TWI507415B - 重組蛋白 - Google Patents
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Description
本發明係有關於一種重組蛋白，且特別有關於一種具有較長半衰期之高醣基化紅血球生成素。
紅血球生成素(Erythropoietin，簡稱EPO)是一種糖蛋白質激素，骨髓中紅血球前驅的細胞因子。在人體中，可進行紅血球的製造、荷爾蒙的調節。同時，它也具有其他的生物功能，例如，當神經受到傷害時，紅血球生成激素也參與傷口癒合過程。
紅血球生成作用是指紅血球細胞之生成，其作用為彌補被破壞的細胞。紅血球生成是一種受控制的生理機制，使足夠的紅血球細胞可被運用於適當之組織氧合作用。人類紅血球生成素(hEPO)由腎所產生，為一種體液血漿因子，可刺激紅血球細胞的生成(Carnot,P and Deflandre,C(1906)C.R.Acad.Sci.143：432；Erslev,AJ(1953 Blood 8：349；Reissmann,RR(1950)Blood 5：372；Jacobson,LO,Goldwasser,E,Freid,W and Plzak,LF(1957)Nature 179：6331-4)。自然生成之EPO可刺激骨髓中紅血球前驅細胞的分裂及分化，並經由與紅血球前軀物受體的結合而展現其生物活性(Krantz,BS(1991)Blood 77：419)。
利用重組體DNA技術已可生合成紅血球生成素(Egrie,JC,Strickland,TW,Lane,J et al.(1986)Immunobiol.72：213-224)，將經選殖之人類EPO基因嵌入，並以中國倉鼠卵巢組織細胞表現。EPO多肽在無糖部份下的分子量是18,236 Pa。在完整的EPO分子中，分子量中約有40%為碳水化合物基團，其在蛋白質醣基化作用位置上將蛋白質糖基化(Sasaki,H,
Bothner,B,Dell,A and Fukuda,M(1987)J.Biol.Chem.262：12059)。
因紅血球生成素是形成紅血球所必要的，所以EPO可用來治療紅血球細胞低下或缺失之血液失調症。就臨床而言，EPO可用於治療慢性腎衰竭病人(CRF)(Eschbach,JW,Egri,JC,Downing,MR et al.(1987)NEJM 316：73-78；Eschbach,JW,Abdulhadi,MH,Browne,JK et al.(1989)Ann.Intern.Med.111：992；Egrie,JC,Eschbach,JW,McGuire,T,Adamson,JW(1988)Kidney Intl.33：262；Lim,VS,Degowin RL,Zavala,D et al.(1989)Ann.Intern.Med.110：108-114)、AIDS及接受化療之癌症病人的貧血(Danna,RP,Rudnick,SA,Abels,RI In：MB,Garnick,ed.Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective.New York,NY：Marcel Dekker；1990：p.301-324)。然而，目前EPO蛋白質治療之生物利用率，受限於不良的血漿半衰期，以及蛋白酶的降解作用，使其難以獲得良好的臨床效力。
本發明的目的為提供一種具有較長半衰期之高醣基化紅血球生成素。
為達上述目的，本發明提供一種重組蛋白，包括一紅血球生成素，以及一高醣基化片段。
本發明更提供一種核苷酸序列，其編碼上述重組蛋白。
本發明更提供一種細胞，其轉染上述核苷酸序列以表現上述重組蛋白。
本發明更提供一種組成物，包括上述重組蛋白，以及一藥學上可接受之載體或佐劑。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作
詳細說明如下：
EPO‧‧‧紅血球生成素
N1‧‧‧高醣基化片段1
N2‧‧‧高醣基化片段2
CTP‧‧‧人類絨毛膜促性腺激素的羧基端胜肽
TpS‧‧‧促血小板生成素的羧基端胜肽
第1圖顯示本發明EPO-NNCT、NNCT-EPO、EPO-N1N2、N1N2-EPO、EPO-N1、EPO-N2基因片段的設計。
第2圖顯示本發明EPO-NNCT與市售Eprex®的活性比較。
第3圖顯示本發明EPO-NNCT與市售Eprex®藥物動力特性(PK)的比較(靜脈注射)。
第4圖顯示本發明EPO-NNCT與市售Eprex®藥物動力特性(PK)的比較(皮下注射)。
第5顯示本發明EPO-N1N2、N1N2-EPO、NNCT-EPO與市售Eprex®藥物動力特性(PK)的比較(皮下注射)。
