JP2004515246A - 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質 - Google Patents
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Abstract
Description
技術分野
本発明は、新規な貧血治療剤であって、エリスロポエチンの生体内(in vivo)活性が増強された融合蛋白質(fusion protein)に関する。より詳細には、本発明はEPO分子と、半減期(half−life)増加活性を持つ人体由来の特定ペプチドとの融合によって、エリスロポエチンの生体内活性が画期的に増強された融合蛋白質に関する。
【0002】
背景技術
エリスロポエチン(EPO)は分子量30,000〜34,000の糖蛋白質であり、赤血球の生成を促進する。この蛋白質は、赤血球前駆細胞の受容体との結合によって初めてその機能を発揮し、細胞内カルシウムイオン濃度の増加、DNA生合成の増加およびヘモグロビン生成の刺激などを起こす。この組換えヒトEPO(rhEPO)は、腎臓病患者の貧血、未熟児の貧血、甲状腺機能低下症による貧血、栄養失調による貧血などの治療剤のために用いられてきた。他方で、rhEPOの臨床的利用は拡大しつつある。しかし、rhEPOの短い半減期のために、平均週3回の投与の不便さと高コストをもたらす。従って、EPOの生体内活性を長期間維持させれば、EPOの投与回数を大きく減少させることができる。
【0003】
EPOの生体内活性度は、EPO生体内半減期に比例する。EPOの生体内半減期は、EPOが持つ糖鎖の末端に位置するシアル酸(sialic acid)の含有量と相関関係があることが知られている。従って、EPOの生体内活性は、糖鎖の存在に大きく左右される。他方では、糖鎖の形態はEPOが発現される細胞の種類によってそれぞれ異なるので、同じ糖蛋白質を異なる細胞で発現させれば、異なる糖鎖を呈する。いくつかのバクテリア、例えば、大腸菌(E.coli)は蛋白質に糖鎖を付けることができないことが知られている。一般に、大腸菌で発現される蛋白質には糖鎖を含まないので、大腸菌由来のEPOは糖鎖を含まず、この場合、増加したインビトロ(in vitro)活性と減少した生体内活性の両方を示す。その理由は、脱グリコシル化EPOは急速に体内から除去され、その半減期が極めて短いためでる。結論として、糖鎖の存在の有無は、EPOの活性に非常に重要な役割を果たす。
【0004】
EPOの活性を増加させるために多くの研究が行われてきた。主な研究方法は、突然変異誘発でEPO遺伝子に突然変異を誘発させることによって、いくつかのアミノ酸を置換させてその目的を達成する方法である。例えば、PCT/US94/09257(名称:”エリスロポエチン類似体”、出願人:アムジェン社)には突然変異誘発を用いてEPOの糖含有量を増加させることによって、体内半減期を延長させる方法が開示されている。また、EPOの二量体形成によって、EPOの半減期を延長させる試みもあった(参照:A. J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, No. 35, pp24773−24778)。その他にも、公知の他の方法として、EPOに新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてEPOの糖鎖含有量、すなわち、シアル酸の含有量を増加させることによって、生体内活性度を増強させる方法等がある。しかし、そのような方法で、すべてのアミノ酸、ペプチドまたは異種の蛋白質断片を使用することはできない。多くの場合、このような融合は蛋白質固有の活性を低下または喪失させる結果を招き、生体内で用いられる時に抗原性の問題を引き起こし得るからである。
【0005】
融合蛋白質またはキメラ蛋白質等が研究されており、例えば、性ホルモンの一種である卵胞刺激ホルモンに関する研究がある(参照:Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol.)。しかし、これらの方法は実際の産業には適用されなかった。蛋白質変形は多くの危険性があり、専門的技術がないと目的蛋白質が容易に得られず、蛋白質本来の活性が喪失または減少し、正反対の結果を引き起こし得るからである。
【0006】
発明の詳細な記載
本発明者らは、EPOに新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてEPOの生体内活性度を増強し得る新しい方法の開発のために鋭意研究を行ってきた。その結果、体内に既に存在する蛋白質であるヒト絨毛性ゴナドトロピン(human chorionic gonadotropin;以下、”HCG”という)のβサブユニットのカルボキシ末端に位置するペプチド断片(carboxy terminal peptide;以下、”CTP”という)をEPOのカルボキシ末端に融合させて得た融合蛋白質がEPO本来の活性をそのまま保持しながら、糖鎖形成部位(glycosylation site)を増加させる多数のアミノ酸によって、生体内半減期が画期的に長くなる一方、体内適用時の抗原性も誘発しないという事実を見出し、本発明を完成した。
