KR20070104452A - 합성 배지에서의 재조합 단백질의 생성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 합성 배양 배지 중에서 폴리하이드록실화 폴리알킬렌이민계 합성 형질감염 시약을 포함하는 조성물로 형질 감염된 진핵 세포를 이용하여 재조합 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

합성 배지에서의 재조합 단백질의 생성 방법{PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS IN SYNTHETIC MEDIUM}
본 발명은 합성 배양 배지 중에서 진핵 세포를 이용한 재조합 단백질의 생성에 관한 것이다.
진핵 세포계는 최근 재조합 단백질의 대규모 공업 생산에 사용되고 있다. HEK-293 및 CHO 세포, 및 이들로부터 유도된 클론은 가장 통상적으로 이용되는 세포주이며 현탁액으로 또는 부착 형태로 배양된다. 조절 조건을 충족하기 위해서, 생성 시스템에는 어떤 동물 기원의 화합물도 없어야 한다. 그래서, HEK-293 및 CHO를 배양할 수 있는 혈청 무함유 배양 배지가 개발되었다. 하지만 단백질은 여전히 증식 인자로서 첨가되었다. 조성이 완전히 규명된 전적으로 합성한 배양 배지, 즉 모든 성분이 알려져 있고 이중 어떤 성분도 동물 기원의 것이 아닌 배양 배지를 사용하는 것이 유리하다.
FreeStyle (Invitrogen사)과 같은 합성 배지 중에서 HEK-293 세포를 특이적으로 형질감염시키는 293-Fectin® 등의 특이적 형질감염제가 개발되었다. 하지만, 상기 제제는 이들을 개발한 배양 배지에만 효과적이다.
보다 넓은 스펙트럼을 갖는 형질감염제로는 폴리에틸렌이민, 즉 PEI가 광범 위하게 사용되고 있다.
본 발명자들은 임의의 합성 배지 중에서 진핵 세포에 의한 재조합 단백질의 생성시 PEI의 유도체가 형질감염제로서 특히 효과적이었다는 것을 밝혀내었다. 또한 다른 폴리알킬렌이민 유도체, 특히 폴리프로필렌이민 유도체로 유사한 결과를 얻었다.
따라서 본 발명은 그러한 유도체의 사용을 포함하는 재조합 단백질의 신규한 생성 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 폴리하이드록실화 폴리알킬렌이민 유도체계 합성 형질감염 시약을 포함하는 조성물로 진핵 세포를 형질감염시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 상당히 친수성인 폴리알킬렌이민 유도체계 형질감염 조성물을 포함한다.
상기 폴리알킬렌이민 유도체는 분지형 또는 선형이다. 상기 폴리알킬렌이민기는 예를 들어 아민, 에스테르 또는 아미드 링커를 통해 임의의 하이드록실화 유도체에 결합한다.
바람직한 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 (약자로 PEI) 또는 폴리프로필렌이민 (약자로 PPI)이다.
유리하게도 폴리하이드록실화 구조는 탄수화물, 예컨대 단당류, 이당류 또는 올리고당류를 포함한다.
더욱 자세하게는 탄수화물 구조는 당류, 예컨대 글루코스, 만노스, 갈락토스 또는 푸코스 잔기를 포함한다.
또한 탄수화물 구조는 글루쿠론산 에스테르 또는 아미드 소중합체에 상응할 수 있다.
폴리하이드록실화 구조는 하이드록실화 알킬 모티프, 예컨대 에톡실기를 포함할 수 있다.
바람직한 형질감염 조성물은 하나 또는 수개의 중성 중합체를 더 포함한다.
폴리알킬렌이민의 분자량(MW)은 약 1∼1000 kDa가 바람직하다.
폴리알킬렌이민에 그래프트된 글루코시드 사슬은 1∼20개의 오시드 단위를 포함한다.
