MX2007008982A - Conjugados de proteinas biologicamente activas que tienen una vida media modificada in vivo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a conjugados de proteinas biologicamente activas, que comprenden un polipeptido biologicamente activo acoplado via un enlace peptidico a un polipeptido, que comprende desde 2 hasta aproximadamente 500 unidades de una porcion peptidica de repeticion, en donde el conjugado de proteina biologicamente activa, exhibe una vida media de plasma modificada, comparada con la vida media intrinseca del polipeptido o proteina biologicamente activa no conjugada. Tambien se describen metodos para elaborar y usar las proteinas conjugadas, asi como tambien metodos para determinar si un conjugado dado exhibe una vida media modificada, con relacion a la vida intrinseca del polipeptido no conjugado.

Description

CONJUGADOS DE PROTEÍNAS BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS QUE TIENEN UNA VIDA MEDIA MODIFICADA IN VIVO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en general, a proteínas biológicamente activas, y más específicamente, para alterar la vida media de las proteínas biológicamente activas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas biológicamente activas, a menudo tienen vidas medias indeseables cuando se administran como terapéuticos humanos. Sus vidas medias intrínsecas, imponen programas de administración y regímenes de dosificación que a menudo, resultan en menos que una eficacia terapéutica, problemas de cumplimiento e inconveniencia al paciente. En la manufactura de proteínas biológicamente activas para terapéuticos humanos, la extensión de la vida media de las proteínas biológicamente activas ha sido intentada a través de medios físicos (por ejemplo, ruta de administración alterada, encapsulación de nanoparticulas y atrapamiento liposomal), modificación química (por ejemplo, emulsiones, pegilación e hiperglicosilación) y modificación genética (por ejemplo, modificación de la estructura de proteina primaria, marcas de polímeros, fusión de albúmina de suero humano, incorporación de modificación post- traduccional . Véase por ejemplo, Lord, et al . , Clin. Cáncer Res. 7:2085-2090 (2001), y van Der Auwera, et al . , Am. J. Hematol. 56:245-251 (2001). Sin embargo, tales procedimientos han resultado en otros problemas. La extensión de vida media de proteína biológicamente activa a través de medios físicos a menudo, introduce complejidad de sustancia de fármaco incrementada con procesos corriente abajo adicionales costosos y que consumen tiempo, durante la manufacturación. La modificación química puede alterar la actividad biológica o perfil de seguridad de la proteína biológicamente activa. En donde las proteínas biológicamente activas se elaboran vía metodología de síntesis de ADN recombinante, el efecto de la modificación genética en la proteína proporciona rendimiento y pureza en las emisiones de sistemas de expresión celular particular, necesita ser valorado para su uso propuesto. Por consiguiente, existe una necesidad de otros procedimientos para modificar la vida media intrínseca de las proteínas biológicamente activas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención se dirige a un conjugado de proteína que comprende un polipéptido biológicamente activo acoplado via un enlace peptídico, a un polipéptido (extensión de aminoácido) que comprende desde 2 hasta aproximadamente 500 unidades de repetición de una porción peptídica. La porción comprende un constituyente principal y un constituyente secundario, en el cual, el constituyente principal es de dos o más residuos de un aminoácido seleccionado de Gly (G) , Asn (N) y Gln (Q) , y el constituyente secundario es uno o más residuos de un aminoácido seleccionado de Ala (A), Ser (S), Thr (T), Asp (D), Gln (Q) , Glu (E) , His (H) y Asn (N) , con la condición de que uno de los aminoácidos está presente en tanto el constituyente principal como dicho constituyente secundario, en donde la vida media del plasma del conjugado es modificada con relación a la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado. El término "modificado" como se usa en este documento, se refiere a una vida media incrementada o reducida con relación a la vida media del plasma del polipéptido o proteina misma biológicamente activa no conjugada (es decir, la vida media intrínseca) . Por la frase "vida media intrínseca", significa la vida media del polipéptido biológicamente activo nativo o la vida media del polipéptido en forma no conjugada (de este modo, que incluye formas recombinantes del polipéptido nativo) . En algunas modalidades, la porción peptídica comprende 3-6 residuos de aminoácido (es decir, 3, 5, 5, ó 6) . En algunas modalidades, en donde la porción peptidica contiene 5 ó 6 residuos de aminoácido, el constituyente secundario comprende 1 residuo de aminoácido de dicho péptido. En algunas modalidades, la porción peptídica tiene una secuencia que consiste de residuos de aminoácido T y N, residuos de aminoácido N y E, residuos de aminoácido Q y S, o residuos de aminoácido N y Q. En algunas modalidades, la extensión de aminoácido es N-terminal con respecto a dicho polipéptido biológicamente activo; en algunas modalidades, es C-terminal con respecto a dicho polipéptido biológicamente activo; y en otras modalidades, está situado a tanto el término N y C con respecto a dicho polipéptido biológicamente activo. En algunas modalidades, el polipéptido biológicamente activo es una citocina (por ejemplo, el factor que estimula la colonia de granulocitos (G-CSF) , hormona del crecimiento humano, o un interferón tal como un beta-interferón o un gama-interferón) , un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, fragmento o dominio de anticuerpo proteolítico, anticuerpo de cadena única, anticuerpo o fragmento genéticamente o químicamente modificado del mismo, una glicoproteina gpl20 ó gpl60 soluble, un factor de coagulación, un receptor tipo II del receptor soluble tal como un factor necrosis del tumor (TNF)- , una enzima terapéutica o eritropoyetina (EPO) . En algunas modalidades, el conjugado de proteína tiene una vida media modificada que es reducida con relación a la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado, por ejemplo, en donde dicho polipéptido biológicamente activo comprende una proteina C activada recombinante o un Factor VII recombinante. Otro aspecto de la presente invención, se dirige a una composición que comprende el conjugado de proteína y un portador. En algunas modalidades, la composición es una composición farmacéutica y el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la presente invención, se dirige a una molécula de ADN quimérica que codifica el conjugado de proteina descrito anteriormente, así como también un vector, que juntos, comprenden la molécula de ADN quimérica, y una célula transformada con la molécula de ADN quimérica o un vector que la contiene. En algunas modalidades, el vector es un plásmido, por ejemplo, pCE2. En algunas modalidades, la célula es una célula de mamífero por ejemplo, célula de ovario de hámster chino (CHO), o una bacteria, por ejemplo, E. coli o levadura. Aún otro aspecto de la presente invención, se dirige a un método para elaborar un conjugado de proteína biológicamente activa que comprende, un polipéptido biológicamente activo acoplado via un enlace peptídico, a un polipéptido que comprende desde 2 hasta aproximadamente 500 unidades de un péptido que comprende como un constituyente principal, dos o más residuos de un aminoácido seleccionado de Gly (G) , Asn (N) y Gln (Q) , y como un constituyente secundario, uno o más residuos de un aminoácido seleccionado de Ala (A), Ser (S) , Thr (T) , Asp (D) , Gln (Q) , Glu (E) , His (H) y Asn (N) , siempre que uno de dichos aminoácidos esté presente en dicho constituyente principal y dicho constituyente secundario, de manera tal que dicha proteína biológicamente activa tenga una vida media de plasma modificada, comparada con la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado, dicho método comprende: cultivar una célula transformada con una molécula de ADN quimérica que codifica dicho conjugado de proteína bajo condiciones, por este medio, dicho ADN es expresado, con ello, produciendo dicho conjugado de proteina; y extraer un producto de expresión de dicha molécula de ADN quimérica a partir de dicha célula. Un aspecto adicional de la presente invención, se dirige a un método para determinar si un conjugado de proteína dado exhibe una vida media del plasma modificada, comparada con la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado, que comprende: a) preparar un conjugado de proteina que comprende un polipéptido biológicamente activo acoplado vía un enlace peptídico a un polipéptido que comprende, desde 2 hasta aproximadamente 500 unidades de repetición de una porción peptídica, en donde la porción comprende un constituyente principal y un constituyente secundario, en el cual, el constituyente principal comprende o consiste de dos o más residuos de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Gly (G) , Asn (N) y Gln (Q) , y el constituyente secundario comprende o consiste de uno o más residuos de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Ala (A) , Ser (S), Thr (T) , Asp (D) , Gln (Q) , Glu (E) , His (H) y Ans (N) , en donde uno o de los aminoácidos está presente en tanto el constituyente principal como el constituyente secundario, y b) probar el conjugado de proteina para determinar si el conjugado de proteina tiene una vida media del plasma modificada, comparada con la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una representación esquemática del vector PHO x pBSK. La Figura 2 es una representación esquemática del vector PHO-G-CSF-NN x pBSK. La Figura 3 es una representación esquemática del vector PHO-G-CSF- (NNT) 65 x pBSK. La Figura 4 es una representación esquemática del vector PHO-G-CSF- (NNT) 133 x pBSK. La Figura 5 es una representación esquemática del vector PHO-G-CSF (NNT) 155 x pCE2. La Figura 6 es un manchado Western de varios conjugados de polipéptido G-CSF y G-CSF no conjugados diferentes . La Figura 7 es un manchado Western de varios conjugados de polipéptido G-CSF y G-CSF no conjugado diferentes, que son tratados con PNGase F antes de la electroforesis. La Figura 8 es un manchado Western de los constructos G-CSF- (NNT) 155 y G-CSF- (NNT) 65 (por duplicado), que se expresaron en células CHOK1 que crecen en medio PROCH04-CDM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usa en este documento, el término "polipéptido", significa un polímero de aminoácidos que no tienen longitud especificada, a menos que se especifique de