【0007】
本発明の目的は、ヒトEPOのカルボキシ末端にHCGβサブユニットのCTPが融合した、ヒトEPOの生体内活性が増強された融合蛋白質を提供することである。
【0008】
本発明の他の目的は、上記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列、上記ヌクレオチド配列を含有するプラスミド、および上記プラスミドで形質転換された宿主細胞株を提供することである。
【0009】
本発明の他の目的は、上記形質転された細胞株を培養して増強された生体内ヒトEPO活性を持つ融合蛋白質を製造する方法を提供することである。第1に、本発明はヒトEPOのカルボキシ末端にHCGβサブユニットのCTPを融合させた、生体内ヒトEPO活性が増強された融合蛋白質に関する。上記CTPは配列番号1に記載のHCGβサブユニットの第112〜145位のアミノ酸またはその一部、特に第118〜145位のアミノ酸を含むことが好ましい。
【0010】
好ましくは、本発明に係る融合蛋白質は、配列番号2に記載されたアミノ酸配列を含むことができる。
【0011】
第2に、本発明は上記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列、上記ヌクレオチド配列を含有するプラスミド、および上記プラスミドで形質転換された宿主細胞株、好ましくはCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞に関する。
【0012】
第3に、本発明は上記形質転換された細胞株を培養して増強された生体内ヒトEPOの活性を持つ融合蛋白質を製造する方法に関する。
【0013】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、ヒトEPOcDNAの製造およびクローニング、EPO−コードDNAを組み込んだ発現ベクターの構築、動物細胞の形質転換、ヒトEPOの発現、発現されたヒトEPOの精製、およびその生物学的検定法の段階を含む。
【0014】
(1)ヒトEPOcDNAの製造およびクローニング
EPOcDNAを、ヒト由来胎児肝臓のcDNAライブラリー(インビトロジェン社)で予め製造されたEPOcDNAの両末端に相補的なプライマー(EP1とEC2)を用いて通常のRT−PCR(バイオニアー社のPreMix KITTM)技術によって得ることができる:
【0015】
得られたEPOcDNAをクローニングベクターであるpGEM−T(プロメガ(Promega)社)にクローニングし(pGEMT−EPOと命名)、配列決定した後、以後の操作の鋳型として用いる。
【0016】
本発明で用いられるHCGβユニットのCTP遺伝子は、合成およびPCRセルフ−プライミングによって得られる。合成されたオリゴ−ヌクレオチド断片はEC1、C2、C3およびC4である:
【0017】
これらの4種類のオリゴマーを1μlずつ(50pモル/μl)採って、高正確度タグ(high fidelity Tag)(BM社)システムを使用してPCRを行った。
【0018】
1%アガロースゲルで約100bpsの遺伝子断片(CTP)を確認した。この遺伝子はHCGβサブユニットのカルボキシ末端の28個のアミノ酸(第118〜145位のアミノ酸)をコードするものである(図1)。
【0019】
pGEMT−EPOを鋳型として用い、プライマーとしてEP1とEC2を使用してPCRを行ってEPO遺伝子のみを得る。得られたEPO遺伝子とCTP遺伝子を共に鋳型として用い、プライマーとしてEP1とC4を利用し、高正確度タグシステム(BM社)を使用して再度PCRを行って、630bpsの所望の融合遺伝子であるECTP遺伝子を得る。この遺伝子をクローニングベクターであるpGEM−Tにクローニングした後(逆方向確認)、配列決定する(pGEMT−ECTPと命名、図2参照)。
【0020】
(2)EPO−コードするDNAを組み込む発現ベクターの構築
発現ベクターとしてpCMV−Script(ストラタジーン社)ベクターまたはpcDNA3.1ベクター(インビトロジェン社)を用いた。
【0021】
(i)発現ベクターとしてpCMV−Scriptを用いた場合
pCMV−ScriptとpGEMT−ECTPを制限酵素SacIとSacIIでそれぞれ処理し、アガロースゲル上で直線状pCMV−ScriptとECTP遺伝子をキアゲン(Qiagen)ゲル抽出キットを用いて精製した後、結紮させて大腸菌NM522内に導入した。LB−カナマイシン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素SacIとSacIIで処理した。1%アガロースゲル電気泳動でECTP遺伝子を持つコロニーを選別した。このプラスミドをpCMV−ECTPと命名した(図3)。
