JP2016501897A - 組換えタンパク質 - Google Patents

Abstract

組換えタンパク質を提供する。本発明の組換えタンパク質は、エリスロポエチンおよび高グリコシル化ペプチドを含み、エリスロポエチンの生物活性を有し、かつより長い半減期を有する。さらに、本発明の組換えタンパク質は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端ペプチドおよびトロンボポエチンのカルボキシ末端ペプチドも含み得る。

Description

本発明は組換えタンパク質に関し、特に半減期がより長い高グリコシル化エリスロポエチンに関する。

エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、骨髄中の赤血球前駆体の糖タンパク質ホルモン、またはサイトカインである。ヒトにおいて、エリスロポエチンは赤血球のプロセスおよびホルモンの調整に関与する。同時にエリスロポエチンはその他の生物学的機能も有する。例えばエリスロポエチンは、神経の損傷がある場合に、創傷治癒のプロセスに関与する。

赤血球新生は赤血球の産生であって、それは細胞破壊を補うために起こる。赤血球新生は、十分な数の赤血球が適切な組織酸素化に利用可能なものとなるようにする、制御された生理学的機序である。自然発生のヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）は腎臓で生成されるもので、かつ赤血球産生を促す体液性の血漿因子である（Ｃａｒｎｏｔ， Ｐ ａｎｄ Ｄｅｆｌａｎｄｒｅ， Ｃ （１９０６） Ｃ． Ｒ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １４３： ４３２（非特許文献１）； Ｅｒｓｌｅｖ， Ａ Ｊ （１９５３） Ｂｌｏｏｄ ８： ３４９（非特許文献２）； Ｒｅｉｓｓｍａｎｎ， Ｋ Ｒ （１９５０） Ｂｌｏｏｄ ５： ３７２（非特許文献３）； Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｌ Ｏ， Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ， Ｅ， Ｆｒｅｉｄ， Ｗ ａｎｄ Ｐｌｚａｋ， Ｌ Ｆ （１９５７） Ｎａｔｕｒｅ １７９： ６３３１−４（非特許文献４））。ＥＰＯは、骨髄中の赤芽球前駆細胞の分裂および分化を促進し、かつ赤血球前駆体上の受容体に結合することによってその生物活性を働かせる（Ｋｒａｎｔｚ， Ｂ Ｓ （１９９１） Ｂｌｏｏｄ ７７： ４１９（非特許文献５））。

エリスロポエチンは組換えＤＮＡ技術を用いて生合成的に製造されており（Ｅｇｒｉｅ， Ｊ Ｃ， Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ， Ｔ Ｗ， Ｌａｎｅ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ． ７２： ２１３−２２４（非特許文献６））、チャイニーズハムスターの卵巣組織細胞中に導入されて発現したクローン化ヒトＥＰＯ遺伝子の産物である。糖部分を除くＥＰＯのポリペプチド鎖の分子量は１８，２３６Ｐａである。無傷のＥＰＯ分子において、分子量の約４０％は、タンパク質上の糖鎖付加部位でタンパク質をグリコシル化する炭水化物基によって占められる（Ｓａｓａｋｉ， Ｈ， Ｂｏｔｈｎｅｒ， Ｂ， Ｄｅｌｌ， Ａ ａｎｄ Ｆｕｋｕｄａ， Ｍ （１９８７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２： １２０５９（非特許文献７））。

ヒトエリスロポエチンは赤血球の形成に不可欠であるため、このホルモンは、赤血球産生の低下または不良により特徴付けられる血液疾患の治療に有用である。臨床上、ＥＰＯは、慢性腎不全患者（ＣＲＦ）（Ｅｓｃｈｂａｃｈ， Ｊ Ｗ， Ｅｇｒｉ， Ｊ Ｃ， Ｄｏｗｎｉｎｇ， Ｍ Ｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＮＥＪＭ ３１６： ７３−７８（非特許文献８）； Ｅｓｃｈｂａｃｈ， Ｊ Ｗ， Ａｂｄｕｌｈａｄｉ， Ｍ Ｈ， Ｂｒｏｗｎｅ， Ｊ Ｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １１１： ９９２（非特許文献９）； Ｅｇｒｉｅ， Ｊ Ｃ， Ｅｓｃｈｂａｃｈ， Ｊ Ｗ， ＭｃＧｕｉｒｅ， Ｔ， Ａｄａｍｓｏｎ， Ｊ Ｗ （１９８８） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ． ３３： ２６２（非特許文献１０）； Ｌｉｍ， Ｖ Ｓ， Ｄｅｇｏｗｉｎ， Ｒ Ｌ， Ｚａｖａｌａ， Ｄ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １１０： １０８−１１４（非特許文献１１））ならびにＡＩＤＳおよび化学療法を受けている癌患者の貧血の治療に用いられる（Ｄａｎｎａ， Ｒ Ｐ， Ｒｕｄｎｉｃｋ， Ｓ Ａ， Ａｂｅｌｓ， Ｒ Ｉ Ｉｎ： Ｍ Ｂ， Ｇａｒｎｉｃｋ， ｅｄ． Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ-Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ； １９９０： ｐ． ３０１−３２４（非特許文献１２））。しかしながら、ＥＰＯタンパク質治療のバイオアベイラビリティはその短い血漿内半減期およびプロテアーゼ分解によって制限されてしまうため、良好な臨床有効性を得ることは難しい。