本發明係提供一種長效型紅血球生成素，及其製備與使用方法。
在一實施例中，本發明提供一種重組蛋白，其包括一紅血球生成素以及一高醣基化片段。
本發明所述之“紅血球生成素(EPO)”包括任何來源的EPO蛋白，特別是指人類或動物EPO。本發明之EPO不限於自然的EPO蛋白，也包括其衍生物、相似物、修飾物、突變物等，只要其具有自然EPO蛋白的活性即可。
本發明也包括任何具有EPO活性的蛋白質，例如突變或其他修飾蛋白等。可藉由DNA重組技術在CHO、BHK、COS、HeLa或PER.C6或其他適合的細胞株中表現重組EPO，相關內容可參考美國專利US 5,733,761、US 5,641,670、US 5,733,746、US 5,994,122、US 5,733,761、US 5,641,670、US 5,981,214及US 5,272,071。EPO的製備與治療上應用可參考
US 5,547,933、US 5,621,080，Huang,S.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)2708-2712，Lai,P.H.et al.,J.Biol.Chem.261(1986)3116-3121，Sasaki,H.et al.,J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076。較佳的EPO種類為人類EPO。
本發明所述之“高醣基化片段”係指具有至少一醣基的10-30個胺基酸片段。本發明之高醣基化片段具有一或複數個N-或O-連接醣基化位置，可產生一或複數個醣基。例如，SEQ ID NO：1及/或2，或與SEQ ID NO：1、2所示序列相似度在60%、65%、70%、80%，較佳為90%、95%、99%以上的序列。
高醣基化片段與EPO融合形成本發明之重組蛋白，高醣基化片段可位於EPO的胺基端(N端)或羧基端(C端)，且數目並無特別限制。例如，可於EPO的N端及/或C端連接一或複數個相同或不同的高醣基化片段。含有高醣基化片段之EPO具有較長的半衰期，以及較佳的活性。在一實施例中，高醣基化片段(SEQ ID NO：1及/或2)可位於EPO的N端或C端，如第1圖所示。
高醣基化片段包括，但不限於，SEQ ID NO：1及/或2。可在EPO的C端連接一或複數個相同或不同的高醣基化片段。例如，在EPO的C端連接SEQ ID NO：1或2，或連接2個以上的SEQ ID NO：1或2；或在EPO的C端依序連接SEQ ID NO：1與2，或依序連接SEQ ID NO：2與1。在另一實施例中，EPO的C端依序連接SEQ ID NO：1與2。
本發明重組蛋白可更包括一人類絨毛膜促性腺激素(human Chorionic Gonadotropin，hCG)的羧基端胜肽(carboxy terminal peptide)。
本發明所述之“人類絨毛膜促性腺激素的羧基端胜肽(以下簡稱CTP)”係指人類絨毛膜促性腺激素第112-118至145位胺基酸的片段，或具有相同生物活性之變異體或類似物。因可分別從hCG的第112、113、114、115、116、
117或118位胺基酸開始，因此CTP可為具有28、29、30、31、32、33或34位胺基酸的片段。
本發明的CTP包括，但不限於，SEQ ID NO：3，或與SEQ ID NO：3所示序列相似度在65%、70%、80%，90%，較佳為95%以上的序列。
本發明之CTP可與EPO(N端或C端)及/或高醣基化片段(N端或C端)連接，且數目並無特別限制。例如，可在EPO的N端或高醣基化片段的C端連接一或複數個相同或不同之hCG的CTP。
本發明之CTP可作為蛋白質或胜肽的保護者，抑制蛋白質或胜肽的分解。在本發明中，hCG的CTP可延長重組蛋白的半衰期，以及增進重組蛋白的力價。
本發明重組蛋白可更包括一促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)的羧基端胜肽。
本發明所述之“血小板生成素的羧基端胜肽(以下簡稱TpS)”係指促血小板生成素第176至353位胺基酸的片段，較佳為第337至353位胺基酸的片段，或具有相同生物活性之變異體或類似物。
本發明之TpS包括，但不限於，SEQ ID NO：4，或與SEQ ID NO：4所示序列相似度在65%、70%、80%，90%，較佳為95%、99%以上的序列。
本發明之TpS可與EPO(N端或C端)、高醣基化片段(N端或C端)及/或CTP(N端或C端)連接，且數目並無特別限制。在一實施例中，可在EPO的N端或高醣基化片段的C端連接一或複數個相同或不同之TpS。在另一實施例中，可在EPO的N端或CTP的C端連接一或複數個相同或不同之TpS。