【0022】
(ii)発現ベクターとしてpcDNA3.1を用いた場合
pGEMT−ECTPを鋳型として用い、プライマーとしてEP11とEP22を用いて高正確度タグシステム(BM社)を使用してPCRを行って630bpsの所望の融合遺伝子であるECTP遺伝子を得る:
【0023】
このECTP遺伝子の末端はそれぞれ制限酵素認識部位HindIIIおよびBamHIを持つ。pcDNA3.1と上記で得たECTP遺伝子を制限酵素HindIIIとBamHIでそれぞれ処理した。アガロースゲル上で直線状pCMV−ScriptとECTP遺伝子を、キアゲンゲル抽出キットを用いて得た後、結紮させて大腸菌NM522内に導入して形質転換された大腸菌を得た。LB−アンピシリン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素HindIIIとBamHIで処理した。1%アガロースゲル電気泳動でECTP遺伝子を持つコロニーを選別した。このプラスミドをpcDNA3.1−ECTPと命名した(図4)。
【0024】
(3)CHO細胞の形質転換およびECTP発現
(i)発現ベクターとしてpCMV−Scriptを用いた場合
60mm細胞培養皿(dish)でCHO細胞を40〜80%(1〜4×105細胞/60mm皿)の集蜜となるように培養することによってCHO(tk−)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(BM社)3μlと細胞培地(α−MEM−培地、無血清、無抗生物質)97μlをよく混合した。この混合物にプラスミドpCMV−ECTP DNA(>0.1μg/μl、約2μg)を添加して室温で5〜10分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。1日経過後、培地をG418培地(α−MEM−培地、10%血清、およびG418 500μg/μl)に交換した。培地を7〜10日間毎日G418培地に交換し、G418抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。G418培地で選別された細胞を十分に培養した後、EPO ELISA キット(BM社)を用いて培養液から発現されたECTP蛋白質を確認した。
【0025】
(II)発現ベクターとしてpcDNA3.1を用いた場合
60mm細胞培養皿(dish)でCHO細胞を40〜80%(1〜4×105細胞/60mm皿)の集蜜となるように培養することによってCHO(DG44)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(BM社)3μlと細胞培地(α−MEM−培地、無血清、無抗生物質)97μlをよく混合し、得られた混合物にプラスミドpcDNA3.1−ECTP DNA(>0.1μg/μl、約2g)とpLTRdhfr26(ATCC37295、0.2μg)を添加して室温で5〜10分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。1日経過後、培地をG418培地(α−MEM−培地、10%FBS)に交換した。培地を7〜10日間毎日G418培地に交換し、G418抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。G418培地で選別された細胞を十分に培養した後、EPO ELISA キット(BM社)を用いて培養液から発現されたECTP蛋白質を確認した。
【0026】
(4)発現されたECTPの精製
抗−EPOモノクロナール抗体(R&Dシステム社)を用いて分離精製用親和性樹脂を下記のように調製した。
【0027】
CNBr−活性化セファロースCL 4B 0.3gを1mM HClで20分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、1mM HClで洗浄した。樹脂を4mLのカップリング緩衝液(0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3)で洗浄し、直ぐに4mLのカップリング緩衝液に入っている抗−EPOモノクロナール抗体(500μg/バイアル)とチューブ内で混合し、チューブを振りながら常温で2時間反応させた。緩衝液を遮断緩衝液(0.2M グリシン、pH8.0)にリフレッシュした後、常温で2時間チューブを振りながら反応を続けた。次に、6.5mLのカップリング緩衝液、6.5mLの酢酸塩緩衝液(0.1M 酢酸、0.5M NaCl、pH4)および6.5mLのカップリング緩衝液で順次洗浄した。カラムを調製後、下記のように発現されたECTPの精製を行った。
【0028】
