JP3946638B2 - 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質 - Google Patents
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【０００１】
技術分野
本発明は、新規な貧血治療剤であって、エリスロポエチンの生体内(in vivo)活性が増強された融合蛋白質(fusion protein)に関する。より詳細には、本発明はＥＰＯ分子と、半減期(half-life)増加活性を持つ人体由来の特定ペプチドとの融合によって、エリスロポエチンの生体内活性が画期的に増強された融合蛋白質に関する。
【０００２】
背景技術
エリスロポエチン(ＥＰＯ)は分子量３０,０００〜３４,０００の糖蛋白質であり、赤血球の生成を促進する。この蛋白質は、赤血球前駆細胞の受容体との結合によって初めてその機能を発揮し、細胞内カルシウムイオン濃度の増加、ＤＮＡ生合成の増加およびヘモグロビン生成の刺激などを起こす。この組換えヒトＥＰＯ(rhＥＰＯ)は、腎臓病患者の貧血、未熟児の貧血、甲状腺機能低下症による貧血、栄養失調による貧血などの治療剤のために用いられてきた。他方で、rhＥＰＯの臨床的利用は拡大しつつある。しかし、rhＥＰＯの短い半減期のために、平均週３回の投与の不便さと高コストをもたらす。従って、ＥＰＯの生体内活性を長期間維持させれば、ＥＰＯの投与回数を大きく減少させることができる。
【０００３】
ＥＰＯの生体内活性度は、ＥＰＯ生体内半減期に比例する。ＥＰＯの生体内半減期は、ＥＰＯが持つ糖鎖の末端に位置するシアル酸(sialic acid)の含有量と相関関係があることが知られている。従って、ＥＰＯの生体内活性は、糖鎖の存在に大きく左右される。他方では、糖鎖の形態はＥＰＯが発現される細胞の種類によってそれぞれ異なるので、同じ糖蛋白質を異なる細胞で発現させれば、異なる糖鎖を呈する。いくつかのバクテリア、例えば、大腸菌(E.coli)は蛋白質に糖鎖を付けることができないことが知られている。一般に、大腸菌で発現される蛋白質には糖鎖を含まないので、大腸菌由来のＥＰＯは糖鎖を含まず、この場合、増加したインビトロ(in vitro)活性と減少した生体内活性の両方を示す。その理由は、脱グリコシル化ＥＰＯは急速に体内から除去され、その半減期が極めて短いためでる。結論として、糖鎖の存在の有無は、ＥＰＯの活性に非常に重要な役割を果たす。
【０００４】
ＥＰＯの活性を増加させるために多くの研究が行われてきた。主な研究方法は、突然変異誘発でＥＰＯ遺伝子に突然変異を誘発させることによって、いくつかのアミノ酸を置換させてその目的を達成する方法である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２５７(名称："エリスロポエチン類似体"、出願人：アムジェン社)には突然変異誘発を用いてＥＰＯの糖含有量を増加させることによって、体内半減期を延長させる方法が開示されている。また、ＥＰＯの二量体形成によって、ＥＰＯの半減期を延長させる試みもあった(参照：A. J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, No. 35, pp24773-24778)。その他にも、公知の他の方法として、ＥＰＯに新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの糖鎖含有量、すなわち、シアル酸の含有量を増加させることによって、生体内活性度を増強させる方法等がある。しかし、そのような方法で、すべてのアミノ酸、ペプチドまたは異種の蛋白質断片を使用することはできない。多くの場合、このような融合は蛋白質固有の活性を低下または喪失させる結果を招き、生体内で用いられる時に抗原性の問題を引き起こし得るからである。
【０００５】
融合蛋白質またはキメラ蛋白質等が研究されており、例えば、性ホルモンの一種である卵胞刺激ホルモンに関する研究がある(参照：Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol.)。しかし、これらの方法は実際の産業には適用されなかった。蛋白質変形は多くの危険性があり、専門的技術がないと目的蛋白質が容易に得られず、蛋白質本来の活性が喪失または減少し、正反対の結果を引き起こし得るからである。
【０００６】
発明の詳細な記載
本発明者らは、ＥＰＯに新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの生体内活性度を増強し得る新しい方法の開発のために鋭意研究を行ってきた。その結果、体内に既に存在する蛋白質であるヒト絨毛性ゴナドトロピン(human chorionic gonadotropin；以下、"ＨＣＧ"という)のβサブユニットのカルボキシ末端に位置するペプチド断片(carboxy terminal peptide；以下、"ＣＴＰ"という)をＥＰＯのカルボキシ末端に融合させて得た融合蛋白質がＥＰＯ本来の活性をそのまま保持しながら、糖鎖形成部位(glycosylation site)を増加させる多数のアミノ酸によって、生体内半減期が画期的に長くなる一方、体内適用時の抗原性も誘発しないという事実を見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明の目的は、ヒトＥＰＯのカルボキシ末端にＨＣＧβサブユニットのＣＴＰが融合した、ヒトＥＰＯの生体内活性が増強された融合蛋白質を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列、上記ヌクレオチド配列を含有するプラスミド、および上記プラスミドで形質転換された宿主細胞株を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、上記形質転された細胞株を培養して増強された生体内ヒトＥＰＯ活性を持つ融合蛋白質を製造する方法を提供することである。第１に、本発明はヒトＥＰＯのカルボキシ末端にＨＣＧβサブユニットのＣＴＰを融合させた、生体内ヒトＥＰＯ活性が増強された融合蛋白質に関する。上記ＣＴＰは配列番号１に記載のＨＣＧβサブユニットの第１１２〜１４５位のアミノ酸またはその一部、特に第１１８〜1４５位のアミノ酸を含むことが好ましい。
【００１０】
好ましくは、本発明に係る融合蛋白質は、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含むことができる。
【００１１】
第２に、本発明は上記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列、上記ヌクレオチド配列を含有するプラスミド、および上記プラスミドで形質転換された宿主細胞株、好ましくはＣＨＯ(チャイニーズハムスター卵巣)細胞に関する。
【００１２】
第３に、本発明は上記形質転換された細胞株を培養して増強された生体内ヒトＥＰＯの活性を持つ融合蛋白質を製造する方法に関する。
【００１３】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、ヒトＥＰＯcＤＮＡの製造およびクローニング、ＥＰＯ−コードＤＮＡを組み込んだ発現ベクターの構築、動物細胞の形質転換、ヒトＥＰＯの発現、発現されたヒトＥＰＯの精製、およびその生物学的検定法の段階を含む。
【００１４】
(１)ヒトＥＰＯcＤＮＡの製造およびクローニング
ＥＰＯcＤＮＡを、ヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン社)で予め製造されたＥＰＯcＤＮＡの両末端に相補的なプライマー(ＥＰ１とＥＣ２)を用いて通常のＲＴ−ＰＣＲ(バイオニアー社のＰreＭix ＫＩＴTM)技術によって得ることができる：
ＥＰ１：ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(配列番号３)
ＥＣ２：GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(配列番号４)
【００１５】
得られたＥＰＯcＤＮＡをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ(Promega)社)にクローニングし(pＧＥＭＴ−ＥＰＯと命名)、配列決定した後、以後の操作の鋳型として用いる。