本發明TpS可作為蛋白質或胜肽的保護者，抑制蛋白質或胜肽的分解。TpS可延長重組蛋白的半衰期，以及促進重組蛋白的力價。
在本發明中，EPO、高醣基化片段、CTP與TpS的數目與排列並無特別限制。
在一實施例中，本發明之重組蛋白包括SEQ ID NO：1、2、3與4。
在另一實施例中，本發明之重組蛋白可擇自於SEQ ID NO：5(EPO-NNCT)、6(NNCT-EPO)、7(EPO-N1N2)、8(N1N2-EPO)、9(EPO-N1)、10(EPO-N2)。
本發明的高醣基化片段、CTP與TpS也包括經修飾的高醣基化片段、CTP與TpS。熟悉此技術領域人士可以一般傳統的技術對胜肽或DNA序列進行修飾。例如，蛋白質序列的修飾可包括改變、置換、取代、揷入或刪除編碼序列中的一或複數個個胺基酸。改變、置換、取代、揷入或刪除序列所使用的方法為一般所習知的技術。序列在改變、置換、取代、揷入或刪除後，較佳仍保有原本高醣基化片段、CTP與TpS的活性。
在一實施例中，修飾包括，但不限於，N-端修飾、C-端修飾、多肽鏈修飾，如CH2
-NH、CH2
-S、CH2
-S=O、O=C-NH、CH2
-O、CH2
-CH2
、S=C-NH、CH=CH或CF=CH、骨架修飾(backbone modifications)與殘基修飾(residue modification)。胜肽化合物的製備方法已為習知，例如，可參照Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press(1992)。
在一實施例中，多肽中的胜肽鍵(-CO-NH-)可被取代，例如，可被N-甲基鍵(-N(CH3
)-CO-)、酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮甲基(ketomethylen)鍵(-CO-CH2
-)、α-aza鍵(-NH-N(R)-CO-)，其中R為任意烷基、hydroxyethylene bonds(-CH(OH)-CH2
-)、硫醯胺(thioamide)鍵(-CS-NH-)、烯雙鍵(-CH=CH-)、逆醯胺鍵(-NH-CO-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2
-CO-)取代。
本發明另提供一種核苷酸序列，其編碼本發明之
重組蛋白。
本發明之“核苷酸”係指單股或雙股的核苷酸序列，其可由一RNA序列、cDNA序列、基因體序列及或上述之組合。
在本發明之核苷酸序列可利用PCR技術或其它已知的習知技術製備，相關技術可參考，例如，"Current Protocols in Molecular Biology",eds.Ausubel et al.,John Wiley & Sons,1992。
本發明之核苷酸序列可插入表現載體以表現重組蛋白。在一實施例中，表現載體包括其它額外的多肽，使其可在原核或真核細胞中複製與重組。在另一實施例中本發明之表現載體包括轉錄與轉譯的起始序列(如，啟動子或增強子)以及轉錄與轉譯的終止序列(如，polyadenylation signals)。
可使用各種真核或原核細胞作為寄主表現系統，以表現本發明之核苷酸序列。在一實施例中，此表現系統包括，但不限於，各種微生物，例如，細菌、真菌，植物細胞，真核細胞(例如，哺乳動物細胞，CHO細胞)等。
本發明之表現載體可利用各種方法轉染至細胞中。此方法可參考Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992),in Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang et al.,Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995),Vega et al.,Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)以及Gilboa et at.[Biotechniques 4(6)：504-512,1986]，且包括，例如，穩定或暫時性轉染、脂質體轉染、電穿孔轉染、或感染重組病毒載體。
本發明另提供一種組成物，包括上述之重組蛋白，以及一藥學上可接受之載體或賦形劑。
本發明所述之“藥學上可接受之載體或賦形劑”係指不會刺激個體組織，且不會抑制給予藥物或化合物之生物活性及特性的載體、賦形劑或佐劑。載體包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、或可溶於有機介質與水性介質的生物相溶性聚合物。賦形劑包括，但不限於，碳酸鈣、磷酸鈣、各種醣類和澱粉、纖維素衍生物、明膠、植物油與聚乙二醇。
