KR100546225B1

KR100546225B1 - 신속한 작용개시를 나타내는 인슐린 유도체

Info

Publication number: KR100546225B1
Application number: KR1019980023037A
Authority: KR
Inventors: 요한 에르틀; 파울 하베르만; 카를 가이젠; 게르하르트 샤입케
Original assignee: 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2006-10-19
Also published as: NO982860D0; PL326936A1; DE59812316D1; DE19726167A1; BRPI9803708B1; HUP9801368A1; CY2005004I1; ES2232900T3; PL196626B1; DK0885961T3; ZA985363B; KR19990007117A; FR05C0009I2; CA2235443A1; AR015899A1; CN1203238A; NO2006014I1; UA65529C2; IL125006A; NL300170I1

Abstract

본 발명은 사람 인슐린과 비교해서 작용 개시가 촉진된 인슐린 유도체, 이의 제조 방법 및 특히 당뇨병을 치료하기 위한 약제학적 제제에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 B쇄의 B3 위치에서의 아스파라긴(Asn)이 천연 염기성 아미노산 잔기로 치환되고 B쇄의 B27, B28 또는 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 또 다른 천연 아미노산 잔기로 치환되며, 임의로 A쇄의 21번 위치의 아스파라긴(Asn)이 Asp, Gly, Ser, Thr 또는 Ala로 치환될 수 있고 B쇄의 B1 위치의 페닐알라닌(Phe) 및 B쇄의 B30 위치의 아미노산 잔기가 부존재할 수 있는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

Description

신속한 작용 개시를 나타내는 인슐린 유도체

본 발명은 사람 인슐린과 비교해서 작용 개시가 촉진된 인슐린 유도체, 이의 제조 방법, 및 특히 당뇨병을 치료하기 위한 약제학적 제제에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

전세계적으로 대략 1억 2천만명이 당뇨병을 앓고 있다. 이들 중에서 대략 1천 2백만명은 제Ⅰ형 당뇨병을 앓고 있는데, 이들을 위해서 인슐린을 투여하는 것이 현재 유일한 치료법이다. 이러한 질병을 앓고 있는 사람들은 대체로 일생 동안 매일 수 차례씩 인슐린 주사를 맞고 있다. 대략 1억명의 환자가 앓고 있는 제Ⅱ형 당뇨병은 대부분의 경우에 근원적으로는 인슐린 결핍에 의해 야기된 것은 아니지만, 인슐린을 사용한 치료가 가장 선호되는 치료법 또는 유일한 치료법으로서 간주되고 있다.

질병을 앓는 기간이 길어짐에 따라, 상당수의 환자는 소위 당뇨병 후기 합병증에 걸리게 된다. 이러한 합병증은 필수적으로 미세혈관성 및 거대혈관성 손상이어서, 그 유형과 정도에 따라 신부전증, 실명 또는 사지 마비를 가져오거나 심장/순환계 장애 위험을 증가시킨다.

그 이유로서, 만성적으로 증가된 혈중 글루코즈 농도가 1차적으로 책임이 있는데, 이는 인슐린 치료법을 조심스럽게 조정하는 경우일지라도, 생리학적 조절에 상응하는 정상 혈중 글루코즈 프로필이 달성되지 않기 때문이다[참조: Ward, J.D.(1989) British Medical Bulletin 45, 111-126; Drury, P.L., et al.(1989) British Medical Bulletin 45, 127-147; Kohner, E.M.(1989) British Medical Bulletin 45, 148-173].

건강한 사람에 있어서, 인슐린 분비는 혈중 글루코즈 농도에 상당히 의존적이다. 식사 후 증가되는 글루코즈 농도는 인슐린 방출의 증가로 인해 신속하게 상쇄된다. 단식 상태에서는 혈장 인슐린 농도가 기초 수치로 떨어지는데, 이는 인슐린-민감성 기관 및 조직에 글루코즈를 지속적으로 공급해 주는데 충분한 수치이다. 오늘날 소위 강화된 인슐린 치료로 불리우는 치료의 최적화는 혈중 글루코즈 농도의 변화량, 특히 상위 편차를 가능한 한 낮게 유지하는 것을 1차적인 목표로 하고 있다[참조: Bolli, G.B.(1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, p. 3-16; Berger, M.(1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, p. 25-32]. 이로써 당뇨병 후기 손상의 발생율 및 진행이 상당히 저하된다[참조: The Diabetes Control and Complications Trial Research Group(1993) N.Engl. J.Med. 329, 977-986].

인슐린 분비에 관한 생리학적 관점에서 보면, 피하 투여용 제제를 사용하여 개선되고 강화된 인슐린 치료를 하는 경우에는 상이한 약력학적 특성을 지닌 2개의 인슐린 제제가 필요하다는 것을 유추해낼 수 있다. 식사 후 상승되는 혈중 글루코즈를 상쇄하기 위하여, 인슐린은 신속하게 유입되야 하고 수 시간 동안만 작용해야 한다. 특히 밤에 기초적인 공급을 위하여, 장시간 동안 작용하고 현저한 최대치를 나타내지 않으며 단지 매우 느리게 주입되는 특정 제제가 사용될 수 있다.

사람 및 동물 인슐린을 기초로 하는 제제는 강화된 인슐린 치료에 대한 요구를 제한된 방식으로만 충족시켜 준다. 피하 투여 후, 신속하게 작용하는 인슐린(변형되지 않은 인슐린)은 너무 느리게 혈액을 통과하여 작용 부위에 도달하게 되어 전반적인 작용 기간이 너무 길어지게 된다. 그 결과, 식후 글루코즈 농도가 너무 높고 혈중 글루코즈는 식사한지 수 시간 후에 심하게 떨어지기 시작한다[참조: Kang, S. et al.(1991) Diabetes Care 14, 142-148; Home, P.J. et al.(1989) British Medical Bulletin 45, 92-110; Bolli, G.B.(1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, p. 3-16]. 결국 이용 가능한 기초 인슐린, 특히 NPH 인슐린은 너무나 짧은 작용 기간을 가지며 심각하게 현저한 최대치를 갖는다.