【００１６】
本発明で用いられるＨＣＧβユニットのＣＴＰ遺伝子は、合成およびＰＣＲセルフ−プライミングによって得られる。合成されたオリゴ−ヌクレオチド断片はＥＣ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４である：
ＥＣ１：AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACTCCTCTTCCT(配列番号５)
Ｃ２：GGAAGGCTGGGGGGAGGGGCCTTTGAGGAAGAGGA(配列番号６)
Ｃ３：CCAGCCTTCCAAGCCCATCCCGACTCCCGGGGCCC(配列番号７)
Ｃ４：TTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTCCGAGGGCCCCG(配列番号８)
【００１７】
これらの４種類のオリゴマーを１μlずつ(５０pモル／μl)採って、高正確度タグ(high fidelity Tag)(ＢＭ社)システムを使用してＰＣＲを行った。
【００１８】
１％アガロースゲルで約1００bpsの遺伝子断片(ＣＴＰ)を確認した。この遺伝子はＨＣＧβサブユニットのカルボキシ末端の２８個のアミノ酸(第１１８〜１４５位のアミノ酸)をコードするものである(図１)。
【００１９】
pＧＥＭＴ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１とＥＣ２を使用してＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得る。得られたＥＰＯ遺伝子とＣＴＰ遺伝子を共に鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１とＣ４を利用し、高正確度タグシステム(ＢＭ社)を使用して再度ＰＣＲを行って、６３０bpsの所望の融合遺伝子であるＥＣＴＰ遺伝子を得る。この遺伝子をクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔにクローニングした後(逆方向確認)、配列決定する(pＧＥＭＴ−ＥＣＴＰと命名、図２参照)。
【００２０】
(２)ＥＰＯ−コードするＤＮＡを組み込む発現ベクターの構築
発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcript(ストラタジーン社)ベクターまたはpcＤＮＡ３.１ベクター(インビトロジェン社)を用いた。
【００２１】
(i)発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcriptを用いた場合
pＣＭＶ−ＳcriptとpＧＥＭＴ−ＥＣＴＰを制限酵素ＳacＩとＳacIIでそれぞれ処理し、アガロースゲル上で直線状pＣＭＶ−ＳcriptとＥＣＴＰ遺伝子をキアゲン(Qiagen)ゲル抽出キットを用いて精製した後、結紮させて大腸菌ＮＭ５２２内に導入した。ＬＢ−カナマイシン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素ＳacＩとＳacIIで処理した。１％アガロースゲル電気泳動でＥＣＴＰ遺伝子を持つコロニーを選別した。このプラスミドをpＣＭＶ−ＥＣＴＰと命名した(図３)。
【００２２】
(ii)発現ベクターとしてｐcＤＮＡ３.１を用いた場合
pＧＥＭＴ−ＥＣＴＰを鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１１とＥＰ２２を用いて高正確度タグシステム(ＢＭ社)を使用してＰＣＲを行って６３０bpsの所望の融合遺伝子であるＥＣＴＰ遺伝子を得る：
ＥＰ１１：TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(配列番号９)
ＥＰ２２：TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT(配列番号１０)
【００２３】
このＥＣＴＰ遺伝子の末端はそれぞれ制限酵素認識部位ＨindIIIおよびＢamＨＩを持つ。ｐcＤＮＡ３.１と上記で得たＥＣＴＰ遺伝子を制限酵素ＨindIIIとＢamＨＩでそれぞれ処理した。アガロースゲル上で直線状pＣＭＶ−ＳcriptとＥＣＴＰ遺伝子を、キアゲンゲル抽出キットを用いて得た後、結紮させて大腸菌ＮＭ５２２内に導入して形質転換された大腸菌を得た。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素ＨindIIIとＢamＨＩで処理した。１％アガロースゲル電気泳動でＥＣＴＰ遺伝子を持つコロニーを選別した。このプラスミドをｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰと命名した(図４)。
【００２４】
(３)ＣＨＯ細胞の形質転換およびＥＣＴＰ発現
(i)発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcriptを用いた場合
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞を４０〜８０％(１〜４×１０5細胞／６０mm皿)の集蜜となるように培養することによってＣＨＯ(tk−)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(ＢＭ社)３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合した。この混合物にプラスミドpＣＭＶ−ＥＣＴＰ ＤＮＡ(＞０.１μg／μl、約２μg)を添加して室温で５〜１０分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。１日経過後、培地をＧ４１８培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％血清、およびＧ４１８ ５００μg／μl)に交換した。培地を７〜１０日間毎日Ｇ４１８培地に交換し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ キット(ＢＭ社)を用いて培養液から発現されたＥＣＴＰ蛋白質を確認した。
【００２５】
(II)発現ベクターとしてｐcＤＮＡ３.１を用いた場合
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞を４０〜８０％(１〜４×１０5細胞／６０mm皿)の集蜜となるように培養することによってＣＨＯ(ＤＧ４４)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(ＢＭ社)３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合し、得られた混合物にプラスミドｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰ ＤＮＡ(＞０.１μg／μl、約２g)とpＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加して室温で５〜１０分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。１日経過後、培地をＧ４１８培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％ＦＢＳ)に交換した。培地を７〜１０日間毎日Ｇ４１８培地に交換し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ キット(ＢＭ社)を用いて培養液から発現されたＥＣＴＰ蛋白質を確認した。
【００２６】
(４)発現されたＥＣＴＰの精製
抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(Ｒ＆Ｄシステム社)を用いて分離精製用親和性樹脂を下記のように調製した。
【００２７】