Ｃａｒｎｏｔ， Ｐ ａｎｄ Ｄｅｆｌａｎｄｒｅ， Ｃ （１９０６） Ｃ． Ｒ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １４３： ４３２ Ｅｒｓｌｅｖ， Ａ Ｊ （１９５３） Ｂｌｏｏｄ ８： ３４９ Ｒｅｉｓｓｍａｎｎ， Ｋ Ｒ （１９５０） Ｂｌｏｏｄ ５： ３７２ Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｌ Ｏ， Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ， Ｅ， Ｆｒｅｉｄ， Ｗ ａｎｄ Ｐｌｚａｋ， Ｌ Ｆ （１９５７） Ｎａｔｕｒｅ １７９： ６３３１−４ Ｋｒａｎｔｚ， Ｂ Ｓ （１９９１） Ｂｌｏｏｄ ７７： ４１９ Ｅｇｒｉｅ， Ｊ Ｃ， Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ， Ｔ Ｗ， Ｌａｎｅ， Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ． ７２： ２１３−２２４ Ｓａｓａｋｉ， Ｈ， Ｂｏｔｈｎｅｒ， Ｂ， Ｄｅｌｌ， Ａ ａｎｄ Ｆｕｋｕｄａ， Ｍ （１９８７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２： １２０５９ Ｅｓｃｈｂａｃｈ， Ｊ Ｗ， Ｅｇｒｉ， Ｊ Ｃ， Ｄｏｗｎｉｎｇ， Ｍ Ｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＮＥＪＭ ３１６： ７３−７８ Ｅｓｃｈｂａｃｈ， Ｊ Ｗ， Ａｂｄｕｌｈａｄｉ， Ｍ Ｈ， Ｂｒｏｗｎｅ， Ｊ Ｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １１１： ９９２ Ｅｇｒｉｅ， Ｊ Ｃ， Ｅｓｃｈｂａｃｈ， Ｊ Ｗ， ＭｃＧｕｉｒｅ， Ｔ， Ａｄａｍｓｏｎ， Ｊ Ｗ （１９８８） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ． ３３： ２６２ Ｌｉｍ， Ｖ Ｓ， Ｄｅｇｏｗｉｎ， Ｒ Ｌ， Ｚａｖａｌａ， Ｄ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １１０： １０８−１１４ Ｄａｎｎａ， Ｒ Ｐ， Ｒｕｄｎｉｃｋ， Ｓ Ａ， Ａｂｅｌｓ， Ｒ Ｉ Ｉｎ： Ｍ Ｂ， Ｇａｒｎｉｃｋ， ｅｄ． Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ-Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ； １９９０： ｐ． ３０１−３２４

本発明は、半減期の長い高グリコシル化エリスロポエチンを提供する。

目的を達成するため、本発明は、エリスロポエチンおよび高グリコシル化ペプチドペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。

本発明は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに提供する。

本発明はまた、ヌクレオチドでトランスフェクトされて組換えタンパク質を発現する細胞を提供する。

本発明は、組換えタンパク質と薬学的に許容可能な担体またはアジュバントとを含む組成物をさらに提供する。

上述した目的、およびその他の目的を達成するために、本発明の特徴および利点をより明白および理解可能にすると共に、詳細に理解するのに役立つよう添付の図面を用いて好ましい実施形態を以下に例示する。