바람직한 형질감염 조성물에 있어서, 폴리알킬렌이민의 질소 잔기의 하이드록실화 정도는 0.1 %보다 크다. 하이드록실화 정도는 예를 들어 에톡시 또는 프로폭시 변형 중합체의 최대 80 % 이상에 이를 수 있다.
본 발명의 방법은 재조합 단백질의 생성에 맞춘 합성 배지에서 성장하는 비부착성 또는 부착성 세포의 효과적이면서 일시적인 형질감염에 특히 유용하다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 하기에 제시되고 형질감염제로서 글리코실화 PEI를 포함하는 형질감염 조성물의 사용에 의해 예시될 것이다.
이 제제는 이하 "TA"로 표시될 것이다.
실시예에 언급된 것이 각각 도시한 도 1 내지 도 5를 나타낼 것이다.
도 1, 합성 배지에서 현탁액 형태의 HEK-293 세포의 형질감염.
도 2, 다양한 합성 배지에서 현탁액 형태의 CHO 세포의 형질감염, 및
도 3 내지 도 5, 현탁액 형태의 CHO 세포에서의 VEGF 생성.
글리코실화 선형 PEI 접합체의 합성
PEI는 종래 문헌[Erbacher P. et al., 1999; 1:210-222 Transfection and physical properties of various saccharides, poly(ethylene glycol), and antibody derivatized polyethylenimines (PEI), S Gene Med]에 의해 기술된 바와 같이 나트륨 시아노보로하이드리드의 존재하에서 환원성 아민화 절차에 의해 글리코실화시켰다. 선형 테트라글루코스 (Glcα4-Glcα4-Glcα6-Glc, Sigma사), 또는 선형 테트라갈락토스 (Galα3-Galβ4-Galα6-Gal, Dextra Laboratories Ltd), 또는 락토스 (Glcα4-Gal, Sigma사) (5 μmol) 및 나트륨 시아노보로하이드리드 (25 μmol, Aldrich사)를 pH 8.2의 0.2 M 붕산염 완충액 0.9 ㎖ 중 선형 PEI (단량체 100 μmol, jetPEITM, Polyplus-Transfection SAS사)에 첨가하였고, 실온의 일정한 교반 하에서 96시간 동안 두었다. 0.15 M NaCl 중 Sephadex-G25 미세 컬럼 (12.5 x 450 mm, Fluka사) 상에서 저 분자량 화합물을 제거하였다. 레조르시놀산/황산 측미법을 사용하여 질소 당 글리코실 모티프의 백분율로서 표시되는, PEI 분자 당 상이한 글리코실 구조의 그래프팅 정도를 측정하였고 이는 3∼5 %였다.
현탁 세포의 일시적 형질감염
1. 현탁액 배양 성장 조건
· 합성 배지에의 세포 적응
HEK-293 또는 CHO 세포는 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 포함하거나/포함하지 않은 1 % PLURONIC® F-68 (10 % 용액), 4 mM 글루타민을 포함하는 합성 배지 중에서 성장한다. 합성 배지 50 ㎖ 중에서의 세포 적응을 위해, 250 ㎖ 폴리카르보네이트 Erlenmeyer 플라스크 또는 진탕 플라스크 내에서 합성 배지 50 ㎖에 1 ㎖ 당 500 000개의 세포를 접종하고, 37℃, 8 % CO2의 가습 대기에서 125 rpm의 일정한 궤도 진탕 하에서 3∼5일 동안 항온 처리한다.
· 형질감염용 세포의 제조
형질감염 전, 신선한 합성 배지로 세포를 1회 세척하고, 회전시킨 후 계수한다. FreeStyleTM (Invitrogen사) 배지 1 ㎖ 당 백만개의 세포를 접종하고 37℃, 8 % CO2에서 일정한 진탕 하에 최종 부피 3 ㎖을 항온 처리한다.
