CN101137746A - 合成培养基中重组蛋白的生产 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过合成培养基中的真核细胞生产重组蛋白的方法,其中用包含基于多羟基化聚亚烷基亚胺的合成转染剂的组合物转染所述真核细胞。
Description
发明领域
本发明涉及通过合成培养基中的真核细胞生产重组蛋白。
发明背景
真核细胞系统目前用于大规模工业生产重组蛋白。HEK-293和CHO细胞和来源于其的克隆是最常使用的细胞系,且以悬浮形式或贴壁形式进行培养。为满足调控需要,所述生产系统现在必须要避免任何动物来源的化合物。已发展了能够培养HEK-293和CHO的无血清培养基。然而仍然以增殖因子的形式加入蛋白。有利地使用完全合成的培养基,所述培养基的组分已完全确定,即所有组分都是已知的且其中没有一种组分来源于动物。
已开发了有效地在合成培养基例如FreeStyle(InVitrogen)中有效地转染HEK-293细胞的特异性转染剂例如293-Fectin。然而,所述试剂只对针对其发展的培养基有效。
已大量地使用具有广谱性的转染剂,即对于聚乙烯亚胺的PEI。
本发明者现已发现PEI的衍生物作为用于通过任何合成培养基中的真核细胞生产重组蛋白的转染剂特别有效。使用其他聚亚烷基亚胺衍生物特别是聚丙烯亚胺衍生物也已获得相似的结果。
发明内容
因此本发明的目的在于提供用于生产重组蛋白的方法,该方法包括使用这些衍生物。
本发明的方法包括用包含基于多羟基化聚亚烷基亚胺衍生物的合成转染剂的组合物转染真核细胞。
本发明的方法包括基于高度亲水的聚亚烷基亚胺衍生物的转染的组合物。
所述聚亚烷基亚胺衍生物是分支的或线性的。所述聚亚烷基亚胺基团通过例如胺、酯或酰胺连接体连接至任何羟基化衍生物。
优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(缩写为PEI)或聚丙烯亚胺(缩写为PPI)。
有利地,多羟基化结构包含碳水化合物类例如单糖、二糖或寡糖。
所述碳水化合物结构更特别地包含糖例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖或岩藻糖残基。
所述碳水化合物结构还可相应于葡萄糖醛酸酯或酰胺寡聚物。
多羟基化结构可包含羟基化烷基基序例如乙氧基。
优选的转染组合物还包含一种或几种中性聚合物。
聚亚烷基亚胺的分子量(MW)优选地是大约1至1000kDa。
接枝至聚亚烷基亚胺的糖苷链包含1至20个osidic单位。
在优选的转染组合物中,聚亚烷基亚胺的氮残基的羟基化程度超过0.1%。对于例如乙氧基或丙氧基修饰的聚合物,羟基化程度可达到80%或更多。
本发明的方法特别适合用于非贴壁或贴壁细胞的有效和瞬时转染,将所述细胞生长在经改进用于重组蛋白生产的合成培养基中。
将在下面通过包含做为转染剂:糖基化PEI的转染组合物的用途给出和举例说明本发明的其他特征和有利方面。
该试剂在下文中用“TA”表示。
在所述的实例中,将参考图1至5,所述图各表示,
-图1,悬浮在合成培养基中的HEK-293细胞的转染,
-图2,悬浮在各种合成培养基中的CHO细胞的转染,和
-图3至5,悬浮的CHO细胞中的VEGF生产。
糖基化线性PEI缀合物的合成。
