囲であるポリリジンを好ましく
使用することができる。
【００１０】本発明に用いる架橋剤としては、ヘキサメ
チレンイソシアネート等の２官能性試薬、ジグリシジル
エーテル等のジエポキシ、一端がハロゲン化されたエピ
クロロヒドリン等を挙げることができる。その中でもエ
ポキシ化合物は容易に開環し、安価であることから好ま
しい架橋剤であり、エポキシ化合物の中でも、エピクロ
ロヒドリンは本発明により好ましく使用することができ
る。
チレンイソシアネート等の２官能性試薬、ジグリシジル
エーテル等のジエポキシ、一端がハロゲン化されたエピ
クロロヒドリン等を挙げることができる。その中でもエ
ポキシ化合物は容易に開環し、安価であることから好ま
しい架橋剤であり、エポキシ化合物の中でも、エピクロ
ロヒドリンは本発明により好ましく使用することができ
る。
【００１１】該架橋剤を用いてポリリジンを架橋する際
の反応方法および条件は、使用する架橋剤ごとに好まし
い条件を選択すべきであるが、一般的には不活性の分散
媒中で撹拌しながら架橋反応を行うことにより、あるい
はポリリジンの水溶液中に架橋剤を添加し、架橋剤とポ
リリジンとを懸濁重合させることにより、ポリリジンを
架橋する事ができる。また、架橋剤の添加量を調節する
ことにより、機械的強度の調節やアミノ基量の調節が可
能である。
の反応方法および条件は、使用する架橋剤ごとに好まし
い条件を選択すべきであるが、一般的には不活性の分散
媒中で撹拌しながら架橋反応を行うことにより、あるい
はポリリジンの水溶液中に架橋剤を添加し、架橋剤とポ
リリジンとを懸濁重合させることにより、ポリリジンを
架橋する事ができる。また、架橋剤の添加量を調節する
ことにより、機械的強度の調節やアミノ基量の調節が可
能である。
【００１２】前述の懸濁重合によりポリリジンを架橋す
る場合の、水溶液中のポリリジン濃度は、１０〜７０重
量％であることが好ましい。反応温度及び反応時間は使
用する架橋剤の反応性、さらにその添加量によって異な
るため、一概に特定できないが、本発明の好ましい架橋
剤であるエピクロロヒドリンを用いた場合には、４０℃
前後の反応温度で１６時間程度撹拌することでポリリジ
ンの架橋が終了し、粒状物質（本発明の細胞培養用粒状
マイクロキャリア）を得ることができる。
る場合の、水溶液中のポリリジン濃度は、１０〜７０重
量％であることが好ましい。反応温度及び反応時間は使
用する架橋剤の反応性、さらにその添加量によって異な
るため、一概に特定できないが、本発明の好ましい架橋
剤であるエピクロロヒドリンを用いた場合には、４０℃
前後の反応温度で１６時間程度撹拌することでポリリジ
ンの架橋が終了し、粒状物質（本発明の細胞培養用粒状
マイクロキャリア）を得ることができる。
【００１３】本発明の細胞培養用粒状マイクロキャリア
の粒径は、特に限定されるものではないが、１０〜３０
０μｍの範囲であることが好ましく、更に好ましくは１
００〜３００μｍの範囲であることが好ましい。
の粒径は、特に限定されるものではないが、１０〜３０
０μｍの範囲であることが好ましく、更に好ましくは１
００〜３００μｍの範囲であることが好ましい。
【００１４】本発明のマイクロキャリアは、何れの動物
細胞培養にも使用することができ、具体的にはmouse L
cell、vero cell、CHO cell等の継代用動物繊維芽細胞
の生産に使用すると効果的である。また、本発明のマイ
クロキャリアを用いた細胞培養は、従来のマイクロキャ
リアを用いた細胞培養法で使用されている培地、装置を
用いて行うことができる。以下、本発明について実施例
及び比較例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれら
の実施例に限定されるものではない。
細胞培養にも使用することができ、具体的にはmouse L
cell、vero cell、CHO cell等の継代用動物繊維芽細胞
の生産に使用すると効果的である。また、本発明のマイ
クロキャリアを用いた細胞培養は、従来のマイクロキャ
リアを用いた細胞培養法で使用されている培地、装置を
用いて行うことができる。以下、本発明について実施例
及び比較例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれら
の実施例に限定されるものではない。
【００１５】
１．マイクロキャリア粒子の調整 実施例１ 流動パラフィン（ナカライテスク（株）製、試薬１級）
１０００ｍｌ中に、ε−ポリリジン２５％水溶液（チッ
ソ株式会社製）３０ｍｌを添加・撹拌し、液滴を形成さ
せたのち、エピクロロヒドリン（ナカライテスク（株）
製、試薬特級）５ｇを添加し、５０℃で１６時間撹拌し
て水不溶性の球状粒子を得た。得られた球状粒子を水及
びメタノールで洗浄した後篩により分級し、５３〜１２