ＣＮＢr−活性化セファロースＣＬ ４Ｂ ０.３ｇを１mＭ ＨＣlで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mＭ ＨＣlで洗浄した。樹脂を４mLのカップリング緩衝液(０.１Ｍ ＮaＨＣＯ3、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ８.３)で洗浄し、直ぐに４mLのカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)とチューブ内で混合し、チューブを振りながら常温で２時間反応させた。緩衝液を遮断緩衝液(０.２Ｍ グリシン、pＨ８.０)にリフレッシュした後、常温で２時間チューブを振りながら反応を続けた。次に、６.５mLのカップリング緩衝液、６.５mLの酢酸塩緩衝液(０.１Ｍ 酢酸、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ４)および６.５mLのカップリング緩衝液で順次洗浄した。カラムを調製後、下記のように発現されたＥＣＴＰの精製を行った。
【００２８】
細胞を無血清培養液で一日培養した後、細胞のない培地をセントリプレップＴＭ(CentriprepTM、ＭＷＣＯ １０,０００、ミリポア社)を用いて約５分の１に濃縮した。次いで、これを２０mL／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに充填し、再びＰＢＳで洗浄した。カラムを溶出緩衝液(０.１Ｍ グリシン、pＨ２.８)で洗浄した後、溶出液を直ぐに１Ｍトリス−ＨＣlでpＨ７.５に滴定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は９７％以上であった。
【００２９】
(５)バイオアッセイ法による活性測定および生化学的分析
フェニルヒドラジンで処理されたマウスの脾臓細胞を用いて発現および適当に精製されたＥＰＯおよびＥＣＴＰのインビトロ生物活性を測定した。ＥＣＴＰがＥＰＯより高い活性を示した。ＥＣＴＰに添加されたＣＴＰの存在は、ＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができる。
【００３０】
ＥＰＯの生体内活性に非常に重要な役割をするすることが知られている糖、すなわち、糖鎖末端に位置するシアル酸の存在を確認するために、ＩＥＦ(Isoelectric focusing：等電点電気泳動)を実施した。シアル酸の強い負電荷のために、シアル酸含有量の増加は蛋白質を低いpＨに移動させる。ＩＥＦゲルパターン(ノベックス(Novex)社)でＥＣＴＰはＥＰＯより低いpＨに移動しているこを確認することができる。これはＥＣＴＰがＥＰＯより生体内活性がはるかに長く持続され得ることを示す。
【００３１】
(６)薬物動態学試験
製造された候補物質が実際生体内でより長い持続性を持つか否かをテストするために、薬物動態学試験実施した。候補物質を４匹のマウスに対して１匹２０ユニットの投与量で静脈内投与した。マウスから採血した後、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Manheim)社のＥＩＡキットを用いてＥＰＯおよびＥＣＴＰの濃度を決定した。候補物質ＥＣＴＰはコントロールのＥＰＯよりはるかに長い半減期を示すことがわかった(図６)。
【００３２】
発明の実施のための最良の形態
以下、本発明を実施例に基づいて、より詳細に説明するが、これによって本発明の範囲が限定されるものではない。
【００３３】
実施例１：ヒトＥＰＯcＤＮＡの製作およびクローニング
ＥＰＯcＤＮＡをヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン社)で予め製作されたＥＰＯcＤＮＡの両末端に相補的なプライマー(ＥＰ１、ＥＣ２)を用いて通常のＲＴ−ＰＣＲ(バイオニアー社のＰreＭix ＫＩＴTM)技術を行って得た。ＰＣＲを５５℃でアニーリング３５秒、７２℃で４０秒および９４℃で２０秒の条件下で、総３０サイクルＰＣＲを行ってＥＰＯcＤＮＡを得た。得られたＥＰＯcＤＮＡをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ社)にクローニングした。すなわち、ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルに流し、分離されたＥＰＯcＤＮＡをpＧＥＭ−Ｔに結紮させた。次に、組換えpＧＥＭ−Ｔを大腸菌ＮＭ５２２内に導入して形質転換された大腸菌を得た。Ｘ−gal／ＩＰＴＧを塗抹したＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した、白色コロニーからプラスミドＤＮＡを精製し、制限酵素ＳacＩおよびＳacIIと反応させてＥＰＯcＤＮＡが含まれているコロニーを選別した。得られたプラスミドをpＧＥＭＴ−ＥＰＯと命名した。
【００３４】
ＨＣＧβ ユニットのＣＴＰ遺伝子は、ヌクレオチド合成およびＰＣＲセルフープライミングを用いて得た。合成されたオリゴヌクレオチドはＥＣ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４である。これら４つの遺伝子を１μl(５０pモル／μl)ずつ採って、５５℃でアニーリング４０秒、７２℃で４０秒、９４℃で２０秒の条件下で総１５サイクルのＰＣＲを行った。１％アガロースゲル上で約１００bpsのＤＮＡ断片を確認した。この遺伝子はＨＣＧβサブユニットのカルボキシ末端の２８個のアミノ酸をコードするものである(図１)。
【００３５】
pＧＥＭＴ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１とＥＣ２を使用して上記と同一条件でＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得た。鋳型としてＣＴＰと、プライマーとしてＥＰ１とＥＣ２を同時に用い、５８℃でアニーリング４０秒、７２℃で６０秒、９４℃で２０秒の条件下で総３０サイクルのＰＣＲを行うことによって、６３０bpsのＥＣＴＰ遺伝子を得た。この遺伝子をクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔに上記と同様にしてクローニングした後、配列決定した(pＧＥＭＴ−ＥＣＴＰと命名、図２)。
【００３６】
実施例２：発現ベクターpＣＭＶ−ＥＣＴＰの構築
発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcript(ストラタジーン社)を用いた。pＣＭＶ−ＳcriptとpＧＥＭＴ−ＥＣＴＰを制限酵素ＳacＩとＳacIIでそれぞれ処理し、アガロースゲル上で直線状pＣＭＶ−ＳcriptとＥＣＴＰ遺伝子をキアゲンゲル抽出キットを用いて得た後、結紮させて大腸菌ＮＭ５２２内に導入した。ＬＢ−カナマイシン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素ＳacＩとＳacIIで処理した。１％アガロースゲル電気泳動でＥＣＴＰ遺伝子が含まれたコロニーを選別した。このプラスミドをpＣＭＶ−ＥＣＴＰと命名した(図３)。
【００３７】
実施例３：発現ベクターｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰの構築
発現ベクターとしてインビトロジェン社のｐcＤＮＡ３.１ベクター(インビトロジェン社)を用いた。pＧＥＭＰ−ＥＣＴＰを鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１１とＥＰ２２を用い、およびＢＭ社の高正確度タグシステムを使用してＰＣＲを行って６３０bpsの所望の融合遺伝子を得た。このＥＣＴＰ遺伝子の末端はそれぞれＨindIIIおよびＢamＨＩの制限酵素認識部位を持つ。ｐcＤＮＡ３.１と上記で得たＥＣＴＰ遺伝子を制限酵素ＨindIIIとＢamＨＩでそれぞれ処理した。アガロースゲル上で直線状pＣＭＶ−ＳcriptとＥＣＴＰ遺伝子をキアゲンゲル抽出キットを用いて得た後、結紮させて大腸菌ＮＭ５２２内に導入した。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素ＨindIIIとＢamＨＩで処理した。１％アガロースゲル電気泳動でＥＣＴＰ遺伝子が含まれたコロニーを選別した。このプラスミドをｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰと命名した(図４)。