図１は、本発明の実施形態によるＥＰＯ−ＮＮＣＴ、ＮＮＣＴ−ＥＰＯ、ＥＰＯ−Ｎ１Ｎ２、Ｎ１Ｎ２−ＥＰＯ、ＥＰＯ−Ｎ１、およびＥＰＯ−Ｎ２のプラスミド構築を示している。 図２は、本発明のＥＰＯ−ＮＮＣＴと市販のＥｐｒｅｘ（登録商標）間の活性レベルの比較を示している。 図３は、本発明のＥＰＯ−ＮＮＣＴと市販のＥｐｒｅｘ（登録商標）間の薬物動態特性（ＰＫ）の比較を示している（静脈内注射）。 図４は、本発明のＥＰＯ−ＮＮＣＴと市販のＥｐｒｅｘ（登録商標）間の薬物動態特性（ＰＫ）の比較を示している（皮下注射）。 図５は、本発明のＥＰＯ−Ｎ１Ｎ２、Ｎ１Ｎ２−ＥＰＯ、ＮＮＣＴ−ＥＰＯと市販のＥｐｒｅｘ（登録商標）間の薬物動態特性（ＰＫ）の比較を示している（皮下注射)。

本発明は、半減期の長い組換えエリスロポエチンおよびその製造方法を提供する。

１実施形態において、本発明は、エリスロポエチンおよび高グリコシル化ペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。

本明細書において、ここで用いられる「エリスロポエチン （ＥＰＯ）」という語には、あらゆる由来のＥＰＯ、特にヒトまたは動物のＥＰＯが含まれる。本明細書で用いられるこの用語には、自然発生的、すなわち野生型のＥＰＯの形態だけでなく、その誘導体、アナログ、修飾体、突然変異体またはその他のものも、それらが野生型エリスロポエチンの生物学的効果を示すものでさえあれば、包含される。

突然変異タンパク質または他の修飾タンパク質のようなＥＰＯの活性を有する任意のタンパク質もまた、包含される。組換えＥＰＯは、組換えＤＮＡ技術を用い、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨｅＬａもしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞株またはその他の適した細胞株における発現によって作製され得るもので、その関連する内容は米国特許第５７３３７６１号、５６４１６７０号、５７３３７４６号、５９９４１２２号、５７３３７６１号、５６４１６７０号、５９８１２１４号および５２７２０７１号を参照することができる。その作製および治療への応用は米国特許第５５４７９３３号および５，６２１０８０号、Ｈｕａｎｇ， Ｓ． Ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８４） ２７０８−２７１２、ならびにＬａｉ， Ｐ． Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１ （１９８６） ３１１６−３１２１， およびＳａｓａｋｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２ （１９８７） １２０５９−１２０７６を参照することができる。好ましいＥＰＯ種はヒトＥＰＯ種である。

本明細書において、「高グリコシル化ペプチド」という語は、少なくとも１つのグリコシドを持つ約１０から３０のアミノ酸残基を有するポリペプチドのことを指す。本発明の高グリコシル化ペプチドは、１つまたはそれ以上のグリカンを産生するための１つまたはそれ以上のＮ−もしくはＯ−結合型グリコシル化部位を含む。例えば、配列番号１および／もしくは２の配列、または配列番号１もしくは２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、および８０％の配列同一性、好ましくは９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列である。

高グリコシル化ペプチドはＥＰＯと融合して本発明の組換えタンパク質を形成する。高グリコシル化ペプチドはＥＰＯのアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシ末端（Ｃ末端）に位置していてよく、かつ高グリコシル化ペプチドの数に制限はない。例えば、１つまたはそれ以上の同じまたは異なる高グリコシル化ペプチドが、ＥＰＯのＮ末端および／またはＣ末端に結合され得る。高グリコシル化ペプチドを含む組換えタンパク質はより長い半減期およびより高い活性を有する。図１に示されるように、１実施形態において、高グリコシル化ペプチド（配列番号１および／または２）はＥＰＯのＮ末端またはＣ末端に位置していてよい。

高グリコシル化ペプチドは、限定はされないが、配列番号１および／または2を含む。１つまたはそれ以上の同じまたは異なる高グリコシル化ペプチドが、ＥＰＯのＣ末端に結合され得る。例えば、配列番号１もしくは２がＥＰＯのＣ末端に結合される；または２つもしくはそれ以上の配列番号１もしくは２がＥＰＯのＣ末端に結合される；または配列番号１および２がＥＰＯのＣ末端に順次に結合される；または配列番号２および１がＥＰＯのＣ末端に順次に結合される。別の実施形態では、配列番号１および２がＥＰＯのＣ末端に順次に結合される。