細胞を無血清培養液で一日培養した後、細胞のない培地をセントリプレップTM(CentriprepTM、MWCO 10,000、ミリポア社)を用いて約5分の1に濃縮した。次いで、これを20mL/hrの流速でPBSによって平衡化させたカラムに充填し、再びPBSで洗浄した。カラムを溶出緩衝液(0.1M グリシン、pH2.8)で洗浄した後、溶出液を直ぐに1Mトリス−HClでpH7.5に滴定した。SDS−PAGEおよび銀染色によって分析したとき、純度は97%以上であった。
【0029】
(5)バイオアッセイ法による活性測定および生化学的分析
フェニルヒドラジンで処理されたマウスの脾臓細胞を用いて発現および適当に精製されたEPOおよびECTPのインビトロ生物活性を測定した。ECTPがEPOより高い活性を示した。ECTPに添加されたCTPの存在は、EPOの活性自体を妨害しないことを確認することができる。
【0030】
EPOの生体内活性に非常に重要な役割をするすることが知られている糖、すなわち、糖鎖末端に位置するシアル酸の存在を確認するために、IEF(Isoelectric focusing:等電点電気泳動)を実施した。シアル酸の強い負電荷のために、シアル酸含有量の増加は蛋白質を低いpHに移動させる。IEFゲルパターン(ノベックス(Novex)社)でECTPはEPOより低いpHに移動しているこを確認することができる。これはECTPがEPOより生体内活性がはるかに長く持続され得ることを示す。
【0031】
(6)薬物動態学試験
製造された候補物質が実際生体内でより長い持続性を持つか否かをテストするために、薬物動態学試験実施した。候補物質を4匹のマウスに対して1匹20ユニットの投与量で静脈内投与した。マウスから採血した後、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Manheim)社のEIAキットを用いてEPOおよびECTPの濃度を決定した。候補物質ECTPはコントロールのEPOよりはるかに長い半減期を示すことがわかった(図6)。
【0032】
発明の実施のための最良の形態
以下、本発明を実施例に基づいて、より詳細に説明するが、これによって本発明の範囲が限定されるものではない。
【0033】
実施例1:ヒトEPOcDNAの製作およびクローニング
EPOcDNAをヒト由来胎児肝臓のcDNAライブラリー(インビトロジェン社)で予め製作されたEPOcDNAの両末端に相補的なプライマー(EP1、EC2)を用いて通常のRT−PCR(バイオニアー社のPreMix KITTM)技術を行って得た。PCRを55℃でアニーリング35秒、72℃で40秒および94℃で20秒の条件下で、総30サイクルPCRを行ってEPOcDNAを得た。得られたEPOcDNAをクローニングベクターであるpGEM−T(プロメガ社)にクローニングした。すなわち、PCR生成物を1%アガロースゲルに流し、分離されたEPOcDNAをpGEM−Tに結紮させた。次に、組換えpGEM−Tを大腸菌NM522内に導入して形質転換された大腸菌を得た。X−gal/IPTGを塗抹したLB−アンピシリン固体培地で一夜培養した、白色コロニーからプラスミドDNAを精製し、制限酵素SacIおよびSacIIと反応させてEPOcDNAが含まれているコロニーを選別した。得られたプラスミドをpGEMT−EPOと命名した。
【0034】
HCGβ ユニットのCTP遺伝子は、ヌクレオチド合成およびPCRセルフープライミングを用いて得た。合成されたオリゴヌクレオチドはEC1、C2、C3およびC4である。これら4つの遺伝子を1μl(50pモル/μl)ずつ採って、55℃でアニーリング40秒、72℃で40秒、94℃で20秒の条件下で総15サイクルのPCRを行った。1%アガロースゲル上で約100bpsのDNA断片を確認した。この遺伝子はHCGβサブユニットのカルボキシ末端の28個のアミノ酸をコードするものである(図1)。
【0035】
pGEMT−EPOを鋳型として用い、プライマーとしてEP1とEC2を使用して上記と同一条件でPCRを行ってEPO遺伝子のみを得た。鋳型としてCTPと、プライマーとしてEP1とEC2を同時に用い、58℃でアニーリング40秒、72℃で60秒、94℃で20秒の条件下で総30サイクルのPCRを行うことによって、630bpsのECTP遺伝子を得た。この遺伝子をクローニングベクターであるpGEM−Tに上記と同様にしてクローニングした後、配列決定した(pGEMT−ECTPと命名、図2)。
【0036】
実施例2:発現ベクターpCMV−ECTPの構築
発現ベクターとしてpCMV−Script(ストラタジーン社)を用いた。pCMV−ScriptとpGEMT−ECTPを制限酵素SacIとSacIIでそれぞれ処理し、アガロースゲル上で直線状pCMV−ScriptとECTP遺伝子をキアゲンゲル抽出キットを用いて得た後、結紮させて大腸菌NM522内に導入した。LB−カナマイシン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素SacIとSacIIで処理した。1%アガロースゲル電気泳動でECTP遺伝子が含まれたコロニーを選別した。このプラスミドをpCMV−ECTPと命名した(図3)。