2. TA/플라스미드 DNA 복합체의 제조 및 형질감염 절차
사용된 합성 배지에 따르면, 형질감염제 및 플라스미드 DNA의 비율은 DNA 1 μg 당 1∼3 ㎕로 달라질 수 있다. 통상 2개의 상이한 양의 플라스미드 DNA를 테스트하여 최적 조건을 결정하기를 권장한다. 형질감염 시약의 양 대 HEK 293 및 CHO 세포의 플라스미드 DNA 양은 일부 시판되는 합성 배양 배지에 대하여 최적화되었다. 이러한 최적 조건은 표 1에 요약되어 있다. 상이한 DNA/형질감염제 비율의 형질감염에 대해서는 표 2 참조.
Figure 112007064021116-PCT00001
2. 1. 세포 배양물 1 ㎖에 대한 형질감염 절차
합성 배지 1 ㎖ 중에서 1 x 106개 현탁 세포의 형질감염에 대한 조건이 주어진다. 거대 부피의 배지 (1∼10 ㎖) 중에서 형질감염을 실시하기 위해, 형질감염 시약 및 플라스미드 DNA의 양과 접종할 총 세포수를 비례하게 변화시켜야 한다.
세포 배양물 1 ㎖ 당 DNA 2 μg의 형질감염에 대한 프로토콜
* (PLURONIC® F-68 및 항생제를 함유하지 않는) 합성 배지 50 ㎕ 중에 플라스미드 DNA 2 μg를 희석시킨다. 10초간 보텍스하고 15분간 실온에서 항온 처리한다.
* (PLURONIC® F-68 및 항생제를 함유하지 않는) 합성 배지 50 ㎕ 중에 TA 시약 2 ㎕를 희석시킨다. 10초간 보텍스하고 15분간 실온에서 항온 처리한다.
* TA 용액 50 ㎕를 플라스미드 DNA 용액 50 ㎕에 빠르게 한번에 모두 첨가한다.
* 10초간 보텍스한다.
* 실온에서 30분간 항온 처리하여 복합체를 형성한다.
* TA/플라스미드 DNA 복합체 용액 100 ㎕를 세포 현탁액 1 ㎖ (농도: 1 x 106 세포/㎖)에 첨가하고 37℃, 8 % CO2의 가습 대기 중에서 125 rpm의 일정한 궤도 진탕 하에서 항온 처리한다(세포 배양 용기 형태를 최종 형질감염 부피에 맞춤. 1∼2 ㎖의 경우, 10 ㎖ 폴리카르보네이트 둥근 바닥 튜브 사용, 3∼10 ㎖의 경우, 50 ㎖ 폴리카르보네이트 원뿔형 튜브 사용).
* 최대 단백질 생성은 통상 형질감염 48 시간 후 관찰된다.
2. 2. 세포 배양물 50 ㎖에 대한 형질감염 절차
최적화를 위해 플라스미드 DNA의 2개의 상이한 양(50 및 100 μg)(표 2)으로 테스트하기를 권장한다. 다음의 프로토콜은 DNA 100 μg 및 TA 100 ㎕를 포함한 합성 배지 (1 x 106 세포/㎖) 50 ㎖에서 성장한 50 x 106개의 현탁 세포의 형질감염에 맞춘 것이다.
* (PLURONIC® F-68 및 항생제를 함유하지 않는) 합성 배지 2.5 ㎖ 중에 플라스미드 DNA 100 μg를 희석시킨다. 10초간 보텍스하고 15분간 실온에서 정치한다.
* (PLURONIC® F-68 및 항생제를 함유하지 않는) 합성 배지 2.4 ㎖ 중에 TA 100 ㎕를 희석시킨다. 10초간 보텍스하고 15분간 실온에서 항온 처리한다.
* TA 용액 2.5 ㎖를 플라스미드 DNA 용액 2.5 ㎖에 빠르게 한번에 모두 첨가한다.
* 10초간 보텍스하여 즉시 혼합한다.