本発明の組換えタンパク質は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のカルボキシ末端ペプチドをさらに含む。

本明細書において、「ｈＣＧのカルボキシ末端ペプチド（以下、ＣＴＰという）」という語は、Ｃ末端のアミノ酸１１２−１１８から残基１４５もしくは所定の部分まで延びるヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端に見られるアミノ酸配列、または同等の生物活性を有するその変異型もしくはアナログのことをいう。ＣＴＰ配列ペプチドは２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４アミノ酸長であり、ｈＣＧアミノ酸配列の１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、または１１８位から始まる。

本発明のＣＴＰは、限定はされないが、配列番号３、または配列番号３に対して少なくとも６５％、７０％、８０％、９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

本発明のＣＴＰは、ＥＰＯ（そのＮ末端もしくはＣ末端で）および／または高グリコシル化ペプチド（そのＮ末端もしくはＣ末端で）に結合され得る。ＣＴＰの量に制限はない。例えば、１つまたはそれ以上の同じまたは異なるｈＣＧのＣＴＰが、本発明のＥＰＯのＮ末端または高グリコシル化ペプチドのＣ末端に結合され得る。

本発明のＣＴＰは、タンパク質またはペプチドの分解に対する保護剤として機能し得る。本出願において、ｈＣＧのＣＴＰは組換えタンパク質の循環半減期を延長することができると共に、組換えタンパク質の作用を強化することができる。

本発明は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）のカルボキシ末端ペプチドをさらに含む。

本明細書において、「トロンボポエチンのカルボキシ末端ペプチド（以下、ＴｐＳという）」という語は、トロンボポエチンの１７６から３５３位のアミノ酸、特にトロンボポエチンの３３７から３５３位のアミノ酸、または同等の生物活性を有するその変異型もしくはアナログのことをいう。

本発明のＴｐＳは、限定はされないが、配列番号４、または配列番号４に対して少なくとも６５％、７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性、好ましくは９５％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

本発明のＴｐＳは、ＥＰＯ（そのＮ末端もしくはＣ末端で）、高グリコシル化ペプチド（そのＮ末端もしくはＣ末端で）、および／またはＣＴＰ（そのＮ末端もしくはＣ末端で）に結合されてよく、ＴｐＳの量に制限はない。１実施形態において、１つまたはそれ以上の同じまたは異なるＴｐＳは、ＥＰＯのＮ末端または高グリコシル化ペプチドのＣ末端に結合され得る。別の実施形態では、１つまたはそれ以上の同じまたは異なるＴｐＳは、ＥＰＯのＮ末端またはＣＴＰのＣ末端に結合され得る。

本出願のＴｐＳは、タンパク質またはそれから誘導されるペプチドの分解に対する保護剤として機能し得る。ＴｐＳは組換えタンパク質の循環半減期を延長することができると共に、組換えタンパク質の作用を強化することができる。

本発明において、ＥＰＯ、高グリコシル化ペプチド、ＣＴＰ、およびＴｐＳの量および配置に制限はない。

１実施形態において、本発明の組換えタンパク質は配列番号１、２、３、および４を含む。

別の実施形態において、本発明の組換えタンパク質は、配列番号５（ＥＰＯ−ＮＮＣＴ）、６（ＮＮＣＴ−ＥＰＯ）、７（ＥＰＯ−Ｎ１Ｎ２）、８（Ｎ１Ｎ２−ＥＰＯ）、９（ＥＰＯ−Ｎ１）、または１０（ＥＰＯ−Ｎ２）から選択され得る。

高グリコシル化ペプチド、ＣＴＰ、およびＴｐＳは、欠失、置換、挿入、および／または化学修飾によって修飾されてもよい。アミノ酸の欠失、置換、挿入、および／または化学修飾の方法およびプロセスは当該分野において周知であり、かつ高グリコシル化ペプチド、ＣＴＰ、およびＴｐＳは修飾後も元の活性を維持する。

１実施形態において、修飾には、限定はされないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ポリペプチド結合修飾、例えばＣＨ_２−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｓ、ＣＨ_２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｏ、ＣＨ_２−ＣＨ_２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨなど、主鎖修飾（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、および残基修飾（ｒｅｓｉｄｕｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が含まれる。ペプチド模倣化合物を作製する方法は当該分野において周知であり、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， Ｃ． Ａ． Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２， Ｆ． Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ （１９９２）を参照とすることができる。