약제학적 활성성분을 통하여 작용 프로필에 영향을 미칠 수 있는 것 이외에도, 오늘날 대체 방안은 구조적 특성에 의해서만 작용 개시 및 작용 기간과 같은 특정 성질을 달성시키는, 유전 공학의 보조하에 인슐린 유도체를 고안하게 되었다. 따라서, 적합한 인슐린 유도체를 사용함으로써, 혈중 글루코즈를 상당히 잘 조정하여 천연 상태에 보다 가깝게 만들 수 있다.

작용 개시가 촉진된 인슐린 유도체는 EP 0 214 826, EP 0 375 437 및 EP 0 678 522에 기술되어 있다. EP 0 214 826는 특히 B27 및 B28의 치환에 관한 것이지만, B3의 치환과 조합되지는 않는다. EP 0 678 522에는 B29 위치에 각종 아미노산, 바람직하게는 프롤린을 갖지만, 글루탐산을 갖지 않는 인슐린 유도체가 기술되어 있다. EP 0 375 437는 임의로 B3 및/또는 A21에서 추가적으로 변형될 수 있는, B28에 리신 또는 아르기닌을 갖는 인슐린 유도체를 포괄하고 있다.

EP 0 419 504에는 B3 위치의 아스파라긴과 A5, A15, A18 또는 A21 위치의 하나 이상의 추가의 아미노산을 변화시킴으로써 화학적 변형으로부터 보호된 인슐린 유도체가 기술되어 있다. 그러나, B27, B28 또는 B29 위치의 변형과의 조합은 기술되어 있지 않다. 이들 화합물이 보다 신속한 작용 개시를 가져오는 변형된 약력학을 지닌다는 지적은 제시되지 않았다.

WO 92/00321에는 B1 내지 B6 위치의 하나 이상의 아미노산이 리신 또는 아르기닌으로 대체된 인슐린 유도체가 기술되어 있다. WO 92/00321에 따르면, 이러한 유형의 인슐린은 작용 기간이 길다. 그러나, B27, 28, 29 위치의 변형과의 조합은 기술되어 있지 않다.

본 발명의 목적은 투여 후, 특히 피하 투여 후, 사람 인슐린과 비교해서 작용 개시가 촉진된 인슐린 유도체를 제조하는 것이다.

인슐린 유도체는, 하나 이상의 천연 아미노산 잔기를 치환하고/하거나 하나 이상의 아미노산 잔기 및/또는 유기 잔기를 부가함으로써 상응하는 또는 동일한 천연 인슐린과 상이한, 천연 인슐린, 즉 사람 인슐린(서열 1=사람 인슐린의 A쇄 참조; 서열 2=사람 인슐린의 B쇄 참조, 서열 목록) 또는 동물 인슐린의 유도체이다.

본 발명의 추가의 목적은 상기 언급된 성질을 갖는 인슐린 유도체를 제조하는 방법, 상응하는 중간체 및 이의 전구체를 제공하는 것이다.

이러한 목적은 B쇄의 B3 위치에서의 아스파라긴(Asn)이 천연 염기성 아미노산 잔기로 치환되고 B쇄의 B27, B28 또는 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 또 다른 천연 아미노산 잔기로 치환되며, 임의로 A쇄의 21번 위치의 아스파라긴(Asn)이 Asp, Gly, Ser, Thr 또는 Ala로 치환될 수 있고, B쇄의 B1 위치의 페닐알라닌(Phe) 및 B쇄의 B30 위치의 아미노산 잔기가 부재할 수 있는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염에 의해 달성된다.

바람직하게는, 본 발명의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염은 다음 화학식 1의 화합물이다:

[화학식 1]

상기식에서,

(A1-A5)는 사람 인슐린(서열 1 참조) 또는 동물 인슐린의 A쇄의 A1 내지 A5 위치에서의 아미노산 잔기이고,

(A12-A19)는 사람 인슐린(서열 1 참조) 또는 동물 인슐린의 A쇄의 A12 내지 A19 위치에서의 아미노산 잔기이며,

(B8-B18)는 사람 인슐린(서열 2 참조) 또는 동물 인슐린의 B쇄의 B8 내지 B18 위치에서의 아미노산 잔기이고,

(B20-B26)는 사람 인슐린(서열 2 참조) 또는 동물 인슐린의 B쇄의 B20 내지 B26 위치에서의 아미노산 잔기이며,

A8, A9, A10은 사람 인슐린(서열 1 참조) 또는 동물 인슐린의 A쇄의 A8, A9 및 A10 위치에서의 아미노산 잔기이고,

A21은 Asn, Asp, Gly, Ser, Thr 또는 Ala이며,

B30은 -OH 또는 사람 인슐린(서열 2 참조) 또는 동물 인슐린의 B쇄의 B30 위치에서의 아미노산 잔기이고,

B1은 페닐알라닌 잔기(Phe) 또는 수소 원자이며,

B3은 천연 염기성 아미노산 잔기이고,

B27, B28 및 B29는 사람 인슐린(서열 2 참조) 또는 동물 인슐린의 B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 아미노산 잔기이거나, 각 경우에 있어서 B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 또 다른 천연 아미노산 잔기로 치환된 또 다른 천연 아미노산 잔기이다.

유전자-암호화 가능한 20개의 천연 아미노산 중에서, 아미노산 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 발린(Val), 루이신(Leu), 이소루이신(Ile), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp) 및 프롤린(Pro)은 본원에서 중성 아미노산으로서 명명되고, 아미노산 아르기닌(Arg), 리신(Lys) 및 히스티딘(His)은 염기성 아미노산으로서 명명되며, 아미노산 아스파르트산(Asp) 및 글루탐산(Glu)은 산성 아미노산으로서 명명된다.