如之前由Erbacher P.等人,1999;1:210-222 Transfection andphysical properties of various saccharides,poly(ethyleneglycol),and antibody derivatized polyethylenimines(PEI)所描述,在氰基硼氢化钠存在的情况下通过还原胺化法糖基化PEI。向在0.9ml,pH8.2的0.2M的硼酸盐缓冲剂中的线性PEI(100μmol的单体,jetPEITM,Polyplus-Transfection SAS)中加入S Gene Med.线性四葡萄糖(Glcα4-Glcα4-Glcα6-Glc,Sigma),或线性四半乳糖(Galα3-Galβ4-Galα6-Gal,Dextra Laboratories Ltd)或乳糖(Glcα4-Gal,Sigma)(5μmol)和氰基硼氢化钠(25μmol,Aldrich),然后在持续搅拌下在室温下放置96小时。在0.15M NaCl中的葡聚糖凝胶G25细柱(12.5×450mm,Fluka)上除去低分子量化合物。通过使用间苯二酚/硫酸微量法确定每PEl分子不同糖基结构的接枝程度(表示为每氮糖基基序的百分比),该接枝程度为3-5%。
悬浮细胞的瞬时转染
1.悬浮培养生长条件
·细胞对合成培养基的适应
将HEK-293或CHO细胞培养在合成培养基中,所述合成培养基含有4mM谷氨酰胺、1%PLURONICF-68(10%的溶液),其含有/不含有青霉素/链霉素抗生素。对于50ml合成培养中的细胞适应,将细胞以每ml500000个细胞接种在250ml聚碳酸酯锥形瓶(Erlenmeyer)或摇瓶中的50ml合成培养基中,然后在潮湿的、具有8%CO2的气氛中和在以125rpm进行的轨道恒定的振荡下将其在37℃下温育3-5天。
·用于转染的细胞的制备
在转染前,用新配制的合成培养基洗涤细胞一次,离心沉淀并计数。将细胞以每ml1百万个接种在FreeStyleTM(Invitrogen)培养基中并以3ml的总体积在恒定振荡的条件下在37℃、8%CO2中进行温育。
2.TA/质粒DNA复合物的制备和转染方法
根据所用的合成培养基,转染剂和质粒DNA之间的比例可在每μgDNA1至3μl的范围内变动。为了确定最佳条件,通常推荐检测质粒DNA的两种不同的量。对于一些商购可获得的合成培养基,已最优化了转染剂的量对用于HEK293和CHO细胞的质粒DNA的量。这些最优化的条件概述于表1。关于使用不同的DNA/转染剂比例的转染参见表2。
表1
*用于最优化的一般起始条件
2.1.用于1ml细胞培养物的转染方法
提供了在1ml合成培养基中转染1x106个悬浮细胞的条件。为在更大体积的培养基(1至10ml)中进行转染,必须相应地改变接种的总细胞数目以及转染剂和质粒DNA的量。
用于每ml细胞培养物2μg DNA的转染的方案。
·在50μl合成培养基(无PLURONICF-68和抗生素)中稀释2μg质粒DNA。涡旋10秒钟,然后在室温下温育15分钟。
·在50μl合成培养基(无PLURONICF-68和抗生素)中稀释2μgTA试剂。涡旋10秒钟,然后在室温下温育15分钟。
·向所述50μl质粒DNA溶液中快速和骤然地加入50μlTA溶液
·涡旋10秒钟。
·在室温下温育30分钟,以使复合物形成。
·向1ml细胞悬浮液(密度:1x106个细胞/ml)中加入100μl TA/质粒DNA复合溶液,然后在潮湿的具有8%CO2的气氛中和在以125rpm进行的轨道恒定的振荡下将其在37℃下进行温育(使细胞培养瓶规格(format)适合最终的转染体积。对于1-2ml,使用10ml聚碳酸酯圆底试管,对于3-10ml使用50ml聚碳酸酯圆锥管)。
·通常在转染后48小时观察到最大蛋白产量。
2.2.用于50ml细胞培养物的转染方法
推荐检测两种不同量的质粒DNA:50和100μg(表2)以进行最优化。下列方案适合进行用100μg DNA和100μl TA.转染培养在50ml合成培养基中的50×106个悬浮细胞(1×106细胞/ml)。
·在2.5ml合成培养基(无PLURONICF-68和抗生素)中稀释100μg质粒DNA。涡旋10秒钟,然后在室温下放置15分钟。