１実施形態において、ポリペプチドのペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えばＮ−メチル結合（−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン（ｋｅｔｏｍｅｔｈｙｌｅｎ）（−ＣＯ−ＣＨ_２−）、α−ａｚａ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）で置換されてよく、このうちＲは、任意のアルキル、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−）、チオアミド（−ＣＳ−ＮＨ−）、アルケン結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、アミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、またはポリペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ_２−ＣＯ−）である。

本発明は、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。

「ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド」という語は、分離され、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または上記の組み合わせの形で提供される一本または二本鎖核酸配列のことをいう。

本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ技術、または当業者に知られているその他任意の方法もしくは手順を用いて作製され得る。当該手順には、２つの異なるＤＮＡ配列のライゲーションが含まれる（例えば、 "Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２参照）。

本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクター中に挿入されて組換えタンパク質の発現を可能にすることができる。１実施形態において、発現ベクターは、このベクターを原核生物または真核生物における複製および組み込みに適したものとする追加の配列を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、転写および翻訳開始配列（例えばプロモーターまたエンハンサー）ならびに転写および翻訳ターミネーター（例えばポリアデニル化信号）を含む。

さまざまな原核または真核細胞が、本発明のポリペプチドを発現するための宿主発現系として用いられ得る。１実施形態において、これら発現系には、限定はされないが、バクテリア、酵母、植物細胞、真核生物（例えば哺乳類細胞、ＣＨＯ細胞）などのような微生物が含まれる。

形質転換の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９， １９９２）， ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍｄ． （１９８９）， Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， Ｍｉｃｈ． （１９９５）， Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ． （１９９５）， Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ， Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ． （１９８８）およびＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ． ［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４ （６）： ５０４−５１２， １９８６］を参照することができ、例えば、安定また一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウィルスベクターの感染を含む。

本発明は、本発明の組換えタンパク質と、生理学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物をさらに提供する。

同じ意味で用いられる「薬学的に許容可能な担体または賦形剤」という語は、生物に重大な刺激を引き起こさず、かつ投与される化合物の生物活性および特徴を無効にしない担体、賦形剤、またはアジュバントのことをいう。担体には、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、有機および水媒体の両方に溶解性を有する生体適合性ポリマーが含まれる。賦形剤には、限定はされないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖類およびでんぷん、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが含まれる。

本発明の組成物は、貧血を持つ患者、慢性腎機能障害を持つ貧血患者、末期の腎疾患を持つ貧血患者、透析を受けている貧血患者、慢性腎不全を持つ貧血患者、貧血のＨＩＶ感染患者、癌を持つ貧血患者、化学療法を受けている貧血患者、および非心臓性、非血管性手術を受ける予定の貧血患者を治療するのに用いることができる。

有効量の本発明の組成物を貧血患者に投与した後、貧血患者のヘマトクリット値は顕著に増加し得、かつ本発明の高グリコシル化組換えＥＰＯは、被験体における半減期がより長い。本発明の高グリコシル化組換えＥＰＯは、市販のＥＰＯ製品（例えばＥｐｒｅｘ（登録商標）およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標））に比べて半減期がより長い。例えば、本発明の高グリコシル化ＥＰＯは、市販のＥＰＯ製品に比べ、半減期が少なくとも約１倍、好ましくは２倍、より好ましく３倍長い。別の実施形態では、本発明の高グリコシル化ＥＰＯは、市販のＥＰＯ製品（例えばＥｐｒｅｘ（登録商標）およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標））に比べ、より長い半減期、より高いＡＵＣ（曲線下面積）およびＣｍａｘ、ならびにより長いＴｍａｘ値を有する。

「治療上有効である」という語は、通常、約１から１００００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ体重、好ましくは約５０から２０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ体重、より好ましくは約５０から６００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ体重、最も好ましくは約５０から３００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ体重のことをいう。本発明の製剤は、任意の所望の頻度または投与間の時間間隔で投与することができる。投与計画は、被験体に、本発明の徐放性製剤を２週間に３回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１か月に１回、５週間に１回、６週間に１回、またはより頻繁にもしくはより低い頻度で、または望み通りの任意の組み合わせの頻度もしくは時間間隔で、投与する。必要とされる投薬量は、限定はされないが、用いられる化合物もしくは複数の化合物、被験体の種、被験体の大きさ、および関連疾患の状態の重症度を含む当業者に知られている多数の要因によって変わるであろう。好ましい投与計画は、特に癌の治療として化学療法を受けている被験体には、多くの化学療法レジメンは３週間に１回のスケジュールで投与されるものであるため、３週間に１回とすることができる。