【００３８】
実施例４：ＣＨＯ細胞の形質転換およびＥＣＴＰ発現 (i)発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcriptを用いた場合
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞を４０〜８０％(１〜４×１０5細胞／６０mm皿)の集蜜となるように培養することによってＣＨＯ(tk−)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(ＢＭ社)３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合し、この混合物にプラスミドpＣＭＶ−ＥＣＴＰ ＤＮＡ(＞０.１μg／μl、約２μg)を添加して室温で５〜１０分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。１日経過後、培地をＧ４１８培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％血清、およびＧ４１８ ５００μg／μl)に交換した。培地を７〜１０日間毎日Ｇ４１８培地に交換し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ キット(ＢＭ社)を用いて培養液から発現されたＥＣＴＰ蛋白質を確認した。
【００３９】
(II)発現ベクターとしてｐcＤＮＡ３.１を用いた場合
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞を４０〜８０％(１〜４×１０5細胞／６０mm皿)の集蜜となるように培養することによってＣＨＯ(ＤＧ４４)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(ＢＭ社)３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合し、得られた混合物にプラスミドｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰ ＤＮＡ(＞０.１μg／μl、約２μg)とpＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加して室温で５〜１０分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。１日経過後、培地をＧ４１８培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％ＦＢＳ)に交換した。培地を７〜１０日間毎日Ｇ４１８培地に交換し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ キット(ＢＭ社)を用いて培養液から発現されたＥＣＴＰ蛋白質を確認した。
【００４０】
実施例５：発現されたＥＣＴＰの精製
Ｒ＆Ｄシステム社の抗−ＥＰＯモノクロナール抗体を用いて分離精製用親和性樹脂を下記のように製造した。
【００４１】
ＣＮＢr−活性化セファロースＣＬ ４Ｂ ０.３ gを１mＭ ＨＣlで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mＭ ＨＣlで洗浄した。
樹脂を４mLのカップリング緩衝液(０.１Ｍ ＮaＨＣＯ3、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ８.３)で洗浄し、直ぐに４mLのカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)とチューブ内で混合し、チューブを振りながら常温で２時間反応させた。緩衝液を遮断緩衝液(０.２Ｍ グリシン、pＨ８.０)に置き換えた後、常温で２時間チューブを振りながら反応を続けた。次に、６.５mLのカップリング緩衝液、６.５mLの酢酸塩緩衝液(０.１Ｍ 酢酸、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ４)および６.５mLのカップリング緩衝液で順次洗浄した。カラムを調製した後、下記のように、発現されたＥＣＴＰの精製を行った。
【００４２】
細胞を無血清培養液で一日培養した後、細胞のない培地をセントリプレップTM(CentriprepTM、ＭＷＣＯ １０,０００、ミリポア社)を用いて約５分の１に濃縮した。２０mL／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに充填し、再びＰＢＳで洗浄した。カラムを溶出緩衝液(０.１Ｍ グリシン、pＨ２.８)で洗浄した後、溶出液を直ぐに１Ｍトリス−ＨＣlでpＨ７.５に滴定した。精製されたＥＣＴＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図５aに示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は９７％以上であった。
【００４３】
実施例６：バイオアッセイ法による活性測定およびＩＥＦ分析
フェニルヒドラジンをマウスに１日１回、２日間６０mg／kgずつ注射した。３日経過後、拡大した脾臓を分離し、ホモジナイザーで破砕して脾臓細胞を得た。脾臓細胞を６×１０6細胞／mLで希釈して９６ウェルプレートに１００μlずつ分注した。分注された各ウェルに標準ＥＰＯ(０〜５００mＵ／mL)と、発現されたＥＰＯおよびＥＣＴＰを１００mＵ／mLの濃度でそれぞれ加えた後、プレートを３７℃ ＣＯ２インキュベーターで２２時間放置した。各ウェルにジメチル3[Ｈ]−チミジン(２０μＣi／mL)を５０μlずつ加えた後、同じインキュベーターで２時間さらに反応させた。反応液を各ウェル別にグラスフィルター(Ｎunc １−７３１６４)に吸着させた。フィルターを生理食塩水で３回洗浄してβカウンターを用いて各フィルターの放射能量を測定した。適当に精製されたＥＰＯおよびＥＣＴＰの活性を測定した時、ＥＣＴＰの活性がＥＰＯ活性に類似するか、若干高く現れた。ＥＰＯに添加されたＣＴＰの存在は、ＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができた。
【００４４】
ＥＰＯの生体内活性に重要な役割をするものと知られている糖、すなわち、糖鎖末端に位置するシアル酸の存在を確認するために、ＩＥＦ(等電点電気泳動)分析を実施した。ＩＥＦゲルパターン(ノベックス社)を図５bに示した。図５bに示すように、ＥＣＴＰはＥＰＯより顕著に負極へ移動するパターンを示すことが確認された。これはＥＣＴＰがＥＰＯに比べて生体内活性が顕著に長く持続され得ることを示す。
【００４５】
実施例７：薬物動態学試験
製造された候補物質が、実際に生体内では長い半減期を持っているか否かを確認するために、薬物動態学試験をマウスを対象に実施した。実施例６に記載された方法によって精製された融合蛋白質をそれぞれ合計４匹のマウスに対し、１匹当たり２０ユニットで静脈内投与した。経時的血中濃度を確認するために、最初の２時間は３０分間隔で、後は２時間間隔で採血した後、ベーリンガー・マンハイム社のＥＩＡキットを使用して濃度を決定した。その結果を図６に示した。図６に示すように、候補物質ＥＣＴＰはコントロールＥＰＯより約２.５倍以上のはるかに長い半減期を示すことがわかった。
【００４６】
産業上利用可能性
本発明の融合蛋白質は、ＥＰＯの固有活性自体には影響を与えず、糖鎖を増加させるアミノ酸の存在によってＥＰＯの生体内半減期を画期的に延長させ、ＣＴＰは体内ペプチドであるから、抗原性を誘発せず産業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＣＧのカルボキシ末端ペプチド(ＣＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図２】 ＥＰＯとＣＴＰである融合蛋白質(ＥＣＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図３】 発現ベクターpＣＭＶ−ＥＣＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図４】 発現ベクターｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図５ａ】 精製されたＥＣＴＰの電気泳動写真である。