바람직하게는, 본 발명에 따르는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염은 소 인슐린, 돼지 인슐린 또는 사람 인슐린의 유도체, 즉 다음과 같이 특정된 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염이다:

A8이 알라닌(Ala)이고,

A9가 세린(Ser)이며,

A10이 발린(Val)이고,

B30이 알라닌(Ala)이며(소 인슐린의 아미노산 잔기 A8 내지 A10 및 B30),

A8이 트레오닌(Thr)이고,

A9가 세린(Ser)이며,

A10이 이소루이신(Ile)이고(사람 또는 돼지 인슐린의 아미노산 잔기 A8 내지 A10),

B30이 알라닌(Ala)이며(돼지 인슐린의 아미노산 잔기 B30),

B30이 트레오닌(Thr)이다(사람 인슐린의 아미노산 잔기 B30, 서열 2 참조).

특히 바람직하게는, 사람 인슐린의 상기 아미노산 잔기 A8 내지 A10 및 B30을 갖는 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염은 다음과 같이 추가로 특정된다:

(A1-A5)가 사람 인슐린의 A쇄(서열 1 참조)의 A1 내지 A5 위치에서의 아미노산 잔기이고,

(A12-A19)가 사람 인슐린의 A쇄(서열 1 참조)의 A12 내지 A19 위치에서의 아미노산 잔기이며,

(B8-B18)이 사람 인슐린의 B쇄(서열 2 참조)의 B8 내지 B18 위치에서의 아미노산 잔기이고,

(B20-B26)이 사람 인슐린의 B쇄(서열 2 참조)의 B20 내지 B26 위치에서의 아미노산 잔기이다.

본 발명의 추가로 바람직한 양태는, B쇄의 B1 위치에서의 아미노산 잔기가 페닐알라닌 잔기(Phe)인 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염, 또는 B쇄의 B3 위치에서의 아미노산 잔기가 히스티딘(His), 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg)인 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염이다.

본 발명의 추가로 바람직한 양태는, B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 중성 또는 산성 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천연 아미노산 잔기로 치환되는 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염;

B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 이소루이신(Ile), 아스파르트산(Asp) 및 글루탐산(Glu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천연 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 B쇄의 B27, B28 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 중성 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천연 아미노산 잔기로 치환되거나, 특히 바람직하게는 B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 이소루이신(Ile) 잔기인 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염; 또는

B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 산성 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천연 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 아스파르트산(Asp) 잔기이며, 바람직하게는 B쇄의 B27 또는 B28 위치에서의 아미노산 잔기가 아스파르트산(Asp) 잔기이거나, B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 글루탐산(Glu) 잔기인 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염이다.

본 발명의 바람직한 양태는 또한, B쇄의 B29 위치에서의 아미노산 잔기가 아스파르트산(Asp) 잔기인 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염이다.

본 발명의 바람직한 추가의 양태는 B쇄의 B27 위치에서의 아미노산 잔기가 글루탐산(Glu) 잔기인 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염;

B쇄의 B28 위치에서의 아미노산 잔기가 글루탐산 잔기(Glu)인 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염; 또는

B쇄의 B29 위치에서의 아미노산 잔기가 글루탐산 잔기(Glu)인 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염이다.

매우 특히 바람직하게는, B쇄가 다음 서열, 즉

Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr

(서열 3)을 갖는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염, 예를 들면, Lys(B3), Glu(B29)-사람 인슐린;

B쇄의 B27 위치에서의 아미노산 잔기가 이소루이신 잔기(Ile)라는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 B쇄가 다음 서열, 즉

Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr

(서열 5)을 갖는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염, 예를 들면, Lys(B3), Ile(B27)-사람 인슐린; 또는

B쇄의 B28 위치에서의 아미노산 잔기가 이소루이신 잔기(Ile)인 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 B쇄가 다음 서열, 즉

Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr

(서열 4)을 갖는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염, 예를 들면, Lys(B3), Ile(B28)-사람 인슐린이다.

특히 바람직하게는, B쇄의 B28 위치에서의 아미노산 잔기가 이소루이신 잔기(Ile)이고 A21 위치에서의 아미노산 잔기가 아스파라긴 잔기(Asp)인 것을 특징으로 하는 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염은 바람직하게는 A쇄가 다음 서열, 즉

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Tyr Gln

Leu Glu Asn Tyr Cys Asp(서열 9)을 갖고, B쇄가 다음 서열, 즉

Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr(서열 10)을 갖는 것[Lys(B3), Ile(B28), Asp(A21)-사람 인슐린]이다.

화학식 1의 인슐린 유도체는 바람직하게는 유전 공학적 방법에 의해 제조할 수 있다.

초기에 설정된 당해 목적은 또한, A쇄의 A1 위치에서의 아미노산 잔기가 화학식 2의 펩티드 쇄를 통하여 B쇄의 아미노산 잔기 B30에 연결되고 B쇄가 화학식 3의 펩티드 쇄를 통하여 B1 위치에서 연장되는 인슐린 유도체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 복제 가능한 발현 비히클을 작제하고, 이를 숙주 세포에서 발현시킨 다음, 화학적 및/또는 효소적 방법을 이용하여 당해 인슐린 유도체를 이의 전구체로부터 방출시키는 것을 포함하여, 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법에 의해 추가로 달성된다.

[화학식 2]

-R¹ _n-Arg-

[화학식 3]

Met-R² _m-(Arg)_p-

상기식에서,

R¹ _n은 n개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 쇄이고,

n은 0 내지 34의 정수이며,

R² _m은 m개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 쇄이고,

m은 0 내지 40, 바람직하게는 0 내지 9의 정수이며,

p는 0, 1 또는 2이며,

p가 0인 경우 R² _m은 바람직하게는 Lys로 종결된다.

