NO321720B1

NO321720B1 - Insulinderivater og forloperproteiner, fremgangsmate for fremstilling inkludert DNA-sekvenser, ekspresjonsbaerer og vertsceller, samt deres anvendelse spesielt i farmasoytiske preparater for behandling av diabetes.

Info

Publication number: NO321720B1
Application number: NO19982860A
Authority: NO
Inventors: Gerhard Seipke; Paul Habermann; Karl Geisen; Johann Ertl
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2006-06-26
Also published as: NO982860D0; PL326936A1; DE59812316D1; DE19726167A1; BRPI9803708B1; HUP9801368A1; CY2005004I1; ES2232900T3; PL196626B1; DK0885961T3; ZA985363B; KR19990007117A; FR05C0009I2; CA2235443A1; AR015899A1; CN1203238A; NO2006014I1; UA65529C2; IL125006A; NL300170I1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører insulinderivater som oppviser en sammenlignet med human insulin aksellerert virkningsinntreden, en fremgangsmåte for deres fremstilling, forløperproteiner og deres anvendelse spesielt i farmasøytiske preparater for behandling av Diabetes mellitus. Oppfinnelsen angår også DNA-sekvenser som koder forløperpro-teiner, ekspresjonsbærere og vertsceller.

Verden over lider ca. 120 millioner mennesker av Diabetes mellitus. Herunder er ca. 12 millioner type I-diabetikere, for hvilke tilførselen av insulin utgjør den i dag eneste mulige behandlingen. De som er berørt av dette er livet gjennom henvist til insulininjeksjo-ner, som regel flere ganger daglig. Selv om type II-diabetes, som ca. 100 millioner mennesker lider av, ikke prinsippielt starter med en mangel på insulin anses likevel i et stort antall tilfeller behandlingen med insulin som den gunstigste eller eneste mulige behand-lingsformen.

Med økende varighet av sykdommen lider et stort antall pasienter av såkalt diabetiske senkomplikasjoner. Det dreier seg derved idet vesentlige om mikro- og makrovaskulære skader, som avhengig av type og omfang har til følge nyresvikt, blindhet, tap av ekstre-miteter eller en forhøyet risiko for hjerte/kretsløpssykdommer.

Som årsak gjøres i første rekke kronisk forhøyet blodglukosespeil ansvarlig, idet det heller ikke ved omhyggelig instilling av insulinbehandlingen oppnås en normal blodglu-koseprofil, som tilsvarer den fysiologiske reguleringen (Ward, J.D. (1989) British Medical Bulletin 45,111-126; Drury, P.L. et al. (1989) British Medical Bulletin 45,127-147; Kohner, E.M. (1989) British Medical Bulletin 45,148-173).

Hos sunne mennesker er insulinsekresjonen nært tilpasset glukosekonsentrasjonen i blodet. Forhøyede glukosespeil, som opptrer etter måltidene, kompenseres raskt ved en øket insulinfirgivelsé. I edru tilstand synker plasmainsulinspeilet til en basal verdi som er tilstrekkelig til å sikre at insulinfølsomme organer og vev kontinuerlig forsørges med glukose. En optimalisering av behandlingen, den såkalte intensiverte insulinterapien, er i dag rettet mot å holde variasjoner av. blodglukosekonsentrasjonen, spesielt avvik oppad, minst mulig (Bolli, G.B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S3-S16; Berger, M. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S25-S32). Dette fører til en signifikant reduksjon av opp-treden og utviklingen av diabetiske senskader (The Diabetes Control and CompHcations Trial Research Group (1993) N. Engi. J. Med. 329,977-986).

Fra fysiologien ved insulinsekresjon lar det seg avlede at for en forbedret, intensivert insulinterapi under anvendelse av subkutant tilførte preparater kreves det to insulinpre-parater med forforskjellig farmakodynamikk. For kompenasjon av blodglukoseøkningen etter måltidene må insulinet strømme raskt til og må bare virke noen timer. For basal besørgelse, spesielt om natten, bør det stå til disposisjon et preparater som virker lenge, ikke oppviser noe utpreget maksimum og bare strømmer langsomt til.

De på humane og animalske insuliner baserte preparatene oppfyller kravene ved en intensivert insulinterapi bare i begrenset grad. Raskt virksomme insuliner (Alt-insuliner) når etter subkutan tilførsel bare langsomt inn i blodet og til virkestedet og oppviser en for lang virkningsvarighet. Følgen er at de postprandiale glukosespeilene ligger for høyt og flere timer etter måltidet synker blodglukosen for lavt (Kang, S. et al. (1991) Diabetes Care 14,142-148; Home, P.J. et al. (1989) British Medical Bulletin 45,92-110; Bolli, G.B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S3-S16). De disponerbare basalinsuline-ne oppviser igjen, fremfor alt NPH-insuliner, en for kortvarig virkningsvarighet og har et for sterkt utpreget maksimum.