【図５ｂ】 発現されたＥＰＯとＥＣＴＰのＩＥＦ写真である。
【図６】 ＥＰＯとＥＣＴＰの薬物動態学結果を示すグラフである。
技術分野
本発明は、新規な貧血治療剤であって、エリスロポエチンの生体内(in vivo)活性が増強された融合蛋白質(fusion protein)に関する。より詳細には、本発明はＥＰＯ分子と、半減期(half-life)増加活性を持つ人体由来の特定ペプチドとの融合によって、エリスロポエチンの生体内活性が画期的に増強された融合蛋白質に関する。
【０００２】
背景技術
エリスロポエチン(ＥＰＯ)は分子量３０,０００〜３４,０００の糖蛋白質であり、赤血球の生成を促進する。この蛋白質は、赤血球前駆細胞の受容体との結合によって初めてその機能を発揮し、細胞内カルシウムイオン濃度の増加、ＤＮＡ生合成の増加およびヘモグロビン生成の刺激などを起こす。この組換えヒトＥＰＯ(rhＥＰＯ)は、腎臓病患者の貧血、未熟児の貧血、甲状腺機能低下症による貧血、栄養失調による貧血などの治療剤のために用いられてきた。他方で、rhＥＰＯの臨床的利用は拡大しつつある。しかし、rhＥＰＯの短い半減期のために、平均週３回の投与の不便さと高コストをもたらす。従って、ＥＰＯの生体内活性を長期間維持させれば、ＥＰＯの投与回数を大きく減少させることができる。
【０００３】
ＥＰＯの生体内活性度は、ＥＰＯ生体内半減期に比例する。ＥＰＯの生体内半減期は、ＥＰＯが持つ糖鎖の末端に位置するシアル酸(sialic acid)の含有量と相関関係があることが知られている。従って、ＥＰＯの生体内活性は、糖鎖の存在に大きく左右される。他方では、糖鎖の形態はＥＰＯが発現される細胞の種類によってそれぞれ異なるので、同じ糖蛋白質を異なる細胞で発現させれば、異なる糖鎖を呈する。いくつかのバクテリア、例えば、大腸菌(E.coli)は蛋白質に糖鎖を付けることができないことが知られている。一般に、大腸菌で発現される蛋白質には糖鎖を含まないので、大腸菌由来のＥＰＯは糖鎖を含まず、この場合、増加したインビトロ(in vitro)活性と減少した生体内活性の両方を示す。その理由は、脱グリコシル化ＥＰＯは急速に体内から除去され、その半減期が極めて短いためでる。結論として、糖鎖の存在の有無は、ＥＰＯの活性に非常に重要な役割を果たす。
【０００４】
ＥＰＯの活性を増加させるために多くの研究が行われてきた。主な研究方法は、突然変異誘発でＥＰＯ遺伝子に突然変異を誘発させることによって、いくつかのアミノ酸を置換させてその目的を達成する方法である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２５７(名称："エリスロポエチン類似体"、出願人：アムジェン社)には突然変異誘発を用いてＥＰＯの糖含有量を増加させることによって、体内半減期を延長させる方法が開示されている。また、ＥＰＯの二量体形成によって、ＥＰＯの半減期を延長させる試みもあった(参照：A. J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, No. 35, pp24773-24778)。その他にも、公知の他の方法として、ＥＰＯに新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの糖鎖含有量、すなわち、シアル酸の含有量を増加させることによって、生体内活性度を増強させる方法等がある。しかし、そのような方法で、すべてのアミノ酸、ペプチドまたは異種の蛋白質断片を使用することはできない。多くの場合、このような融合は蛋白質固有の活性を低下または喪失させる結果を招き、生体内で用いられる時に抗原性の問題を引き起こし得るからである。
【０００５】
融合蛋白質またはキメラ蛋白質等が研究されており、例えば、性ホルモンの一種である卵胞刺激ホルモンに関する研究がある(参照：Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocrinol.)。しかし、これらの方法は実際の産業には適用されなかった。蛋白質変形は多くの危険性があり、専門的技術がないと目的蛋白質が容易に得られず、蛋白質本来の活性が喪失または減少し、正反対の結果を引き起こし得るからである。
【０００６】
発明の詳細な記載
本発明者らは、ＥＰＯに新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融合させてＥＰＯの生体内活性度を増強し得る新しい方法の開発のために鋭意研究を行ってきた。その結果、体内に既に存在する蛋白質であるヒト絨毛性ゴナドトロピン(human chorionic gonadotropin；以下、"ＨＣＧ"という)のβサブユニットのカルボキシ末端に位置するペプチド断片(carboxy terminal peptide；以下、"ＣＴＰ"という)をＥＰＯのカルボキシ末端に融合させて得た融合蛋白質がＥＰＯ本来の活性をそのまま保持しながら、糖鎖形成部位(glycosylation site)を増加させる多数のアミノ酸によって、生体内半減期が画期的に長くなる一方、体内適用時の抗原性も誘発しないという事実を見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明の目的は、ヒトＥＰＯのカルボキシ末端にＨＣＧβサブユニットのＣＴＰが融合した、ヒトＥＰＯの生体内活性が増強された融合蛋白質を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列、上記ヌクレオチド配列を含有するプラスミド、および上記プラスミドで形質転換された宿主細胞株を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、上記形質転された細胞株を培養して増強された生体内ヒトＥＰＯ活性を持つ融合蛋白質を製造する方法を提供することである。第１に、本発明はヒトＥＰＯのカルボキシ末端にＨＣＧβサブユニットのＣＴＰを融合させた、生体内ヒトＥＰＯ活性が増強された融合蛋白質に関する。上記ＣＴＰは配列番号１に記載のＨＣＧβサブユニットの第１１２〜１４５位のアミノ酸またはその一部、特に第１１８〜1４５位のアミノ酸を含むことが好ましい。
【００１０】
好ましくは、本発明に係る融合蛋白質は、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含むことができる。
【００１１】
第２に、本発明は上記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列、上記ヌクレオチド配列を含有するプラスミド、および上記プラスミドで形質転換された宿主細胞株、好ましくはＣＨＯ(チャイニーズハムスター卵巣)細胞に関する。
【００１２】
第３に、本発明は上記形質転換された細胞株を培養して増強された生体内ヒトＥＰＯの活性を持つ融合蛋白質を製造する方法に関する。
【００１３】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、ヒトＥＰＯcＤＮＡの製造およびクローニング、ＥＰＯ−コードＤＮＡを組み込んだ発現ベクターの構築、動物細胞の形質転換、ヒトＥＰＯの発現、発現されたヒトＥＰＯの精製、およびその生物学的検定法の段階を含む。
【００１４】
(１)ヒトＥＰＯcＤＮＡの製造およびクローニング
ＥＰＯcＤＮＡを、ヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン社)で予め製造されたＥＰＯcＤＮＡの両末端に相補的なプライマー(ＥＰ１とＥＣ２)を用いて通常のＲＴ−ＰＣＲ(バイオニアー社のＰreＭix ＫＩＴTM)技術によって得ることができる：
ＥＰ１：ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(配列番号３)
ＥＣ２：GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(配列番号４)
【００１５】
得られたＥＰＯcＤＮＡをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ(Promega)社)にクローニングし(pＧＥＭＴ−ＥＰＯと命名)、配列決定した後、以後の操作の鋳型として用いる。