実施例１
宿主細胞
台湾食品研究所の生物資源保存および研究センター（ＣＣＲＣ、６０１３３）から細胞（ＣＨＯ ｄｆｈｒ−）を購入した。ＣＨＯ ｄｆｈｒ−細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．１００９１１４８）、加えてヒポキサンチンおよびチミジン（Ｇｉｂｃｏ， Ｃａｔ．１１０６７−０３０）および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ． ２５０３０−０８１）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｉｓｏｃｏｖｅｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ， ＩＭＤＭ， Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ． １２２００−３６）中で培養した。Ｄｈｆｒ（−）マーカーを増幅および選別のために用いた。ｄｈｆｒ遺伝子の発現を、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、メトトレキサート（ＭＴＸ，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ ｎｏ． Ｍ８４０７）を投与することによって、増幅することができた。ｄｆｈｒ遺伝子が増幅されたときに、多くの場合、他の隣接する遺伝子が共増幅され、これにより各ラウンドの増幅の後、細胞をサブクローニングして産生率の増加したクローンを選別した。３７℃の加湿した９５％ａｉｒ／５％ＣＯ_２のインキュベータ（Ｍｏｄｅｌ ３３２６， Ｆｏｒｍａ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で細胞を培養した。

実施例２
発現ベクターの構築
２．１ ＥＰＯ−ＮＮＣＴ
ＥＰＯ−ＮＮＣＴ遺伝子断片をアセンブリＰＣＲ（ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ）法を用いて得てから、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏ（＋）／ＤＨＦＲベクターに挿入し、ｐＮＤ／ＥＰＯ−ＮＮＣＴを得た。発現ベクター構築物は、選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含んでいた。ＥＰＯ−ＮＮＣＴ遺伝子を図１に示したが、図中、「ＥＰＯ」はエリスロポエチン、「Ｎ１」は高グリコシル化ペプチド１（配列番号１）、「Ｎ２」は高グリコシル化ペプチド２（配列番号２）、「ＣＴＰ」はｈＣＧのカルボキシ末端ペプチド（配列番号３）、および「ＴｐＳ」はトロンボポエチンのカルボキシ末端ペプチド（配列番号４)である。

２．２ ＮＮＣＴ−ＥＰＯ
図１に示されるように、ＬＳＰ−Ｎ−Ｓ１プライマー

、ＬＳＰ−Ｎ−Ｓ２プライマー

、およびＥＮＮＣＴ１−Ａプライマー

を用い、ＰＣＲによりｐＮＤ／ＥＰＯ−ＮＮＣＴプラスミドからＮＮＣＴのＤＮＡ断片を複製し、ＮＮＣＴ−ＥＰＯ断片を得た。次いで、ＮＮＣＴ−ＥＰＯ断片を発現ベクターに挿入してｐＰＤ／ＮＮＣＴ−ＥＰＯベクターを得た。発現ベクターは選択マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子を含んでいた。

２．３ ＥＰＯ−Ｎ１Ｎ２
図１に示されるように、Ｅ−Ｓプライマー

およびＥＮＮＣＴ２−Ａプライマー

を用いＰＣＲによりｐＮＤ／ＥＰＯ−ＮＮＣＴプラスミドからＥＰＯ−Ｎ１Ｎ２のＤＮＡ断片を複製し、ＥＰＯ−Ｎ１Ｎ２断片を得た。次いで、そのＥＰＯ−Ｎ１Ｎ２断片を発現ベクターに挿入してｐＰＤ／ＮＮＣＴ−ＥＰＯベクターを得た。発現ベクターは選択マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子を含んでいた。

２．４ Ｎ１Ｎ２−ＥＰＯ
Ｎ１Ｎ２−ＥＰＯのＤＮＡ断片をＧＥＮＥＷＩＺ，Ｉｎｃによって合成し（図１に示されるとおり）、そしてそれを発現ベクターに挿入してｐＰＤ／Ｎ１Ｎ２−ＥＰＯベクターを得た。発現ベクターは選択マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子を含んでいた。

２．５ ＥＰＯ−Ｎ１
図１に示されるように、Ｅ−Ｓプライマー

およびＥＮＮＣＴ４−Ａプライマー

を用いＰＣＲによりｐＮＤ／ＥＰＯ−ＮＮＣＴプラスミドからＥＰＯ−Ｎ１のＤＮＡ断片を複製した。そのＥＰＯ−Ｎ１断片を発現ベクターに挿入してｐＰＤ／ＥＰＯ−Ｎ１を得た。発現ベクター選択マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子を含んでいた。