本發明之組成物可用於治療貧血患者。貧血患者包括，但不限於，慢性腎功能不全患者、終末期腎臟病患者、接受透析的患者、慢性腎功能衰竭患者、愛滋病患者，癌症患者、化療患者，以及預定接受非心臟、非血管外科手術的貧血患者。
在給予貧血患者一治療有效量之本發明組成物後，可有效地增加貧血患者的血球容積比，且於本發明之高醣基化紅血球生成素在個體中具有較長的半衰期。本發明之高醣基化紅血球生成素具有比市售紅血球生成素(如，Eprex®及Aranesp®)更長的半衰期，例如，本發明高醣基化紅血球生成素的半衰期是市售紅血球生成素的1倍以上，較佳2倍以上，更佳3倍以上。在另一實施例中，本發明之高醣基化紅血球生成素具有比市售紅血球生成素(如，Eprex®及Aranesp®)更長的半衰期、更高的AUC值(area under curve)、Cmax值、與更長的Tmax值。
本發明所述之“治療有效量”一般係指約1至10000I.U./個體重量kg，較佳約50至2000I.U./個體重量kg，更佳約50至600I.U./個體重量kg，最佳約50至300I.U./個體重量kg。本發明的組成物可在任何所需的頻率或間隔給藥。給藥的方式，例如，可為每兩週三次，每週一次，每兩週一次，每三週一次，每月一次，每五週一次，每六週一次，或更頻繁或不頻繁的間隔，或在任何所需的頻率，或任何的時間間隔組合。本發明之活性成份的劑量可依照個體的種類，個體的大小、疾病的嚴重性等做適當的調整。例如，若個體
為接受化療的癌症患者，則給藥頻率可為每三週一次，以配合化療的時程。
1.宿主表現細胞
本實施例之宿主表現細胞使用缺少二氫葉酸還原酶的中國倉鼠卵巢細胞(CHO dfhr-)，其購買自台灣食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(CCRC,60133)。將CHO dfhr-細胞培養於IMDM培養基(Isocoves Modified Dulbecco’s Medium IMDM；Gibco Cat.12200-36)中，其中含有10%的胎牛血清(Gibco Cat.10091148)、次黃嘌呤與胸腺嘧啶(Gibco,Cat.11067-030)、以及2mM的L-麩醯胺(Gibco Cat.25030-081)。Dhfr(-)標誌被用來表現及篩選。藉由使用二氫葉酸還原酶抑制劑“甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)”(Sigma Cat no.M8407)使dhfr基因表現。當dfhr基因表現時，其他鄰近基因也被一起表現，選擇表現量高的細胞株，將細胞培養於37℃，5% CO2
的培養箱中(Model 3326，Forma scientific)。
2.表現載體的構築
2.1 EPO-NNCT
利用組合式PCR(assembly PCR)，將EPO-NNCT基因片段(SEQ ID NO：5)插入pcDNA3.1/Neo(+)/DHFR載體，形成pND/EPO-NNCT載體。此表現載體包含作為篩選標誌的抗新黴素基因(neomycin-resistance gene)。EPO-NNCT的基因片段如第1圖所示，其中EPO為紅血球生成素，N1為高醣基化片段1(SEQ ID NO：1)，N2為高醣基化片段2(SEQ ID NO：2)，CTP為人類絨毛膜促性腺激素的羧基端胜肽(SEQ ID NO：3)，TpS為促血小板生成素的羧基端胜肽(SEQ ID NO：4)。
2.2 NNCT-EPO
利用PCR及LSP-N-S1引子(3’-cctagggccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtggcttctcctgtccc
tgctgtcgctccctctgg-5’)(SEQ ID NO：11)、LSP-N-S2引子(3’-ctgtccctgctgtcgctccctctgggcctcccagtcctgggcgaggccgagaatatcacgacgggcggtaac-5’)(SEQ ID NO：12)與ENNCT1-A引子(3’-ctcggctgtcacagatgaggcgtggtggggccccttcctgagacagattctgggagtgggtgtaggatg-5’)(SEQ ID NO：13)由pND/EPO-NNCT質體複製NNCT的DNA片段，以獲得NNCT-EPO片段，如第1圖所示。將NNCT-EPO片段插入表現載體，獲得PPD/NNCT-EPO載體。此表現載體包含作為篩選標誌的抗新黴素基因(puromycin-resistance gene)。