Ved siden av muligheten til å påvirke virkningsprofilen via galeniske prinsipper finnes i dag ved hjelp av genteknikk det alternativ å utforme insulinderivater som oppnår be-stemte egenskaper som virkningsinntreden og -varighet utelukkende på grunnlag av de strukturelle egenskapene. Ved anvendelsen av egnede insulinderivater kan det følgelig oppnås en vesentlig bedre innstilling av blodglukosen, som ligger nærmere opptil de naturlige forholdene.

Insulinderivater med aksellerert virkningsinntreden beskrives i EP 0 214 826, EP 0 375 437 og EP 0 678 522. EP 0 214 826 vedrører blant annet substitusjoner av B27 og B28, imidlertid ikke i forbindelse med substitusjonen av B3. EP 0 678 522 beskriver insulinderivater som i posisjon B29 oppviser forskjellige aminosyrer, fortrinnsvis prolin, imidlertid ikke glutaminsyre. EP 0 375 437 omfatter insulinderivater med lysin eller arginin i B28, som eventuelt i tillegg kan være modifisert i B3 og/eller A21.

I EP 0 419 504 beskrives insulinderivater som er beskyttet med kjemiske modifikasjoner, ved at asparagin i B3 og minst en ytterligere aminosyre i posisjonene A5, A15, Al 8 eller A21 er forandret. Kombinasjoner med modifikasjoner i posisjonene B27, B28 eller B29 beskrives imidlertid ikke. En antydning om at disse forbindelsene har en forandret farmakodynamikk med den følge at de har en raskere virkningsinntreden er ikke angitt. IWO 92/00321 beskrives insulinderivater hvorved minst en aminosyre i posisjonene B1-B6 er erstattet med lysin eller arginin. Slike insuliner oppviser ifølge WO 92/00321 en forlenget virkning. Kombinasjoner med modifikasjoner i posisjonene B27,28,29 beskrives imidlertid ikke.

Oppgaven ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe insulinderivater som etter tilførsel, spesielt etter subkutan tilførsel, oppviser en sammenlignet med human insulin aksellerert virkningsinntreden.

Insulinderivater er derivater av naturlig forekommende insuliner, nemlig humaninsulin (se SEQ ED NO. 1 = A-kjede av humaninsulin; se SEQ ED NO. 2 = B-kjede av humaninsulin, sekvensprotokoll) eller animalske insuliner, som skiller seg ved substitusjon av minst en naturlig opptredende aminosyrerest og/eller addisjon av minst en aminosyrerest og/eller organisk rest fra det tilsvarende, forøvrig like naturlig forekommende insulinet.

Det er videre oppgave ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av insulinderivatene med den nevnte egenskapen, de tilsvarende mel-lomproduktene samt deres forstadier.

Oppgaven løses ved et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt, kjennetegnet ved formel I

hvori

(A1-A5) betyr aminosyrerestene i posisjonene Al til A5 av A-kjeden av humaninsulin eller animalsk insulin,

(A12-A19) betyr aminosyrerestene i posisjonene A12 til A19 av A-kjeden av humaninsulin eller animalsk insulin,

A21 betyr Asn,

(B8-B18) betyr aminosyrerestene i posisjonene B8 til B18 av B-kjeden av humaninsulin eller animalsk insulin,

(B20-B26) beteyr aminosyrerestene i posisjonene B20 til B26 av B-kjeden av humaninsulin eller animalsk insulin,

A8, A9, A10 betyr aminosyrerestene i posisjonene A8, A9 og A10 av A-kjeden av humaninsulin eller animalsk insulin,

B30 betyr -OH eller ammosyreresten i posisjon B30 av B-kjeden av humaninsulin eller animalsk insulin,

B1 betyr en fenylalaninrest (Phe) eller et hydrogenatom,

B3 betyr en naturlig opptredende basisk aminosyrerest,

B27, B28 og

B29 betyr aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden av humaninsulin eller animalsk insulin og i hvert tilfelle en annen naturlig opptredende aminosyrerest, hvorved minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er byttet ut med en annen naturlig opptredende aminosyrerest, som er valgt fra gruppen av nøytrale eller sure aminosyrer.

Av de tyve naturlig opptredende aminosyrene som er genetisk kodbare, betegnes her

aminosyrene glysin (Gly), Alanin (Ala), Valin (Val), Leucin (Leu), Isoleucin (Ile), Serin (Ser), Threonin (Thr), Cystein (Cys), Metionin (Met), Asparagin (Asn), Glutamin (Gin), Fenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Tryptofan (Trp) og Prolin (Pro) som nøytrale aminosyrer, aminosyrene Arginin (Arg), Lysin (Lys) og Histidin (His) betegnes som basiske

aminosyrer og aminosyrene asparaginsyre (Asp) og glutaminsyre (Glu) betegnes som sure aminosyrer.