２．６ ＥＰＯ−Ｎ２
図１に示されるように、Ｅ−Ｓプライマー

およびＥＮＮＣＴ５−Ａプライマー

を用いＰＣＲ法によりｐＮＤ／ＥＰＯ−ＮＮＣＴプラスミドからＥＰＯ−Ｎ２のＤＮＡ断片を得て、ＥＰＯ−Ｎ２断片を得た。次いで、ＥＰＯ−Ｎ２断片を発現ベクターに挿入してｐＰＤ／ＥＰＯ−Ｎ１プラスミドを得た。発現ベクターは選択マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子を含んでいた。

実施例３
組換え細胞株の確立
ＥＰＯ−ＮＮＣＴ遺伝子を含むベクターをエレクトロポレーション（ＰＡ４０００ ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（登録商標）エレクトロポレーター、Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトした。先ず、細胞をトリプシン処理し、ＣＰ−Ｔバッファー（Ｃｙｔｏ ｐｌｕｓｅ Ｃａｔ． ＣＰ−Ｔ）中にて３×１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液２００μｌ（６×１０^５細胞）をｐＮＤ／ＢＭＰ２ １０μｇと混合し、電気泳動させた。電気泳動させた細胞を、選択物質を含まない完全培地（１０％ウシ胎児血清およびＨＴサプリメントを含有するＩＭＤＭ）中で培養し、回復成長させた。選択物質を含まない培地で４８時間成長させた後、細胞をＩＭＤＭ、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミンおよび５ｎＭ ＭＴＸを含有する、選択物質を含んだ完全培地に移した。約２週間の培養期間の後、細胞株を９６−ウェルプレートに移し、ＥＬＩＳＡでタンパク質レベルを定量化することにより、ｒｈＢＭＰ−２を高レベルに発現した細胞株を選別した。選別した細胞を選択培地中で培養した。細胞を１細胞／１００μｌの濃度に希釈してから、９６−ウェルプレートに移して培養し、細胞集塊に成長させた。発現レベルの高い細胞をＥＬＩＳＡの結果に基づいてスクリーニングし、ＭＴＸの濃度を徐々に高め０．００５、０．０１、０．０２から０．０５μＭにした。

実施例４
回分培養
実施例３で得た組換え細胞株４×１０^５細胞／ｍｌを、無血清培地の入った５０ｍｌフラスコ中で回分培養した。細胞を毎日監視し、培地を収集してＥＰＯの濃度を測定すると共に、０．０２μＭ ＭＴＸの投与下で高収量のクローンを選別した。撹拌培養において、ＥＰＯ−ＮＮＣＴの累積された生産性は、表１に示すように１４０．６９μｇ／ｍｌであった。

（表１）回分培養の結果

実施例５
生物活性アッセイ
本実施例のプロセスおよび手順を、欧州薬局方５．２（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ）の開示に従って実施した。雌８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを２つのグループに分け、本発明のＥＰＯ−ＮＮＣＴとＥｐｒｅｘ（登録商標）を個別にそれぞれ２１、４２、８４、１６８、３３６、および６７２ｎｇ／ｍｌ皮下注射した。注射後、全血０．２５ｍｌを採取した。細胞を染色した後、細胞をフローサイトメトリーおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアにより分析し、その結果を表２に示した。図２を参照すると、同じ投与量において、本発明のＥＰＯ−ＮＮＣＴを投与したマウスの網状赤血球の平均数は、Ｅｐｒｅｘ（登録商標）を投与したマウスのそれよりも高かった。

（表２）注射後の網状赤血球の量

２５匹の雌８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを５つのグループに分け、ＥＰＯ−ＮＮＣＴとＥｐｒｅｘ（登録商標）を個別にそれぞれ３３６ｎｇ／ｍｌ皮下注射した。注射後４から９、および１３日目に、マウスの全血を採取した。網状赤血球のパーセンテージをフローサイトメトリーで測定すると共に、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアにより分析し、その結果を表３に示した。表３に示されるように、網状赤血球の量（平均％）は、本発明のＥＰＯ−ＮＮＣＴを注射したマウスの７日目で最高であり、Ｅｐｒｅｘ（登録商標）に比べて著しく高かった。