【0037】
実施例3:発現ベクターpcDNA3.1−ECTPの構築
発現ベクターとしてインビトロジェン社のpcDNA3.1ベクター(インビトロジェン社)を用いた。pGEMP−ECTPを鋳型として用い、プライマーとしてEP11とEP22を用い、およびBM社の高正確度タグシステムを使用してPCRを行って630bpsの所望の融合遺伝子を得た。このECTP遺伝子の末端はそれぞれHindIIIおよびBamHIの制限酵素認識部位を持つ。pcDNA3.1と上記で得たECTP遺伝子を制限酵素HindIIIとBamHIでそれぞれ処理した。アガロースゲル上で直線状pCMV−ScriptとECTP遺伝子をキアゲンゲル抽出キットを用いて得た後、結紮させて大腸菌NM522内に導入した。LB−アンピシリン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素HindIIIとBamHIで処理した。1%アガロースゲル電気泳動でECTP遺伝子が含まれたコロニーを選別した。このプラスミドをpcDNA3.1−ECTPと命名した(図4)。
【0038】
実施例4:CHO細胞の形質転換およびECTP発現 (i)発現ベクターとしてpCMV−Scriptを用いた場合
60mm細胞培養皿(dish)でCHO細胞を40〜80%(1〜4×105細胞/60mm皿)の集蜜となるように培養することによってCHO(tk−)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(BM社)3μlと細胞培地(α−MEM−培地、無血清、無抗生物質)97μlをよく混合し、この混合物にプラスミドpCMV−ECTP DNA(>0.1μg/μl、約2μg)を添加して室温で5〜10分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。1日経過後、培地をG418培地(α−MEM−培地、10%血清、およびG418 500μg/μl)に交換した。培地を7〜10日間毎日G418培地に交換し、G418抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。G418培地で選別された細胞を十分に培養した後、EPO ELISA キット(BM社)を用いて培養液から発現されたECTP蛋白質を確認した。
【0039】
(II)発現ベクターとしてpcDNA3.1を用いた場合
60mm細胞培養皿(dish)でCHO細胞を40〜80%(1〜4×105細胞/60mm皿)の集蜜となるように培養することによってCHO(DG44)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(BM社)3μlと細胞培地(α−MEM−培地、無血清、無抗生物質)97μlをよく混合し、得られた混合物にプラスミドpcDNA3.1−ECTP DNA(>0.1μg/μl、約2μg)とpLTRdhfr26(ATCC37295、0.2μg)を添加して室温で5〜10分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。1日経過後、培地をG418培地(α−MEM−培地、10%FBS)に交換した。培地を7〜10日間毎日G418培地に交換し、G418抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。G418培地で選別された細胞を十分に培養した後、EPO ELISA キット(BM社)を用いて培養液から発現されたECTP蛋白質を確認した。
【0040】
実施例5:発現されたECTPの精製
R&Dシステム社の抗−EPOモノクロナール抗体を用いて分離精製用親和性樹脂を下記のように製造した。
【0041】
CNBr−活性化セファロースCL 4B 0.3 gを1mM HClで20分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、1mM HClで洗浄した。
樹脂を4mLのカップリング緩衝液(0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3)で洗浄し、直ぐに4mLのカップリング緩衝液に入っている抗−EPOモノクロナール抗体(500μg/バイアル)とチューブ内で混合し、チューブを振りながら常温で2時間反応させた。緩衝液を遮断緩衝液(0.2M グリシン、pH8.0)に置き換えた後、常温で2時間チューブを振りながら反応を続けた。次に、6.5mLのカップリング緩衝液、6.5mLの酢酸塩緩衝液(0.1M 酢酸、0.5M NaCl、pH4)および6.5mLのカップリング緩衝液で順次洗浄した。カラムを調製した後、下記のように、発現されたECTPの精製を行った。
【0042】