５μｍの大きさの粒子を得た。このようにして得られた
粒子をマイクロキャリアＡとした。
１０００ｍｌ中に、ε−ポリリジン２５％水溶液（チッ
ソ株式会社製）３０ｍｌを添加・撹拌し、液滴を形成さ
せたのち、エピクロロヒドリン（ナカライテスク（株）
製、試薬特級）５ｇを添加し、５０℃で１６時間撹拌し
て水不溶性の球状粒子を得た。得られた球状粒子を水及
びメタノールで洗浄した後篩により分級し、５３〜１２
５μｍの大きさの粒子を得た。このようにして得られた
粒子をマイクロキャリアＡとした。
【００１６】比較例１ ビーズ状架橋デキストランマトリックスにN,N-ジエチル
アミノエチル（DEAE）荷電基を導入した球状粒子である
Cytodex１（ファルマシア（株）製、商品名）をマイク
ロキャリアＢとした。
アミノエチル（DEAE）荷電基を導入した球状粒子である
Cytodex１（ファルマシア（株）製、商品名）をマイク
ロキャリアＢとした。
【００１７】２．細胞培養 上記実施例１及び比較例１で示したマイクロキャリアＡ
及びＢを用いて、Mouce L-929細胞（繊維芽細胞由来）
の培養を行った。培養条件は２種とも同一とし、それぞ
れ下記の条件で操作を行った。細胞増殖性の評価に使用
した細胞（Mouce L-929細胞）は、１０％牛胎児血清（F
BS）を含むＤ-MEM（Dulbecco's Modified Eagle Mediu
m）を用いて継代培養し、播種５日目のコンフルエント
になったものを使用した。 「条件」湿潤体積で2.5mlのマイクロキャリア（あらか
じめDulbecco PBS(-)緩衝液中で121℃、１５分オートク
レーブで加熱滅菌したもの）が入った３枚のシャーレ
に、 FBS (10vol％)およびPenicillin G (100U/ml) 、St
reptmycin sulfate( 64μg/ml)を含むD-MEM-細胞懸濁液
を1×105 cells/mlずつ注入した後、5%炭酸ガス、37℃
の雰囲気下でインキュベートした。インキュベーション
開始２日、４日、６日目に該シャーレを取り出し、該シ
ャーレ中の マイクロキャリアをDulbecco PBS(-)で洗浄
した後、0.25％トリプシン溶液により細胞を脱離させ
た。次いで0.25%トリパンブルー（0.05%アザイド）によ
り該細胞を染色し、改良型ノイバウェル血球計算盤によ
り細胞数をカウントした。仕込み細胞数（S0）に対する
カウントの総数（St）を細胞の増殖率（St / S0）とし
た。
及びＢを用いて、Mouce L-929細胞（繊維芽細胞由来）
の培養を行った。培養条件は２種とも同一とし、それぞ
れ下記の条件で操作を行った。細胞増殖性の評価に使用
した細胞（Mouce L-929細胞）は、１０％牛胎児血清（F
BS）を含むＤ-MEM（Dulbecco's Modified Eagle Mediu
m）を用いて継代培養し、播種５日目のコンフルエント
になったものを使用した。 「条件」湿潤体積で2.5mlのマイクロキャリア（あらか
じめDulbecco PBS(-)緩衝液中で121℃、１５分オートク
レーブで加熱滅菌したもの）が入った３枚のシャーレ
に、 FBS (10vol％)およびPenicillin G (100U/ml) 、St
reptmycin sulfate( 64μg/ml)を含むD-MEM-細胞懸濁液
を1×105 cells/mlずつ注入した後、5%炭酸ガス、37℃
の雰囲気下でインキュベートした。インキュベーション
開始２日、４日、６日目に該シャーレを取り出し、該シ
ャーレ中の マイクロキャリアをDulbecco PBS(-)で洗浄
した後、0.25％トリプシン溶液により細胞を脱離させ
た。次いで0.25%トリパンブルー（0.05%アザイド）によ
り該細胞を染色し、改良型ノイバウェル血球計算盤によ
り細胞数をカウントした。仕込み細胞数（S0）に対する
カウントの総数（St）を細胞の増殖率（St / S0）とし
た。
【００１８】マイクロキャリアＡ及びＢを用いた場合の
２、４，６日後での細胞の増殖率（St/ S0）を図１に示
した。この結果より、本発明の架橋ポリリジンからなる
マイクロキャリアＡは比較例のマイクロキャリアＢに比
べ増殖率が高く、細胞培養用のマイクロキャリアとして
有効に使用できることが確認された。
２、４，６日後での細胞の増殖率（St/ S0）を図１に示
した。この結果より、本発明の架橋ポリリジンからなる
マイクロキャリアＡは比較例のマイクロキャリアＢに比
べ増殖率が高く、細胞培養用のマイクロキャリアとして
有効に使用できることが確認された。
【００１９】
【発明の効果】本発明の粒状マイクロキャリアを用いて
細胞培養を行えば、付着依存性動物細胞を効率よく大量
に培養することが可能である。
細胞培養を行えば、付着依存性動物細胞を効率よく大量
に培養することが可能である。
