SK285267B6

SK285267B6 - Deriváty inzulínu s rýchlym začiatkom pôsobenia, spôsob ich prípravy a farmaceutický prostriedok s ich obsahom

Info

Publication number: SK285267B6
Application number: SK836-98A
Authority: SK
Inventors: Johann Ertl; Paul Habermann; Karl Geisen; Gerhard Seipke
Original assignee: Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-17
Publication date: 2006-10-05
Also published as: ID20462A; HK1016616A1; CZ295964B6; NZ330700A; CY2005004I1; US6221633B1; AU7306498A; PL196626B1; NO2006014I2; DE122004000049I2; LU91138I2; CN1195777C; ATE283919T1; FR05C0009I2; BR9803708A; IL125006A; PL326936A1; KR100546225B1; IL125006A0; NL300170I1

Abstract

Opisujú sa deriváty inzulínu, ktoré v porovnaní sľudským inzulínom majú zrýchlený začiatok pôsobenia, spôsob ich prípravy a ich použitie predovšetkým vo farmaceutických prostriedkoch na liečenie Diabetes mellitus. Osobitne sa opisujú deriváty inzulínu alebo ich fyziologicky prijateľné soli, v ktorých je aminokyselina asparagín (Asp) v pozícii B3 reťazca B zamenený za prirodzene sa vyskytujúci bázický aminokyselinový zvyšok a aspoň jeden aminokyselinový zvyšok v pozíciách B27, B28 alebo B29 reťazca B je zamenený za iný, prirodzene sa vyskytujúci aminokyselinový zvyšok, ktorý je vybraný zo skupiny tvorenej neutrálnymi alebo kyslými aminokyselinami a fenylalanín (Phe) v pozícii B1 reťazca B aaminokyselinový zvyšok v pozícii B30 reťazca B môžu úplne chýbať.

Description

Oblasť techniky

Vynález opisuje deriváty inzulínu, ktoré v porovnaní s ľudským inzulínom majú zrýchlený začiatok pôsobenia, spôsob ich prípravy a ich použitie predovšetkým vo farmaceutických prostriedkoch na liečenie Diabetes mellitus.

Doterajší stav techniky

Vo svete trpí asi 120 miliónov ľudí na Diabetes mellitus. Medzi nimi je asi 12 miliónov diabetikov typu I, pre ktorých je aplikácia inzulínu v súčasnosti jedinou možnosťou terapie. Postihnutí sú doživotne, spravidla niekoľkokrát denne, odkázaní na injekciu inzulínu. Aj keď Diabetes typu H, ktorým trpí asi 100 miliónov, nie je primáme spôsobený nedostatkom inzulínu, napriek tomu sa v mnohých prípadoch liečba inzulínom používa ako priaznivá alebo jediná možná forma terapie.

S pokračujúcim časom trvania ochorenia trpí veľký počet pacientov takzvanými oneskorenými diabetickými komplikáciami. Ide pritom v podstate o mikro- a makrovaskuláme poškodenia, ktoré spôsobujú, podľa druhu a rozsahu, zlyhanie obličiek, oslepnutie, stratu končatín, alebo zvýšené riziko ochorenia srdca alebo obehového systému.

Príčinou komplikácií je v prvom rade chronicky zvýšená hladina glukózy v krvnom obraze, pretože aj dôkladná snaha o dosiahnutie normálnej hladiny glukózy v krvi takouto inzulínovou terapiou, aká by zodpovedala fyziologickej regulácii, nie je úspešná (Ward, J.D. (1989) British Medical Bulletin 45, strana 111 až 126; Drury, P. L. a kol. (1989) British Medical Bulletin 45, strana 127 až 147; Kohner, E. M. (1989) British Medical Bulletin 45, strana 148 až 173).

Sekrécia inzulínu u zdravých jedincov úzko závisí od koncentrácie glukózy v krvi. Jej zvýšená hladina, ku ktorej dochádza po prijatí potravy, je rýchlo kompenzovaná zvýšeným uvoľňovaním inzulínu. V období hladovania klesá hladina inzulínu v plazme na bazálnu hodnotu, ktorá zaručuje kontinuálne zásobovanie inzulín-senzitívnych orgánov a tkanív glukózou. Optimalizácia terapie, takzvaná intenzívna inzulínová terapia, sa v súčasnosti sústreďuje primárne na to, aby kolísanie koncentrácie glukózy v krvi bolo čo najmenšie, a to obzvlášť smerom nahor (Bolli, G. B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, strana 3 až 16;, Berger, M. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, strana 25 až 32). To napokon vedie k výraznému zníženiu výskytu a nástupu poškodení počas neskorej fázy choroby. (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, strana 977 až 986).

Z fyziológie sekrécie inzulínu je možné odvodiť, že na zlepšenú, intenzívnu inzulínovú terapiu sú pri použití subkutánne aplikovaných preparátov potrebné dva inzulínové prípravky s odlišnou farmakodynamikou. Na kompenzáciu vzostupu hladiny glukózy v krvi po prijatí jedla musí inzulín začať účinkovať rýchlo a môže pôsobiť iba niekoľko hodín. Na bazálne zásobovanie, predovšetkým v noci, by mal byť k dispozícii preparát, ktorý pôsobí dlho, nedosahuje žiadne výrazné maximum koncentrácie a začína účinkovať iba veľmi pomaly.

Preparáty, ktoré sú odvodené z ľudského a zvieracieho inzulínu, iba obmedzene spĺňajú nároky inzulínovej terapie. Rýchlo účinkujúci inzulín (Alt-inzulín) sa po subkutánnej aplikácii dostáva do krvi a na miesto pôsobenia príliš pomaly a pôsobí až príliš dlhý čas. Dôsledkom toho je, že po stprandiálna (po prijatí potravy) hladina glukózy je príliš vysoká, a že za niekoľko hodín po prijatí potravy hladina glukózy v krvi príliš výrazne klesne (Kang, S. a kol. (1991) Diabetes Čare 14, strana 142 až 148; Horne, P. J. a kol., (1989) British Medical Bulletin 45, strana 92 až 110; Bolli, G. B. (1989) Diabetes Res. Clin, Pract. 6, strana S3 až S16). Dostupné bazálne inzulíny, predovšetkým NPH-inzulíny, majú príliš krátky čas pôsobenia a dosahujú príliš výrazné maximum koncentrácie glukózy.

Okrem možnosti ovplyvnenia profilu účinku inzulínu galenickými prístupmi sa v súčasnosti naskytuje možnosť navrhnúť pomocou génových techník deriváty inzulínu s určitými vlastnosťami, ako je napríklad začiatok pôsobenia a čas účinku. Tieto zmeny možno dosiahnuť tým, že sa zmenia štruktúrne vlastnosti inzulínu. Lepšie nastavenie hladiny glukózy v krvi, ktoré by bolo viac podobné prirodzeným pomerom, by bolo potom možné dosiahnuť použitím vhodných derivátov inzulínu.

Deriváty inzulínu so zrýchleným začiatkom pôsobenia sú opísané v EP 0 214 826, EP 0 375 437 a EP 0 678 522. EP 0 214 826 okrem iného opisuje substitúciu v pozícií B27 a B28, ale nie je v spojení so substitúciou v pozícii B3. EP 0 678 522 opisuje deriváty inzulínu, ktoré majú v pozícii B29 rozdielne aminokyseliny, menovite prolín, a nie kyselinu glutámovú. EP 0 375 437 opisuje inzulínové deriváty s lyzinom alebo arginínom v pozícii B28, ktoré môžu byť ešte výhodne modifikované v pozícii B3 alebo A21.