otro modo. De este modo, péptidos y proteínas están incluidos en la definición de "polipéptido", y estos términos son usados intercambiablemente a través de la especificación, así como también en las reivindicaciones. El término "polipéptido", no excluye modificaciones post-traduccionales, tales como, polipéptidos que tienen unión covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lípidos, hidroxilación de prolina o lisina, y similares. También, abarcados por esta definición de "polipéptidos", están homólogos de los mismos. El término "purificado", como se usa en este documento, significa que el conjugado de proteína biológicamente activa, ha sido purificado en un nivel adecuado para su uso propuesto. La presente invención se dirige, en un aspecto general, a un conjugado de proteína que comprende un polipéptido biológicamente activo acoplado via un enlace peptidico, a un polipéptido que comprende desde 2 hasta aproximadamente 500 unidades de una porción peptídica que contiene un constituyente principal de dos o más residuos de un aminoácido seleccionado de Gly (G) , Asn (N) , y Gln (Q) , y un constituyente secundario de uno o más residuos de un aminoácido seleccionado de Ala (A) , Ser (S) , Thr (T) , Asp (D) , Gln (Q) , Glu (E) , His (H) y Asn (N) , siempre que uno de los aminoácidos esté presente como tanto un constituyente principal como constituyente secundario. Los conjugados de proteína de la presente invención, tienen una vida media de plasma mayor que el polipéptido o proteína biológicamente activa no conjugado correspondiente. La unidad de repetición de la porción contiene en general, 3-7 (3, 4, 5, 6 ó 7), residuos de aminoácido. Las porciones peptidicas representativas que tienen N (Asn) como el constituyente principal, se describen en la SEC ID NO. 1. Las porciones peptidicas representativas que tienen G (Gly) como el constituyente principal, se describen en la SEC ID NO. 2. Las porciones peptidicas representativas que tienen Q (Glu) como el constituyente principal, se describen en la SEC ID NO. 3. El número de las porciones peptídicas varía desde 2 hasta aproximadamente 500. De este modo, las porciones que incluyen las porciones peptídicas específicas expuestas en este documento, pueden estar presentes en el polipéptido en el siguiente número de unidades: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 198, 199, 200 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 25 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 28 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 29 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 301, 302, 303, 30 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 31 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 32 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 34 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 35 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 36 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 37 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 38 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 40 102, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 41 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 42 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 43 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 44 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 y 500 (de este modo, incluyendo cualquier sub-intervalo del mismo) . Como se describe anteriormente, el polipéptido conjugado al polipéptido biológicamente activo, puede también ser referido como un aminoácido o extensión poliamino (posteriormente "extensión de aminoácido) del polipéptido biológicamente activo. La extensión aminoácido puede ser situada en el N-término, al C-térraino o a tanto el N como C-términos, con respecto a la secuencia de polipéptido biológicamente activo. Sin pretender ser ligado por la teoría, los Solicitantes creen que las extensiones de aminoácido no adoptan conformaciones estables y como tales, no interfieren con o de otro modo, influencian la actividad de la proteína. También, limitando la extensión de aminoácido a dos diferentes aminoácidos, se cree que reduce la complejidad química de la extensión del aminoácido, la cual ayuda a minimizar el potencial de inmunogenicidad, así como también, permite la modulación de propiedades fisicoquímicas tan exhaustivamente que sea posible a través del uso de solo un tipo o clase de aminoácido. Ampliamente, el polipéptido biológicamente activo incluye cualquier proteína (que incluye polipéptidos nativos (es decir, como existen in vivo) o polipéptidos producidos recombinantemente, tales como G-CSF humano recombinante (rh-G-CSF) para el cual, una vida media modificada de plasma podría ser deseable, a partir de algún punto de vista, particularmente a partir de un punto de vista terapéutico, significando que cuando se suministra a un organismo vertebrado, trata, por ejemplo, cura, alivia, o disminuye los síntomas de, una enfermedad dada en tal vertebrado, o alternativamente, prolonga la vida del vertebrado disminuyendo el progreso de una enfermedad terminal. Los tipos de proteínas biológicamente activas incluyen, citocinas, quimiocinas, linfocinas, ligandos, receptores, hormonas, polipéptidos que inducen apoptosis, enzimas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos y factores de crecimiento. Ejemplos de receptores incluyen, receptor del FNT Tipo I, receptor IL-1 tipo II, antagonista del receptor IL-1, receptor IL-4 y cualquiera de los receptores químicamente o genéticamente modificados, solubles. Ejemplos de enzimas incluyen, proteína C activada, factor VII, colagenasa (por ejemplo, comercializada por Advance Biofactures Corporation, bajo el nombre Santyl) ; agalsidasa-beta (por ejemplo, comercializada por Genzy a bajo el nombre Fabrazyme) ; dornasa-alfa (por ejemplo, comercializada por Genentech bajo el nombre Pulmozyme) ; alteplasa (por ejemplo, comercializada por Genentech bajo el nombre Activasa) ; asparaginasa pegilada (por ejemplo, comercializada por Enzon bajo el nombre Oncaspar) ; asparaginasa (por ejemplo, comercializada por Merck bajo el nombre Elspar) ; y imiglucerasa (por ejemplo, comercializada por Genzyme bajo el nombre Ceredase) . Ejemplos de polipéptidos o proteínas específicas incluyen, pero no se limitan a, factor de estimulación de la colonia de macrófagos del granulocito (GM-CSF) , factor de estimulación de la colonia del granulocito (G-CSF) , factor de estimulación de la colonia de macrófagos (M-CSF) , factor de estimulación de colonias (CSF), beta interferón (IFN-ß), gama interferón (IFN?), factor I que induce el gama interferón (IGIF) , factor beta del crecimiento de transformación (TGF-ß), RANTES (células T expresadas normales, regulada sobre activación, y presumiblemente secretadas) , proteínas inflamatorias del macrófago (por ejemplo, MIP-1- y MIP-1-ß) , factor de iniciación de elongación de Leishmania (LEIF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor necrosis del tumor (TNF), factores de crecimiento, por ejemplo, factores de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento del fibroblasto (FGF) , factor de crecimiento del nervio (NGF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , neurotrofina-2 (NT-2) , neurotrofina-3 (NT-3) , neurotrofina-4 (NT-4), neurotrofina-5 (NT-5) , factor neurotrófico derivado de la linea de células gliales (GDNF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , receptor del TNF- tipo II, eritropoyetina (EPO) , insulina y glicoproteínas solubles, por ejemplo, glicoproteínas gpl20 y gpl60. La glicoproteína gpl200 es una proteína de envoltura del virus de in unodeficiencia humana (VIH) , y la glicoproteína gpl60 es un precursor desconocido a la glicoproteína gpl20. En algunas modalidades, es deseable modificar la vida media de un polipéptido biológicamente activo, de manera tal que su reducción con relación a la vida media intrínseca, es deseable. Tales modalidades incluyen, proteina C activada recombinante (por ejemplo, comercializada por Eli Lilly bajo el nombre Xigris) y Factor VII recombinante (comercializado por Novo Nordisk bajo el nombre NovoSeven) . Los polipéptidos biológicamente activos, pueden ser usados para tratar enfermedades tales como, enfermedad de Parkinson, cáncer y enfermedad cardiaca. Además, lo polipéptidos terapéuticos pueden ser usados para tratar trastornos autoinmunes, tales como esclerosis múltiple; síndrome de Sjogren; sarcoidosis; diabetes mellitus dependiente de la insulina; tiroiditis autoinmune; artritis (por ejemplo, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reactiva, y artritis psoriática) ; espondilitis anquilosante; y escleroderma. También, los polipéptidos terapéuticos de la presente invención, pueden ser usados para tratar trastornos inflamatorios agudos y crónicos, para promover el incremento en estatura, para promover la cicatrización de heridas, y prevenir el rechazo después del transplante de células, tejidos u órganos. En algunas modalidades preferidas, el polipéptidos es G-CSF. El G-CSF induce la rápida proliferación y liberación de los granulocitos neutrofílicos a la corriente sanguínea, con ello, proporcionando un efecto terapéutico en el combate de la infección. Como se explica en la Patente Estadounidense 6,831,158, el (rh) -G-CSF recombinante humano, es en general, usado para tratar varias formas de leucopenia (un nivel reducido de células blancas de la sangre) y neutropenia (un nivel reducido de neutrófilos) . La leucopenia y neutropenia resultan en susceptibilidad incrementada a varias infecciones. Las preparaciones comerciales de rh-G-CSF, están disponibles bajo los nombres filgrastim (GRAN® y NEUPOGEN®) , lenograstrim (NEUTROGIN® y GRANOCYTE®) y nartograstim (NEU-UP®) . GRAN® y NEUPOGEN® son no glicosilados y producidos en células E. coli recombinantes. NEUTROGIN® y GRANOCYTE®, son glicosilados y producidos en células CHO recombinantes. NEU-UP® es no glicosilado con cinco aminoácidos sustituidos en la región N-terminal del rh-G-CSF intacto producido en células E. coli recombinantes . Además de G-CSF, per se, análogos de G-CSF que son biológicamente funcionales o tienen actividad biológica son también empleados. Se describen métodos de preparación de rh-G-CSF en la Patente Estadounidense 4,810,643. También se reportan varios análogos de G-CSF en la Patente Estadounidense 4,810,643. El polinucleótido que codifica a rh-G-CSF y la estructura de aminoácido de rh-G-CSF, son ambos proporcionados en la Patente Estadounidense 5,985,265. Un ejemplo representativo de una secuencia de aminoácido (y la secuencia de polinucleótido correspondiente) de un conjugado de proteína de la presente invención, se muestra