바람직하게는, 당해 방법은 숙주 세포가 세균이며, 특히 바람직하게는 상기 세균이 이. 콜라이(E. Coli)이다.

바람직하게는, 당해 방법은 숙주 세포가 효모이며, 특히 바람직하게는 상기 효모가 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다.

서열 9(A쇄) 및 서열 10(B쇄)의 아미노산 서열을 갖는 인슐린 유도체를 제조하기 위하여, 이러한 인슐린 유도체의 전구체가 바람직하게는 다음 서열, 즉

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp(서열 11)[Lys(B3), Ile(B28), Asp(A21)-프레프로인슐린]을 갖는다.

서열 3의 아미노산 서열을 갖는 인슐린 유도체를 제조하기 위하여, 이러한 인슐린 유도체의 전구체는 바람직하게는 다음 서열, 즉

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 6)[Lys(B3), Glu(B29)-프레프로인슐린]을 갖는다.

서열 5의 아미노산 서열을 갖는 인슐린 유도체를 제조하기 위하여, 이러한 인슐린 유도체의 전구체는 바람직하게는 다음 서열, 즉

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 8)[Lys(B3), Ile(B27)-프레프로인슐린]을 갖는다.

서열 4의 아미노산 서열을 갖는 인슐린 유도체를 제조하기 위하여, 이러한 인슐린 유도체의 전구체는 바람직하게는 다음 서열, 즉

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 7)[Lys(B3), Ile(B28)-프레프로인슐린]을 갖는다.

본 발명은 또한, 바람직한 인슐린 유도체의 전구체, 즉 서열 11, 서열 6, 서열 7 및 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 이러한 전구체를 암호화하는 DNA 서열, 이러한 DNA 서열을 포함하는 발현 비히클 및 이들 발현 비히클을 사용하여 형질전환시킨 숙주 세포에 관한 것이다.

당해 화학식 1의 인슐린 유도체는 주로 표준 방법에 따라서 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 유전 공학적으로 제조된다.

이를 위하여, 목적하는 화학식 1의 인슐린 유도체를 암호화하는 유전자 구조물을 작제하고 이를 숙주 세포, 바람직하게는 이. 콜라이와 같은 세균 또는 삭카로마이세스 세레비지애와 같은 효모에서 발현시키며, 상기 유전가 구조물이 융합 단백질을 암호화하는 경우에는 화학식 1의 인슐린 유도체를 상기 융합 단백질로부터 방출시키는데; 이와 유사한 방법이, 예를 들면, EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 및 DE 특허원 제P 38 21 159호에 기술되어 있다.

융합 단백질 성분의 제거는 시아노겐 할라이드를 사용하여 세포 파열시킴으로써 화학적으로 수행할 수 있다[EP-A-0 180 920 참조].

US 5,358,857에 따른 융합 단백질 성분(프레서열)을 갖는 프레프로인슐린 전구체를 통한 제조에 있어서는, 이러한 융합 단백질 성분의 제거가 C 펩티드의 제거와 함께 후기 단계에서 이루어진다.

이어서, 상기 인슐린 전구체를 문헌[참조: R.C. Marshall and A.S. Inglis in "Practical Protein Chemistry-A Handbook"(Publisher A. Darbre) 1986, p. 49-53]에 기술된 방법에 따라서 산화적 설피토리시스(sulfitolysis)시킨 다음, 예를 들면, 문헌[참조: G.H. Dixon and A.C. Wardlow in Nature(1960), p. 721-724]에 기재된 방법에 따라서 티올의 존재하에서 정확한 디설파이드 브릿지를 형성시켜 재생시킨다. 그러나, 이러한 인슐린 전구체는 또한 직접적으로 폴딩될 수도 있다(EP-A-0 600 372; EP-A-0 668 292).

C 펩티드는, 예를 들면, 문헌[참조: Kemmler et al., J.B.C.(1971), p. 6786-6791]에 기재된 방법에 따라서 트립신에 의한 절단을 통해 제거하고, 화학식 1의 인슐린 유도체는 크로마토그래피(EP-A-0 305 760) 및 결정화와 같은 공지된 기술에 의해 정제한다.

화학식 2에서의 n이 0인 경우, 트립신에 의한 절단으로 A쇄와 B쇄 간의 펩티드 결합을 절단한다.

이러한 방법에서는, B쇄 C 말단이 아르기닌 또는 2개의 아르기닌 잔기로 종결된다. 이들은 카복시펩티다제 B를 통하여 효소에 의해 제거될 수 있다.

본 발명에 따르는 인슐린 유도체는 완전한 생물학적 활성을 지닌다. 이는 래빗트에 대한 정맥내 주사에 의해 나타나며, 이로부터 혈중 글루코즈 농도가 떨어진다(실시예 5 및 6).

피하 주사 후의 보다 신속한 작용 개시는 유글리세믹 클램프(euglycemic clamp) 기술을 이용한 굶긴 개에서 나타내었다(실시예 7). 0.3IU/kg을 투여한다. 참조 제제는 사람 인슐린이다. 이러한 클램프 기술에 있어서, 혈중 글루코즈 수치를 인슐린 주입후 짧은 시간 간격으로 측정하고, 강하된 수치를 보충하기 위한 정확한 양의 글루코즈를 주입한다. 이는 인슐린 투여후 혈중 글루코즈의 심각한 강하가 나타나는 경우에서와 같이 동물에게서 역-조절이 전혀 발생되지 않는다는 점에서 유리하다. 주입되는 글루코즈의 양과 주입 시간은 인슐린 작용을 특징화한 것이다. Lys(B3), Glu(B29)-(서열 3) 및 Lys(B3), Ile(B28)-(서열 4) 인슐린은 사람 인슐린보다 명백하게 신속한 작용 개시를 나타낸다. 최대 작용(글루코즈 주입 속도)은 사람 인슐린을 사용하는 경우에는 100분 후에 성취되지만, Lys(B3), Glu(B29)-인슐린(서열 3)을 사용하는 경우에는 80분 후에 성취되고, Lys(B3), Ile(B28)-인슐린(서열 4)을 사용하는 경우에는 60분 후에 성취된다. 따라서, 이들을 식사 직전에 주입하면, 이들 동족체는 사람 인슐린보다 더 우수하게 혈중 글루코즈 수치의 식후 상승을 상쇄할 수 있다.