V EP 0 419 504 sú opísané deriváty inzulínu, ktoré sú chránené proti chemickým modifikáciám, pričom je zamenený asparagin v pozícii B3 a minimálne ešte jedna ďalšia aminokyselina v pozícii A5, A15, A18 alebo A21. Doteraz však neboli opísané kombinácie s modifikáciami v pozíciách B27, B28 alebo B29. Rovnako nebol doteraz opísaný dôkaz toho, že tieto zlúčeniny majú pozmenenú farmakodynamiku s rýchlejším začiatkom pôsobenia.

Vo WO 92/00321 boli opísané deriváty inzulínu, ktoré majú minimálne jednu aminokyselinu v pozíciách BI až B6 nahradenú lyzinom alebo arginínom. Takéto inzulíny majú podľa WO 92/00321 predĺžený účinok. Kombinácie s modifikáciami v pozíciách B27, B28 a B29 však opísané neboli.

Cieľom vynálezu je príprava derivátov inzulínu, ktoré po aplikácii, predovšetkým po subkutánnej aplikácii, majú zrýchlený začiatok pôsobenia v porovnaní s ľudským inzulínom.

Deriváty inzulínu sú deriváty prirodzene sa vyskytujúcich inzulínov, t. j. ľudského (pozri sekvencia SEQ ID NO:

1, t. j. A-reťazec ľudského inzulínu, sekvencia SEQ ID NO:

2, t. j. B-reťazec ľudského inzulínu, sekvenčný protokol) alebo zvieracieho inzulínu, ktoré sa od zodpovedajúceho, prirodzene sa vyskytujúceho inzulínu líšia substitúciou aspoň jedného prirodzene sa vyskytujúceho aminokyselinového zvyšku alebo adíciou aspoň jedného aminokyselinového zvyšku, alebo organického zvyšku.

Cieľom predloženého patentu je ďalej poskytnúť postup na prípravu derivátov inzulínu s menovanými vlastnosťami, zodpovedajúcich medziproduktom ako aj ich prekurzorom.

Vynález opisuje inzulínový derivát alebo jeho fyziologicky prijateľnú soľ, ktorý spĺňa tento cieľ, v ktorom je asparagín (Asn) v pozícii B3 reťazca B zamenený za prirodzene sa vyskytujúci bázický aminokyselinový zvyšok a pričom aspoň jeden aminokyselinový zvyšok v pozíciách B27, B28 alebo B29 B-reťazca je zamenený za iný, priro2 dzene sa vyskytujúci aminokyselinový zvyšok, ktorý je vybraný zo skupiny tvorenej neutrálnymi alebo kyslými aminokyselinami afenylalanín (Phe) v pozícii BI reťazca B a aminokyselinový zvyšok v pozícii B30 reťazca B môžu chýbať úplne.

Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ sú znázornené vzorcom (I) s--s

I (A1-A5I-Cys-Cy$-Ä8-A9-fll0-Cys-tA12-A19)-Cys-A21

S---- S 15------------ s tllj

Bl-Val-B3-Gln-His-Leu-Cys-(B8-01B)-Cys-ÍB20-B26)-B27-B28-B29-B33 kde (A1-A5) označujú aminokyselinové zvyšky v pozíciách A1 až A5 reťazca A ľudského inzulínu (porovnaj so sekvenciou SEQ ID NO: 1), (A12-A19) označujú aminokyselinové zvyšky v pozíciách A12 až A19 reťazca A ľudského (porovnaj so sekvenciou SEQ IDNO: 1), (B8-B18) označujú aminokyselinové zvyšky v pozíciách B8 až BI8 reťazca B ľudského (porovnaj so sekvenciou SEQ ID NO: 2), (B20-B26) označujú aminokyselinové zvyšky v pozíciách B20 až B26 reťazca B ľudského (porovnaj so sekvenciou SEQ ID NO: 2),

A8, A9, A10 označujú aminokyselinové zvyšky v pozíciách A8, A9 a A10 reťazca A ľudského (porovnaj so sekvenciou SEQ ID NO: 1) alebo zvieracieho inzulínu, A21 je Asn,

B30 označuje -OH alebo aminokyselinový zvyšok v pozícii B30 reťazca B ľudského (porovnaj so sekvenciou SEQ ID NO: 2) alebo zvieracieho inzulínu,

BI označuje fenylalanínový zvyšok (Phe) alebo atóm vodíka,

B3 označuje prirodzene sa vyskytujúci bázický aminokyselinový zvyšok,

B27, B28 a B29 označujú aminokyselinové zvyšky v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B ľudského (porovnaj so sekvenciou SEQ ID NO: 2) alebo zvieracieho inzulínu, alebo vždy iný prirodzene sa vyskytujúci aminokyselinový zvyšok, pričom aspoň jeden aminokyselinový zvyšok v pozícii B27, B28 a B29 reťazca B je vymenený za iný prirodzene sa vyskytujúci aminokyselinový zvyšok.

Z dvadsiatich prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín, ktoré sú geneticky kódované, sú v ďalšom texte glycín (Gly), alanín (Ala), valín (Val), leucín (Leu), izoleucín (íle), Serín (Ser), treonín (Thr), cysteín (Cys), metionin (Met), asparagín (Asn), glutamín (Gin), fenylalanín (Phe), tyrozín (Tyr), tryptofán (Trp) a prolín (Pro) označované ako neutrálne aminokyseliny, aminokyseliny arginín (Arg), lyzín (Lys) a histidín (His) ako bázické a aminokyseliny kyselina asparágová (Asp) a kyselina glutámová (Glu) ako kyslé aminokyseliny.

Deriváty inzulínu podľa vynálezu, alebo ich fyziologicky prijateľné soli, sú výhodne odvodené z hovädzieho, prasacieho alebo ľudského inzulínu, mimoriadne výhodné sú potom deriváty inzulínu alebo ich fyziologicky prijateľné soli podľa vzorca (I), kde A8 znamená alanín (Ala),

A9 serín (Ser), A10 valín (Val), B30 alanín (Ala) (aminokyselinové zvyšky A8 až A10 a B30 hovädzieho inzulínu,

A8 znamená treonín (Thr),

A9 serín (Ser) a

A10 izoleucín (íle) (aminokyselinové zvyšky A8 až A10 ľudského alebo prasacieho inzulínu, pričom

B30 znamená alanín (Ala) (aminokyselinový zvyšok B30 prasacieho inzulínu) alebo

B30 znamená treonín (Thr) (aminokyselinový zvyšok B30 ľudského inzulínu, porovnaj sekvenciu SEQ ID NO: 2).

V mimoriadne výhodnom uskutočnení vynálezu má derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I) aminokyselinové zvyšky A8 až A10 a B30 ľudského inzulínu a ďalej:

(A1 až A5) označuje aminokyselinové zvyšky v pozíciách A1 až A5 reťazca A ľudského inzulínu (porovnaj so sekvenciou SEQ ID NO: 1), (A12 až A19) aminokyselinové zvyšky v pozíciách A12 až A19 reťazca A ľudského inzulínu (porovnaj so sekvenciou SEQ IDNO: 1), (B8 až B18) aminokyselinové zvyšky v pozíciách B8 až BI8 reťazca B ľudského inzulínu (porovnaj so sekvenciou SEQ ID NO: 2) a (B20 a B26) aminokyselinové zvyšky v pozíciách B20 až B26 reťazca B ľudského inzulínu (porovnaj so sekvenciou SEQ ID NO: 2).