* 실온에서 30분간 항온 처리하여 복합체를 형성한다.
* 250 ㎖ 진탕 플라스크 (폴리카르보네이트 Erlenmeyer 플라스크) 중에서 TA/플라스미드 DNA 복합체 용액 5 ㎖를 세포 현탁액 50 ㎖ (농도: 1 x 106 세포/㎖)에 첨가하고 37℃, 8 % CO2의 가습 대기에서 125 rpm의 일정한 궤도 진탕 하에서 항온 처리한다.
* 최대 단백질 생성은 통상 형질감염 48 시간 후 발견된다.
거대 부피의 배지 중에서 형질감염을 실시하기 위해, 형질감염 시약 및 플라스미드 DNA의 양과 접종할 총 세포수를 비례하게 변화시켜야 한다.
Figure 112007064021116-PCT00002
부착 세포의 일시적 형질감염
1. 세포 접종
TA를 이용한 최적의 형질감염 조건의 경우, 세포는 50∼60 %가 융합되어야 한다. 통상적으로, 24-웰 평판 내의 형질감염의 경우, 형질감염 24시간 전에 웰당 50 000개의 세포를 접종한다. 다른 배양 형태의 경우에는 표 3에 제시한 권장 세포수를 형질감염 하루 전에 접종한다.
표 3은 상이한 세포 배양 형태에 대한 복합체 제조를 설명한다.
Figure 112007064021116-PCT00003
2. TA/DNA 복합체의 제조 및 형질감염 절차
2. 1. 세포 배양물 1 ㎖에 대한 형질감염 절차
다음의 프로토콜은 24-웰 조직 평판 중에서의 형질감염을 위해 주어지는데, 다른 배양 형태의 형질감염은 표 3에 제시된다. 합성 배지 1 ㎖ 중에서 50 000개의 세포의 형질감염을 위한 조건이다. 최적화하는 동안 본 발명자들은 2개의 상이한 플라스미드 DNA의 양(2 및 1 μg)으로 테스트할 것을 권장한다. 다음의 프로토콜은 DNA 2 μg의 형질감염용 제조법이다.
* (PLURONIC® F-68 및 항생제를 함유하지 않는) 합성 배지 50 ㎕ 중 플라스미드 DNA 2 μg를 희석시킨다. 10초간 보텍스하고 15분간 실온에서 정치한다.
* (PLURONIC® F-68 및 항생제를 함유하지 않는) 합성 배지 50 ㎕ 중 TA 2 ㎕를 희석시킨다. 10초간 보텍스하고 15분간 실온에서 항온 처리한다.
* TA 용액 50 ㎕를 플라스미드 DNA 용액 50 ㎕에 빠르게 한번에 모두 첨가한다.
* 10초간 보텍스하여 즉시 혼합한다.
* 실온에서 30분간 항온 처리하여 복합체를 형성한다.
* TA/플라스미드 DNA 복합체 용액 100 ㎕를 각 웰에 적하하고 평판을 천천히 흔들어 혼합물을 균질화한다.
* 37℃의 5 또는 8 % CO2의 가습 대기 중에서 항온 처리한다.
* 형질감염 실험은 통상 24 내지 48시간 후에 종료하고 단백질 발현 정도를 평가한다.
합성 배지에서 현탁액 형태의 비부착성 HEK-293 세포의 형질감염
FreeStyleTM (Invitrogen사) 배지 1 ㎖ 당 백만개의 세포를 접종하고 37℃, 8 % CO2에서의 일정한 진탕 하에서 최종 부피 3 ㎖을 항온 처리한다. 플라스미드 DNA (pCMVLuc) 6 μg 및 PEI-Glc4 (선형 테트라글루코실 PEI 유도체) 6 ㎕로 세포를 형질감염시켰다. 제조자의 권장에 따라 293FectinTM (Invitrogen사) 및 jetPEITM (선형 폴리에틸렌이민, Polyplus-Transfection사)을 사용하였다. 형질감염 24시간 후 루시퍼라제 단백질 함량 (루시퍼라제 ng)을 정량하였다. 각 형질감염을 3회 반복 실시하였다.