【図１】実施例２で示した、マイクロキャリアＡ及びＢ
を用いた場合の２、４，６日後での細胞（ Mouce L-929
細胞）の増殖率（St / S0）のグラフ
を用いた場合の２、４，６日後での細胞（ Mouce L-929
細胞）の増殖率（St / S0）のグラフ
Claims (4)
- 【請求項１】 架橋剤でポリリジンを架橋してなる細胞
培養用粒状マイクロキャリア。 - 【請求項２】 架橋剤がエピクロロヒドリンである請求
項１に記載の細胞培養用粒状マイクロキャリア。 - 【請求項３】 ポリリジンがポリ（ε-リジン）である
請求項１または２に記載の細胞培養用粒状マイクロキャ
リア。 - 【請求項４】 ポリリジンがストレプトマイセス属細菌
により生産されたものである請求項１〜３いずれか１項
に記載の細胞培養用粒状マイクロキャリア。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31877399A JP2001128659A (ja) | 1999-11-09 | 1999-11-09 | 細胞培養用粒状マイクロキャリア |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31877399A JP2001128659A (ja) | 1999-11-09 | 1999-11-09 | 細胞培養用粒状マイクロキャリア |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001128659A true JP2001128659A (ja) | 2001-05-15 |
Family
ID=18102794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31877399A Pending JP2001128659A (ja) | 1999-11-09 | 1999-11-09 | 細胞培養用粒状マイクロキャリア |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001128659A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006055157A (ja) * | 2004-07-23 | 2006-03-02 | Chisso Corp | 細胞培養器具及びその製造方法 |
| JP2007020444A (ja) * | 2005-07-14 | 2007-02-01 | Chisso Corp | 細胞培養器具及びその製造方法 |
| US9938378B2 (en) | 2011-04-20 | 2018-04-10 | Spheritech Ltd | Cross-linked poly-E-lysine non-particulate support |
| JP7448143B2 (ja) | 2020-03-31 | 2024-03-12 | Jnc株式会社 | 化学架橋されたε－ポリリジン極細繊維および繊維構造体 |
-
1999
- 1999-11-09 JP JP31877399A patent/JP2001128659A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006055157A (ja) * | 2004-07-23 | 2006-03-02 | Chisso Corp | 細胞培養器具及びその製造方法 |
| JP2007020444A (ja) * | 2005-07-14 | 2007-02-01 | Chisso Corp | 細胞培養器具及びその製造方法 |
| US9938378B2 (en) | 2011-04-20 | 2018-04-10 | Spheritech Ltd | Cross-linked poly-E-lysine non-particulate support |
| US10266652B2 (en) | 2011-04-20 | 2019-04-23 | Spheritech Ltd. | Cross-linked poly-E-lysine non-particulate support |
| JP7448143B2 (ja) | 2020-03-31 | 2024-03-12 | Jnc株式会社 | 化学架橋されたε－ポリリジン極細繊維および繊維構造体 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060711 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090602 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091020 |