V ďalších výhodných uskutočneniach vynálezu má derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I) v pozícii BI reťazca fenylalanínový zvyšok (Phe) alebo derivát inzulínu, alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ vzorca (I), ktorý má ako aminokyselinový zvyšok v pozícii B3 reťazca B histidín (His), lyzín (Lys) alebo arginín (Arg).

V inom výhodnom uskutočnení vynálezu má derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I) aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B nahradený jedným prirodzene sa vyskytujúcim aminokyselinovým zvyškom, ktorý patrí do skupiny tvorenej neutrálnymi alebo kyslými aminokyselinami.

Vynález ďalej opisuje výhodný derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľnú soľ podľa vzorca (I), kde aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B je prirodzene sa vyskytujúci aminokyselinový zvyšok, ktorý je vybraný zo skupiny tvorenej aminokyselinami: izoleucín (íle), kyselina asparágová (Asp) a kyselina glutámová (Glu); a v mimoriadne výhodnom je aspoň jeden aminokyselinových zvyškov, ktorý je vybraný zo skupiny neutrálnych aminokyselín, alebo v ďalšom mimoriadne výhodnom uskutočnení vynálezu je aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B derivátu inzulínu podľa vynálezu izoleucínovým zvyškom (íle).

Vynález ďalej opisuje výhodný derivát inzulínu alebo fyziologicky prijateľnú soľ podľa vzorca (I), kde aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B je prirodzene sa vyskytujúcim aminokyselinovým zvyškom, ktorý je vybraný zo skupiny kyslých aminokyselín; alebo aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B je zvyšok kyseliny asparágovej (Asp); alebo výhodne kde aminokyselinový zvyšok v pozíciách B27 a B28 reťazca B je zvyškom kyseliny asparágovej (Asp), alebo ešte výhodnejšie kde aspoň jeden a aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B je zvyškom kyseliny glutámovej (Glu).

Výhodným uskutočnením vynálezu je tiež derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I), kde je amitiokyselinový zvyšok v pozícii B29 reťazca B zvyškom kyseliny asparágovej (Asp).

Ďalším výhodným uskutočnením vynálezu je derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I), kde je aminokyselinový zvyšok v pozícii B27 reťazca B zvyškom kyseliny glutámovej (Glu); alebo derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I), v ktorom je aminokyselinový zvyšok v pozícii B28 reťazca B zvyškom kyseliny glutámovej (Glu) alebo derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ vzorca (I), v ktorom je aminokyselinový zvyšok v pozícii B28 reťazca B zvyškom kyseliny glutámovej (Glu).

Mimoriadne výhodné uskutočnenie vynálezu je derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I), ktorý sa vyznačuje tým, že reťazec B má sekvenciu: Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Scr His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr (sekvencia SEQ ID NO: 3), napríklad ľudský mutantný inzulín Lys (B3), Glu (B29).

Ďalším mimoriadne výhodným uskutočnením vynálezu je derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I), v ktorom je aminokyselinový zvyšok v pozícii B27 reťazca B zvyškom aminokyseliny izoleucínu (íle); a mimoriadne výhodným je potom menovite derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I), v ktorom B-reťazec má sekvenciu:

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr íle Pro Lys Thr (sekvencia SEQ ID NO: 5), napríklad ľudský mutantný inzulín Lys (B3), íle (B27).

Ďalším výhodným uskutočnením vynálezu je derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (1), v ktorom je v pozícii B28 reťazca B izoleucínový zvyšok (íle); a mimoriadne výhodným je potom menovite derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I), v ktorom B-reťazec má sekvenciu: Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr íle Lys Thr (sekvencia SEQ ID NO: 4), napríklad ľudský mutantný inzulín Lys (B3), íle (B28).

Ďalším výhodným uskutočnením vynálezu je derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa vzorca (I), ktorý sa vyznačuje tým, že aminokyselinový zvyšok v pozícii A21 je asparagín (Asp); menovite výhodný je potom derivát inzulínu, ktorého A-reťazec má sekvenciu: Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asp (sekvencia SEQ ID NO: 9) a B-reťazec sekvenciu:

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr íle Lys Thr (sekvencie SEQ ID NO: 10), napríklad ľudský mutantný inzulín Lys (B3), íle (B28), Asp (A21).

Deriváty inzulínu podľa vzorca (I) je možné pripraviť pomocou génových technológií.

Vynález ďalej opisuje spôsob prípravy derivátu inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľnej soli podľa vzorca (I) konštrukciou replikovateľného expresného systému, ktorý obsahuje DNA sekvenciu kódujúcu prekurzor derivátu inzulínu, v ktorom je aminokyselinový zvyšok v pozícii A1 reťazca A spojený s aminokyselinovým zvyškom B30 reťazca B peptidovým podľa vzorca (II)

R'„ -Arg- (II), kde, R'_n - znamená peptidový reťazec s n aminokyselinovými zvyškami, pričom n je celé číslo z intervalu od 0 do 34; a reťazec B je v pozícii BI predĺžený o peptidový reťazec podľa vzorca (III)

Met - R² _m - (Arg)_p - (III), kde , R²m dole znamená peptidový reťazec s m aminokyselinovými zvyškami, pričom m je celé číslo od 0 do 40, vo výhodnom uskutočnení vynálezu od 0 do 9, a p znamená 0, 1 alebo 2, pričom pre p = 0 končí R²m výhodne s aminokyselinou lyzínom (Lys). Expresia v hostiteľskej bunke a uvoľnenie derivátu inzulínu z jeho prekurzora sú realizované chemickými alebo enzýmovými spôsobmi.

V spôsobe podľa vynálezu môže byť hostiteľskou bunkou baktéria, menovite potom baktéria E. coli.

V spôsobe podľa vynálezu môže byť hostiteľskou bunkou tiež kvasinka, pričom vo výhodnom uskutočnení vynálezu je touto bunkou kvasinka Saccharomyces cerevisiae.

Na prípravu derivátu inzulínu s aminokyselinovou sekvenciou podľa sekvencie SEQ ID NO: 9 (reťazec A) a sekvencie SEQ ID NO: 10 (reťazec B) je výhodné použiť prekurzor derivátu inzulínu so sekvenciou:

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr íle Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Íle Val Glu Gin Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asp (sekvencia SEQ ID NO: 11), Lys (B3), íle (B28), Asp (A21) - preproinzulín

Na prípravu derivátu inzulínu a aminokyselinovou sekvenciou podľa sekvencie SEQ ID NO: 3 je výhodné použiť prekurzor derivátu inzulínu so sekvenciou: Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Asn Tyr Cys Asn (sekvencia SEQ ID NO: 6), Lys (B3), Glu (B29) - preproinzulín

Na prípravu derivátu inzulínu s aminokyselinovou sekvenciou podľa sekvencie SEQ ID NO: 5 je výhodné použiť prekurzor derivátu so sekvenciou:

Met Ala Thr Thr Ser Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr íle Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (sekvencia SEQ ID NO: 8), Lys (B3), íle (B27) - preproinzulín

Na prípravu derivátu inzulínu s aminokyselinovou sekvenciou podľa sekvencie SEQ ID NO: 4 je výhodné použiť prekurzor derivátu inzulínu so sekvenciou:

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr íle Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg

Gly íle Va1 Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (sekvencia SEQ ID NO: 7), Lys (B3), íle (B28) - preproinzulín

Vynález takisto opisuje menované prekurzory výhodného derivátu inzulínu, peptidy podľa Sekvencie SEQ ID NO: 11, sekvencie SEQ ID NO: 6, sekvencie SEQ ID NO: 7 a sekvencie SEQ ID NO: 8; sekvencie DNA, ktoré kódujú spomínané prekurzory, expresné systémy, ktoré obsahujú tieto DNA sekvencie ako aj hostiteľské bunky, ktoré sú transformované týmto expresným systémom.