따라서, 언급된 인슐린 유도체는 바람직하게는 기본 인슐린과 함께 제I형 및 제II형 당뇨병 치료 모두에 적합하다.

따라서, 본 발명은 작용 개시가 신속한 인슐린 활성을 지닌 약제학적 제제를 제조하기 위한, 화학식 1의 인슐린 유도체 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

생리학적으로 허용되고 인슐린 유도체와 상용성인 적합한 담체 매질은, 통상적인 방법으로 예를 들면, 글리세롤, 염화나트륨, 글루코즈를 이용하여 혈액과 등장성이 되도록 제조되고, 또한 통상의 방부제, 예를 들면, 페놀, m-크레졸 또는 p-하이드록시벤조산 에스테르 중의 하나를 함유하는 멸균 수용액이다. 이러한 담체 매질은 완충 물질, 예를 들면, 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 인산나트륨 등을 부가적으로 함유할 수 있다. pH를 조정하기 위하여, 묽은 산(전형적으로 HCl) 또는 알칼리(전형적으로 NaOH)를 사용한다. 이러한 제제는 추가로 아연 이온을 함유할 수도 있다.

당해 인슐린 유도체는 심지어 이의 생리학적으로 허용되는 염의 형태, 알칼리 금속염 또는 암모늄 염으로서 당해 약제학적 제제에 사용될 수 있다. 하나 이상의 화학식 1의 인슐린 유도체 또는 화학식 1의 인슐린 유도체의 목적하는 어떠한 비율도 서로 독립적인 이들 기타 인슐린 유도체의 혼합물 중에 각 경우에 용해된 형태, 무정형 및/또는 결정 형태로 존재할 수 있다.

각종 물질과의 접촉시 열기계적 응력하에서 단백질 침전을 방지하는데 적합한 양의 적합한 안정화제를 본 발명에 따르는 약제에 가하는 것이 종종 유리하다. 이러한 안정화제는, 예를 들면, EP-A-18609, DE-A-32 40 177 또는 WO 83/00288에 기재되어 있다.

추가로, 본 발명은 하나 이상의 화학식 1의 인슐린 유도체 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 바람직하게는 용해된 형태, 무정형 및/또는 결정 형태로 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 인슐린 유도체는 신속한 작용 개시를 나타낸다. 실질적인 인슐린 치료에 있어서, 신속히 작용하는 인슐린을 데포우(depot) 보조제(예: NPH 인슐린)를 함유하는 제제와 혼합하는 것이 특정 상황하에서 통상적이다. 조성에 따라서, 이로부터 제제가 생성되며, 이의 작용 프로필은, 상기 혼합물 중의 개개의 성분이 안정하고 서로 영향을 받지 않는다면, 부가된 개개의 프로필에 상응한다. 그러나, 인슐린 유도체를 사람 NPH 인슐린과 혼합하면, 특히 장시간 동안 저장시, 용해된 유도체와 결정성 NPH 인슐린 간에 교환이 일어날 것으로 예상된다. 그 결과, 데포우 인슐린의 약력학과 용해되어 신속하게 작용하는 인슐린의 약력학 모두가 예측할 수 없는 방식으로 변화한다. 이를 피하기 위해서는, 데포우 보조제, 예를 들면, NPH 인슐린을 사용하여 신속하게 작용하는 유도체를 제조하는 것이 바람직하다. 이어서, 이러한 인슐린 유도체의 데포우 형을, 경우에 따라, 용해된 신속하게 작용하는 형태와 혼합할 수 있으며, 이 경우에 특정 형태 또는 기타 형태의 조성이 저장 기간 동안 교환으로 인해 변화되지 않는다.

본 발명이 필수적으로 신속하게 작용하는 인슐린 유도체에 관한 것이긴 하지만, 혼화성을 위해서는 이러한 유형의 유도체를 데포우 형태로서 제조할 수도 있으며, 데포우 보조제는 바람직하게는 프로타민 설페이트이고, 인슐린 유도체 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염은 공결정화물로서 이러한 프로타민 설페이트와 함께 존재한다.

추가로, 본 발명은 상기 기술된 약제학적 제제를 용해된 형태로 포함하는 주입용 용액제에 관한 것이다.

실시예 1:

실시예 2 내지 4에 상응하는 본 발명과 관련된 플라스미드에 대한 출발점으로서의 Lys(B3)-프로인슐린의 작제

US 5,358,857에는 벡터 pINT 90d 및 PCR 프라이머 Tir 및 Insu 11이 기재되어 있다. 이들 성분은 목적하는 Lys(B3)-프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT 125d를 작제하기 위한 출발 물질로서 사용한다.

부가적으로, 서열 5' TTT GTG AAG CAG CAC CTG 3'을 갖는 프라이머 Insu 35 및 서열 5' CAG GTG CTG CTT CAC AAA 3'을 갖는 Insu 36을 합성한다.

프라이머 Tir 및 Insu 36을 사용하여 PCR 반응을 수행하고 프라이머 Insu 11 및 Insu 35를 사용하여 제2 반응을 수행한다. 이에 사용된 주형은 pINT 90d DNA이다.