【００１６】
本発明で用いられるＨＣＧβユニットのＣＴＰ遺伝子は、合成およびＰＣＲセルフ−プライミングによって得られる。合成されたオリゴ−ヌクレオチド断片はＥＣ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４である：
ＥＣ１：AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACTCCTCTTCCT(配列番号５)
Ｃ２：GGAAGGCTGGGGGGAGGGGCCTTTGAGGAAGAGGA(配列番号６)
Ｃ３：CCAGCCTTCCAAGCCCATCCCGACTCCCGGGGCCC(配列番号７)
Ｃ４：TTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTCCGAGGGCCCCG(配列番号８)
【００１７】
これらの４種類のオリゴマーを１μlずつ(５０pモル／μl)採って、高正確度タグ(high fidelity Tag)(ＢＭ社)システムを使用してＰＣＲを行った。
【００１８】
１％アガロースゲルで約1００bpsの遺伝子断片(ＣＴＰ)を確認した。この遺伝子はＨＣＧβサブユニットのカルボキシ末端の２８個のアミノ酸(第１１８〜１４５位のアミノ酸)をコードするものである(図１)。
【００１９】
pＧＥＭＴ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１とＥＣ２を使用してＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得る。得られたＥＰＯ遺伝子とＣＴＰ遺伝子を共に鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１とＣ４を利用し、高正確度タグシステム(ＢＭ社)を使用して再度ＰＣＲを行って、６３０bpsの所望の融合遺伝子であるＥＣＴＰ遺伝子を得る。この遺伝子をクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔにクローニングした後(逆方向確認)、配列決定する(pＧＥＭＴ−ＥＣＴＰと命名、図２参照)。
【００２０】
(２)ＥＰＯ−コードするＤＮＡを組み込む発現ベクターの構築
発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcript(ストラタジーン社)ベクターまたはpcＤＮＡ３.１ベクター(インビトロジェン社)を用いた。
【００２１】
(i)発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcriptを用いた場合
pＣＭＶ−ＳcriptとpＧＥＭＴ−ＥＣＴＰを制限酵素ＳacＩとＳacIIでそれぞれ処理し、アガロースゲル上で直線状pＣＭＶ−ＳcriptとＥＣＴＰ遺伝子をキアゲン(Qiagen)ゲル抽出キットを用いて精製した後、結紮させて大腸菌ＮＭ５２２内に導入した。ＬＢ−カナマイシン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素ＳacＩとＳacIIで処理した。１％アガロースゲル電気泳動でＥＣＴＰ遺伝子を持つコロニーを選別した。このプラスミドをpＣＭＶ−ＥＣＴＰと命名した(図３)。
【００２２】
(ii)発現ベクターとしてｐcＤＮＡ３.１を用いた場合
pＧＥＭＴ−ＥＣＴＰを鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１１とＥＰ２２を用いて高正確度タグシステム(ＢＭ社)を使用してＰＣＲを行って６３０bpsの所望の融合遺伝子であるＥＣＴＰ遺伝子を得る：
ＥＰ１１：TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(配列番号９)
ＥＰ２２：TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT(配列番号１０)
【００２３】
このＥＣＴＰ遺伝子の末端はそれぞれ制限酵素認識部位ＨindIIIおよびＢamＨＩを持つ。ｐcＤＮＡ３.１と上記で得たＥＣＴＰ遺伝子を制限酵素ＨindIIIとＢamＨＩでそれぞれ処理した。アガロースゲル上で直線状pＣＭＶ−ＳcriptとＥＣＴＰ遺伝子を、キアゲンゲル抽出キットを用いて得た後、結紮させて大腸菌ＮＭ５２２内に導入して形質転換された大腸菌を得た。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素ＨindIIIとＢamＨＩで処理した。１％アガロースゲル電気泳動でＥＣＴＰ遺伝子を持つコロニーを選別した。このプラスミドをｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰと命名した(図４)。
【００２４】
(３)ＣＨＯ細胞の形質転換およびＥＣＴＰ発現
(i)発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcriptを用いた場合
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞を４０〜８０％(１〜４×１０5細胞／６０mm皿)の集蜜となるように培養することによってＣＨＯ(tk−)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(ＢＭ社)３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合した。この混合物にプラスミドpＣＭＶ−ＥＣＴＰ ＤＮＡ(＞０.１μg／μl、約２μg)を添加して室温で５〜１０分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。１日経過後、培地をＧ４１８培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％血清、およびＧ４１８ ５００μg／μl)に交換した。培地を７〜１０日間毎日Ｇ４１８培地に交換し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ キット(ＢＭ社)を用いて培養液から発現されたＥＣＴＰ蛋白質を確認した。
【００２５】
(II)発現ベクターとしてｐcＤＮＡ３.１を用いた場合
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞を４０〜８０％(１〜４×１０5細胞／６０mm皿)の集蜜となるように培養することによってＣＨＯ(ＤＧ４４)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(ＢＭ社)３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合し、得られた混合物にプラスミドｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰ ＤＮＡ(＞０.１μg／μl、約２g)とpＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加して室温で５〜１０分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。１日経過後、培地をＧ４１８培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％ＦＢＳ)に交換した。培地を７〜１０日間毎日Ｇ４１８培地に交換し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ キット(ＢＭ社)を用いて培養液から発現されたＥＣＴＰ蛋白質を確認した。
【００２６】
(４)発現されたＥＣＴＰの精製
抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(Ｒ＆Ｄシステム社)を用いて分離精製用親和性樹脂を下記のように調製した。
【００２７】