·在2.4ml合成培养基(无PLURONICF-68和抗生素)中稀释100μgTA。涡旋10秒钟,然后在室温下温育15分钟。
·向2.5μl质粒DNA溶液中快速和骤然地加入2.5ml TA溶液。
·立即用涡旋器混合10秒钟。
·在室温下温育30分钟,以使复合物形成。
·向250ml摇瓶(聚碳酸酯Er1enmeyer烧瓶)中的50ml细胞悬浮液(密度:1×106个细胞/ml)加入5ml TA/质粒DNA复合溶液,然后在潮湿的具有8%CO2的气氛中和在以125rpm进行的轨道恒定的振荡下将其在37℃下进行温育。
·通常在转染后48小时发现最大的蛋白产量。
为在更大体积的培养基中进行转染,必须相应地改变用于接种的总细胞数目以及转染剂和质粒DNA的量。
表2
DNA的量 | DNA/TA的比例 | TA试剂的体积(μl) | 用于TA和DNA稀释的培养基体积 | 复合物的总体积 | 细胞培养物的终体积 |
50μg | 1/1 | 50 | 2.5ml | 5ml | 50ml |
1/3 | 150 | 2.5ml | 5ml | 50ml | |
100μg | 1/1 | 100 | 2.5ml | 5ml | 50ml |
1/3 | 300 | 2.5ml | 5ml | 50ml | |
1mg | 1/1 | 1ml | 15ml | 30ml | 500ml |
1/3 | 3ml | 15ml | 30ml | 500ml |
贴壁细胞的瞬时转染
1.细胞接种
为了使用TA的最佳转染条件,细胞应当为50-60%的融合。一般地,对于在24孔板中的转染,在转染前24小时,每孔接种50000个细胞。对于其他培养形式,关于转染前一天接种的细胞的推荐数目参考表3。
表3提供了用于不同细胞培养形式的复合物的制备。
Table3
培养瓶 | 接种的细胞数目 | 质粒DNA的量(μg) | 用于TA和DNA稀释的培养基的量 | TA试剂的体积(μl)(比例1/1) | 每孔复合物的总体积 | 培养基的总体积 |
24孔 | 50000 | 2 | 50μl | 2 | 100μl | 1ml |
12孔 | 100000 | 4 | 50μl | 4 | 100μl | 2ml |
6孔/35mm | 200000 | 8 | 100μl | 8 | 200μl | 4ml |
10cm | 1000000 | 25至40 | 500μl | 25-40 | 1000μl | 20ml |
14cm/153cm2 | 4×106-107 | 50至100 | 2ml | 50至100 | 4ml | 40ml |
多碟630cm2 | 107-4×107 | 300至500 | 20ml | 300至500 | 40ml | 200ml* |
*转染后2至4小时,加入合成培养基至400ml
2.TA/DNA复合物的制备和转染方法
2.1.用于1ml细胞培养物的转染方法
提供了用于在24孔组织培养板中进行转染的下列方案,关于在其他培养形式中的转染参考表3。提供了用于在1ml合成培养基中转染50000个细胞的条件。在最优化过程中,我们推荐测试质粒DNA的两种不同的量:2和1μg。准备用于2μg DNA转染的下列方案。
·在50μl合成培养基(无PLURONICF-68和抗生素)中稀释2μg质粒DNA。涡旋10秒钟,然后在室温下放置15分钟。
·在50μl合成培养基(无PLURONICF-68和抗生素)中稀释2μlTA。涡旋10秒钟,然后在室温下温育15分钟。
·向50μl质粒DNA溶液中快速且骤然地加入50μl TA溶液。
·立即用涡旋器混合10秒钟。
·在室温下温育30分钟,以使复合物形成。
·在各小孔中逐滴加入100μl TA/质粒DNA复合物溶液,然后通过温和地回荡该板使混合物均匀化。
·在37℃下在潮湿的具有5或8%的CO2的气氛中进行温育。