2가지 PCR 반응 산물은, 이들이 제3의 PCR 반응에서 프라이머 Tir 및 Insu 11과 조합될 때 이들이 위치 3에서 B쇄 리신을 함유하는 프로인슐린 변이체를 암호화하는 단편을 제공하도록, 부분적으로 상보적이다. 이러한 PCR 단편을 정제용 에탄올에 침전시키고, 건조시킨 다음, 제조업자의 지시에 따라서 제한 효소 Nco 1 및 Sal 1로 분해한다. 이러한 반응 혼합물을 겔 전기영동시켜 분리하고, 목적하는 Nco 1/Sal 1 단편을 분리시킨다.

상기 인용된 특허원에는 미니-프로인슐린을 암호화하는 플라스미드 pINT 91d가 기재되어 있다. 미니-프로인슐린을 암호화하는 서열을 Nco 1 및 Sal 1로 절단하고 잔여 플라스미드 DNA를 분리하는 경우, 이러한 잔여 플라스미드 DNA를 T4 라가제 반응에서 나타난 Nco 1/Sal 1 PCR 단편과 반응시켜 플라스미드 pINT 125d를 수득한다. 이를 이. 콜라이 K12에 의해 형질전환시키고, 그 곳에서 복제시킨 다음 재분리한다. DNA 서열 및 제한 분석을 통한 플라스미드 구조의 확인 후, pINT 125d DNA를 이러한 프로인슐린 변이체 내로 추가의 돌연변이를 도입하기 위한 주형 DNA로서 사용한다.

실시예 2:

Lys(B3) Glu(B29)-프로인슐린의 작제

이러한 뮤테인을 제조하기 위하여, 서열 5' TTC TAC ACA CCC GAG ACC CGC GGC ATC G-3'를 갖는 프라이머 329a 및 서열 5' GCC GCG GGT CTC GGG TGT GTA GAA GAA GC 3'를 갖는 프라이머 329b를 합성한다.

사용된 주형은 플라스미드 pINT 125d 및 pINT 91d의 DNA이다. PCR 반응에서, 프라이머 329a를 주형 pINT 91d 상에서 프라이머 Insu 11과 반응시키고 프라이머 329b를 주형 pINT 125d 상에서 프라이머 Tir(상기 실시예 참조)과 반응시킨다. PCR 산물 둘 모두 부분적으로 상보적이기 때문에, 이들을 직접적인 PCR 반응에 조합하여 프라이머 Tir 및 Insu 11과 다시 반응시킨다. 목적하는 뮤테인을 암호화하는 DNA 단편이 생성된다. 이러한 단편을 제한 효소 Nco 1 및 Sal 1를 사용하여 이중 분해하고, 생성된 Nco 1/Sal 1 단편을 T4 리가제 반응으로 pINT 91d 잔여 플라스미드 DNA 내로 삽입한다.

플라스미드 pINT 329가 생성되며, 이를 이. 콜라이 K12에서 제한을 통해 증폭시키고 DNA 서열 분석을 목적하는 구조물에 대하여 확인한다.

상기 플라스미드에 의해 암호화된 프로인슐린 유도체는 2개의 아미노산 대체물 및 아미노산 아르기닌으로 이루어진 C-결합 구성원을 특징으로 한다.

실시예 3:

Lys(B3) Ile(B27)-프로인슐린의 작제

프라이머 쌍, 즉 서열 5' TTC TAC ATC CCC AAG ACC CGC CG 3'를 갖는 프라이머 KB3 JB 27A와 Insu 11, 및 또한 서열 5' CTT GGG GAT GTA GAA GAA GCC TCG 3'을 갖는 프라이머 K B3 J 27B와 Tir를 사용하여 앞의 실시예에 따라서 작제를 수행한다.

두 PCR 반응 모두에 사용된 주형은 플라스미드 pINT 125d의 DNA이다. 두 반응의 PCR 산물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제3의 반응에서 조합하고, 이 산물을 상기 실시예에 상응하게 클로닝한다.

플라스미드 pINT 332가 생성된다.

실시예 4:

Lys(B3) Ile(B28)-프로인슐린의 작제

프라이머 쌍, 즉 서열 5' TAC ACA ATC AAG ACC CGC CGG GAG-3'를 갖는 프라미머 KB3 JB 28A와 Insu 11, 및 또한 서열 5' GGT CTT GAT TGT GTA GAA GAA GCC TCG-3'을 갖는 프라이머 KB JB 28B와 Tir를 사용하여 실시예 3에 따라서 작제를 수행한다.

플라스미드 pINT 333가 생성된다.

작제된 인슐린 변이체의 발현

플라스미드 pINT 329, 332 및 333을 각각 이. 콜라이 K12 W3110을 통하여 형질전환시킨다. 이어서, 각각의 변이체를 암호화하는 플라스미드를 함유하는 재조합 세균을 상기 미국 특허 제5,227,293호의 실시예 4에 따라서 발효시키고, 이로써 각각의 인슐린 변이체를 제조하기 위한 목적하는 원료가 생성된다.

실시예 5:

Lys(B3), Ile(B28), Asp(A21)-프로인슐린의 작제

작제를 실시예 3에서와 같이 수행한다. 그러나, pINT 125d 대신, PCR 반응에 사용되는 주형은 실시예 4에서 작제된 플라스미드 pINT 333의 DNA이다. 다음 프라이머 쌍이 본 실시예에서 사용된다:

서열 5' TTTTTTGTCGACTATTAGTCGCAGTAGTTCTACCAGCTG-3'을 갖는 P-pint 365 및 Tir.

플라스미드 pINT 365가 생성된다.