ＣＮＢr−活性化セファロースＣＬ ４Ｂ ０.３ｇを１mＭ ＨＣlで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mＭ ＨＣlで洗浄した。樹脂を４mLのカップリング緩衝液(０.１Ｍ ＮaＨＣＯ3、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ８.３)で洗浄し、直ぐに４mLのカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)とチューブ内で混合し、チューブを振りながら常温で２時間反応させた。緩衝液を遮断緩衝液(０.２Ｍ グリシン、pＨ８.０)にリフレッシュした後、常温で２時間チューブを振りながら反応を続けた。次に、６.５mLのカップリング緩衝液、６.５mLの酢酸塩緩衝液(０.１Ｍ 酢酸、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ４)および６.５mLのカップリング緩衝液で順次洗浄した。カラムを調製後、下記のように発現されたＥＣＴＰの精製を行った。
【００２８】
細胞を無血清培養液で一日培養した後、細胞のない培地をセントリプレップＴＭ(CentriprepTM、ＭＷＣＯ １０,０００、ミリポア社)を用いて約５分の１に濃縮した。次いで、これを２０mL／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに充填し、再びＰＢＳで洗浄した。カラムを溶出緩衝液(０.１Ｍ グリシン、pＨ２.８)で洗浄した後、溶出液を直ぐに１Ｍトリス−ＨＣlでpＨ７.５に滴定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は９７％以上であった。
【００２９】
(５)バイオアッセイ法による活性測定および生化学的分析
フェニルヒドラジンで処理されたマウスの脾臓細胞を用いて発現および適当に精製されたＥＰＯおよびＥＣＴＰのインビトロ生物活性を測定した。ＥＣＴＰがＥＰＯより高い活性を示した。ＥＣＴＰに添加されたＣＴＰの存在は、ＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができる。
【００３０】
ＥＰＯの生体内活性に非常に重要な役割をするすることが知られている糖、すなわち、糖鎖末端に位置するシアル酸の存在を確認するために、ＩＥＦ(Isoelectric focusing：等電点電気泳動)を実施した。シアル酸の強い負電荷のために、シアル酸含有量の増加は蛋白質を低いpＨに移動させる。ＩＥＦゲルパターン(ノベックス(Novex)社)でＥＣＴＰはＥＰＯより低いpＨに移動しているこを確認することができる。これはＥＣＴＰがＥＰＯより生体内活性がはるかに長く持続され得ることを示す。
【００３１】
(６)薬物動態学試験
製造された候補物質が実際生体内でより長い持続性を持つか否かをテストするために、薬物動態学試験実施した。候補物質を４匹のマウスに対して１匹２０ユニットの投与量で静脈内投与した。マウスから採血した後、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Manheim)社のＥＩＡキットを用いてＥＰＯおよびＥＣＴＰの濃度を決定した。候補物質ＥＣＴＰはコントロールのＥＰＯよりはるかに長い半減期を示すことがわかった(図６)。
【００３２】
発明の実施のための最良の形態
以下、本発明を実施例に基づいて、より詳細に説明するが、これによって本発明の範囲が限定されるものではない。
【００３３】
実施例１：ヒトＥＰＯcＤＮＡの製作およびクローニング
ＥＰＯcＤＮＡをヒト由来胎児肝臓のcＤＮＡライブラリー(インビトロジェン社)で予め製作されたＥＰＯcＤＮＡの両末端に相補的なプライマー(ＥＰ１、ＥＣ２)を用いて通常のＲＴ−ＰＣＲ(バイオニアー社のＰreＭix ＫＩＴTM)技術を行って得た。ＰＣＲを５５℃でアニーリング３５秒、７２℃で４０秒および９４℃で２０秒の条件下で、総３０サイクルＰＣＲを行ってＥＰＯcＤＮＡを得た。得られたＥＰＯcＤＮＡをクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔ(プロメガ社)にクローニングした。すなわち、ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルに流し、分離されたＥＰＯcＤＮＡをpＧＥＭ−Ｔに結紮させた。次に、組換えpＧＥＭ−Ｔを大腸菌ＮＭ５２２内に導入して形質転換された大腸菌を得た。Ｘ−gal／ＩＰＴＧを塗抹したＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養した、白色コロニーからプラスミドＤＮＡを精製し、制限酵素ＳacＩおよびＳacIIと反応させてＥＰＯcＤＮＡが含まれているコロニーを選別した。得られたプラスミドをpＧＥＭＴ−ＥＰＯと命名した。
【００３４】
ＨＣＧβ ユニットのＣＴＰ遺伝子は、ヌクレオチド合成およびＰＣＲセルフープライミングを用いて得た。合成されたオリゴヌクレオチドはＥＣ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４である。これら４つの遺伝子を１μl(５０pモル／μl)ずつ採って、５５℃でアニーリング４０秒、７２℃で４０秒、９４℃で２０秒の条件下で総１５サイクルのＰＣＲを行った。１％アガロースゲル上で約１００bpsのＤＮＡ断片を確認した。この遺伝子はＨＣＧβサブユニットのカルボキシ末端の２８個のアミノ酸をコードするものである(図１)。
【００３５】
pＧＥＭＴ−ＥＰＯを鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１とＥＣ２を使用して上記と同一条件でＰＣＲを行ってＥＰＯ遺伝子のみを得た。鋳型としてＣＴＰと、プライマーとしてＥＰ１とＥＣ２を同時に用い、５８℃でアニーリング４０秒、７２℃で６０秒、９４℃で２０秒の条件下で総３０サイクルのＰＣＲを行うことによって、６３０bpsのＥＣＴＰ遺伝子を得た。この遺伝子をクローニングベクターであるpＧＥＭ−Ｔに上記と同様にしてクローニングした後、配列決定した(pＧＥＭＴ−ＥＣＴＰと命名、図２)。
【００３６】
実施例２：発現ベクターpＣＭＶ−ＥＣＴＰの構築
発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcript(ストラタジーン社)を用いた。pＣＭＶ−ＳcriptとpＧＥＭＴ−ＥＣＴＰを制限酵素ＳacＩとＳacIIでそれぞれ処理し、アガロースゲル上で直線状pＣＭＶ−ＳcriptとＥＣＴＰ遺伝子をキアゲンゲル抽出キットを用いて得た後、結紮させて大腸菌ＮＭ５２２内に導入した。ＬＢ−カナマイシン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素ＳacＩとＳacIIで処理した。１％アガロースゲル電気泳動でＥＣＴＰ遺伝子が含まれたコロニーを選別した。このプラスミドをpＣＭＶ−ＥＣＴＰと命名した(図３)。
【００３７】
実施例３：発現ベクターｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰの構築
発現ベクターとしてインビトロジェン社のｐcＤＮＡ３.１ベクター(インビトロジェン社)を用いた。pＧＥＭＰ−ＥＣＴＰを鋳型として用い、プライマーとしてＥＰ１１とＥＰ２２を用い、およびＢＭ社の高正確度タグシステムを使用してＰＣＲを行って６３０bpsの所望の融合遺伝子を得た。このＥＣＴＰ遺伝子の末端はそれぞれＨindIIIおよびＢamＨＩの制限酵素認識部位を持つ。ｐcＤＮＡ３.１と上記で得たＥＣＴＰ遺伝子を制限酵素ＨindIIIとＢamＨＩでそれぞれ処理した。アガロースゲル上で直線状pＣＭＶ−ＳcriptとＥＣＴＰ遺伝子をキアゲンゲル抽出キットを用いて得た後、結紮させて大腸菌ＮＭ５２２内に導入した。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一夜培養したコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素ＨindIIIとＢamＨＩで処理した。１％アガロースゲル電気泳動でＥＣＴＰ遺伝子が含まれたコロニーを選別した。このプラスミドをｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰと命名した(図４)。
【００３８】
実施例４：ＣＨＯ細胞の形質転換およびＥＣＴＰ発現 (i)発現ベクターとしてpＣＭＶ−Ｓcriptを用いた場合