Deriváty inzulínu podľa vzorca (I) sa pripravujú hlavne génovými technikami prostredníctvom cielenej mutagenézy pomocou spôsobov známych zo stavu techniky.

Pre požadovaný derivát inzulínu vzorca (I) sa konštruuje génová štruktúra, ktorá je potom exprimovaná v hostiteľskej bunke, výhodne v baktérii E. coli alebo v kvasinke, konkrétne v kvasinke Saccharomyces cerevisiae. V prípade, keď génová štruktúra kóduje fúzny proteín, je z neho uvoľnený derivát inzulínu podľa vzorca (1); analogické spôsoby sú opísané napríklad v EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 939, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 a v DE-patentovej prihláške číslo P 38 21 159.

Odštiepenie fúznej časti proteínu po rozbití buniek môže byť realizované chemicky s halogéncyanom (pozri EP-A-0 180 920).

Pri výrobe derivátu inzulínu prostredníctvom preproinzulínového prekurzoru, ktorý obsahuje časť fúzneho proteínu (presekvencia) podľa US 5,358,857, dochádza k odštiepeniu fúznej časti v ďalšom kroku spolu s odštiepením C-terminálneho peptidu.

Inzulínový prekurzor je ďalej podrobený oxidačnej sulfitolýze podľa metódy opísanej napríklad R.C. Marshall a A.S. Inglis v „Practical Proteín Chemistry - A Handbook“ (vydavateľ A. Darbre) 1986, strany 49 až 53 a následne je v prítomnosti tiolu renaturovaný tvorbou požadovaných disulfidických mostíkov spôsobom opísaným napríklad v G. H. Dixon a A.C. Wardlow, Náture (1960), strana 721 až 724.

Inzulínový prekurzor môže byť zložený tiež priamo, pozri EP-A-0 600 372, EP-A-0 668 292.

C-terminálny peptid sa odstráni štiepením trypsínom - napríklad spôsobom opísaným v Kemmler a kol., J. B. C. (1971), strana 6786 až 6791 a derivát inzulínu vzorca (I) sa prečistí pomocou známych techník, napríklad chromatograficky, pozri EP-A-0 305 760 a kryštalizáciou.

V prípade, keď sa n vo vzorci (II) rovná nule, štiepenie trypsínom slúži na rozštiepenie peptidovej väzby medzi reťazcom A a B.

V tomto spôsobe končí reťazec B na C-konci arginínom alebo dvoma arginínovými zvyškami. Tie sa môžu odstrániť pomocou karboxypeptidázy B.

Inzulínový derivát podľa vynálezu má úplnú biologickú aktivitu. To sa dokázalo prostredníctvom intravenóznej aplikácie na králikoch a z poklesu glukózy v ich krvi (príklady 5 a 6).

Rýchlejší nástup účinku inzulínového derivátu po subkutánnej aplikácii sa dokázal euglykemickou clamp technikou na hladujúcom psovi (príklad 7). Podávalo sa 0,3 IU/kg inzulínu a ako referenčný preparát sa použil ľudský inzulín.

Pri clamp technike sa po aplikácii inzulínu v krátkych časových intervaloch meria hladina glukózy v krvi a rovnaké množstvo glukózy sa aplikuje, aby sa kompenzoval jej pokles. Výhodou metódy je, že pri zvieratách nenastupuje génová regulácia, ktorá by sa dal očakávať v prípade rýchleho úbytku krvnej glukózy po podaní inzulínu. Množstvo a časový priebeh glukózy podanej infúziou charakterizujú pôsobenie inzulínu. Inzulíny Lys(B3), Glu(B29) - (sekvencia SEQ ID NO: 3) a Lys (B3), íle (B28) - (sekvencia SEQ ID NO: 4) majú zreteľne rýchlejší začiatok pôsobenia ako ľudský inzulín. Maximálny účinok (infúzna rýchlosť glukózy) sa dosiahne s ľudským inzulínom 100 minút po aplikácii, zatiaľ čo s inzulínom Lys(B3), Glu(B29) - (sekvencia SEQ ID NO: 3) 80 minút a s inzulínom Lys (B3), íle (B28) - (sekvencia SEQ ID NO: 4) už po 60 minútach. Preto by mali tieto analógy lepšie kompenzovať postprandiálny nárast glukózy v krvi ako ľudský inzulín, keď sa aplikujú krátko predjedlom.

Opísané inzulínové deriváty sú výhodné na terapiu diabetes mellitus typ I ako aj typ II, predovšetkým v spojení s bazálnym inzulínom.

Vynález sa preto tiež dotýka použitia derivátu inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľnej soli podľa vzorca (I) na výrobu farmaceutického prípravku, ktorý má rýchly začiatok pôsobenia.

Ako fyziologicky neškodné a s inzulínovým derivátom znášané nosné médium je vhodný sterilný vodný roztok napríklad glukózy, glycerínu, kuchynskej soli, ktorý je izotonický proti krvi a ktorý obsahuje tiež konzervačný prostriedok ako je napríklad fenol, m-krezol alebo ester kyseliny p-hydroxybenzoovej. Nosné médium môže navyše obsahovať pufor, napríklad acetát sodný, citrát sodný, fosfát sodný. Na nastavenie pH sa používajú zriedené kyseliny (obyčajne HC1) alebo zásady (NaOH). Prípravok môže ďalej obsahovať ióny zinku.

Deriváty inzulínu sa môžu použiť vo farmaceutických prípravkoch vo forme ich fyziologicky prijateľných solí, ako sú soli amónne alebo alkalické. Ľubovoľný diel jedného alebo niekoľkých derivátov inzulínu podľa vzorca (I) alebo derivát inzulínu podľa vzorca (I) môže existovať v zmesi ďalších derivátov inzulínu vždy navzájom nezávisle, v rozpustenej, amorínej alebo v kryštalickej forme.

Niekedy je výhodné k prípravku podľa vynálezu pridať príslušné množstvo vhodného stabilizátora, ktorý zabráni zrážaniu proteínov pri tepelno-mechanickej námahe prípravku pri kontakte s rôznymi materiálmi. Takéto stabilizátory sú opísané napríklad v patentoch EP-A-018609 DE-A 32 40 177 alebo WO-83/00288.

Vynález ďalej opisuje farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje aspoň jeden derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľnú soľ podľa vzorca (I), konkrétne v rozpustenej, amorfnej alebo kryštalickej forme.

Derivát inzulínu podľa vynálezu sa vyznačuje rýchlym začiatkom pôsobenia. V praktickej inzulínovej terapii je podľa okolností vhodné rýchlo pôsobiace inzulíny zmiešať s prípravkom, ktorý obsahuje depotnú pomocnú látku (napríklad NPH-inzulín). Jeho profd účinkuje následkom toho podľa zloženia prípravku zložený z profilov jednotlivých komponentov, ak sú jednotlivé komponenty zmesi stabilné a navzájom sa neovplyvňujú. Pri zmiešaní inzulínového derivátu s ľudským NPH-inzulínom sa však dá očakávať, že hlavne pri dlhodobom skladovaní dochádza k výmene medzi rozpusteným derivátom a kryštalickým NPH-inzulínom. Preto môže byť farmakodynamika depotného inzulínu ako aj rozpusteného inzulínu s rýchlym účinkom pozmenená nepredvídateľným spôsobom. Preto je vhodné pripraviť rýchlo pôsobiaci derivát s použitím depotnej pomocnej látky - ako je napríklad NPH-inzulín. Táto depotná forma inzulínového derivátu sa môže ľubovoľne miešať s rozpustenou rýchlo pôsobiacou formou bez toho, aby sa zloženie jednej alebo druhej formy v priebehu skladovanie menilo.