실시예 6:

래빗트에게 정맥내 투여한 후 Lys(B3), Glu(B29)-인슐린의 생물학적 활성

[표 1]

8마리 래빗트에게 지시된 인슐린을 정맥내 투여한다(0.2IU/kg). 4시간 동안, 혈중 글루코즈 농도를 지시된 시간에서 측정하고 0시간의 출발값의 %로서 산정한다. 평균값은 사람 인슐린과 Lys(B3), Glu(B29)-인슐린 간에는 현저한 생물학적 활성 차이가 없는 것으로 나타났다.

실시예 7:

래빗트에게 정맥내 투여한 후 Lys(B3), Ile(B27)- 및 Lys(B3), Ile(B28)-인슐린의 생물학적 활성

6마리 래빗트에게 지시된 인슐린을 정맥내 투여한다(0.2IU/kg). 4시간 동안, 혈중 글루코즈 농도를 지시된 시간에서 측정하고 0시간의 출발값의 %로서 산정한다. 평균값은 사람 인슐린과 Lys(B3), Ile(B27)- 및 Lys(B3), Ile(B28)-인슐린 간에는 현저한 생물학적 활성 차이가 없는 것으로 나타났다.

[표 2]

실시예 8:

개에게 피하 투여 후 Lys(B3), Glu(B29)-인슐린 및 Lys(B3), Ile(B28)-인슐린의 약력학

각 경우에 있어서 4마리 개에게 지시된 인슐린(0.3IU/kg)을 피하 주사한다. 글루코즈를 지속적으로 주입하여 혈중 글루코즈 농도를 3.7 내지 4mmol/l로 유지시킨다. 주사 시간(t=0)으로부터 240분에 걸친 평균 글루코즈 주입 속도 ±SEM를 나타낸다.

[표 3]

신속하게 작용하는 인슐린 유도체를 이용한 굶긴 개에서의 글루코즈 클램프

[표 4]

신속하게 작용하는 인슐린 유도체를 이용한 굶긴 개에서의 글루코즈 클램프[투여량: t₀에서 1 x 0.3IU/kg(피하)(평균 ± SEM, n=4)

[표 5]

기호:

1 신속하게 작용하는 인슐린 유도체를 이용한 굶긴 개에서의 글루코즈 클램프

2 투여량: t₀에서 1 x 0.3IU/kg(피하)

3 H-인슐린, Hoechst

4 글루코즈 주입 속도(mg.kg^-1.분^-1)

5 분

본 발명에 따른 인슐린 유도체는 투여 후, 특히 피하 투여 후, 사람 인슐린과 비교해서 작용 개시가 촉진된다.

서열 목록

(1) 일반 정보:

(ⅰ) 출원인:

(A) 명칭: 훽스트 마리온 러쎌 도이칠란트 게엠베하

(B) 거리: -

(C) 시: 프랑크푸르트 암 마인

(D) 주: -

(E) 국가: 독일

(F) 우편번호: 65926

(G) 전화번호: 069-305-5307

(H) 팩시밀리번호: 069-35-7175

(ⅱ) 발명의 명칭: 신속한 작용 개시를 나타내는 인슐린 유도체

(ⅲ) 서열 수: 8

(ⅳ) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체 유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환

(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.25(EPO)

(2) 서열 1에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 21개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..21

[서열 1]

(2) 서열 2에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 30개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..30

[서열 2]

(2) 서열 3에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 30개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..30

[서열 3]

(2) 서열 4에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 30개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..30

[서열 4]

(2) 서열 5에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 30개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..30

[서열 5]

(2) 서열 6에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 97개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..97

[서열 6]

(2) 서열 7에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 97개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..97

[서열 7]

(2) 서열 8에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 97개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..97

[서열 8]

(2) 서열 9에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 21개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..21

[서열 9]

(2) 서열 10에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 30개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..30

[서열 10]

(2) 서열 11에 대한 정보

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 97개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(ⅸ) 양상:

(A) 명칭/특징: 단백질

(B) 위치: 1..97

[서열 11]

Claims

화학식 1의 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.

화학식 1

상기식에서,

(A1-A5)는 사람 인슐린의 A쇄의 A1 내지 A5 위치에서의 아미노산 잔기이고,

(A12-A19)는 사람 인슐린의 A쇄의 A12 내지 A19 위치에서의 아미노산 잔기이며,

A21은 Asn이고,

(B8-B18)는 사람 인슐린의 B쇄의 B8 내지 B18 위치에서의 아미노산 잔기이고,

(B20-B26)는 사람 인슐린의 B쇄의 B20 내지 B26 위치에서의 아미노산 잔기이며,

A8, A9, A10은 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 A쇄의 A8, A9 및 A10 위치에서의 아미노산 잔기이고,

B30은 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 B쇄의 B30 위치에서의 아미노산 잔기이며,

B1은 페닐알라닌 잔기(Phe)이고,

B3은 천연 염기성 아미노산 잔기이며,

B27, B28 및 B29는 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 아미노산 잔기이거나, 각 경우에 있어서 또 다른 천연 아미노산으로서, 이때 B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 중성 또는 산성 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 또 다른 천연 아미노산 잔기로 치환된다.
제1항에 있어서,