·通常在24至48小时后停止转染实验并估量蛋白质的表达。
悬浮在合成培养基中的非贴壁HEK-293细胞的转染。
以每毫升1百万个细胞将细胞接种在FreeStyleTM(Invitrogen)培养基中,然后以3ml的总体积在恒定的振荡下,在37℃,8%CO2的条件下进行温育。用6μg质粒DNA(pCMVLuc)和6μl PEI-Glc4(线性四葡萄糖基PEI衍生物)转染细胞。按照厂商的推荐使用293FectinTM(获自Invitrogen)和jetPEITM(线性聚乙烯亚胺,购自Polyplus-Transfection)转染细胞。转染后24小时定量荧光素酶蛋白含量(荧光素酶的ng)。各转柒重复进行三次。
在图1中给出了结果。
使用PEI-Glc4获得的荧光素酶水平几乎不比使用未修饰的线性聚乙烯亚胺(jetPEITM)获得的水平高,且也有利地与使用293-FectinTM(特别地设计用于该蛋白的生产应用)获得的水平相差无几。
悬浮在各种合成培养基中的非贴壁CHO细胞的转染。
以每毫升1百万个细胞将细胞接种在CD-CHO(Invitrogen)、ProCHOTM-4(Cambrex)或CHOExpress(PAA Laboratories)培养基中,然后以3ml的总体积在恒定的振荡下在37℃,8%CO2下进行温育。用6μg pCMVluc DNA和18μl PEI-Glc4或30μl LipoFectAmine2000(LipoFect,Invitrogen)转染细胞。在转染后24小时测定荧光素酶的表达(RLU)。各实验重复进行三次。
在图2中给出了结果,该结果显示与LipofectAmine2000相比,PEI-Glc4在转染中更有效。
在50ml的总体积中,以每毫升1百万个细胞将细胞接种在ProCHOTM-4(Cambrex)培养基中,然后在恒定的振荡下在37℃,8%CO2下进行温育。用2μg/ml pCMVhVEGF165DNA(编码人血管生长因子)和每μg DNA 3μl PEI-Glc4转染细胞。在转染后的不同时间通过ELISA定量产生的VEGF蛋白的量。各定量重复进行三次。
在图3中提供了结果。分泌的VEGF的定量显示了许多天内持续的生产,肯定了PEI-Glc4用于治疗目的的蛋白生产的潜力。
在其他实验中,
在3或50或500ml的不同总体积中,以每毫升1百万个细胞将细胞接种在ProCHOTM-4(Cambrex)培养基中,然后在恒定的振荡下在37℃,8%CO2下进行温育。用2μg/ml pCMVhVEGF165DNA(编码人血管生长因子)和每μg DNA 3μl PEI-Glc4转染细胞。在转染后不同时间通过ELISA定量产生的VEGF蛋白的量。各定量重复进行三次。
在图4中给出了结果,该结果显示PEI-Glc4非常适合在不同体积的生物反应器中用于蛋白的扩大生产而不影响其转染性质。
在其他实验中,
在50ml的总体积中,以每毫升1百万个细胞将细胞接种在ProCHOTM-4(Cambrex)培养基中,然后在恒定的振荡下在37℃,8%CO2下进行温育。用2μg/ml pCMVhVEGF165DNA(编码人血管生长因子)和每μg DNA 3μl PEI-Glc4或jetPEITM转染细胞。在转染后第5天通过ELISA定量产生的VEGF蛋白的量。各定量重复进行三次。
在图5中给出了结果。提供了在合成ProCHOTM-4培养基中用PEI-G1c4衍生物和线性PEI(jetPEITM)转染的非贴壁CHO细胞之间的比较。结果显示与用PEI-Glc4获得的水平相比,使用未修饰的线性PEI转染获得的VEGF产量的水平非常低。
表4给出在3ml合成培养基中转染非贴壁CHO细胞后两天,细胞密度对VEGF产量的影响。对于各转染剂使用2μg/ml pCMVLuc质粒和使用3μl/μgDNA进行转染。通过ELISA确定VEGF的量。重复进行各实验三次。