Aj keď vynález opisuje predovšetkým rýchlo pôsobiaci inzulínový derivát, zahŕňa tiež možnosť pripraviť tento derivát pre lepšiu miešateľnosť ako depotné formy, pričom sa ako depotná pomocná látka používa predovšetkým aprotaminsulfát a inzulínový derivát alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ sa potom premení na kokryštalickú formu s protanrinsulfátom.

Vynález ďalej opisuje injikovateľný roztok, ktorý obsahuje farmaceutické prípravky podľa vynálezu v rozpustenej forme.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Konštrukcia proinzulínu Lys (B3) ako východisko pre plazmidy podľa príkladov 2 až 4

V patente Spojených štátov US 5,258,857 je opísaný vektor pINT90d ako aj PCR primery Tir a Insu 11. Tieto komponenty slúžia ako východiskový materiál na konštrukciu plazmidu pINT125d, ktorý kóduje požadovaný proinzulín Lys (B3). Dodatočne sa syntetizoval primér Insu 35 so sekvenciou:

’ TTT GTG AAG CAG CAC CTG 3’ a primér Insu 36 so sekvenciou: 5’ CAG GTG CTG CTT CAC AAA 3’

Následne sa uskutočnila jedna PCR reakcia pomocou printerov Tir a Insu 36 a druhá PCR reakcia s použitím primerov Insu 11 a Insu 35. Ako templát sa použil plazmid pINT90d.

Produkty obidvoch reakcií sú navzájom čiastočne komplementárne, takže je ich možné použiť ako templáty na ďalšiu PCR reakciu s primermi Tir a Insu 11. Produktom tejto reakcie bol zjednotený fragment kódujúci variant proinzulínu, ktorý obsahuje v pozícii 3 reťazca B aminokyselinu lyzín. Tento PCR fragment sa potom prečistil etanolom, vysušil a následne sa naštiepil s reštrikčnými enzýmami Ncol a Sali. Reakčná zmes sa po štiepení elektroforeticky rozdelila a izoloval sa požadovaný fragment Ncol/Sall.

V citovanej prihláške je opísaný plazmid pINT91d, ktorý kóduje mini-proinzulín. Sekvencia kódujúca miniproinzulín sa vyštiepila pomocou reštrikčných enzýmov Ncol a Sali a izoloval sa zostávajúci plazmid. Do tohto plazmidu sa vložil Ncol/Sall PCR fragment pomocou T4 ligázy, pričom vznikol plazmid pINT125d. Týmto plazmidom sa transformovali baktérie E. coli KÍ2, ktoré sa namnožili a plazmid sa opäť izoloval. Štruktúra plazmidu sa prekontrolovala pomocou DNA-sekvenovania a reštrikčnej analýzy. Po tejto analýze sa DNA plazmidu pINT125d použila ako templát na vnesenie ďalších mutácií do tohto variantu génu pre proinzulín.

Príklad 2: Konštrukcia proinzulínu Lys (B3) Glu (B29)

Na prípravu mutovaných proteinov sa nasyntetizovali dva primery: primér 329 so sekvenciou:

’ TTC TAC ACA CCC GAG ACC CGC GGC ATC G - 3 ’ a primér 329b so sekvenciou:

’ GCC GCG GGT CTC GGG TGT GTA GAA GAA GC - 3 ’

Ako templát sa použila DNA z plazmidu pINT125d a pINT91d. Primér 328a sa použil v PCR reakcii spolu s printerom Insu 11 a plazmidom pINT91d ako templátom a primér 329b sa použil v PCR reakcii s primerom Tir (pozri príklad 1) a plazmidom pINT125d. Vzhľadom na to, že sú oba produkty čiastočne komplementárne , je možné ich spojiť do ďalšej PCR reakcie s primermi Tir a Insu 11. Vzniknutý DNA fragment kóduje proteín s požadovanou mutáciou. Tento fragment sa potom naštiepil s enzýmami Ncol a Sali a vzniknutý Ncol/Sall fragment sa pomocou T4 ligázy vložil do zvyškového plazmidu pINT91d.

Týmto postupom sa vytvoril plazmid pINT329, ktorý sa po amplifikácii v kmeni E. coli K12 podrobil sekvenčnej a reštrikčnej analýze, čím sa overila jeho štruktúra.

Derivát proinzulínu kódovaný týmto plazmidom je charakterizovaný tak uvedenou zámenou aminokyselín ako aj C-spojovacím peptidom, ktorý pozostáva z arginínu.

Príklad 3: Konštrukcia proinzulínu Lys (B3) íle (B27)

Konštrukcia tohto proinzulínu sa uskutočnila spôsobom opísaným v predošlom príklade s tým rozdielom, že sa použili nasledujúce páry primerov: primér KB3 J 27A so sekvenciou 5’ TTC TAC ATC CCC AAG ACC CGC CG 3’ spolu s primerom Insu 11 a primér KB3 J 27B so sekvenciou 5’ CTT GGG GAT GTA GAA GAA GCC TCG 3’ spolu s primerom Tir.

Ako templát poslúžil v obidvoch PCR reakciách plazmid pINT125d. Produkty obidvoch reakcií sa spojili treťou PCR reakciou tak ako sa opísalo v príklade 1 a vzniknutý produkt sa naklonoval do plazmidu podobným spôsobom za vzniku plazmidu pINT322.

Príklad 4: Konštrukcia proinzulínu Lys (B3) íle (B28)

Konštrukcia tohto proinzulínu sa uskutočnila spôsobom opísaným v príklade 3 s tým rozdielom, že sa použili nasledujúce páry primerov: primér KB3 JB 28A so sekvenciou 5’ TAC ACA ATC AAG ACC CGC CGG GAG - 3’ spolu s primerom Insu 11 a primér KB J B28B so sekvenciou 5’ GGT CTT GAT TGT GTA GAA GAA GCC TCG - 3’ spolu s primerom Tir.

Podobným opísaným spôsobom sa vytvoril plazmid pINT333.

Expresia skonštruovaných variantov inzulínu

Baktérie kmeňa E. coli KÍ2 sa transformovali s plazmidmi pINT329, 322 a 333. Rekombinantné baktérie obsahujúce príslušné plazmidy sa kultivovali podľa príkladu 4 US patentu číslo 5227293. Tak sa pripravili požadované východiskové suroviny na výrobu príslušných variantov inzulínu.

Príklad 5: Konštrukcia proinzulínu Lys(B3), Ile(B28), Asp(A21)

Konštrukcia tohto proinzulínu sa uskutočnila spôsobom opísaným v príklade 3. Namiesto plazmidu pINT125d sa však ako templát na PCR reakciu použil plazmid plNT333, pripravený v príklade 4. Na vloženie mutácie sa použili nasledujúce primery: primér P-pint365 ’ TTTTTTGTCGACTATTAGTCGCAGTAGTTCTACCAGCTG-3 ’ a primér Tir.

Vzniknutý plazmid sa označil pINT 365.