en la SEC ID NO. 4. La secuencia lider PHO se incluye. En la secuencia de aminoácido, la secuencia líder PHO es de aminoácidos 1 hasta 18, el G-CSF es desde los aminoácidos 19 hasta 192, y la extensión de aminoácido NNT155 es desde los aminoácidos 193 a 347. El codón de detención es denotado por el símbolo "*". Como se representa en la secuencia de polinucleótidos, los ácidos nucleicos 1 a 54, codifican la secuencia líder PHO, los ácidos nucleicos 55 a 57 codifican a G-CSF, y los ácidos nucleicos 577 a 1041, codifican la extensión de aminoácido NNT155. Los ácidos nucleicos 1042 a 1044 (TAG) , constituyen el codón de detención. En algunas modalidades, el número de unidades peptídicas de repetición es entre 75 y 225. De este modo, en el caso de un conjugado de proteína que contiene el G-CSF ligado a un polipéptido que contiene unidades de repetición de la porción peptídica tiene la secuencia NNT, modalidades de la presente invención pueden incluir cualquiera de los siguientes conjugados de proteína: G-CSF- (NNT) 75 G-CSF- (NNT) 76, G- CSF- (NNT) ?? , G-CSF- (NNT ) 78, G-CSF- (NNT) 79, G-CSF- (NNT) 80 G-CSF- (NNT )ßl, G-CSF- (NNT) 82, G-CSF- (NNT) 83, G-CSF- (NNT) 84, G-CSF- (NNT ) ß5, G-CSF- (NNT) 86, G-CSF- (NNT) 87, G-CSF- (NNT) 88, G-CSF- (NNT) 89, G-CSF- (NNT) 90, G-CSF- (NNT) 9i, G-CSF- (NNT) 92, G-CSF- (NNT ) 93, G-CSF- (NNT) 94 , G-CSF- (NNT) 95, G-CSF- (NNT ) 9e, G-CSF- (NNT) 97, G-CSF- (NNT) 98 , G-CSF- (NNT) 99, G-CSF- (NNT) 100, G-CSF- (NNT) 10?, G-CSF- (NNT) i 02 , G-CSF- (NNT) 103 G-CSF- (NNT) 104, G-CSF- (NNT) 105, G-CSF- (NNT) 106, G-CSF- (NNT) 107, G-CSF- (NNT) 108, G-CSF- (NNT) 109, G-CSF- (NNT) no, G-CSF- (NNT) ni, G-CSF- (NNT) 112 G-CSF- (NNT) U3, G-CSF- (NNT) n4/ G-CSF- (NNT) 115, G-CSF- (NNT) ??6, G-CSF- (NNT) 117, G-CSF- (NNT) uß, G-CSF- (NNT) 119, G-CSF- (NNT) 120, G-CSF- (NNT) 121/ G-CSF- (NNT) 122, G-CSF- (NNT) 123, G-CSF- (NNT) 12 , G-CSF- (NNT) 125, G-CSF- (NNT) ?26, G-CSF- (NNT) 127, G-CSF- (NNT) ?28, G-CSF- (NNT) 129, G-CSF- (NNT) 130, G-CSF- (NNT) i3i, G-CSF- (NNT) 132, G-CSF- (NNT) 133, G-CSF- (NNT) 134, G-CSF- (NNT) 135, G-CSF- (NNT) 136, G-CSF- (NNT) 137, G-CSF- (NNT) ?38, G-CSF- (NNT) 139, G-CSF- (NNT) 140, G-CSF- (NNT) X4?, G-CSF- (NNT) 142, G-CSF- (NNT) 143, G-CSF- (NNT) 144, G-CSF- (NNT) 145, G-CSF- (NNT) 146, G-CSF- (NNT) 147, G-CSF- (NNT) i48, G-CSF- (NNT) 149, G-CSF- (NNT) 150, G-CSF- (NNT) 151 G-CSF- (NNT) 152, G-CSF- (NNT) 153, G-CSF- (NNT) 154, G-CSF- (NNT) 155, G-CSF- (NNT) 156, G-CSF- (NNT) 157, G-CSF- (NNT) ?58, G-CSF- (NNT) 159, G-CSF- (NNT) 160, G-CSF- (NNT) ?6?, G-CSF- (NNT) ?62, G-CSF- (NNT) íes, G-CSF- (NNT) 164, G-CSF- (NNT) ?65, G-CSF- (NNT) ?66, G-CSF- (NNT) 167, G-CSF- (NNT) ?68, G-CSF- (NNT) ?69, G-CSF- (NNT) 170, G-CSF- (NNT) i7i, G-CSF- (NNT) i72, G-CSF- (NNT) 173, G-CSF- (NNT) x74, G-CSF- (NNT) 175, G-CSF- (NNT) ?76, G-CSF- (NNT) 177, G-CSF- (NNT) 178, G-CSF- (NNT) 179, G-CSF- (NNT) iso, G-CSF- (NNT) ißi, G-CSF- (NNT) :82, G-CSF- (NNT) 183, G-CSF- (NNT) 184, G-CSF- (NNT) 185, G-CSF- (NNT) 186, G-CSF- (NNT) 187, G-CSF- (NNT) ?88, G-CSF- (NNT) 189, G-CSF- (NNT) ?90, G-CSF- (NNT) i9i, G-CSF- (NNT) 192, G-CSF- (NNT) 193, G-CSF- (NNT) l94, G-CSF- (NNT) 195, G-CSF- (NNT) 196, G-CSF- (NNT) 197, G-CSF- (NNT) 198, G-CSF- (NNT) 199, G-CSF- (NNT) 200, G-CSF- (NNT) 201, G-CSF- (NNT) 202, G-CSF- (NNT) 203, G-CSF- (NNT) 204, G-CSF- (NNT) 205, G-CSF- (NNT) 206, G-CSF- (NNT) 207, G-CSF- (NNT) 2os, G-CSF- (NNT) 209r G-CSF- (NNT) 210, G-CSF- (NNT) 211, G-CSF- (NNT) 212, G-CSF- (NNT) 213, G-CSF- (NNT) 214, G-CSF- (NNT) 215, G-CSF- (NNT) 216, G-CSF- (NNT) 2i7, G-CSF- (NNT) 2?ß/ G-CSF- (NNT) 219, G-CSF- (NNT) 220, G-CSF- (NNT) 221, G-CSF- (NNT) 222/ G-CSF- (NNT) 223, G-CSF- (NNT) 224 y G-CSF- (NNT) 225 • En otras modalidades preferidas, el polipéptido es EPO. Como se explicó en Krantz, Blood 77:419 (1991), la EPO que se origina naturalmente, estimula la división y diferenciación de progenitores eritroides comprometidos en la médula ósea, y ejerce su actividad biológica enlazándose a receptores y precursores eritroides. La EPO ha sido manufacturada biosintéticamente usando tecnología recombinante como el producto del gen EPO humano clonado (hEPO) en y expresado en células de ovario de Hámster Chino (CHO). Véase Egrie, et aJ . , Immunobiol . 72:213-224 (1986). La estructura primaria (es decir, la secuencia de aminoácido) de la forma completamente procesada, predominante de hEPO, se ilustra en la Patente Estadounidense 6,583,272. En EPO, existen dos puentes disulfuro entre Cys7-Cys161 y Cys29-Cys33. El peso molecular de la cadena de polipéptido de EPO sin las porciones de azúcar es 18,236 DA. En la molécula EPO intacta, aproximadamente 40% del peso molecular se cuenta por grupos de carbohidrato que glicosilan la proteína en los sitios de glicosilación en la proteina. Véase Sasaki, et al . , J . Biol. Chem. 262:12059 (1987). Debido a que la hEPO es esencial en la formación de sangre roja, la hormona es empleada en el tratamiento de trastornos sanguíneos, caracterizados por producción de células rojas de la sangre, bajas o defectivas. Clínicamente, la EPO es usada en el tratamiento de anemia en pacientes con insuficiencia renal crónica (CRF) . Véase Eschbach, et al . , NEJM 315: 73-78 (1987); Eschbach, et al . , Ann. Intern. Med. 111:992 (1989); Egrie, et al . , Kidney Intl. 33:262 (1988); y Lim et al . , Ann. Intern. Med. 110:108-114 (1989). La EPO también ha sido usada para el tratamiento de anemia en Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida (SIDA) y pacientes con cáncer que se someten a quimioterapia. Véase, R. P. Danna, et al . , Erythropoietin In Clinical Applications - An International Perspective 301-324 (M. B. Garnick, ed., Marcel Dekker 1990). Las secuencias de nucleótido y aminoácido correspondientes, así como también otros polipéptidos biológicamente activos empleados en la presente invención, se exponen en la SEC ID NO. 5. Otras dos secuencias de aminoácido de la EPO, se exponen en la SEC ID NO. 6. El conjugado de proteína puede además, comprender una o más marcas de afinidad. En general, una marca de afinidad es un segmento de polipéptido que facilita el aislamiento, purificación o detección de la proteina de fusión que contiene la marca de afinidad. Al principio, cualquier péptido o proteína para la cual un anticuerpo u otro agente de enlace específico está disponible, puede ser usado como una marca de afinidad. Marcas de afinidad representativas incluyen, una proteína A del tracto poli-histidina, (Nilsson, et al . , EMBO J. 4:1075, (1985); Nilsson, et al . , Methods Enzymol. 198:3, (1991)), glutationa S transferasa (Smith et al . , Gene 67: 31 (1988)), proteina de enlace a maltosa (Kellerman et al . , Methods Enzymol. 90:459-463 (1982); Guan, et al . , Gene 67:21-30 (1987)), marca de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer, et al . , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 82: 7952-4 (1985); véase oNDEPHO-lR) , péptido Flag™, sustancia P (Hopp, et al . , Biotechnology 6:1204-10 (1988)), péptido de enlace a estreptavidina, tioredoxina, ubiquitina, proteína de enlace a celulosa, polimerasa T7, u otros dominios de enlace o epitope antigénica. Véase, en general, Ford, et al . , Protein Expression and Purification 2:95-107 (1991). Las marcas de afinidad que codifican el AND, son disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey; New England Biolabs, Beverly, Massachussets; y Eastman Kodak, New Haven, Connecticut) . Como en el caso de la extensión de aminoácido, la marca de afinidad puede ser situada en el N-terminal, C-termina o tanto N-terminal como C-terminal, con respecto a la secuencia de polipéptido biológicamente activo. La presente invención también se dirige a un método para elaborar los conjugados de proteína. El método involucra cultivar una célula transformada con una molécula de ADN quimérica que codifica el conjugado de proteína bajo condiciones por medio de la cual, el ADN es expresado, con ello, produciendo el conjugado de proteína; y extrayendo un producto de expresión de la molécula de ADN quimérica, a partir de la célula o medio de cultivo (o un medio a partir del cultivo celular) . Contrario con los conjugados de proteina formados por medios químicos (por ejemplo, el producto comercial NEULASTA (PEG-G-CSF, el cual es un conjugado covalente de G-CSF metionilo humano recombinante y onometionil polietilenglicol) , la conjugación en la presente invención, se realiza recombinantemente contrario a través de medios físicos o químicos, que resultan en la producción de la proteina biológicamente activa y el polipéptido, como componentes de una proteína continua. Un enlazador, por ejemplo, de aproximadamente 10-20 aminoácidos en longitud, puede ser usado para unir la proteina con la extensión de aminoácido. La molécula de ADN quimérica, incluye un gen o fragmento de nucleótido que codifica una porción de proteína y uno o más fragmentos de gen, por ejemplo, oligonucleótidos que en conjunto, codifican el polipéptido o extensión de aminoácido. Los oligonucleótidos que codifican las porciones peptídicas contenidas en la extensión de aminoácido (y las cuales codifican las porciones peptídicas específicamente descritas en este documento), se exponen en la SEC ID NO. 7. (Los símbolos de una letra usados en la SEC ID NO. 7, son explicados en la Tabla 1) . Las moléculas de ADN, pueden además, contener fragmentos que codifican las marcas de afinidad, enlazadores, así como también los elementos regulatorios al 5' y 3' . El gen o polinucleótido que codifica una porción de proteína, puede ser cualquier gen o polinucleótido conocido por codificar la proteína o polipéptido deseado de la porción de proteína. Tales genes y polinucleótidos, y los cebadores usados para generarlos, son proteínas o polipéptidos específicos y bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos ligados que codifican la porción de polipéptido, pueden ser producidos de conformidad con los procedimientos expuestos anteriormente y descritos en el Ejemplo 1 . Los oligonucleótidos pueden ser de cualquier longitud, pero son preferiblemente, diseñados para evitar el uso de secuencias de ADN repetitivas que son conocidas por inhibir la transcripción. Por ejemplo, los oligonucleótidos ligados que contienen combinaciones de dos codones de glutamato, son menos probable que adopten una configuración estructural que impide la expresión del gen que un polinucleótido hace de solamente un codón de glutamato. La molécula de ADN quimérica que codifica el conjugado de proteína de la presente invención, puede ser diseñado por ingeniería para contener codones que codifican al aminoácido metionina (M) y/o prolina, en su extremo 5' para facilitar la expresión.