表4
转染剂 | 合成培养基 | 细胞密度 | DNA的量 | VEGF/10*6细胞/ml的ng |
PEI-G1c4 | CDCHO | 10*6/ml | 2μg/ml | 72 |
2.10*6/ml | 2μg/ml | 123 | ||
3.10*6/ml | 2μg/ml | 19 | ||
PEI-G1c4 | ProCH04 | 10*6/ml | 2μg/ml | 1082 |
2.10*6/ml | 2μg/ml | 276 | ||
3.10*6/ml | 2μg/ml | 243 |
表4提供了当使用TA时非贴壁CHO细胞的转染条件的最优化的实例。结果显示适合高密度细胞培养(>500,000个细胞/ml)的转染条件通常用于重组蛋白生产方法。
表5给出了在3ml ProCHO-4培养基中接枝至线性PEI的糖基基序对非贴壁CHO细胞的转染功效的影响。对于各转染剂,使用2μg/mlpCMVLuc质粒和3μl/μg DNA进行转染。在转染后48小时确定荧光素酶活性。重复进行各实验三次。
表5
转染剂 | 糖基基序 | RLU/mg蛋白 | SD |
线性PEI(jetPEITM) | 无 | 3.37E+4 | 2.15E+3 |
PEI-G1c4 | Glcα4-Glcα4-Glcα6-Glc | 1.40E+7 | 5.15E+5 |
PEI-Ga14 | Galα3-Galβ4-Galα6-Gal | 2.45E+7 | 7.57E+5 |
PEI-Lact | Glcα4-Gal | 1.86E+8 | 5.26E+6 |
BPEI-Etox80% | 无 | 1.60E+6 | 3.25E+4 |
表5提供了在使用线性PEI的各种糖基化衍生物进行的pCMVLuc质粒的瞬时转染后,在ProCHOTM-4培养基中的非贴壁CHO细胞中产生的荧光素酶蛋白的活性水平。接枝在线性PEI上的糖基基序的结构可以是不同的但不会极大地影响蛋白产量的总体水平。区分糖基基序例如葡萄糖基或半乳糖残基的osidic性质对由转染产生的重组蛋白的水平没有重大影响。事实上,所有线性PEI的糖基衍生物比未修饰的线性PEI更有效。
Claims (11)
1.用于通过合成培养基中的真核细胞生产重组蛋白的方法,其中用包含基于多羟基化聚亚烷基亚胺的合成转染剂的组合物转染所述真核细胞
2.权利要求1的方法,其中所述聚亚烷基亚胺衍生物是分支的或线性的。
3.权利要求1或2的方法,其中所述聚亚烷基亚胺基通过例如胺、酯或酰胺连接体连接至任何羟基化衍生物。
4.权利要求1的方法,其中所述聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(PEI)或聚丙烯亚胺(PPI)。
5.权利要求1至3中任一项的方法,其中所述多羟基化结构包含碳水化合物例如单糖、二糖或寡糖。
6.权利要求1至3中任一项的方法,其中所述碳水化合物结构包含糖例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖或岩藻糖残基。
7.权利要求1至3中任一项的方法,其中所述碳水化合物结构对应于葡糖醛酸酯或酰胺寡聚体。
8.权利要求1至3中任一项的方法,其中多羟基化结构包含羟基化的烷基基序例如乙氧基。
9.权利要求1至7中任一项的方法,其中所述转染组合物还包含一种或几种中性聚合物。
10.权利要求1至9中任一项的方法,其中所述聚亚烷基亚胺的分子量是1至1000kDa。
11.权利要求1至10中任一项的方法,其中所述聚亚烷基亚胺的氮残基的多羟基化程度超过0.1%。
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