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞を４０〜８０％(１〜４×１０5細胞／６０mm皿)の集蜜となるように培養することによってＣＨＯ(tk−)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(ＢＭ社)３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合し、この混合物にプラスミドpＣＭＶ−ＥＣＴＰ ＤＮＡ(＞０.１μg／μl、約２μg)を添加して室温で５〜１０分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。１日経過後、培地をＧ４１８培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％血清、およびＧ４１８ ５００μg／μl)に交換した。培地を７〜１０日間毎日Ｇ４１８培地に交換し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ キット(ＢＭ社)を用いて培養液から発現されたＥＣＴＰ蛋白質を確認した。
【００３９】
(II)発現ベクターとしてｐcＤＮＡ３.１を用いた場合
６０mm細胞培養皿(dish)でＣＨＯ細胞を４０〜８０％(１〜４×１０5細胞／６０mm皿)の集蜜となるように培養することによってＣＨＯ(ＤＧ４４)細胞を製造した。スーパーフェクション試薬(ＢＭ社)３μlと細胞培地(α−ＭＥＭ−培地、無血清、無抗生物質)９７μlをよく混合し、得られた混合物にプラスミドｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰ ＤＮＡ(＞０.１μg／μl、約２μg)とpＬＴＲdhfr２６(ＡＴＣＣ３７２９５、０.２μg)を添加して室温で５〜１０分間反応させた後、上記で製造した細胞に加えた。１日経過後、培地をＧ４１８培地(α−ＭＥＭ−培地、１０％ＦＢＳ)に交換した。培地を７〜１０日間毎日Ｇ４１８培地に交換し、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を持たない細胞と陰性コントロールの細胞を死滅させた。Ｇ４１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ キット(ＢＭ社)を用いて培養液から発現されたＥＣＴＰ蛋白質を確認した。
【００４０】
実施例５：発現されたＥＣＴＰの精製
Ｒ＆Ｄシステム社の抗−ＥＰＯモノクロナール抗体を用いて分離精製用親和性樹脂を下記のように製造した。
【００４１】
ＣＮＢr−活性化セファロースＣＬ ４Ｂ ０.３ gを１mＭ ＨＣlで２０分間膨潤させ、樹脂をカラムに移した後、１mＭ ＨＣlで洗浄した。
樹脂を４mLのカップリング緩衝液(０.１Ｍ ＮaＨＣＯ3、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ８.３)で洗浄し、直ぐに４mLのカップリング緩衝液に入っている抗−ＥＰＯモノクロナール抗体(５００μg／バイアル)とチューブ内で混合し、チューブを振りながら常温で２時間反応させた。緩衝液を遮断緩衝液(０.２Ｍ グリシン、pＨ８.０)に置き換えた後、常温で２時間チューブを振りながら反応を続けた。次に、６.５mLのカップリング緩衝液、６.５mLの酢酸塩緩衝液(０.１Ｍ 酢酸、０.５Ｍ ＮaＣl、pＨ４)および６.５mLのカップリング緩衝液で順次洗浄した。カラムを調製した後、下記のように、発現されたＥＣＴＰの精製を行った。
【００４２】
細胞を無血清培養液で一日培養した後、細胞のない培地をセントリプレップTM(CentriprepTM、ＭＷＣＯ １０,０００、ミリポア社)を用いて約５分の１に濃縮した。２０mL／hrの流速でＰＢＳによって平衡化させたカラムに充填し、再びＰＢＳで洗浄した。カラムを溶出緩衝液(０.１Ｍ グリシン、pＨ２.８)で洗浄した後、溶出液を直ぐに１Ｍトリス−ＨＣlでpＨ７.５に滴定した。精製されたＥＣＴＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図５aに示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析したとき、純度は９７％以上であった。
【００４３】
実施例６：バイオアッセイ法による活性測定およびＩＥＦ分析
フェニルヒドラジンをマウスに１日１回、２日間６０mg／kgずつ注射した。３日経過後、拡大した脾臓を分離し、ホモジナイザーで破砕して脾臓細胞を得た。脾臓細胞を６×１０6細胞／mLで希釈して９６ウェルプレートに１００μlずつ分注した。分注された各ウェルに標準ＥＰＯ(０〜５００mＵ／mL)と、発現されたＥＰＯおよびＥＣＴＰを１００mＵ／mLの濃度でそれぞれ加えた後、プレートを３７℃ ＣＯ２インキュベーターで２２時間放置した。各ウェルにジメチル3[Ｈ]−チミジン(２０μＣi／mL)を５０μlずつ加えた後、同じインキュベーターで２時間さらに反応させた。反応液を各ウェル別にグラスフィルター(Ｎunc １−７３１６４)に吸着させた。フィルターを生理食塩水で３回洗浄してβカウンターを用いて各フィルターの放射能量を測定した。適当に精製されたＥＰＯおよびＥＣＴＰの活性を測定した時、ＥＣＴＰの活性がＥＰＯ活性に類似するか、若干高く現れた。ＥＰＯに添加されたＣＴＰの存在は、ＥＰＯの活性自体を妨害しないことを確認することができた。
【００４４】
ＥＰＯの生体内活性に重要な役割をするものと知られている糖、すなわち、糖鎖末端に位置するシアル酸の存在を確認するために、ＩＥＦ(等電点電気泳動)分析を実施した。ＩＥＦゲルパターン(ノベックス社)を図５bに示した。図５bに示すように、ＥＣＴＰはＥＰＯより顕著に負極へ移動するパターンを示すことが確認された。これはＥＣＴＰがＥＰＯに比べて生体内活性が顕著に長く持続され得ることを示す。
【００４５】
実施例７：薬物動態学試験
製造された候補物質が、実際に生体内では長い半減期を持っているか否かを確認するために、薬物動態学試験をマウスを対象に実施した。実施例６に記載された方法によって精製された融合蛋白質をそれぞれ合計４匹のマウスに対し、１匹当たり２０ユニットで静脈内投与した。経時的血中濃度を確認するために、最初の２時間は３０分間隔で、後は２時間間隔で採血した後、ベーリンガー・マンハイム社のＥＩＡキットを使用して濃度を決定した。その結果を図６に示した。図６に示すように、候補物質ＥＣＴＰはコントロールＥＰＯより約２.５倍以上のはるかに長い半減期を示すことがわかった。
【００４６】
産業上利用可能性
本発明の融合蛋白質は、ＥＰＯの固有活性自体には影響を与えず、糖鎖を増加させるアミノ酸の存在によってＥＰＯの生体内半減期を画期的に延長させ、ＣＴＰは体内ペプチドであるから、抗原性を誘発せず産業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＣＧのカルボキシ末端ペプチド(ＣＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図２】 ＥＰＯとＣＴＰである融合蛋白質(ＥＣＴＰ)の塩基およびアミノ酸配列を示す。
【図３】 発現ベクターpＣＭＶ−ＥＣＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図４】 発現ベクターｐcＤＮＡ３.１−ＥＣＴＰの製作過程を示す模式図である。
【図５ａ】 精製されたＥＣＴＰの電気泳動写真である。
【図５ｂ】 発現されたＥＰＯとＥＣＴＰのＩＥＦ写真である。
【図６】 ＥＰＯとＥＣＴＰの薬物動態学結果を示すグラフである。
Claims (3)
- 配列番号２のアミノ酸からなる、ヒトＥＰＯとヒト絨毛性ゴナドトロピン(ＨＣＧ)βサブユニットのカルボキシ末端ペプチド融合蛋白質(ＥＣＴＰ)。
- 請求項１に記載の融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列。
- 生体内ヒトＥＰＯ活性が増強された融合蛋白質の製造方法であって、請求項２に記載のＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞株を培養することを特徴とする方法。
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