Los conjugados de la presente invención son elaborados via técnicas recombinantes estándares en biología molecular. En algunas modalidades, un gen o polinucleótido que codifica la proteína biológicamente activa es primero clonado en un constructo, por ejemplo, un plásmido u otro vector. Después, los oligonucleótidos que codifican las unidades de repetición de la porción de polipéptido, son clonados en el constructo a través de un esquema de ligación o multimerización, en el cual, los oligonucleótidos son ligados en conjunto para formar un polinucleótido que codifica la porción de polipéptido. De esta manera, los oligonucleótidos son agregados al gen o polinucleótido que codifica la porción de proteína, con ello, produciendo la molécula de ADN quimérica dentro del constructo. Como una opción, la molécula de ADN quimérica, puede ser transferida o clonada en otro constructo que es un vector de expresión más apropiado. En este punto, una célula hospedera capaz de expresar la molécula de ADN quimérica, es transformada con la molécula de ADN quimérica. La transformación puede ocurrir con o sin la utilización de un portador, tal como un vector de expresión. Entonces, la célula hospedera transformada, es cultivada bajo condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de ADN quimérica, resultando en la codificación del conjugado de proteina.

Los métodos de ligación o multimerización empleados en la presente invención son bien conocidos.

Véase, Joseph Sambrook, et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1.53 (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) . El proceso de clonación puede tomar lugar a través de "clonación direccional", la cual es bien conocida en la técnica. La clonación direccional se refiere a la inserción de un polinucleótido en un plásmido o vector en una orientación específica y predefinida. Una vez clonado en un vector, una secuencia de polinucleótido puede ser estirada a su extremo 3' u otros polinucleótidos insertados en sus extremos 5' y/o 3' . Tal diseño proporciona una forma eficiente y relativamente fácil para crear polímeros grandes sin tener que realizar rondas múltiples de ligación. El vector preferiblemente contiene sitios de restricción en dirección 5' de un polinucleótido clonado, pero en dirección 3' de elementos regulatorios requeridos para expresión para facilitar la inserción del segundo polinucleótido. Para facilitar la clonación direccional, pueden ser ligados "oligonucleótidos adaptadores" a los extremos 5' y 3' de la molécula de ADN quimérica que codifica el conjugado de proteína. Preferiblemente, los adaptadores que contienen sitios de restricción que son compatibles con aquellos presentes en el vector de expresión. El oligonucleótido del adaptador 3' , puede también comprender un codón de detención para designar el extremo de la secuencia de codificación con la cual están ligados. Los oligonucleótidos que codifican la porción de polipéptido, son preferiblemente agregados en exceso de los oligonucleótidos adaptadores, para incrementar la probabilidad de que se genere después de la ligación, un polinucleótido largo. La metodología no está limitada a cualquier estrategia de clonación particular. El experto en la técnica, puede usar cualquiera de una variedad de estrategias de clonación, para producir un constructo que comprende una molécula de ADN quimérica de la presente invención. La molécula de ADN quimérica, puede ser introducida en las células hospederas de conformidad con técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, transformación usando moléculas de ADN quiméricas co-precipitadas de fosfato de calcio, co-transfección de reactivo lipídico (es decir, Lipofectamina) , electroporación, transducción poniendo en contacto las células con un virus, o microinyección de las moléculas de ADN quiméricas en las células. La célula hospedera puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedera puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. Los hospederos procarióticos adecuados para transformación incluyen, E. coli , Bacill us subtilis, Salmonella typhimuri um y varias especies con el género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, aunque otros pueden también ser empleados como un material de elección. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de vectores de expresión/hospederos en la expresión de los conjugados de proteína de la presente invención. En general, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedera (por ejemplo, resistencia a neomicina o reductasa dihidrofolato para cultivo de células eucarióticas, o tales como resistencia a ampicilina o tetraciclina en E. coli, o el gen TRP1 de S. cerevi siae) , y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural en dirección 3' . Tales promotores pueden ser derivados de enzimas glicolíticas que codifican operones, tales como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK) , factor-A, fosfatasa de ácido, o proteínas de golpe de calor, entre otras. La secuencia estructural heteróloga, es montada en una fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de la traducción, y en algunas modalidades, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de conjugados de proteína traducidos. El vector además, comprenderá un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si es deseable, proporcionar amplificación dentro del hospedero. Los vectores de expresión útiles que pueden ser usados incluyen, por ejemplo, segmentos de las secuencias de ADN cromosomales, no cromosomales y sintéticas. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, derivados de SV40 y pcADN y plásmidos conocidos tales como, col El, pCRl, pBR322, pMal-C2, pET, pGET como se describe por Smith, et al . , Gene 67:31-40 (1988), pMB9 y derivados de los mismos, plásmidos tales como RP4, ADN del fago tal como los numerosos derivados de fago I como NM989, así como también otros ADN de fago tal como M13 y ADN de fago de hebra única filamentoso; plásmidos de levadura tales como plásmido de 2 micrones o derivados del plásmido 2m, asi como también vectores de lanzadera de levadura centoméricos e integrativos; vectores empleados en células eucarióticas tales como vectores empleados en células de insecto o mamífero; vectores derivados de combinaciones de ADN de fago y plásmidos, tales como plásmidos que han sido modificados para emplear el ADN de fago o las secuencias de control de la expresión; y similares. Los requerimientos son que los vectores son replicables y viables en la célula hospedera de elección. Los vectores de números de copias altas o bajas, pueden ser usados como se desee. Por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus, ambos vectores de transferencia sin fusión, tales como, pero no limitados a pVL941 (sitio de clonación BamHI , disponible de Su ers, et al . , Virology 84:390-402 (1978)), pVL1393 (sitios de clonación BamHI , Smal , Xbal , EcoRl , Notl , XmalI I , Bgll l y PstI; Invitrogen), pVL1392 (sitios de clonación Bglll, Pstl, Notl , XmalII, £coRI, Xball , Smal y BamHl ; Summers, et aJ . , Virology 84: 390-402 (1978) e Invitrogen) y pBlueBacIII (sitios de clonación BamHl , Bgll l , Pstl , Ncol y BíndlII, con selección recombinante azul/blanca, Invitrogen) , y vectores de transferencia de fusión tales, como, pero no limitados a, pAc700 (sitios de clonación BamHl y Kpnl , en los cuales, el sitio de reconocimiento BamHl comienza con el codón de iniciación; Summers, et al . , Virology 84:390-402 (1978)), pAc701 y pAc70-2 (el mismo como pAc700, con diferentes estructuras lectoras) , pAc360 (sitio de clonación BamHl de 36 pares base en dirección 3' de un codón de iniciación polihedrina; Invitrogen (1995)) y pBlueBacHisA, B, C (tres diferentes estructuras lectoras con sitios de clonación BamHl , Bgl l l , Pstl , Ncol y ífindlll, un péptido ?-terminal para purificación de ProBond y selección recombinante azul/blanca de placas; Invitrogen (220), se pueden usar. Los vectores de expresión de mamífero, comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y potenciador, y también cualquier sitio de enlace de ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donador y aceptor de empalme, secuencias de terminación transcripcionales, y secuencias no transcritas de flanqueo al 5' . Las secuencias de ADN derivadas del empalme SV40, y sitios de poliadenilación, pueden ser usadas para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. Los vectores de expresión no mamíferos contemplados para uso en la invención, incluyen vectores con promotores inducibles, tales como los promotores de dihidrofolato reductasa, cualquier vector de expresión con un cásete de expresión DHFR o un vector co-amplificación de DHFR/metotrexato tal como, pED (sitios de clonación PstI, Salí, S£>al, Smal y EcoRI , con el vector que expresa tanto el gen clonado como DHFR; Randal J. Kaufman, 1991, Randal J, Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16, 12 (1991)). Alternativamente, un vector de co-amplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (sitios de clonación Hindl l l , X all, Smal, S£>al, EcoRl y Bell en los cuales, el vector expresa glutamina sintetasa y el gen clonado; Celltech) . Un vector que dirige la expresión episomal bajo el control del Virus Epstein Barr (EBV) o antígeno nuclear (EBNA) , puede ser usado tal como pREP4 (sitios de clonación BapiHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvull y Kpnl, promotor RSV-LTR constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen) , pCEP4 (sitios de clonación, BamHI, Sf?l, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, PvulI y Kpnl, promotor del gen temprano inmediato hCMV constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pMEP4 (sitios de clonación Kpnl, Pvul, Nhel, HindIII, Notl, Xhol, Sfil, Ba Hl, promotor del gen metalotioneina lia inducible, marcador seleccionable de higromicina, Invitrogen), pREPd (sitios de clonación BaznHI, Xhol, Notl, Hindlll, Nhel, y Kpnl, promotor RSV-LTR, marcador seleccionable histidinol; Invitrogen), pREP9 (sitios de clonación Kpnl, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil, BamHl, promotor RSV-LTR, marcador seleccionable G418; Invitrogen) , y pEBVHis (promotor RSV-LTR; marcador seleccionable de higromicina, péptido ?-terminar purificable vía resina ProBond y escindido por enterocinasa; Invitrogen) . Los vectores de expresión de mamífero seleccionables, para uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, pRc/CMV (sitios de clonación Hindlll, BstXl, Notl, Sbal y Apal, selección G418, Invitrogen), pRc/RSV (sitios de clonación i?indll, Spel, BstXI, Notl, Xbal, selección G418, Invitrogen) y similares. Los vectores de expresión de mamífero del virus de Vaccinia (véase por ejemplo, Randall J. Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology 16.12 (Frederick M. Ausubel, et al . , eds. Wiley 1991), que pueden ser usados en la presente invención, incluyen pero no se limitan a, pSCll (sitio de clonación Smal, selección TK y ß-gal), pMJ601 (sitios de clonación SaJl, Smal , Afl l , NarI, BspMII, BamHl, Apal, Nhel, SaclI, Kpnl, y HindIII; selección TK y ß-gala) , pTKgpFIS (sitios de clonación BcoRI, PstI, SalII, Accl, Hindl l , Sbal , BamHl y Hpa, selección TK o XPRT) y similares. Los sistemas de expresión de levadura que también pueden ser usados en la presente incluyen, pero no se limitan a, el vector pYES2 sin fusión (sitios de clonación Xbal , Sphl , Shol , Notl , GstXI, EcoRl , BstXl , BamHl , Sacl , Kpnl , y HindlII, Invitrogen), la fusión pYEShisA, B, C (sitios de clonación Xball , Sphl , Shol , Notl , BstXI, BcoRI, Ba Hl, Sacl, Kpnl y HindIII, péptido N-terminal purificado con resina ProBond y escindido con enterocinasa; Invitrogen), vectores pRS y similares. Un vector particularmente preferido para uso en la presente invención, es el plásmido pCE2. El plásmido pCE2, puede ser obtenido por métodos conocidos en el arte. Uno de tales métodos el cual se utiliza en el Ejemplo 2.A., se describe en Leung, et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 52:4813-4817 (1995) . En una modalidad preferida, las moléculas de ADN quiméricas pueden ser insertadas en un vector de expresión que ya contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la molécula de ADN quimérica insertada. Además, el vector de expresión que contiene la molécula de ADN quimérica, puede incluir marcadores de selección de fármaco. Tales marcadores ayudan en la clonación y en la selección o identificación de vectores que contienen las moléculas de ADN quiméricas. Por ejemplo, genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, dihidrofolato reductasa (DHFR) , guanina fosforibosil transferasa (GPT) , zeocina, e histidinol, son empleados como marcadores seleccionables. Alternativamente, enzimas tales como timidina cinasa del virus del herpes simple (tk) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , pueden ser empleados. Los marcadores inmunológicos también pueden ser empleados. Cualquier marcador seleccionable conocido, puede ser empleado tan pronto como sea capaz de ser expresado simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto de gen. Ejemplos adicionales de marcadores seleccionables son bien conocidos por uno de habilidad en la técnica e incluyen, reporteros tales como proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) ; beta- galactosidasa (ß-gal) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) . Consecuentemente, las células de mamífero y típicamente humanas, así como también células bacterianas, de levadura, hongos, insectos, nematodos y plantas, pueden ser usadas en la presente invención como células hospederas, y pueden ser transformadas por el vector de expresión como se define en este documento. En algunos hospederos celulares, tales como células de mamífero, la célula que contiene la molécula de ADN quimérica, puede ser "aislada" en que es removida de su ambiente original (por ejemplo, el ambienta natural si esta se origina naturalmente) . En otras modalidades, tales como plantas, las células no tienen que ser aisladas en que la planta completa puede ser usada preferentemente, en un cultivo de células de plantas o partes. Ejemplos de células adecuadas incluyen pero no se limitan a, células VERO, células HELA, tales como ATCC No. CCL2, líneas de células CHO tales como ATCC No. CCL61, células COS tales como células COS-7 y células ATCC No. CRL 1650, W138, BHK, HepG2 , 3T3, tales como células ATCC No. CRL6361, A549, PC12, K562, células 293, células Sf9 tales como ATCC No. CRL1711 y Cvl tales como ATCC No. CCL70. Otras células adecuadas que pueden ser usadas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cepas de células hospederas procarióticas tales como, Escherichia coli , (por ejemplo, cepa DH5- ) , Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cepas del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus . Células además adecuadas que pueden ser usadas en la presente invención incluyen, células de levadura, tales como aquellas de Saccharomyces tales como Saccharomyces cerevi siae . Las células hospederas que contienen los polinucleótidos de interés, pueden ser cultivadas en medio nutriente convencional (por ejemplo, mezcla nutriente Ham), modificada como se apropiada para promotores de activación, selección de transformantes o genes de amplificación. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con la célula hospedera seleccionada para expresión, y será aparente para el experto ordinariamente habilidoso. Las células son típicamente colectadas por centrifugación, disgregadas por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante retenido para purificación adicional. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas, pueden ser disgregadas por cualquier método conveniente, que incluye ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rompimiento mecánico, o uso de agentes de lisado celular, todos los cuales son bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Modalidades que involucran lisis celular, pueden vincular el uso de un amortiguador que contiene inhibidores de proteasa que limitan la degradación después de la expresión de la molécula de ADN quimérica. Los inhibidores de proteasa adecuados incluyen, leupeptina, pepstatina o aprotinina. El sobrenadante puede entonces, ser precipitado en concentraciones sucesivamente incrementadas de sulfato de amonio saturado. El producto de conjugados de proteína, puede ser purificado vía una o más técnicas. Típicamente, la purificación vincula combinaciones de procedimientos individuales tales como, filtración por gel, purificación de afinidad, concentración de sal, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de adsorción de hidroxilapatito, cromatografía de interacción hidrofóbica y electroforesis de gel. Las etapas de repliegue de la proteína, pueden ser usadas, como sean necesarias, en configuración de terminación del conjugado de proteína. La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) a menudo es empleada para etapas de purificación final. Véase en general, Robert K. Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (Charles R. Castor, ed., Springer-Verlag 1994) y Joseph Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2da edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) . Ejemplos de separaciones de purificación de etapas múltiples, también se describen en Barón, et al . , Crit. Rev. Biotechnol. 10:179-90 (1990) y Below, et al . , J. Chromatogr. A. 679:67-83 (1994). Los conjugados son probados antes del uso para determinar si exhiben vida media del plasma modificada, comparada con la proteina no conjugada. Por ejemplo, en experimentos conducidos con G-CSF, y varias extensiones de aminoácido tales como (NNT) , los Solicitantes encontraron que la vida media se incrementó en un caso, y en otro caso, se redujo. Las pruebas pueden ser conducidas de conformidad con técnicas estándares en farmacocinética, como se muestra en el ejemplo 3. Este procedimiento vincula la administración de una dosis predeterminada del conjugado a un animal, preferiblemente, un animal de laboratorio, tal como un roedor, por ejemplo, ratón, colectando plasma del animal a intervalos predeterminados, y analizando el plasma por ejemplo, vía Ensayo Inmunosorbente Ligado a la Enzima ("ELISA") , para determinar la concentración del conjugado, hasta que la concentración no es más medible. La vida media puede ser calculada via un análisis de farmacocinética sin compartimientos (por ejemplo, usando software WINNonLin versión 4.1). Además del tiempo prolongado en el cual la concentración de conjugado es medible (tf) , los análisis incluyen observación o cálculo de los siguientes parámetros principales: ?z, constante de velocidad terminal aparente, asociada con la fase terminal aparente, estimada por análisis de regresión lineal del logaritmo de las concentraciones de plasma contra tiempo, en la parte terminal onoexponencial de la curva, t?/2,z, vida media terminal aparente, calculada de conformidad con la siguiente ecuación: t?/2f = ln(2)/?2; AUC, área bajo la curva de tiempo-concentración de plasma a partir del tiempo cero a infinito; AUC/D, área bajo la curva de tiempo-concentración de plasma, por unidad de dosis; MRT significa tiempo de residencia, calculado como la relación entre el área bajo el primer momento de la curva, AUMC, y AUC; CL, separación sistémica, calculada como CL=D/AUC; y Vss, volumen de estado de distribución listo, calculado como VSS=CL*MRT . Un aspecto adicional de la presente invención, se refiere a una composición que comprende el conjugado de proteína y un portador. Ampliamente, el portador puede ser un medio de cultivo o una matriz (por ejemplo, una matriz de purificación) . En algunas modalidades, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable, en tal caso, la composición es empleada para prevenir o tratar trastornos y/o enfermedades en un humano o anima, más preferiblemente, en un mamífero, o para propósitos de diagnóstico. Como un ingrediente activo de la composición, el conjugado de proteína está preferiblemente, en una forma soluble.