Príklad 6: Biologická aktivita inzulínu Lys (B3), Glu (B29), po intravenóznej aplikácii králikovi

Čas [h]	Ľudský inzulín	Inzulín Lys (B3), Glu (B29)
0	100	100
0,25	89,17	89,47
0,5	67,56	58,32
0,75	73,24	66,59
1,0	73,13	68,21
1,5	78,12	71,95
2	89,47	80,88
3	107,01	94,2
4	104,55	99,78

králikov dostalo intravenózne dávku 0,2 IU/kg uvedeného inzulínu. V priebehu nasledujúcich štyroch hodín sa v uvedených časoch stanovovali koncentrácie krvnej glukózy a vzťahovali sa na počiatočnú hodnotu v čase 0. Priemerné hodnoty nemajú žiadne významné rozdiely v biologickej aktivite medzi ľudským inzulínom a inzulínom Lys (B3), Glu (B29).

Príklad 7: Biologická aktivita inzulínu Lys (B3), Ile (B27) a Lys (B3), Ile (B28) po intravenóznej aplikácii králikovi králikov dostalo intravenózne dávku 0,2 IU/kg uvedeného inzulínu. V priebehu nasledujúcich štyroch hodín sa v uvedených časoch stanovovali koncentrácie krvnej glukózy a vzťahovali sa na počiatočnú hodnotu v čase 0. Priemerné hodnoty nemajú žiadne významné rozdiely v biologickej aktivite medzi ľudským inzulínom a inzulínmi Lys (B3), Ile (B27) a Lys (B3), Ile (B28).

Čas [h]	Ľudský inzulín	Inzulín Lys (B3), Ile (B27)	Inzulín Lys (B3), Ile (B28)
0	100	100	100
0,33	67,8	62,6	63,3
0,66	54,9	60,6	55,8
1	55,2	60,6	59,3
1,5	63	79,2	66,7
2	77,8	90,9	81,6
3	91,5	96,3	97,2
4	99,5	96	101,6

Príklad 8: Farmakodynamika inzulínu Lys (B3), Glu (B29) a Lys (B3), Ile (B28) po subkutánnej aplikácii do psieho organizmu

Psom (po štyroch pre každý inzulín) sa podala subkutánne dávka 0,3 IU/kg inzulínu. Koncentrácia krvnej glukózy sa kontinuálnou infúziou udržiavala na 3,7 až 4 mmol/1. V tabuľke sú uvedené priemerné hodnoty infúznej rýchlosti glukózy + stredná chyba priemeru (SEM). Hodnoty sú uvádzané v intervale 0 (čas aplikácie) až 240 minút.

Priebeh koncentrácií glukózy pri hladujúcich psoch po podaní derivátov inzulínu s rýchlym účinkom

Parametre profilu udávajúceho rýchlosť infúzie glukózy

Dávka bola 1 x 0,3 IU/kg v t=0, n=4

Preparát	Vzostupná fáza	t...		ná fáza
Inflexný bod {mín)	v lnflexnom		Inflexný bod	Smernica bode
Hlnzultn Ho.cli.t	43	MM	.00	156	-0,065
Inzulín l.ya (03), Clu 1029)	33		BO	127	-0,09.
Inzulín i.ya<B3), Ile(D?0l		íl, ?fid	60	1.04	-0.102

Priebeh koncentrácií glukózy pri hladujúcich psoch po podaní derivátov inzulínu s rýchlym účinkom Dávka bola 1 x 0,3 IU/kg subkutánne v t = 0 (priemer ± SEM)

rýc čas [min)	H hlosť infú glukózy mg.mir priemer	inzulín 1zle ’.kg SEM	OECHS1 kon krvne čas (min)	r centrácia j glukóz) mmo priemer	ľ SEM	rýc čas [min]	Inzu hlosť Infi glukózy mg.mi priemer	ín Lys(E zíe ť¹.kg SEM	3), Glu(E kon kivn čas (min)	29) centrácií 3j glukóz priemer	y. í. r¹ SEM	rýc čas (min)	Inzii hlosť Infi glukózy mg.mi priemer	lín Lys( zle n'íkg SEM	33), lle(B kon krv n Čas (mini	28) cenlrácl ej glukóz mmc priemer	1 L- SEM
0	000	0.00	0	398	OO7	0	000	000	0	3.77	0.12	0	0.00	ooo	0	3.74	0.07
a	0.14	o.oi	4	397	0.04	6	0.24	0.08	6	3.85	0.22		1.54	0.53	4	3.60	0.17
11	0.23	0.08	β	398	0.08	11	036	0.18	10	3.86	0.17	II	3.75	1.24	10	3.40	0.19
IB	035	βίο	14	309	0.04	18	095	080	15	3.86	0.22	16	5.25	0.89	15	3.53	0.14
21	0 44	0.16	19	401	0 05	21	2.75	008	20	361	0.16	21	8.25	1.87	20	3.38	0.18
2«	1.50	0 25	24	3.85	0.08	28	325	0 65	25	3.73	0.14	26	7 25	1.83	26	381	0.20
31	3.60	0.56	29	3.82	0.13	31	3.75	022	30	3.76	0.06	31	760	1.25	30	3 64	0.13
M	560	0.00	34	3 7?	α n	38	5.25	0.41	33	306	0.15	36	6.50	1.15	35	3 88	0 12
41	4.60	0.55	30	3 00	0 07	41	0.00	0.00	40	3.71	0.12	41	11 00	1.12	40	3.83	009
44	400	1.17	44	4 00	0 11	45	000	0.57	45	3 58	0 19	46	11 76	0.22	45	388	0.10
51	6 25	0 54	49	305	0 06	61	8.00	000	60	3.73	0.14	61	1076	0.08	60	381	0 09
M	675	060	54	4 01	0 10	59	8.50	058	55	391	0.11	56	II 25	I 78	56	173	Q.I1
BI	7 25	110	69	303	0 13	5»	11.60	0.43	60	3.57	0.14	61	1050	109	60	3 78	0.18
ββ	560	100	84	408	008	67	1000	1.22	65	3 BI	0.20	66	0 75	1 85	65	3 83	0.14
71	7.75	1.08	69	308	oot	71	11.50	0.43	70	385	0.23	71	11 00	1.50	70	3 89	0 11
75	7.75	1.14	74	4.05	0 10	76	11 00	1.70	75	3.61	028	78	1060	0 83	75	381	006
51	550	100	79	4.03	0 12	81	1050	0.B3	80	3.94	0.15	81	0 25	1 19	80	3 80	001
55	S 76	t 20	54	4 09	0.15	88	8.26	1.75	85	3 05	0.18	66	10.00	1 22	aa	3 78	002
01	5 75	105	59	4 03	0.15	01	9 00	0.60	00	3 00	0.12	01	8 75	1.29	00	3 43	004
M	»25	3 33	04	300	0 22	M	11 00	0 04	08	3 86	0 14	M	10 26	0 74	05	387	0 11
101	a sa	1 55	OD	4 05	0.10	101	B 75	041	100	3.71	0.16	101	10.00	1.22	100	3.68	0.16
108	5 60	1.44	104	396	0.08	106	10.26	0.89	105	3.59	0.20	106	10.50	1.16	105	350	0.15
111	800	1.06	109	392	0.10	111	6.00	094	110	384	0 16	111	850	1 03	109	3 74	0 10
116	025	1.47	114	353	0.17	116	1025	0.74	116	346	0.10	118	775	022	115	381	006
12»	800	1.58	119	4.04	0 21	121	1025	1.24	120	358	0.25	121	750	1.00	120	363	007
<26	6 00	í.37	124	3.05	0 12	126	9.75	t 34	125	370	0 23	>26	eoo	182	>25	3 94	o o?
131	025	t 10	120	181	0 09	131	7.75	1.52	130	388	0.21	131	425	1.29	130	305	0.12
136	6.50	1.30	134	392	0 16	136	5 50	1.44	135	397	0.15	136	533	1.19	135	3 70	020
141	850	1 25	»30	3 86	0.13	141	6.75	1.BS	140	3.04	0.15	142	4.75	1 19	140	37i	0 06
146	5 25	1.24	144	391	0.12	140	8 25	1 57	145	3 71	0 14	148	4 00	0 04	145	^3,1	0 07 1