상기 결과를 도 1에 도시한다.
PEI-Glc4로 얻은 루시퍼라제 농도는 비변형된 선형 폴리에틸렌이민 (jetPEITM)으로 얻은 농도보다 상당히 높았고, 특히 이러한 단백질의 생성을 위해 제작된 293-FectinTM으로 얻은 농도와 비교하였을 때도 더 높았다.
다양한 합성 배지에서 현탁액 형태의 비부착성 CHO 세포의 형질감염
CD-CHO (Invitrogen사), ProCHOTM-4 (Cambrex사) 또는 CHOExpress (PAA Laboratories사) 배지 1 ㎖ 당 백만개의 세포를 접종하였고 37℃, 8 % CO2에서의 일정한 진탕 하에서 최종 부피 3 ㎖을 항온 처리하였다. pCMVluc DNA 6 μg 및 PEI-Glc4 18 ㎕ 또는 LipoFectAmine2000 (LipoFect, Invitrogen사) 30 ㎕로 세포를 형질감염시켰다. 루시퍼라제 발현 (RLU)은 형질감염 24시간 후 분석하였다. 각 실험을 3회 반복 실시하였다.
결과를 도 2에 도시하였고 LipofectAmine2000과 비교하였을 때 PEI-Glc4가 더욱 효과적임을 제시한다.
총 부피 50 ㎖ 중 ProCHOTM-4 (Cambrex사) 배지 1 ㎖ 당 백만개의 세포를 접종하였고 37℃, 8 % CO2에서의 일정한 진탕 하에서 항온 처리하였다. DNA 1 μg 당 (인간 혈관 성장 인자를 암호화하는) pCMVh VEGF165 DNA 2 μg/㎖ 및 PEI- Glc4 3 ㎕로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 상이한 시간에 ELISA를 이용하여 생성된 VEGF 단백질의 양을 정량하였다. 각 정량을 3회 반복 실시하였다.
결과를 도 3에 도시한다. 분비된 VEGF의 정량 분석 결과 수일에 걸쳐 지속적 생성을 제시하고, 치료적 관심사의 단백질 생성을 위해서 PEI-Glc4의 적용 효과를 확인한다.
기타 실험에 있어서,
상이한 총 부피 3 또는 50 ㎖, 또는 500 ㎖의 ProCHOTM-4 (Cambrex사) 배지 1 ㎖ 당 백만개의 세포를 접종하였고 37℃, 8 % CO2에서의 일정한 진탕 하에서 항온 처리하였다. DNA 1 μg 당 (인간 혈관 성장 인자를 암호화하는) pCMVhVEGF165 DNA 2 μg/㎖ 및 PEI-Glc4 3 ㎕로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 상이한 시간에 ELISA를 이용하여 생성된 VEGF 단백질의 양을 정량하였다. 각 정량을 3회 반복 실시한다.
결과는 도 4에 도시되어 있으며, 이 결과는 PEI-Glc4가 형질감염 특성에 영향을 미지치 않으면서 바이오반응기의 상이한 부피에 있어서 단백질 생성의 규모를 증가시키는데 적합하다는 것을 제시한다.
기타 실험에 있어서,
총 부피 50 ㎖의 ProCHOTM-4 (Cambrex사) 배지 1 ㎖ 당 백만개의 세포를 접종하였고 37℃, 8 % CO2에서의 일정한 진탕 하에서 항온 처리하였다. DNA 1 μg 당 (인간 혈관 성장 인자를 암호화하는) pCMVhVEGF165 DNA 2 μg/㎖ 및 PEI-Glc4 또는 jetPEITM 3 ㎕로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후에 ELISA를 이용하여 생성된 VEGF 단백질의 양을 정량하였다. 각 정량을 3회 반복 실시한다.