En general, la composición comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva del conjugado de proteína, el cual logra el efecto deseado, por ejemplo, terapéutico o diagnóstico. Las cantidades farmacéuticamente efectivas pueden ser estimadas a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, una dosis puede ser formulada en modelos animales para lograr un intervalo de concentración de circulación que incluye o abarca, un punto o intervalo de concentración que tiene el efecto deseado en un sistema in vi tro . Véase por ejemplo, Molineux, et al . , Exp. Hematol. 27:1724-34 (1999). Esta información puede de este modo, ser usada para determinar exactamente la dosis en otros mamíferos, que incluyen humanos y animales. En general, las cantidades de dosificación varían desde aproximadamente 1 ng/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg basado en el peso del sujeto. La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos, puede ser determinada por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o en animales experimentales. Véase por ejemplo, Molineux, et al . , Exp. Hematol. 27:1724-34 (1999). Por ejemplo, la LD50 (la dosis letal a 50% de la población) asi como también la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) , pueden ser determinadas usando métodos conocidos en la técnica. La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos, es el índice terapéutico que puede ser expresado como la relación entre compuesto LD50 y ED50 que exhiben altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir del cultivo celular y estudios animales, pueden ser usados en la formulación de un intervalo de dosificaciones de tales compuestos, los cuales caen preferiblemente, dentro de un intervalo de concentraciones de circulación que incluyen, la ED50 con poca o ninguna toxicidad. Las composiciones pueden ser administradas vía cualquier ruta adecuada tal como, localmente, oralmente, sistémicamente, intravenosamente, intramuscularmente, mucosalmente, transdérmicamente (por ejemplo, vía un parche) . Pueden ser encapsuladas en liposomas, micropartículas, microcápsulas, nanopartículas y similares. Las técnicas para formular y administrar polipéptidos biológicamente activos, también se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro, et al . , eds. Philadelphia College of Pharmacy and Science 2000) . Para ilustrar completamente la presente invención y ventajas de la misma, se dan los siguientes ejemplos específicos, se debe entender que los mismos están propuestos únicamente como ilustrativos y no en forma limitativa.

EJEMPLO 1 Clonación de Molécula de ADN Quimérica Para facilidad de purificación de proteina de extremo 5, se decidió que las proteínas de polímero G-CSF se secretaran en el medio de cultivo. Experiencias previas usando señales de secreción (ST2) bacterianas con constructos citocina-polímero variados mostraron baja eficiencia de secreción. Sin embargo, se conoce el uso de la secuencia de señal de secreción de Schi zosaccharomyces pombe de phol + fosfatasa acida (PHO) para la secreción de proteínas heterólogas (GFP y HPV 16 E7) en un medio. Por lo tanto, esta señal de secreción se probó con los constructos de polímero G-CSF descritos abajo en un sistema de expresión de células CHO. También descritos abajo, están vectores que se sintetizan para la producción de constructos de polímero G-CSF y expresión de polímeros G-CSF. l.A. Producción de Constructos PHO x pBSK °íls_tructo PHO x pBSK El primer constructo sintetizado es simplemente la secuencia lider PHO clonada en el vector pBSK de clonación bacterial. La secuencia de aminoácido de la señal de secreción PHO se lista abajo.

M F L Q N L F L G F L AV V C AN A Se sintetizó la señal de secreción por fusión de dos series de oligonucleótidos de ADN complementarios juntos y clonando estos en pBSK. La consideración más importante que entró en el diseñó de los oligonucleótidos fue que la fusión de la secuencia líder al N-término del polímero G-CSF es directa, sin alguna secuencia de intervención. Esto asegura que la señal de secreción completa se sujeta de la molécula durante el proceso, resultando en una forma de secreción de G-CFS sin una modificación amino-terminal cuando se compara a versiones de G-CSF que se originan de forma natural y clínicamente disponibles. Preparando los constructos en esta manera, no únicamente se puede hacer comparaciones directas a G-CSF y PEG-G-CSF, sino esto también limita cualquier inmunogenicidad potencial introduciendo aminoácidos adicionales en la proteína G-CSF recombinante. Incorporando sitios de restricción en los oligonucleótidos clonando la PHO líder en pBSK, así como la subsecuente clonación G-CSG en PHO x pBSK, se satisfacen estos requerimientos. Los oligonucleótidos que se usaron se listan abajo. oNDEPHO-lF: 5' -GGCCGCCATATGTTCTTGCAAAATTTATTCCTTGGCT - 3' oNDEPHO-lR; 5' -CCAAAAAGCCAAGGAATAAATTTTGCAAGAACATATGGC -3' ONDEPH0-2F: 5' -TTTTGGCCGTTGTTTGCGCAAACGCGTCCCGCAGGTG-3' ONDEPH0-2R: 5' -GATCCACCTGCGGGACGCGTTTGCGCAAACAACGG-3' Se muestra un diagrama del vector PHO x pBSK en la Figura 1. Se clonó el líder PHO (PhoA) en pBSK usando NotJ y BamHl. Se colaron la secuencia para G-CSF madura en este constructo, utilizando los sitios BspMI y BamHl. Este vector confiere resistencia a ampicilina (bla) cuando se hace crecer en bacteria.

Método de Construcción Se polimerizaron pares complementarios de oligonucleótidos (o?DEPO-lF y o?DEPHO-lR) y (o?DEPH0-2F y O?DEPHO-2R) usando polinucleótido cinasa T4 (P?K) . El P?K T4 se activó con calor y los pares de oligonucleótidos se dejaron endurecer lentamente en hielo. Las reacciones se diluyeron en TE y se usaron en una ligación con pBSK previamente digerido usando Notl y BamHl. Los productos de ligación se sometieron a electroporación en células competentes ToplO y se hicieron crecer en placas de LB-ampicilina. Se realizaron minipreparados en colonias resistentes a ampicilina para aislar el AD? y la digestión de diagnóstico identificó clones putativos. Se corrigieron las secuencias de análisis determinadas de los clones putativos. l.B. Producción de Constructo PHO-G-CSF-NN x pBSK Constructo PHO-G-CSF-NN x pBSK Este constructo resultó de la clonación de material amplificado de RCP que corresponde a la secuencia codificante de G-CSF maduro en el vector PHO x pBSK, usando BspMI y BamHl. Como previamente se declaró, los oligonucleótidos para este propósito se diseñaron para asegurar que la unión entre PHO y G-CSF no tenga secuencia de intervención utilizando la enzima de restricción BspMI. Además, el C-termino de G-CSF tiene una fusión directa de dos residuos de asparagina (NN) y sitios de restricción para las enzimas BbSI y BamHl. La BbSI fue subsecuentemente utilizada para agregarla directamente al polímero NNT para el C-termino de G-CSF, mientras se usó BamHl para clonar GCSF-NN en el vector. Los oligonucleótidos que se utilizaron para amplificar G-CSF son como sigue: oBspMIGCSF: 5' -CGATCGACCTGCAAGTCGCGACTCCGCTGGGTCCAGCTA-3' oGCSFBbsBam: 5' -CGGGATCCGAAGACGTGTTGTTAGGCTGGGCAAGGTGGC-3' Se muestra un diagrama del vector PHO-G-CSF-NN x pBSK en la Figura 2. Se clonó la secuencia para G-CSF-NN madura en PHO x pBSK usando BspMI (destruido) y BamHl. La adición subsecuente de un polímero NNT utilizó los sitios Bbsl y BamHl indicados en el mapa del plásmido. Este vector confiere resistencia a ampicilina (bla) cuando crece en bacteria.

Método de Construcción Se amplificó G-CSF por RCP usando oligonucleótidos oBspMIGCSF y oGCSFBbsBam. La banda * 520 pb que corresponde a G-CSF maduro, se cortó de un gel de agarosa y se purificó. El fragmento purificado se digirió con BspMI y BamHl, purificado y ligado en corte PHO x pBSK con las mismas enzimas. Los productos de ligación se sometieron a electroporación en células competentes ToplO y se hicieron crecer en placas LB-ampicilina. Se realizaron minipreparados en colonias resistentes a ampicilina para aislar ADN y las digestiones de diagnóstico identificaron clones putativos. El análisis de secuencia determinó que los clones putativos son correctos. l.C. Producción de Constructo PHO-G-CSF- (NNT) 65 x pBSK Constructo PHO-G-CSF- (NNT) 65 x pBSK La composición de aminoácido de este polímero codifica para el sitio de glicosilación N-enlazado de mamífero consenso, N-X-(S/T). Por lo tanto, el polímero puede ser glicosilado en los residuos de treonina de la extensión de polímero cuando este constructo es expresado en las células CHO. La expectación fue que el incremento polimérico en el tamaño del producto traducido y la modificación post-traducida, podrían modular los parámetros pK de G-CSF, confiriendo después de la vida media mejorada de la proteína en suero, sin disminuir su actividad biológica. La construcción de este polímero se logró usando un esquema de oligonucleótido ligación/multimerización. Cortando el constructo PHO-G-CSF-NN x pBSK con Bbsl, se crearon unas cuatro bases colgantes (GTTG) en los dos residuos de asparagina agregados al C-término de G-CSF. Diseñando series complementarias de oligonucleótidos que codifican para tripletes de NNT de repetición así como endurecer el GTTG colgante, es posible multimerizar los oligonucleótidos que codifican para 9 aminoácidos en cadenas más largas. Adaptadores cortos que contienen un codón de detención, se agregan a un sitio BJOST para futura extensión del polímero y un sitio BamHl en proporciones bajas para determinar la mutimerización y permitir la clonación del fragmento del polímero BbsI-BamHI en PHO-G-CSF-NN x pBSK. Los oligonucleótidos usados para sintetizar el polímero (NNT) 65 se listan abajo: Oligonucleótidos de estructura polimérica o3NNTF: 5' -CAACACCAAC ATACCAACAATACAAA-3' ?3NNTR: 5' -GTTGTTTGTATTGTTGGTATTGTTGGT-3' Oligonucleótidos Adaptadores 0Den3F: 5' -CAACTAGTCTTCG-3' oDent3R: 5' -GATCCGAAGACTA-3' La siguiente secuencia (NTNNTNNTN) es la unidad de repetición del polímero NNT que se produce, usando los oligonucleótidos de estructura polimérica de o3NNTF y o3NNTR, los cuales muestran un CAAC sobresaliente y GTTG colgante respectivamente, que se usaron para multimerizar el polímero.

N T N N T N N T N 5'-C AAC ACC AAC AAT ACC AAC AAT ACÁ AA-3' (o3NNTF) 3'-TGG TTG TTA TGG TTG TTA TGT TTG TTG-5' (o3NNTR) La siguiente es la molécula adaptadora de terminación que completa el polímero e incluye un codón de detención, un sitio Bbsl para futura extensión del polímero y un sitio BamHl que es necesariamente para clonación.

Molécula Adaptadora de Terminación N * 5'-C AAC TAG TCT TCG-3' (oDENT3F) 3' -ATC AGA AGC CTA G-5' (oDent3R) Bbsl BamHl Se muestra un diagrama del vector PHO-G-CSF-NNT65 x pBSK en la Figura 3. La adición del polímero NNT65 utiliza el sitio Bbsl (destruido) que se localiza en el C-término de G-CSF y BamHl. Como se muestra en la Figura 3, el sitio Bbsl se regeneró en el extremo del polímero NNT65 para futura extensión de longitud. Este vector confiere resistencia a ampicilina (bla ) cuando crece en bacteria.

Método de Construcción Pares complementarios de oligonucleótidos de estructura polimérica (o3NNTF y o3NNTR) y oligonucleótidos adaptadores (oDent3F y oDent3R) se sometieron a fosforilación usando PNK T4. El PNK T4 se activó por calor y los pares de oligonucleótido se dejaron lentamente endurecer en hielo. Se realizó la multimerización del polímero mezclando polímero y adaptadores dúplex a relaciones 20:1 y 40:1 con Ligasa T . La ligasa T4 se activó por calor y las reacciones de ligación completas se digirieron con BamHl durante la noche. Ambas reacciones se precipitaron y se dejaron corren en un gel de acrilamida. Se cortó material entre 250 pb - 800 pb y se purificó en gel.