細胞を無血清培養液で一日培養した後、細胞のない培地をセントリプレップTM(CentriprepTM、MWCO 10,000、ミリポア社)を用いて約5分の1に濃縮した。20mL/hrの流速でPBSによって平衡化させたカラムに充填し、再びPBSで洗浄した。カラムを溶出緩衝液(0.1M グリシン、pH2.8)で洗浄した後、溶出液を直ぐに1Mトリス−HClでpH7.5に滴定した。精製されたECTPのSDS−PAGEを図5aに示した。SDS−PAGEおよび銀染色によって分析したとき、純度は97%以上であった。
【0043】
実施例6:バイオアッセイ法による活性測定およびIEF分析
フェニルヒドラジンをマウスに1日1回、2日間60mg/kgずつ注射した。3日経過後、拡大した脾臓を分離し、ホモジナイザーで破砕して脾臓細胞を得た。脾臓細胞を6×106細胞/mLで希釈して96ウェルプレートに100μlずつ分注した。分注された各ウェルに標準EPO(0〜500mU/mL)と、発現されたEPOおよびECTPを100mU/mLの濃度でそれぞれ加えた後、プレートを37℃ CO2インキュベーターで22時間放置した。各ウェルにジメチル3[H]−チミジン(20μCi/mL)を50μlずつ加えた後、同じインキュベーターで2時間さらに反応させた。反応液を各ウェル別にグラスフィルター(Nunc 1−73164)に吸着させた。フィルターを生理食塩水で3回洗浄してβカウンターを用いて各フィルターの放射能量を測定した。適当に精製されたEPOおよびECTPの活性を測定した時、ECTPの活性がEPO活性に類似するか、若干高く現れた。EPOに添加されたCTPの存在は、EPOの活性自体を妨害しないことを確認することができた。
【0044】
EPOの生体内活性に重要な役割をするものと知られている糖、すなわち、糖鎖末端に位置するシアル酸の存在を確認するために、IEF(等電点電気泳動)分析を実施した。IEFゲルパターン(ノベックス社)を図5bに示した。図5bに示すように、ECTPはEPOより顕著に負極へ移動するパターンを示すことが確認された。これはECTPがEPOに比べて生体内活性が顕著に長く持続され得ることを示す。
【0045】
実施例7:薬物動態学試験
製造された候補物質が、実際に生体内では長い半減期を持っているか否かを確認するために、薬物動態学試験をマウスを対象に実施した。実施例6に記載された方法によって精製された融合蛋白質をそれぞれ合計4匹のマウスに対し、1匹当たり20ユニットで静脈内投与した。経時的血中濃度を確認するために、最初の2時間は30分間隔で、後は2時間間隔で採血した後、ベーリンガー・マンハイム社のEIAキットを使用して濃度を決定した。その結果を図6に示した。図6に示すように、候補物質ECTPはコントロールEPOより約2.5倍以上のはるかに長い半減期を示すことがわかった。
【0046】
産業上利用可能性
本発明の融合蛋白質は、EPOの固有活性自体には影響を与えず、糖鎖を増加させるアミノ酸の存在によってEPOの生体内半減期を画期的に延長させ、CTPは体内ペプチドであるから、抗原性を誘発せず産業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図1】HCGのカルボキシ末端ペプチド(CTP)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図2】EPOとCTPである融合蛋白質(ECTP)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図3】発現ベクターpCMV−ECTPの製作過程を示す模式図である。
【図4】発現ベクターpcDNA3.1−ECTPの製作過程を示す模式図である。
【図5a】精製されたECTPの電気泳動写真である。
【図5b】発現されたEPOとECTPのIEF写真である。
【図6】EPOとECTPの薬物動態学結果を示すグラフである。
Claims (5)
- ヒトEPOのカルボキシ末端で、ヒトEPOとヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)βサブユニットのカルボキシ末端ペプチド断片(CTP)を融合させた、ヒトEPOの生体内活性が増強された融合蛋白質(ECTP)。
- カルボキシ末端ペプチド断片が、配列番号1に記載のHCGβサブユニットの第112〜145位のアミノ酸、またはその一部を含むものである、請求項1記載の融合蛋白質。
- カルボキシ末端ペプチド断片が、HCGβサブユニットの第118〜145位のアミノ酸を含むものである、請求項2記載の融合蛋白質。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列。
- 生体内ヒトEPO活性が増強された融合蛋白質の製造方法であって、請求項4に記載のDNAを含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞株を培養することを特徴とする方法。
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