결과는 도 5에 도시한다. PEI-Glc4 유도체 및 선형 PEI (jetPEITM)로 형질감염된 합성 ProCHOTM-4 배지 내의 비부착성 CHO 세포의 비교 결과를 제시한다. 결과는 PEI-Glc4로 얻어진 농도와 비교하였을 때 비변형된 선형 PEI로 형질감염시키면 VEGF 생성 농도가 매우 낮음을 제시한다.
표 4는 합성 배지 3 ㎖ 중의 비부착성 CHO 세포를 형질감염시킨 2일 후에 VEGF의 생성에 대한 세포 농도의 효과를 제시한다. 각 형질감염 시약에 대해 pCMVLuc 플라스미드 2 μg/㎖ 및 DNA 3 ㎕/μg을 사용하여 형질감염을 실시하였다. ELISA를 이용하여 VEGF 양을 측정하였다. 각 실험은 3회 반복 실시한다.
Figure 112007064021116-PCT00004
표 4는, TA가 사용되었을 때 비부착성 CHO 세포의 형질감염 조건이 최적화된 예를 제시한다. 결과는 재조합 단백질 생성 과정에 일반적으로 적용되는 고농도 세포 배양 (> 500,000 세포/㎖)에 맞춰진 형질감염 조건을 제시한다.
표 5는 ProCHO-4 배지 3 ㎖ 중 비부착성 CHO 세포의 형질감염 효율에 대한 선형 PEI에 그래프트된 글리코실 모티프의 효과를 제시한다. 각 형질감염 시약에 대해 pCMVLuc 플라스미드 2 μg/㎖ 및 DNA 3 ㎕/μg을 사용하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 48시간 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 각 실험은 3회 반복 실시한다.
Figure 112007064021116-PCT00005
표 5는 선형 PEI의 다양한 글리코실화 유도체를 사용하여 pCMVLuc 플라스미드의 일시적 형질감염 후 ProCHOTM-4 배지 중에서 비부착성 CHO 세포에서 생성된 루시퍼라제 단백질의 활성 농도를 제시한다. 선형 PEI 상에 그래프트된 글리코실 모티프의 구조는 상이할 수 있지만 단백질 생성의 전체적인 농도에 큰 영향을 주지 않는다. 글리코실 모티프, 예컨대 글루코실 또는 갈락토실 잔기를 확인하는 오시드 성질은 형질감염에 의해 생성된 재조합 단백질 농도에 주요한 효과를 갖지 않는다. 실제로 모든 선형 PEI의 글리코실 유도체는 비변형된 선형 PEI보다 더욱 효과적이다.

Claims (11)

  1. 합성 배양 배지 중에서 폴리하이드록실화 폴리알킬렌이민계 합성 형질감염 시약을 포함하는 조성물로 형질감염된 진핵 세포를 이용하여 재조합 단백질을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리알킬렌이민 유도체는 분지형 또는 선형인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리알킬렌이민기는 예를 들어 아민, 에스테르 또는 아미드 링커를 통해 임의의 하이드록실화 유도체에 결합되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 (PEI) 또는 폴리프로필렌이민 (PPI)인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리하이드록실화 구조는 탄수화물, 예컨대 단당류, 이당류 또는 올리고당류를 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 탄수화물 구조는 당류, 예컨대 글루코스, 만노스, 갈락토스 또는 푸코스 잔기를 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 탄수화물 구조는 글루쿠론산 에스테르 또는 아미드 소중합체에 상응하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리하이드록실화 구조는 하이드록실화 알킬 모티프, 예컨대 에톡실기를 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 형질감염 조성물은 하나 또는 수개의 중성 중합체를 더 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리알킬렌이민의 분자량(MW)은 1∼1000 kDa인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리알킬렌이민의 질소 잔기의 폴리하이드록실화 정도는 0.1 %보다 큰 방법.
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