Este material se usó en una ligación con PHO-G-CSF-NN x pBSK que se ha digerido con Bbsl y BamHl. Se transformaron células Stbl2 químicamente competentes con los productos de ligación y se hicieron crecer en placas LB-ampicilina. Se realizaron minipreparados para aislar ADN y la digestión de diagnóstico identificó clones putativos. Se corrigió el análisis de secuencia de los clones putativos. El clon más largo aislado de esta estrategia es PHO-G-CSF-NNT65 x pBSK. l.D. Producción del Constructo PHO-G-CSF- (NNT) 155 x pBSK. Constructo PHO-G-CSF- (NNT) 155 x pBSK La construcción de este clon, requirió la adición de residuos NNT adicionales al constructo PHO-G-CSF- (NNT) 65 x pBSK, usando el mismo esquema de oligomerización. La composición de nucleótido de los oligonucleótidos usados en esta extensión se alteró para identificar la unión entre el polímero original y la extensión. Estas alteraciones mantienen la composición NNT original del polímero y utilizan la misma estrategia GTTG colgante y CAAC sobresaliente. Digiriendo PHO-GCSF- (NNT) 65 con Bbsl y BamHl, es posible extender la longitud del polímero usando la misma estrategia de multimerización de oligonucleótido como anteriormente.

Los oligonucleótidos usados para extender el polímero (NNT) 65 a (NNT) 65 se listan abajo: Oligonucleótidos de estructura polimérica o3NNTextf: 5' -CAACACCAAT ATACCAACAAT CAAA-3' o3NNTextR: 5' -GTTGTTTGTATTGTTGGTATTATTGGT-3' Oligonucleótidos Adaptadores oDeNT3F: 5' -CAACTAGTCTTCG-3' oDent3R: 5' -GATCCGAAGACTA-3' Como con la producción del Constructo PHO-G-CSF- (NNT) 65 x pBSK, NTNNTNNTN fue la unidad de repetición de la extensión del polímero NNT que se produjo usando los oligonucleótidos de estructura polimérica de o3NNTextF y o3NNTextR, en los cuales el CAAC sobresaliente y GTTG colgante son todavía usados para multimerizar el polímero y la composición de aminoácido descargada del polímero NNT65 original . N T N N T N N T N 5'-C AAC ACC AAT AAT ACC AAC AAT AC AA-3' (o3NNTextF) 3'-TGG TTA TTA TGG TTG TTA TGT TTG TTG-5' (o3NNTextR) Los nucleótidos subrayados arriba de o3NNTextF y o3NNTextR difieren de los oligonucleótidos en la misma posición en o3NNTF y o3NNTR respectivamente. La siguiente es la molécula adaptadora de terminación que completa el polímero NNT155 e incluye el sitio BamHl necesariamente para clonación. oDent3F y oDent3 son los mismos oligonucleótidos que se usaron para el polímero NNT65 inicial.

Molécula Adaptadora de Terminación N * 5'-C AAC TAG TCT TCG-3' (oDent3F) 3' -ATC AGA AGC CTA G-5' (oDent3R) Bbsl BamHl Se muestra un diagrama del vector PHO-G-CSF- (NNT) 155 x pBSK en la Figura 4. La extensión del polímero NNT65 por 90AA utilizó el sitio Bbsl (destruido) que se localiza en el C-término de PHO-G-CSF-NNT65 x pBSK y BamHl. Se nota que el sitio Bbsl se regeneró en el extremo del polímero NNT155 para futura extensión de longitud. Este vector confiere resistencia a ampicilina (bla ) cuando crece en bacteria.

Método de Construcción Pares complementarios de oligonucleótidos de estructura polimérica o3NNTextF y o3NNTextR, y oligonucleótidos oDent3F y oDent3R adaptadores se sometieron a fosforilación usando PNK T4. El PNK T4 se inactivo por calor los pares de oligonucleótido se dejaron endurecer lentamente en hielo. Se realizó la oligomerización del polímero mezclando polímero y adaptadores dúplex a relaciones 20:1 y 40:1 con Ligasa T4. La ligasa T4 se inactivo con calor y las reacciones de ligación completa se digirieron con BamHl durante la noche. Ambas reacciones se precipitaron y se corrieron en un gel de acplamida. Se cortó material entre 250 pb a 800 pb y se purificó en gel. Este material se ligó en PHO-G-CSF-NNT65 x pBSK digerido con B sl y BamHl. Se transformaron células Stbl2 químicamente competentes en placas de LB-penicilma. Se realizaron minipreparaciones para aislar ADN y la digestión de diagnóstico identificó clones putativos. El análisis de secuencia determinó que clones putativos se corrigieron. El clon más largo aislado de esta estrategia es PHO-G-CSF- (NNT) 155 x pBSK.

EJEMPLO 2 Transformación de la Célula Hospedante y Expresión de Molécula de ADN Quimérica 2. . Producción del Constructo PHO-G-CSF- (NNT) 155 x pCE2 Preparación_ del Vector pCE2 Se derivó el plásmido pCE2 del plásmido pREP7b, a través de las siguientes manipulaciones. Primero, se eliminó la región codificante EBNA de 200 pb. Después, se reemplazó pBR322ori con pKS-ori . Después, se reemplazó la región promotora RSV por el potenciador CMV y el promotor de factor -la de alargamiento (EF-la) e intrón. El potenciador CMV se derivó de un fragmento Xbal-Sphl de 380 pb, producido por la reacción en cadena de polimerasa (RCP) a partir de pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) usando los siguientes cebadores: 5'-GGCTCTAGAT ATTAATAGTA ATCAATTAC-3' ; y 5'-CCTCACGCAT GCACCATGGT AATAGC-3' .

El promotor EF-la y el intrón (Uetsuki, et al., J. Bio. Chem. 264:5791-5798 (1989)) se derivaron de un fragmento SphI-Asp718I de 1200 pb producido por RCP a partir del ADN genómico de humano usando los siguientes cebadores : 5'-GGTGCATGCG TGAGGCTCCG GTGC-3' ; y 5' -GTAGTTTTCACGGTACCTGAAATGGAAG-3' .

Los dos fragmentos se ligaron en un vector digerido XbaI/Asp718I derivado de pREP7b para generar pCE2.

Constructo PHO-G-CSF- (NNT) 155 x pCE2 Para expresar PHO-G-CSF- (NNT) 155 en células de mamífero, es necesario mover el constructo en el vector pCE2. Este vector contiene el promotor secundario y el primer intrón para el factor-1- de alargamiento de humano flanqueado por el potenciador CMV de inmediato adelantado.

El vector también contiene el marcador de resistencia de higromicina B para selección de mamífero. Se mostró un diagrama del vector PHO-G-CSF- (NNT) 155 x pCE2 en la Figura 5. El promotor que conduce la expresión es células CHO es Pcmv/ef-la. El vector es linealizado por electroporación en células CHO usando Sal í.

Este vector confiere resistencia a higromicina B en células de mamífero y resistencia a ampicilina (bla) cuando crece en bacteria.

Método de Construcción Este constructo se produjo aislando y purificando por gel, el fragmento Notl-BamHI de 1100 pb de PHO-G-CSF- (NNT) 155 x pBSK. Este material se ligó en pCE2 que ha sido digerido con Notl y BamHl. Las células Stbl2 químicamente competentes se transformaron con los productos de ligación y se hicieron crecer en placas de LB-ampicilina. Se realizaron minipreparaciones para aislar el ADN y la digestión de diagnóstico identificó clones putativos. Se realizaron preparados máximos a gran escala para aislar cantidades de microgramo del plásmido para transformación de células CHO. 2.B. Producción de Líneas de Célula Transfectante Para producir los polímeros descritos anteriormente, se usaron células de mamífero como células hospedantes para expresión. En este ejemplo, se seleccionaron líneas de célula de ovario de hámster Chino (CHO) . Las células CHO son ampliamente usadas en la industria farmacéutica para expresar terapéuticos de proteína recombinante, que incluyen G-CSF y EPO. Como se describe abajo, se estabilizaron cultivos de expresión de constructos de polímero G-CSF en células CHO.

Establecimiento_ de los Cultivos Adherentes Se linealizó el vector PHO-G-CSF- (NNT) 155 x pCE2 usando la enzima Sal í. Lo digerido se precipitó y se suspendió nuevamente en 50 µl de TE. Se usó un (1) gramo de este plásmido en una electroporación junto con células CHO 5 x 106. Se hicieron crecer células CHO adherentes en una Mezcla Nutriente de Ham F-12 (medio de Ham F-12) que contiene 10% de FBS. Las células se dejaron recuperar durante la noche, y al siguiente dia, se agregó el medio que contiene 700 µg/ml de higromicina B siendo selección de células resistentes. El medio se cargó cada 2-3 días como se necesite durante el curso de 2-3 semanas. Se aislaron reservas de volumen de células resistentes y se pasaron dos adicionales en la presencia de higromicina B. Para probar estas células para la secreción de PHO-G-CSF- (NNT) 155 en el medio, las células se hicieron crecer en medio de Ham que contiene medio de suero bajo (0.5%) por 3-5 días. El medio se aisló y se usó en manchados Western, que se probaron usando un anticuerpo policlonal contra G-CSF. Los manchados se reproduce en las Figuras 6 y 7, la diferencia entre los manchados es que las muestras en la figura 7 son adicionalmente sometidas a tratamiento Péptido:N Glicosidasa F (PNGase F) . Como se muestra en la Figura 6, las manchas mostraron material inmunoreactivo que pasa a peso molecular aparente * 95 kDa. Como se muestra en la Figura 7, la digestión de estas mismas muestras con PHGase F, un glicosilado que remueva cadenas de glicosilación N-enlazado, reduce el material inmunoreactivo por evidenciar el peso molecular * 49 kDa. Esto corresponde aproximadamente al tamaño teórico de proteína G-CSF- (NNT) 155. La G-CSF nativa migra electroforéticamente a * 18 kDa; la adición del polímero NNT al C-término agrega masa sustancial a la molécula polimérica recombinante. La expresión también parece muy estable, no se observa degradación proteolítica apreciable para la proteina sin purificar presente en medio acondicionado. Además, como se muestra en la Figura 7, la disminución en tamaño de los constructos después del tratamiento con PHGase F, sugiere que los constructos de proteina recombinante, se sometieron a una cantidad sustancial de glicosilación.

Establecimiento de Cultivos de Suspensión Para facilitar la purificación de G-CSF- (NNT) 155, encontrada en el medio acondicionado de cultivos CHO establecidos, las células se hicieron crecer en un químico definido, proteína baja, medio libre de suero (PROCH04-CDM, Cambrex) . En el proceso de adaptación de las células a este medio, las células se adaptan del adherente para crecimiento de suspensión. Las células se hicieron crecer en Ham F12 1 FBS al 10% para casi confluencia en matraces T-185, se tripsinizaron y se suspendieron en medio PROCH04-CDM. Se agregaron 107 células a 50 ml de PROCH04-CDM y se incubaron en matraces T-185. Después de 4-5 pasadas, aproximadamente 90% de las células no son muy adherentes y crecen como una mezcla de célula única y grumos celulares agregados. Se incubó medio PROCH04-CDM con 7-8 ml de un cultivo de densidad celular alto por 5-6 dias. Las células se removieron del medio por centrifugación y el medio es subsecuentemente clarificado usando un filtro de 0.2 micrón. El medio se cuantifico para proporcionar G-CSF- (NNT) 155 por manchado western (típicamente 100-200 µg/1) y se almacenó según se necesite. 2.C. Expresión de Constructos G-CSF-NNT en PR0CH04-CDM Las muestras son medios acondicionados de las líneas celulares CHO de volumen, anteriores que se hicieron crecer por 6 días en PROCH04-CDM. Se probó el manchado Western usando anticuerpo policlonal contra G-CSF. Como se muestra en la Figura 8, el tamaño de ambos constructos es el mismo como se observa en el medio de Ham (como se describe anteriormente) y no hay degradación observada en las líneas celulares G-CSF (NNT) 155. 2.D. Optimización de Expresión Se probaron varios aditivos nutrientes y químicos, así como también varios parámetros en un intento por determinar las condiciones de crecimiento necesarias para maximizar la expresión del producto deseado. El siguiente procedimiento resulta en un incremento en la acumulación de la proteina.

Aditivos Químicos Aunque se sabe que no todos los aditivos químicos resultan en un incremento en la producción de proteína, la literatura publicada indica que la adición de adenosina o AMP a 2.5 mM, conduce a detención del ciclo celular; efectivamente prolongando viabilidad de cultivo celular, con un incremento concomitante en la acumulación de proteína. El efecto de AMP se probó en producción mediada por CHO de producción de G-CSF- (NNT) 155 en medio químicamente definido ProCH04 (CDM) . El AMP se agregó a una concentración final de 1 mM en ProCH04 CDM. No se observó reducción en la viabilidad celular, comparada con el control. La adición de AMP resultó en un ligero incremento en la producción de proteina.