2.3 EPO-N1N2
利用PCR及E-S引子(3’-cctagggccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcc-5’)(SEQ ID NO：14)與ENNCT2-A引子(3’-gtatacctacagctgcagagtctcgttcacctgggaagag-5’)(SEQ ID NO：15)由PND/EPO-NNCT質體複製EPO-N1N2的DNA片段，以獲得EPO-N1N2片段，如第1圖所示。將EPO-N1N2片段插入表現載體中，獲得PPD/NNCT-EPO載體。此表現載體包含作為篩選標誌的抗新黴素基因(puromycin-resistance gene)。
2.4 N1N2-EPO
委託GENEWIZ,Inc合成N1N2-EPO的DNA片段(如第1圖所示)，並插入表現載體中，獲得PPD/N1N2-EPO載體。此表現載體包含作為篩選標誌的抗新黴素基因(puromycin-resistance gene)。
2.5 EPO-N1
利用PCR及E-S引子(3’-cctagggccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcc-5’)(SEQ ID NO：16)與ENNCT4-A引子(3’-gtatacctagtctgggacagtgatattctc-5’)(SEQ ID NO：17)由PND/EPO-NNCT質體複製EPO-N1的DNA片段，如第1圖所示。將EPO-N1片段插入表現載體中，獲得PPD/EPO-N1載體。此表現載體包含作為篩選標誌的抗新黴素基因
(puromycin-resistance gene)。
2.6 EPO-N2
利用PCR及E-S引子(3’-cctagggccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcc-5’)(SEQ ID NO：18)與ENNCT5-A引子(3’-gtatacctacagctgcagagtctcgttcacctgggaagagttgaccaacagtctgtcccctgtcctgcaggcctccc-5’)(SEQ ID NO：19)由PND/EPO-NNCT質體複製EPO-N2的DNA片段，以獲得EPO-N2片段，如第1圖所示。將EPO-N2片段插入表現載體中，獲得PPD/EPO-N1載體。此表現載體包含作為篩選標誌的抗新黴素基因(puromycin-resistance gene)。
3.重組細胞株的建立
將含有人類EPO-NNCT基因的載體以電脈衝法(PA4000 PulseAgile® electroporator，Cyto Pulse Sciences)轉染至CHO dhfr-細胞內。首先將細胞以胰蛋白酶處理後，將細胞懸浮於CP-T緩衝液(Cyto pluse Cat.CP-T)中使細胞密度為3x106
細胞/ml。將200μl的細胞懸浮液(6x105
細胞)與10μg的pND/BMP2混合後進行電脈衝處理，將經電脈衝處理之細胞培養於不含篩選物質之完全培養基(含10%胎牛血清及HT補充物(HT Supplement)之IMDM)使細胞恢復成長。培養於不含篩選物質之培養基48小時後，將細胞移至含有IMDM、10%胎牛血清、L-麩醯胺及5nM甲氨蝶呤之含篩選物質的完全培養基中。在培養2週後，將細胞株移至96孔盤中，並利用ELISA定量分析篩選出高表現rhBMP-2的細胞株。將篩選出的細胞培養於篩選培養基中。將細胞稀釋至1細胞/100μl的濃度後移至96孔盤中培養至生長成細胞叢。利用ELISA偵測並定量BMP-2蛋白，再依據ELISA的結果篩選出高產量細胞並逐步增加MTX濃度從0.005、0.01、0.02至0.05μM。
4.批次培養
將實施例3所獲得的高產量細胞進行批次培養。使用50ml攪拌式培養槽，接種4 x 105
細胞/ml的細胞
在無血清的培養基中培養一個批次，且每天記錄細胞生長狀況及收集培養基以進行定量，在給予0.02μM MTX的條件下，其產量可達140.69μg/ml，如表一所示。
5.生物活性分析
本實施例參照歐洲藥典5.2(Erythropoietini solution concentrata)的規定進行。將8-10週齡BALB/c母鼠分為2組，分別以皮下注射的方式給予不同劑量(21、42、84、168、336、672ng/ml)之本發明EPO-NNCT與市售Eprex®。注射後，抽取0.25ml的全血，將細胞染色後，以細胞流式儀及CellQuest Pro軟體進行分析，結果如表二所示。由第2圖可知，在相同劑量下，給予本發明EPO-NNCT之小鼠的平均網狀紅血球數高於給予Eprex®。