Priebeh koncentrácií glukózy pri hladujúcich psoch po podaní derivátov inzulínu s rýchlym účinkom Dávka bola 1 x 0,3 IU/kg subkutánne v t = 0 (priemer + SEM)

rýc čas (min]	H hlosť inf glukózy mg.m priemer	-Inzulín í jzie n’.kg SEM	HOECHS korí krvn čas (min]	T centrách ej glukóz mmo priemer	y i.r¹ SEM	rýc čas [min]	Inzu hlosťInf glukózy mg. mi priemer	in Lys(E jzie n’¹ kg SEM	3), Glu(E kor krvn čas [min]	329) centráci ej glukóz mmc priemer	i y, lľ¹ SEM	rýc Čas [min]	Inzi ílosť iníf glukózy mg. mi priemer	lín Lys( zle i¹ kg SEM	33), lle(B kon krvn čas [min]	28) centrách ej glukóz mmc priemer	Ír- SEM
151	700	1.46	149	4.05	000	161	4.75	1.14	150	382	008	151	325	O.Bfl	150	374	0.14
IM	825	1.28	154	4.05	004	156	675	0.06	155	371	0.11	158	4.00	0.71	165	362	005
181	800	0.76	159	397	012	181	4.75	D82	160	381	0.11	182	3.75	0.54	160	369	OM
1SÍ	800	0 50	164	404	ODO	188	550	1.03	165	367	0.18	188	2.25	0 54	165	380	0.13
171	4 75	1.38	199	305	0 15	171	4.75	0.41	189	381	0 04	171	2.26	0,41	170	3.75	005
178	433	0.54	174	401	012	178	375	0.54	175	383	008	176	1 63	0.48	176	3.77	0.05
181	6.33	110	179	388	0.14	181	4.00	0.94	160	375	0.16	181	1 54	053	180	3.77	0.12
18«	4.67	0.72	184	403	0.09	168	2.88	0 87	185	3 85	014	166	0.88	0.4«	185	3.76	0 10
191	3 33	072	189	4 12	0.11	191	3.25	041	100	378	0 10	191	1 19	0&4	100	3.78	0.04
IM	300	000	194	4.13	0.03	106	3.13	0 84	105	3.81	0 14	196	1.28	079	195	3.76	0.08
901	367	0 72	IM	3.08	0.11	201	3 13	051	200	3.88	0.13	202	t.O?	054	200	3.71	0.11
20«	4 67	0.72	204	3.91	005	208	208	066	205	385	0 14	206	084	060	205	3.88	008
211	4 87	0.72	209	3.92	008	211	1.79	0.62	210	3.85	0.17	212	1.41	104	210	3.80	008
21«	3.33	0.72	214	4.09	004	218	1 76	0 63	216	3.85	0 16	217	0 05	060	216	3.74	009
221	300	0 64	219	405	0 11	221	1.41	0.58	220	3.87	0 18	221	0 64	0 21	220	386	0 1?
228	2 17	0 6«	224	4 17	0 12	228	0.78	0.38	226	3 88	0 13	226	0 72	038	225	3.72	0 10
231	267	0.96	229	400	0 13	231	0 85	037	230	3 72	0 23	231	D 60	038	230	3 75	OOB
23«	200	0.47	234	4 01	oos	238	C 78	061	235	3 74	0 21	237	0 01	080	235	3 71	0 03
240	1 17	038	239	4 08	002	240	1 07	0.47	240	3 56	0 18	240	088	0 61	240	3 69	003

Priebeh koncentrácií glukózy pri hladujúcich psoch po podaní derivátov inzulínu s rýchlym účinkom Dávka bola 1 x 0,3 IU/kg subkutánne v t = 0 formát dát (priemer ± SEM)

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

o É S

N ‘O

O) oľ e Ž w

□ ‘CO

u.

C Φ ω c o

2.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3J

3.0

2.5

2.0

: H-	nzulín j-rljj	Hoec	ist		Ä-
		W		rii-ϊ		-*p ;

i i	t 1	J...i ,	-j- 1	—i—i.		l i—i

Lys(B3), Giu(B29)-inzulín

Minúty

ZOZNAM SEKVENCIÍ

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (ix) CHARAKTERISTICKÉ ČRTY:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 21 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (ix) CHARAKTERISTICKÉ ČRTY:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 30 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 2

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

25 30

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 30 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr

25 30

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 30 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His l eu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr

25 30

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 30 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 5

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr

25 30

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 97 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (ix) CHARAKTERISTICKÉ ČRTY:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 97 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His 1 5 1015

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 2530

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 35 4045

Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu

5560

Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Val Glu 65 70 7580

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 85 9095

Asn

INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 97 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His 1 5 1015

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 2530

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 35 4045

Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu

5560

Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly íle Val Glu 65 70 7580

Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 85 9095

Asn

SK 285267 Β6

INFORMÁCIA O SEKVENC1I SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 97 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 8

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His 1 5 1015

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 2530

Arg Gly Phe Phe Tyr íle Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 35 4045

Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu

5560

Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly íle Val Glu 65 70 7580

Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 85 9095

Asn

INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 21 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 9

Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asp

INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 30 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Va1 Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr íle Lys Thr

25 30

INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) MENO/KĽÚČ: proteín (B) UMIESTNENIE: 1 až 97 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His 15 1015

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 2530

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr íle Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 35 4045

Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu 50 5560

Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ue Val Glu 65 70 7580

Gin Cys Cys Thr Ser Íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 85 9095

Claims

1. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ všeobecného vzorca (I) s---S (Al-AS)-cys-Cp-AS-A9-X10-cys-(Α12-Λ19I-Cys-X2I s—s s--------s (I>,

Bl-Val-33-Gln-Kis-Leu-Cys-;BB-BlS>-Cys-ÍB20-B26>-B27-B28-B29-B32 kde (A1-A5) sú aminokyselínové zvyšky v pozíciách Al až A5 reťazca A ľudského inzulínu, (A12-A19) sú aminokyselínové zvyšky v pozíciách A12 až A19 reťazca A ľudského inzulínu,

A21 je Asn, (B8-B18) sú aminokyselínové zvyšky v pozíciách B8 až B18 reťazca B ľudského inzulínu, (B20-B26) sú aminokyselínové zvyšky v pozíciách B20 až B26 reťazca B ľudského inzulínu,

A8, A9, A10 sú aminokyselínové zvyšky v pozíciách A8, A9 a

A10 reťazca A ľudského alebo zvieracieho inzulínu, B30 je -OH alebo aminokyselinový zvyšok v pozícii B30 reťazca B ľudského alebo zvieracieho inzulínu, BI je zvyšok aminokyseliny fenylalanín (Phe) alebo vodíkový atóm,

B3 je prirodzene sa vyskytujúci bázický aminokyselinový zvyšok

B27, B28 a B29 sú aminokyselínové zvyšky v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B ľudského alebo zvieracieho inzulínu alebo vždy jeden iný prirodzene sa vyskytujúci aminokyselinový zvyšok, pričom aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28, B29 reťazca B je nahradený iným prirodzene sa vyskytujúcim aminokyselinovým zvyškom, ktorý je vybraný zo skupiny tvorenej neutrálnymi alebo kyslými aminokyselinami.

2. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 1, v ktorom

A8 je alanín (Ala),

A9 je serín (Ser),

A10 je valín (Val) a

B30 je alanín (Ala).

3. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 1, v ktorom

A8 je treonín (Thr),

A9 je serín (Ser) a

A10 je izoleucín (íle).

4. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 3, v ktorom B30 znamená alanín (Ala).

5. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 3, v ktorom B30 znamená treonín (Thr).

6. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 5, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii BI reťazca B je zvyšok aminokyseliny fenylalanín (Phe).

7. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 6, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B3 reťazca B je zvyšok aminokyseliny histidin (His), lyzín (Lys) alebo arginín (Arg).

8. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 7, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B3 reťazca B je zvyšok aminokyseliny histidin (His).

9. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 7, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B3 reťazca B je zvyšok aminokyseliny arginín (Arg).

10. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 7, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B3 reťazca B je zvyšok aminokyseliny lyzín (Lys).

11. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 10, v ktorom aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B je prirodzene sa vyskytujúcim aminokyselinovým zvyškom, ktorý je vybraný zo skupiny tvorenej izoleucínom (íle), kyselinou asparágovou (Asp) a kyselinou glutámovou (Glu).

12. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 11, v ktorom aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B je prirodzene sa vyskytujúcim aminokyselinovým zvyškom, ktorý je vybraný zo skupiny tvorenej kyslými aminokyselinami.

13. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 12, v ktorom aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B je zvyškom kyseliny asparágovej (Asp).

14. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 12, v ktorom aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B je zvyškom kyseliny glutámovej (Glu).

15. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 10, v ktorom aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B28 reťazca B je nahradený prirodzene sa vyskytujúcim aminokyselinovým zvyškom, ktorý je vybraný zo skupiny tvorenej neutrálnymi aminokyselinami.

16. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 15, v ktorom aspoň jeden z aminokyselinových zvyškov v pozíciách B27, B28 a B29 reťazca B je zvyškom aminokyseliny izoleucín (íle).

17. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 13, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B27 reťazca B je zvyšok kyseliny asparágovej (Asp).

18. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 13, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B28 reťazca B je zvyšok kyseliny asparágovej (Asp).

19. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 13, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B29 reťazca B je zvyšok kyseliny asparágovej (Asp).

20. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 14, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B27 reťazca B je zvyšok kyseliny glutámovej (Glu).

21. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 14, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B28 reťazca B je zvyšok kyseliny glutámovej (Glu).

22. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 14, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B29 reťazca B je zvyšok kyseliny glutámovej (Glu).

23. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 16, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B28 reťazca B je zvyšok aminokyseliny izoleucín (íle).

24. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 22, v ktorom reťazec B obsahuje sekvenciii

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr (sekvencia SEQ ID NO: 3).

25. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 15, v ktorom aminokyselinovým zvyškom v pozícii B27 reťazca B je zvyšok aminokyseliny izoleucín (íle).

26. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 25, v ktorom reťazec B obsahuje sekvenciu

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr íle Pro Lys Thr (sekvencia SEQ ID NO: 5)

27. Derivát inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ podľa nároku 23, v ktorom reťazec B obsahuje sekvenciu

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr íle Lys Thr (sekvencia SEQ ID NO: 4).

28. Spôsob prípravy derivátu inzulínu alebo jeho fyziologicky prijateľnej soli podľa aspoň jedného z nárokov laž 27, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa konštrukciu replikovateľného expresného nosiča, ktorý obsahuje DNA sekvenciu kódujúcu prekurzor inzulínu, v ktorom aminokyselinový zvyšok v pozícii A1 reťazca Aje spojený s aminokyselinovým zvyškom B30 reťazca B peptidovým reťazcom podľa vzorca (II)

R'n -Arg- (II), kde R¹,, je peptidový reťazec s n aminokyselinovými zvyškami a n je celé číslo z intervalu 0 až 34 a reťazec B je v pozícii BI predĺžený peptidovým reťazcom podľa vzorca (ΠΙ)

Met - R² _m - (Arg)_p - (III), kde R² _m je peptidový reťazec s m aminokyselinovými zvyškami, m je celé číslo z intervalu 0 až 40 a p je 0, 1 alebo 2 a ďalej zahŕňa expresiu v hostiteľských bunkách a uvoľnenie inzulínu z jeho prekurzora chemickým a/alebo enzymatickým spôsobom.

29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa t ý m , že hostiteľská bunka j e bakteriálna.

30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa t ý m , že bakteriálnou bunkou je E. coli.

31. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa t ý m , že hostiteľskou bunkou je kvasinka.

32. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa t ý m , že kvasinkou je Saccharomyces cerevisiae.

33. Spôsob podľa niektorého z nárokov 28 až 32 na prípravu derivátu inzulínu podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že prekurzor inzulínu obsahuje sekvenciu

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (sekvencia SEQ ID NO: 6).

34. Spôsob podľa niektorého z nárokov 28 až 32 na prípravu derivátu inzulínu podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že prekurzor inzulínu obsahuje sekvenciu

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr íle Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (sekvencia SEQ ID NO: 8).

35. Spôsob podľa niektorého z nárokov 28 až 32 na prípravu derivátu inzulínu podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že prekurzor derivátu inzulínu obsahuje sekvenciu

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr íle Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (sekvencia SEQ ID NO: 7).

36. Prekurzor derivátu inzulínu podľa nároku 33.

37. Prekurzor derivátu inzulínu podľa nároku 34.

38. Prekurzor derivátu inzulínu podľa nároku 35.

39. Sekvencia DNA kódujúca prekurzor derivátu inzulínu podľa nároku 36.

40. Sekvencia DNA kódujúca prekurzor derivátu inzulínu podľa nároku 37.

41. Sekvencia DNA kódujúca prekurzor derivátu inzulínu podľa nároku 38.

42. Expresný nosič, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje sekvenciu DNA podľa nároku 39.

43. Expresný nosič, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje sekvenciu DNA podľa nároku 40.

44. Expresný nosič, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje sekvenciu DNA podľa nároku 41.

45. Hostiteľská bunka transformovaná s použitím expresného nosiča podľa niektorého z nárokov 42 až 44.

46. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje aspoň jeden derivát inzulínu a/alebo jeho fyziologicky prijateľnú soľ podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 27.

47. Farmaceutický prípravok podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že obsahuje derivát inzulínu a/alebo jeho fyziologicky prijateľnú soľ v rozpustenej, amorfnej a/alebo kryštalickej forme.

48. Farmaceutický prípravok podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje pomocnú depotnú látku.

49. Farmaceutický prípravok podľa nároku 48, vyznačujúci sa tým, že depotnou pomocnou látkou je protamín sulfát a kde derivát inzulínu a/alebo jeho fyziologicky prijateľná soľ sú s protamín sulfátom vo forme spoločného kryštálu.

50. Injikovateľný roztok s inzulínovou aktivitou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje farmaceutický prípravok podľa niektorého z nárokov 46 až 49 v rozpustenej forme.

51. Použitie derivátu inzulínu a/alebo jeho fyziologicky prijateľnej soli podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 27 na výrobu farmaceutického prípravku, ktorý má inzulínovú aktivitu s rýchlym začiatkom pôsobenia.

52. Lys (B3), Glu (B29) ľudský inzulín.