Parámetros Ambientales Cambios de Temperatura Las temperaturas de incubación reducidas para cultivos CHO, pueden conducir a niveles marcadamente mejorados de producción de proteína. Como se encuentra con otros métodos de mejoramiento de producción de proteína, el efecto observado es debido a la producción de proteína mejorada durante la detención del ciclo celular. El efecto de reducir la temperatura de incubación de la linea CHO recombinante de 37°C a 28°C, se examinó. Aunque los cultivos se mantienen a 28°C, permanecen considerablemente viables más prolongados que aquellos a 37°C, la temperatura inferior no resultó en producción de proteína recombinante superior.

Adaptación al Cultivo de Suspensión La población de CHO de volumen, se convirtió a condiciones de cultivo de matraz centrifugador. La adaptación a cultivo de suspensión fue mediada por el crecimiento en ProCH04 CDM. Después de la adaptación, las células se expandieron en matraces T y se sembraron en matraces centrifugadores que contienen ProCH5 CDM a varias densidades. Se observó un incremento marcado en la producción de proteína, durante la adaptación al cultivo de suspensión en ProCH05 CDM, con respecto a si las células se hicieron crecer en cultivos centrifugadores o estáticos .

Uso de Diferentes Líneas Celulares como Hospederos Un procedimiento para optimización de la expresión, pude ser usar una nueva línea de células para células hospederas. Por consiguiente, se obtuvo un nuevo embarque de CHO-Kl de ATCC. La nueva población se propagó y banqueó en un pasaje temprano para uso futuro. Este cultivo definido se usó para generar lineas de células clónales estables, que expresan la proteína recombinante de interés. Brevemente, las células CHO-Kl, son electroporadas con el vector de interés y seleccionadas para expresión estable de higromicina. Se aislaron 92 colonias y evaluaron para determinar la expresión de la proteína recombinante de interés. Muchas de estas colonias exhiben niveles de expresión que son marcadamente superiores que aquellos de la población transfectada original, descrita anteriormente.

Resultados Se observó un ligero mejoramiento de la expresión, cuando se trataron medios de cultivo con 1 mM de AMP. Las temperaturas de cultivo reducidas incrementan la longevidad del cultivo, pero no hay mejoramiento de la expresión de la proteína. La adaptación a las condiciones de cultivo de suspensión en ProCH5 CDM, mejoran dramáticamente, la expresión de la proteina recombinante. También, los clones aislados de la línea de células CHO-Kl definida por ATCC, expresan la proteina deseada a niveles significantemente superiores que la población originalmente aislada .

Ejemplo 3 Evaluación Farmacocinética de Conjugados de G-CSF- (NNT) 155 Los parámetros de farmacocinética del conjugado de proteína G-CSF- (NNT) -155, se evaluaron. Se incluyeron tres de otros compuestos como controles positivos. Los controles fueron compuestos Neulasta (PEG-G-CSF) , Nuepogen (rh-G-CSF) y G-CSF. Los compuestos se probaron por administración intravenosa única (i.v.) a ratones y la sangre se colectó hasta 72 horas posteriores a la dosificación. El plasma se analizó por el método ELISA. 3.A. Método Analítico El ensayo emplea la técnica de inmunoensayo de enzima de intercalación cuantitativa. Un anticuerpo monoclonal específico para G-CSF ha sido pre-revestido sobre una microplaca. Se pipetearon estándares y muestras en las cavidades. Cualquier G-CSF presente, se unió por el anticuerpo inmovilizado. Después del lavado lejos de cualquier sustancia no unida, se agregó un anticuerpo policlonal ligado a la enzima específico para G-CSF a las cavidades. Después de un lavado para remover cualquier reactivo de enzima de anticuerpo no unido, se agregó una solución de sustrato a las cavidades y se desarrolló color en proporción a la cantidad de G-CSF unido en la etapa inicial. El desarrollo de color se detuvo y la intensidad del color se midió.

Reactivos Se usaron los siguientes reactivos y materiales: -Microplaca G-CSF: microplaca de poliestireno de 96 cavidades (12 bandas de 8 cavidades), revestida con un anticuerpo monoclonal de urina contra G-CSF. -Conjugado G-CSF: 21 ml de anticuerpo monoclonal contra G-CSF conjugado a peroxidasa de rábano picante, con preservativo. -G-CSF estándar: 2 viales (25 ng/ml) de G-CSF humano recombinante, en una base de proteína amortiguada con preservativo, liofilizada. -Diluyente de ensayo RD1A: 11 ml de una base de proteína amortiguada con preservativo. -Diluyente calibrador RD5: 21 ml de base de proteina amortiguada con preservativo. Para muestras de sobrenadante de cultivo celular. -Diluyente calibrador RD6A: 21 ml de suero de animal con preservativo. Para muestras de suero/plasma. -Concentrado de amortiguador de lavado: 21 ml de solución concentrada 25-partes de tensoactivo amortiguado con preservativo. -Reactivo de color A: 12.5 ml de peróxido de hidrógeno estabilizado. -Reactivo de color B: 12.5 ml de cromógeno estabilizado (tetra etilbencidina) . -Solución de detención: 6 ml de ácido sulfúrico 2N. -Cubiertas de placa: 4 tiras de adhesivo.

Preparación de reactivo Se diluyeron 20 ml de concentrado amortiguador de lavado, en agua desionizada o destilada, para preparar 500 ml de amortiguador de lavado. Se reconstituyó el G-CSF estándar con 1 ml de agua desionizada o destilada. Esta reconstitución produce una solución base de 2500 pg/ml. El estándar G-CSF se dejó sedimentar por un mínimo de 15 minutos con agitación suave antes de elaborar las diluciones. Novecientos (900) µl de diluyente calibrador RD6A se pipeteó en un tubo de 2500 pg/ml. 600 µl del mismo diluyente se pipeteó en los 4 tubos restantes. La solución base se usó para producir una serie de dilución: 25000 pg/ml (1:10) ? 2500 pg/ml y 25000 pg/ml (1:3) ? 833.3 pg/ml (1:3) ? 277.8 pg/ml (1:3) ? 92.6 pg/ml (1:3) ? 30.9 pg/ml. Cada tubo se mezcló uniformemente antes de la siguiente transferencia. El estándar de 2500 pg/ml, sirvió como el estándar alto. El diluyente calibrador RD6A, sirvió como el estándar cero (0 pg/ml). La curva estándar se realizó con 6 puntos: 2500-833.3-277.8-92.6-30-9-0 pg/ml, doble cavidad para cada punto. Para la solución de sustrato, el reactivo de color A y B, se mezclaron en conjunto en volúmenes iguales dentro de 15 minutos de uso. Los reactivos se protegieron de la luz.

Procedimiento de Ensayo Todos los reactivos y muestras se llevaron a temperatura ambiente antes del uso. Todos los reactivos y estándares de trabajo se prepararon. Cien (100) µl de diluyente de ensayo RD1A se agregó a cada cavidad, 100 µl de estándar y un volumen apropiado de la muestra, también se agregaron a cada cavidad. Las cavidades se cubrieron con una tira adhesiva y se incubaron por 2h a temperatura ambiente. Cada cavidad se aspiró y lavó con 400 µl de amortiguador de lavado, el cual se repitió dos veces para un total de tres lavados. Después del último lavado, se removió cualquier amortiguador de lavado restante por aspiración o decantación. La placa se invirtió y manchó contra toallas de papel limpias. Se agregaron 200 µl de conjugado G-CSF a cada cavidad. Las cavidades se cubrieron con una nueva tira adhesiva. Las cavidades se incubaron por 2h a temperatura ambiente. La aspiración/lavado descrito anteriormente, se repitió. Doscientos (200) µl de solución de sustrato se agregaron a cada cavidad. Las cavidades se incubaron por 20 minutos a temperatura ambiente. Las cavidades se protegieron de la luz. Después, se agregaron 50 µl de solución de detención a cada cavidad. Finalmente, la densidad óptica de cada cavidad dentro de 30 minutos, se determinó usando un lector de microplaca (VersaMax-Molecular Device) establecido a 450 nm con corrección a 570 nm (OD 450nm-OD 570 nm) .

Análisis de Farmacocinética Se aplicó un análisis de farmacocinética sin compartimentos (software WINNonLin versión 4.1). Se observaron los siguientes parámetros principales o calculados para cada constructo de GCSF; tf, tiempo final en el cual cada concentración de compuesto es medible; ?z, constante de velocidad terminal aparente asociada con la fase terminal aparente, estimada por análisis de regresión lineal del logaritmo de las concentraciones de plasma contra el tiempo en la parte terminal mono-exponencial de la curva; t?/2#z, vida media terminal aparente, calculada de conformidad con la siguiente ecuación: t?/2, z=ln (2) /?z; AUC, área bajo la curva de tiempo-concentración de plasma a partir del tiempo cero a infinito; AUC/D, área bajo la curva de tiempo-concentración de plasma por unidad de dosis; MRT, tiempo de residencia medio calculado como la relación entre el área bajo el primer momento de curva, AUMC, y AUC; CL, separación sistémica, calculada como CL=D/AUC; y Vss, volumen de distribución de estado listo, calculado como VSS=CL*MRT.

Resultados Como se muestra en la Tabla 2, estudios de farmacocinética en ratones, mostraron que el G-CSF-(NTT) 155, posee una vida media prolongada (6.2 h) que ya sea el control G-CSF (1.53 h) , compuesto NEUPOGEN (1.13 h) o el compuesto NEULASTA (3.04h) . La vida media más larga de G-CSF- (NNT) 155, corresponde a una duración más sostenida del efecto, comparada con tres controles. Un decremento sustancial correspondiente de la separación sistémica, se observó para G-CSF- (NNT) 155, que cuenta para la separación sistémica de 9.6 ml/h/kg. Otros conjugados que contienen extensiones de aminoácido descritas en este documento, exhiben una vida media reducida con relación al control.

Ejemplo 4 Biodisponibilidad y Eficacia de Conjugado G-CSF- (NNT) 155 La neutropenia, un conteo absoluto bajo de neutrófilos, es una condición seria que puede impedir que se luche contra las infecciones. Para estimular un incremento periférico en los conteos de neutrófilo, el factor de estimulación de la colonia de granulocitos (G-CSF) , puede ser usado como una terapia para neutropenia, o en combinación con otros factores de estimulación en la colección de células para transplante. La biodisponibilidad de G-CSF- (NNT) 155 parcialmente purificado, PEG-CSF (NEULASTA) o rh-G-CSF (NEUPOGEN) , se determinó y comparó vía administración i.v. (intravenosa) y s.c. (subcutánea).