將25隻8週齡的BALB/c小鼠分成5組，並分別給予336ng/ml的EPO-NNCT與Eprex®。在注射後，採集第4-9、13天的血液。以流式細胞儀計數網狀紅血球的數目，並利用CellQuest Pro軟體進行分析，結果如表三所示。由表三可知，在第7天時，本發明EPO-NNCT之小鼠的平均網狀紅血球數達到最高，且遠高於控制組Eprex的效果。
6.藥物動力學分析
將14隻8週齡大鼠分為4組，分別以靜脈與皮下注射的方式給予本發明之EPO-NNCT、市售Eprex®及市售Aranesp®，給予劑量為2000IU/kg。注射後，分別於第5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、1、2、5、8、24、30、48、72、96、120、168、216、264、336採血，經離心取得血清，保存於-70℃。以Quantikine® IVD® Epo ELISA套組進行分析，讀取450與600nm的吸光值，並以SoftMax® Pro 5軟體進行分
析，結果如表四所述。參照第3-4圖，相較於市售Eprex®及Aranesp®，本發明之EPO-NNCT具有較高的半衰期(25-26小時)，以及較高的AUC(Area under the Curve)值(8387-4502ng．小時/ml)。
同樣地，相較於市售Eprex®，本發明之EPO-N1N2、N1N2-EPO、NNCT-EPO也具有較高的半衰期(21-30小時)，以及較高的AUC(Area under the Curve)值(370-981ng．小時/ml)，如表五所示。
另外，本發明EPO-N1與EPO-N2的Tmax為約24小時。由此可知，相較於市售Eprex®，本發明EPO-N1與EPO-N2也具有較高的Tmax。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
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EPO‧‧‧紅血球生成素
N1‧‧‧高醣基化片段1
N2‧‧‧高醣基化片段2
CTP‧‧‧人類絨毛膜促性腺激素的羧基端胜肽
TpS‧‧‧促血小板生成素的羧基端胜肽
Claims (14)
- 一種重組蛋白，包括一紅血球生成素，以及一高醣基化片段，其中該高醣基化片段包括與SEQ ID NO.：1及/或2所示序列相似度在90%以上的序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白，其中該高醣基化片段為SEQ ID NO.：1、2及/或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白，其中該紅血球生成素的羧基端連接該高醣基化片段。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白，其中該紅血球生成素的胺基端連接該高醣基化片段。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白，更包括一人類絨毛膜促性腺激素的羧基端胜肽。
- 如申請專利範圍第5項所述之重組蛋白，其中該人類絨毛膜促性腺激素羧基端胜肽包括與SEQ ID NO：3所示序列相似度在90%以上的序列。
- 如申請專利範圍第6項所述之重組蛋白，其中該高醣基化片段的羧基端連接該人類絨毛膜促性腺激素羧基端胜肽。
- 如申請專利範圍第1或5項所述之重組蛋白，更包括一促血小板生成素的羧基端胜肽。
- 如申請專利範圍第8項所述之重組蛋白，其中該促血小板生成素羧基端胜肽包括與SEQ ID NO：4所示序列相似度在90%以上的序列。
- 如申請專利範圍第8項所述之重組蛋白，其中該人類絨毛膜促性腺激素羧基端胜肽的羧基端連接該促血小板生成素的羧基端胜肽。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白，其中該重組蛋白為SEQ ID NO：5或其序列相似度在90%以上的序列。
- 一種經分離之核苷酸分子，其編碼申請專利範圍第1項所述之重組蛋白。
- 一種細胞，其轉染一如申請專利範圍第12項所述之核苷酸序列以表現如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白。
- 一種組成物，包括如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白，以及一藥學上可接受之載體或佐劑。
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