A8이 알라닌(Ala)이고,

A9가 세린(Ser)이며,

A10이 발린(Val)이고,

B30이 알라닌(Ala)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제1항에 있어서,

A8이 트레오닌(Thr)이고,

A9가 세린(Ser)이며,

A10이 이소루이신(Ile)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제3항에 있어서, B30이 알라닌(Ala)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제3항에 있어서, B30이 트레오닌(Thr)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, B쇄의 B3 위치에서의 아미노산 잔기가 히스티딘(His), 리신(Lys) 또는 아르기닌 잔기(Arg)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제6항에 있어서, B쇄의 B3 위치에서의 아미노산 잔기가 히스티딘 잔기(His)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제6항에 있어서, B쇄의 B3 위치에서의 아미노산 잔기가 아르기닌 잔기(Arg)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제6항에 있어서, B쇄의 B3 위치에서의 아미노산 잔기가 리신 잔기(Lys)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 이소루이신(Ile), 아스파르트산(Asp) 및 글루탐산(Glu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천연 아미노산 잔기인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 산성 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천연 아미노산 잔기인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제11항에 있어서, B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 아스파르트산 잔기(Asp)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제11항에 있어서, B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 글루탐산 잔기(Glu)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, B쇄의 B27, B28 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 중성 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천연 아미노산 잔기로 치환된 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제14항에 있어서, B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 이소루이신 잔기(Ile)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제12항에 있어서, B쇄의 B27 위치에서의 아미노산 잔기가 아스파르트산 잔기(Asp)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제12항에 있어서, B쇄의 B28 위치에서의 아미노산 잔기가 아스파르트산 잔기(Asp)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제12항에 있어서, B쇄의 B29 위치에서의 아미노산 잔기가 아스파르트산 잔기(Asp)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제13항에 있어서, B쇄의 B27 위치에서의 아미노산 잔기가 글루탐산 잔기(Glu)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제13항에 있어서, B쇄의 B28 위치에서의 아미노산 잔기가 글루탐산 잔기(Glu)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제13항에 있어서, B쇄의 B29 위치에서의 아미노산 잔기가 글루탐산 잔기(Glu)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제15항에 있어서, B쇄의 B28 위치에서의 아미노산 잔기가 이소루이신 잔기(Ile)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제21항에 있어서,

B쇄가 서열 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr (서열 3)을 갖는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제15항에 있어서, B쇄의 B27 위치에서의 아미노산 잔기가 이소루이신 잔기(Ile)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제24항에 있어서,

B쇄가 서열 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr(서열 5)을 갖는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제22항에 있어서,

B쇄가 서열 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr(서열 4)을 갖는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
A쇄의 A1 위치에서의 아미노산 잔기가 화학식 2의 펩티드 쇄를 통하여 B쇄의 아미노산 잔기 B30에 연결되고 B쇄가 화학식 3의 펩티드 쇄를 통하여 B1 위치에서 연장되는 인슐린 유도체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 복제 가능한 발현 비히클을 작제하고, 이를 숙주 세포에서 발현시킨 다음, 화학적, 효소적 또는 이들 모두의 방법을 이용하여 당해 인슐린 전구체로부터 인슐린 유도체를 방출시키는 것을 포함하여, 제1항에 따르는 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법.

화학식 2

-R¹ _n-Arg-

화학식 3

Met-R² _m-(Arg)_p-

상기식에서,

R¹ _n은 n개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 쇄이고,

n은 0 내지 34의 정수이며,

R² _m은 m개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 쇄이고,

m은 0 내지 40의 정수이며,

p는 0, 1 또는 2이다.
제27항에 있어서, 숙주 세포가 세균인 방법.
제28항에 있어서, 세균이 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
제27항에 있어서, 숙주 세포가 효모인 방법.
제30항에 있어서, 효모가 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 방법.
제27항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린 유도체의 전구체가 서열 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 6)을 갖는 제23항에 따르는 인슐린 유도체를 제조하는 방법.
제27항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린 유도체의 전구체가 서열 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 8)을 갖는 제25항에 따르는 인슐린 유도체를 제조하는 방법.
제27항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린 유도체의 전구체가 서열 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(서열 7)를 갖는 제26항에 따르는 인슐린 유도체를 제조하는 방법.
제32항에 따르는 인슐린 유도체의 전구체.
제33항에 따르는 인슐린 유도체의 전구체.
제34항에 따르는 인슐린 유도체의 전구체.
제35항에 따르는 인슐린 유도체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열.
제36항에 따르는 인슐린 유도체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열.
제37항에 따르는 인슐린 유도체의 전구체를 암호화하는 DNA 서열.
제38항에 따르는 DNA 서열을 포함하는 발현 비히클.
제39항에 따르는 DNA 서열을 포함하는 발현 비히클.
제40항에 따르는 DNA 서열을 포함하는 발현 비히클.
제41항 내지 제43항 중의 어느 한 항에 따르는 발현 비히클을 사용하여 형질전환된 숙주 세포.
제1항에 따르는 하나 이상의 인슐린 유도체 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 포함하는, 작용 개시가 신속한 인슐린 활성을 지닌 약제학적 제제.
제45항에 있어서, 용해된 형태, 무정형 및/또는 결정성 형태의 인슐린 유도체 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 제제.
제45항에 있어서, 데포우(depot) 보조제를 추가로 포함하는 약제학적 제제.
제47항에 있어서, 데포우 보조제가 프로타민 설페이트이고, 인슐린 유도체 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염이 공결정화물로서 이러한 프로타민 설페이트와 함께 존재하는 약제학적 제제.
제45항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 따르는 약제학적 제제를 용해된 형태로 포함하는, 인슐린 활성을 지닌 주사용 용액제.
제6항에 있어서, B쇄의 B27, B28 및 B29 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 이소루이신(Ile), 아스파르트산(Asp) 및 글루탐산(Glu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천연 아미노산 잔기인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제9항에 있어서, B쇄의 B29 위치에서의 아미노산 잔기가 글루탐산 잔기(Glu)인 인슐린 유도체 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
제27항에 있어서, B쇄의 B3 위치에 리신 잔기(Lys)를 갖고 B쇄의 B29 위치에 글루탐산 잔기(Glu)를 갖는 인슐린 유도체가 제조되는 방법.
제45항에 있어서, 인슐린 유도체가 B쇄의 B3 위치에 리신 잔기(Lys)를 갖고 B쇄의 B29 위치에 글루탐산 잔기(Glu)를 갖는 약제학적 제제.