El compuesto NEUPOGEN es un G-CSF humano metionilo recombinante. El compuesto NEULASTA es un conjugado covalente del G-CSF humano metionilo recombinante, y el monometoxipolietilenglicol. Como se describe anteriormente, el G-CSF- (NNT) 155, es una forma de aminoácido alargado y/o glicosilado de G-CSF. 4. . Pruebas para Biodisponibilidad a través de Elisa Para evaluar la biodisponibilidad de G-CSF- (NNT) 155, se realizó un análisis ELISA en muestras de plasma obtenidas de ratones que se dieron dosis de G-CSF- (NNT)155, PEG-G-CSF y rh-G-CSF, a través de administración i .v. y s.c. Los artículos de control y prueba fueron como sigue: G-CSF- (NNT) 115 parcialmente purificado, PEG-G-CSF (NEULASTA) , rh-G-CSF (NEUPOGEN) , y el control de vehículo (150 mM de NaCl + 20 mM de NaOH + 0.004% de Tween-20) ; cada uno manufacturado en una manera que fue aceptable para uso en animales vía las rutas designadas de administración, i .v. y s . c . A los ratones se les dieron dosis de G-CSF- (NNT)155, PEG-G-CSF, rh-G-CSF (cada una en la cantidad de 125 µg/kg) y un control de vehículo a través de la administración i.v. y s.c. Se aislaron muestras de plasma de ratón. Si se requiere, las muestras de plasma de ratón se diluyeron. Después, las muestras de ratón se analizaron con G-CSF ELISA. El propósito principal de analizar las muestras de plasma via ELISA, fue para propósitos solamente cualitativos, y no para propósitos cuantitativos (es decir, no para obtener concentraciones de nivel de plasma extremadamente precisas) . El G-CSF ELISA, resulta ya sea proporcionando una afirmación cualitativa de que el artículo de prueba está presente en el plasma o un repudio cuantitativo de que el artículo de prueba no está en el plasma. Las muestras de plasma se analizaron por triplicado, usando dos diluciones. Los resultados fueron que el G-CSF- (NNT) 155, administrado intravenosamente, podrá ser detectado a las 72 horas, mientras que el PEG-G-CSF, podrá solamente ser detectado hasta 24 horas. Además, tanto el G-CSF- (NNT) 155 administrado subcutáneamente como el PEG-G-CSF, podrán ser detectado hasta 72 horas. El rh-G-CSF administrado subcutáneamente, podrá ser detectado a los 15 minutos y 2 horas de puntos de tiempo del muestreo. 4.B. Comparación de Dosis Única de G-CSF- (NTT) 155 y PEG-G-CSF sobre los efectos hematopoyéticos en ratones En otra evaluación de la biodisponibilidad y eficacia de G-CSF (NNT) 155, análisis hematológicos que involucran células blancas de la sangre y mediciones de conteo de neutrófilos, se realiza en muestras de plasma obtenidas de ratones que se les dio dosis de G-CSF- (NNT)115, PEG-G-CSF y rh-G-CSF a través de administración i .v. y s .c. Los artículos de control y prueba fueron los mismos como para la evaluación de ELISA G-CSF anterior. Los procedimientos para obtener las muestras de plasma también fueron los mismos como para la evaluación de ELISA G-CSF. Los resultados de análisis de hematología fueron como sigue: Datos de medio de conteo de células blancas de la sangre para el control de vehículo que varía desde 0.76 x 103/µl hasta 4.35 x 103/µl y 1.27 x 103/µl hasta 4.25 x 103/µl para la administración i.v. y s.c., respectivamente. Los datos de medias de conteo de neutrófilo absoluto, para el control de vehículo, varían desde 0.11 x 103/µl hasta 0.55 x 103/µl y 0.29 x 103/µl hasta 0.35 x 103/µl para la administración i.v. y s.c., respectivamente. El conteo de células blancas de la sangre para G- CSF- (NNT) 155, se incrementó desde 1.44 x 103 µl, 15 minutos posteriores a la dosis a 11.45 x 103/µl, 72 horas posteriores a la administración i.v. El conteo de la media de células blancas de la sangre para G-CSF- (NNT) 155, se incrementó desde 3.15 x 103/µl, 15 minutes posteriores a la dosis, a 11.45 x 103/µl, 72 horas posteriores a la administración s.c. De manera similar, los datos medios del conteo de neutrófilos absolutos para G-CSF- (NNT) 155, se incrementó desde 0.04 x 103/µl, 15 minutos posteriores a la dosis a 4.24 x 103/µl, 72 horas posteriores a la administración i.v. El conteo medio de neutrófilos absoluto para G-CSF- (NNT) 115 se incrementó desde 0.25 x 103/µl, a 15 minutos posteriores a la dosis a 2.04 x 103/µl, a 72 horas posteriores a la administración y disminución a 0.14 x 103/µl para la ruta s.c. de administración a 120 horas posteriores a la administración. El conteo medio de células blancas de la sangre para PEG-G-CSF (Neulasta), se incrementó desde 1.36 x 103/µl, a 15 minutos posteriores a la dosis a 6.03 x 103/µl, a 24 horas posteriores a la administración, y después, disminuido a 2.01 x 103/µl, a 72 horas posteriores a la administración i.v. El conteo medio de células blancas de la sangre para PEG-G-CSF (Neulasta), se incrementó desde 1.47 x 103/µl, a 15 minutos posteriores a la dosis a 4.58 x 103/µl, a 24 horas posteriores a la administración, y después disminuyó a 2.47 x 103/µl a 120 horas posteriores a la administración s.c. El conteo medio de neutrófilos absolutos para PEG-G-CSF (Neulasta) se incrementó desde 0.05 x 103/µl, a 15 minutos posteriores a la dosis a 1.83 x 103/µl, a 24 horas posteriores a la administración, y después disminuyó a 0.20 x 103/µl, a 72 horas posteriores a la administración i.v. El conteo medio de neutrófilos absolutos para PEG-G-CSF (Neulasta), se incrementó desde 0.18 x 103/µl, a 15 minutos posteriores a la dosis a 1.04 x 103/µl a 24 horas posteriores a la administración, y después disminuyó a 0.22 x 103/µl, 120 horas posteriores a la administración s.c. El conteo medio de células blancas de la sangre para rh-G-CSF (Neupogen) , disminuyó desde 1.30 x 103/µl, a 15 minutos posteriores a la dosis a 1.19 x 103/µl a 2 horas posteriores a la administración s.c. El conteo medio de neutrófilos absoluto para rh-G-CSF (Neupogen) , se incrementó desde 0.11 x 103/µl a 15 minutos posteriores a la dosis a 0.49 x 103/µl a 2 horas posteriores a la ruta de administración s.c. El resultado mostró que la administración intravenosa de G-CSF (NNT) 115, demuestra un incremento sustancial en conteos de células blancas de la sangre, hasta 72 horas posteriores de la dosis, el cual se correlaciona directamente con un incremento en los conteos de neutrófilos absolutos. Esto significa un incremento que excede el conteo de células blancas de la sangre del control de vehículo por aproximadamente 260%. De manera similar, un incremento en el conteo de las células blancas de la sangre para la administración s.c. de G-CSF- (NNT) 155, excede aquel de tanto el control de vehículo como PEG-G-CSF or aproximadamente 295%, 72 horas posteriores a la dosis. Sin embargo, tanto el conteo medio de las células blancas de la sangre como el conteo medio de neutrófilos absolutos, regresó a aquel de tanto el control de vehículo como PEG-G-CSF a 120 horas posteriores a la dosis. En algunas modalidades, el péptido contiene la secuencia NNT, NNNNT o NNNNNT, y n es un número entero de aproximadamente 150 hasta aproximadamente 160. En algunas de estas modalidades, la proteína biológicamente activa es G-CSF. Todas las publicaciones citadas en la especificación, son indicativas del nivel de habilidad de aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Todas estas publicaciones están en este medio incorporadas por referencia en la misma magnitud como si cada publicación individual fuera específicamente e individualmente indicada por ser incorporada por referencia. Aunque la invención en este documento ha sido descrita con referencia a las modalidades particulares, se entiende que estas modalidades son meramente ilustrativas de los principios y aplicaciones de la presente invención. Se entiende por lo tanto, que se pueden hacer numerosas modificaciones a las modalidades ilustrativas y que otros arreglos pueden ser contemplados sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención, como se define por las reivindicaciones adjuntas.

TABLA 1 TABLA 2

Claims (46)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un conjugado de proteina biológicamente activa, caracterizado porque comprende un polipéptido biológicamente activo acoplado vía un enlace peptídico a un polipéptido, que comprende de 2 hasta 500 unidades de un péptido que comprende un constituyente principal, dos o más residuos de un aminoácido seleccionado de Gly (G) , Asn (N) y Gln (Q) , y un constituyente secundario, uno o más residuos de un aminoácido seleccionado de Ala (A) , Ser (S) , Thr (T), Asp (D), Gln (Q) , Glu (E) , His (H) y Asn (N) , siempre que ninguno de dichos aminoácidos esté presente en el constituyente principal y el constituyente secundario, de forma tal que el conjugado de proteína biológicamente activa tenga una vida media de plasma modificada comparada con la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado.

2. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido comprende 3-6 residuos de aminoácidos.

3. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende 3 residuos de aminoácidos. 4. El conjugado de proteina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende

4 residuos de aminoácidos. 5. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende

5 residuos de aminoácidos.

6. El conjugado de proteina de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el constituyente secundario comprende 1 residuos de aminoácidos de dicho péptido .

7. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende 6 residuos de aminoácidos.

8. El conjugado de proteina de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el constituyente secundario comprende 1 residuo de aminoácido de dicho péptido.

9. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene una secuencia que consiste de residuos de aminoácidos N y T.

10. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene una secuencia que consiste de residuos de aminoácidos N y E.

11. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene una secuencia que consiste de residuos de aminoácidos Q y S.

12. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene una secuencia que consiste de residuos de aminoácidos N y Q.

13. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es N-terminal con respecto a dicho polipéptido biológicamente activo .

14. El conjugado de proteina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es C-terminal con respecto al polipéptido biológicamente activo.

15. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido está situado tanto en el término N como C, con respecto a dicho polipéptido biológicamente activo.

16. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polipéptido biológicamente activo es una citocina.

17. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque dicha citocina es factor que estimula la colonia del granulocito (G-CSF) .

18. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque dicha citocina es hormona de crecimiento humana.

19. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la citocina es un interferón.

20. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el interferón es un beta-interferón.

21. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el interferón es un gama-interferón.

22. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido biológicamente activo comprende un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, fragmento o dominio de anticuerpo proteolitico, anticuerpo de cadena única, anticuerpo genéticamente o químicamente optimizado o fragmento del mismo.

23. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido biológicamente activo comprende una glicoproteína soluble gpl20 ó gpl60.

24. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido biológicamente activo comprende un factor de coagulación.

25. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido biológicamente activo comprende un receptor soluble.

26. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el receptor soluble comprende un receptor tipo II del factor necrosis del tumor (TNF)-a.

27. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido biológicamente activo comprende eritropoyetina.

28. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una vida media modificada, que es reducida, relativa, comparada con la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado.

29. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido biológicamente activo comprende una proteína C activada recombinante.

30. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido biológicamente activo comprende un Factor VII recombinante.

31. El conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido biológicamente activo es una enzima terapéutica.

32. Una composición, caracterizada porque comprende el conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1 y un portador.

33. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el portador es un portador farmacéuticamente efectivo.

34. Una molécula de ADN quimérica, caracterizada porque codifica el conjugado de proteína de conformidad con la reivindicación 1.

35. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ADN quimérica de conformidad con la reivindicación 34.

36. El vector de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque es un plásmido.

37. El vector de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el plásmido es pCE2.

38. Una célula, caracterizada porque es transformada con el vector de conformidad con la reivindicación 35.

39. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una célula de mamífero .

40. La célula de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster Chino (CHO) .

41. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una bacteria.

42. La célula de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la bacteria es E. coli .

43. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es levadura.

44. Un método para elaborar un conjugado de proteína biológicamente activa, caracterizado porque comprende un polipéptido biológicamente activo acoplado vía un péptido enlazado a un polipéptido, que comprende de 2 hasta aproximadamente 500 unidades de un péptido que comprende como un constituyente principal, dos o más residuos de un aminoácido seleccionado de Gly (G) , Asn (N) y Gln (Q) , y como un constituyente secundario, uno o más residuos de un aminoácido seleccionado de Ala (A) , Ser (S) , Thr (T) , Asp (D) , Gln (Q) , Glu (E) , His (H) y Asn (N) , siempre que los aminoácidos estén presentes el constituyente principal y el constituyente secundario, de forma tal que la proteína biológicamente activa tenga una vida media de plasma modificada comparada con la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado, el método comprende: cultivar una célula transformada con una molécula de ADN quimérica, que codifica el conjugado de proteína bajo condiciones por las cuales dicho ADN es expresado, con ello se produce dicho conjugado de proteína; y extraer un producto de expresión de dicha molécula de ADN quimérica de dicha célula.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la molécula de ADN quimérica se introduce en dicha célula a través de la inserción de la molécula de ADN quimérica en un vector, el cual es después transformado en dicha célula.

46. Un método para determinar si un conjugado de proteína dado exhibe una vida media de plasma modificada comparada con la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado, caracterizado porque comprende : a) preparar un conjugado de proteína, que comprende un polipéptido biológicamente activo acoplado vía un péptido unido a un polipéptido que comprende de 2 hasta aproximadamente 500 unidades de repetición de una porción peptídica, en donde la porción comprende un constituyente principal y un constituyente secundario, en el cual el constituyente principal comprende o consiste de dos o más residuos de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Gly (G) , Asn (N) y Gln (Q) , y el constituyente secundario comprende o consiste de uno o más residuos de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Ala (A) , Ser (S), Thr (T) , Asp (D) , Gln (Q) , Glu (E) , His (H) y Asn (N) , en donde ninguno de los aminoácidos está presente tanto en el constituyente principal y el constituyente secundario, y b) probar el conjugado de proteína para determinar si el conjugado de proteína tiene una vida media de plasma modificada comparada con la vida media intrínseca del polipéptido biológicamente activo no conjugado.