（表３）注射後の異なる日における網状赤血球の量

実施例６
薬物動態アッセイ
１４匹の雌８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを４つのグループに分け、本発明のＥＰＯ−ＮＮＣＴ、Ｅｐｒｅｘ（登録商標）、およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）を個別にそれぞれ２０００ＩＵ／ｋｇ静脈および皮下注射した。マウスの血液を、注射後５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、５時間、８時間、２４時間、３０時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間、および３３６時間の時点で採取し、遠心分離により血清を得てから、血清を−７０℃で保存した。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＩＶＤ（登録商標）Ｅｐｏ ＥＬＩＳＡキットを用いて薬物動態アッセイを行い、４５０ｎｍおよび６００ｎｍにおける光学密度を測定してから、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ ５ソフトウェアで分析した。その結果が表４に示されている。図３〜４を参照すると、Ｅｐｒｅｘ（登録商標）およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）と比較して、本発明のＥＰＯ−ＮＮＣＴは、より長い半減期（約２５〜２６時間）、およびより高いＡＵＣ（曲線下面積）値（約８３８７〜４５０２ｎｇ・ｈｒ／ｍｌ）を有していた。

（表４）ＥＰＯ−ＮＮＣＴの薬物動態特性

同様に、Ｅｘｐｒｅｘ（登録商標）と比較して、本発明のＥＰＯ−Ｎ１Ｎ２、Ｎ１Ｎ２−ＥＰＯ、およびＮＮＣＴ−ＥＰＯもまた、表５に示されるように、より長い半減期（２１〜３０時間）、およびより高いＡＵＣ（曲線下面積）値（３７０〜９８１ｎｇ・ｈｒ／ｍｌ）を有していた。

さらに、ＥＰＯ−Ｎ１およびＥＰＯ−Ｎ２のＴｍａｘは約２４時間であった。したがって、ＥＰＯ−Ｎ１およびＥＰＯ−Ｎ２のＴｍａｘが市販のＥｐｒｅｘ（登録商標）に比して高かったことがわかる。

（表５）ＥＰＯ−Ｎ１Ｎ２、Ｎ１Ｎ２−ＥＰＯ、ＮＮＣＴ−ＥＰＯの薬物動態特性(皮下注射)

上に好ましい実施形態が開示されているが、これらは本発明を限定するために用いられるものであってはならず、当業者であれば、本発明の精神および範囲をこえることなくいくらかの変更および修飾を加えることができ、よって本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

ＥＰＯ：エリスロポエチン
Ｎｌ：高グリコシル化断片１
Ｎ２：高グリコシル化断片２
ＣＴＰ：ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端ペプチド
ＴｐＳ：トロンボポエチンのカルボキシ末端ペプチド

Claims (15)

1. エリスロポエチンおよび高グリコシル化ペプチドを含む組換えタンパク質。
2. 前記高グリコシル化ペプチドが、配列番号１および／または２に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の組換えタンパク質。
3. 前記高グリコシル化ペプチドが、配列番号１、２および／またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の組換えタンパク質。
4. 前記エリスロポエチンのカルボキシ末端が前記高グリコシル化ペプチドに結合している、請求項１に記載の組換えタンパク質。
5. 前記エリスロポエチンのアミノ末端が前記高グリコシル化ペプチドに結合している、請求項１に記載の組換えタンパク質。
6. ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組換えタンパク質。
7. 前記ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端ペプチドが、配列番号３に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の組換えタンパク質。
8. 前記高グリコシル化ペプチドのカルボキシ末端が前記ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端ペプチドに結合している、請求項７に記載の組換えタンパク質。
9. トロンボポエチンのカルボキシ末端ペプチドをさらに含む、請求項１または６に記載の組換えタンパク質。
10. 前記トロンボポエチンのカルボキシ末端ペプチドが、配列番号４に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項９に記載の組換えタンパク質。
11. 前記ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端ペプチドのカルボキシ末端が、前記トロンボポエチンのカルボキシ末端ペプチドに結合している、請求項９に記載の組換えタンパク質。
12. 前記組換えタンパク質が配列番号５、または配列番号５に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の組換えタンパク質。
13. 請求項１の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列 。
14. 請求項１３に記載のヌクレオチド配列でトランスフェクトされて請求項１の組換えタンパク質を発現する細胞。
15. 請求項１の組換えタンパク質と薬学的に許容可能な担体またはアジュバントとを含む組成物。

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