Fortrinnsvis er insulinderivatet eller dets fysiologisk godtagbare salt ifølge foreliggende oppfinnelse et derivat av okseinsulin, svineinsulin eller humaninsulin, nemlig et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette med formel L som utmerker seg ved at

A8 betyr Alanin (Ala),

A9 betyr Serin (Ser),

Al 0 betyr Valin (Val) og

B30 betyr alanin (Ala) (aminosyrerester A8 til Al0 og B30 av okseinsulin),

A8 betyr Treonin (Thr),

A9 betyr Serin (Ser) og

A10 betyr Isoleucin (Ile) (aminosyrerester A8 til A10 av insulinene fra menneske eller

svin), hvorved

B30 betyr Alanin (Ala) (aminosyrerest B30 av svineinsulin) eller

B30 betyr Treonin (Thr) (aminosyrerest B30 av humaninsulin, krf. SEQ ID NO 2).

Ytterligere foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette med formel I, kjennetegnet ved at aminosyreresten i posisjon Bl av B-kjeden er en fenylalaninrest (Phe) eller

et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av.det samme med formel I, kjennetegnet ved at aminosyreresten i posisjon B3 av B-kjeden er en histidin- (His), lysin-(Lys) eller argininrest (Arg).

Ytterligere foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel I, kjennetegnet ved at minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er erstattet med en naturlig opptredende aminosyrerest, som er valgt fra gruppen av nøytrale eller sure aminosyrer,

et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel I, kjennetegnet ved at minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er en naturlig opptredende aminosyrerest, som er valgt fra gruppen isoleucin (Ile), asparaginsyre (Asp) og glutaminsyre (Glu), fortrinnsvis kjennetegnet ved at minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 av B-kjeden er erstattet med en naturlig opptredende aminosyrerest, som er valgt fra gruppen av nøytrale aminosyrer, eller, spesielt

foretrukket, at minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er en isoleucinrest (Ile), eller

et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel L kjennetegnet ved at minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er en naturlig opptredende aminosyrerest som er valgt fra gruppen av sure aminosyrer, fortrinnsvis kjennetegnet ved at minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28

og B29 av B-kjeden er en asparaginsyrerest (Asp), fortrinnsvis kjennetegnet ved at aminosyreresten i posisjonen B27 eller B28 av B-kjeden er en asparaginsyrerest (Asp), eller kjennetegnet ved at minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er en glutaminsyrerest (Glu).

En foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er også et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel I, kjennetegnet ved at aminosyreresten i posisjonen B29 av B-kjeden er en asparaginsyrerest (Asp).

Ytterligere foretrukne utførelsesformer er et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel L kjennetegnet ved at aminosyreresten i posisjonen B27 av B-kjeden er en glutaminsyrerest (Glu), eller

et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel I, kjennetegnet ved at aminosyreresten i posisjonen B28 av B-kjeden er en glutaminsyrerest (Glu), eller

et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel I, kjennetegnet ved at aminosyresten i posisjon B29 av B-kjeden er en glutaminsyrerest (Glu).

Helt spesielt foretrukket er et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme, som utmerker seg ved at B-kjeden oppviser sekvensen

(SEQU ID NO 3), eksempelvis Lys (B3), Glu (B29)-humaninsulin, eller

et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme som utmerker seg ved at aminosyreresten i posisjon B27 av B-kjeden er en isoleucinrest (Ile), fortrinnsvis et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme, som utmerker seg ved at B-kjeden oppviser sekvensen

(SEQU ID NO 5), eksempelvis Lys (B3), Ile (B27)-hurnaninsulin, eller

et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel I, kjennetegnet ved at aminosyreresten i posisjon B28 av B-kjeden er en isoleucinrest (Ile), fortrinnsvis et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme, som utmerker seg ved at B-kjeden oppviser sekvensen

(SEQU ID NO 4), eksempelvis Lys (B3), Ile (B28)-humaninsulin.

Insulinderivatet med formel I lar seg fortrinnsvis fremstille genteknologisk.

Den innledningsvis stilte oppgaven løses følgelig videre ved en fremgangsmåte for fremstilling av et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel L omfattende konstruksjonen av en replikerbar ekspresjonsbærer, som inneholder en DNA-sekvens, som koder for en forløper av insulinderivatet, hvori aminosyreresten i posisjon Al av A-kjeden er forbundet med aminosyreresten B30 av B-kjeden over et peptidkjede med formel II hvori R'n er en peptidkjede med n aminosyrerester og n er et helt tall fra 0 til 34, og B-kjeden ved posisjon Bl er forlenget med en peptidkjede med formel m

hvori R2m er en peptidkjede med m aminosyrerester, m er et helt tall fra 0 til 40, fortrinnsvis fra 0 til 9, og p betyr 0,1 eller 2, hvorved for p = 0 peptidkjeden R<2>mfortrinnsvis ender med Lys, ekspresjon i en vertscelle og frigivelse av insulinderivatet fra dets forstadium med kjemiske og/eller enzymatiske fremgangsmåter.

Fortrinnsvis er fremgangsmåten kjennetegnet ved at vertscellen er en bakterie, spesielt foretrukket kjennetegnet ved at bakterien er E. coli.

Fortrinnsvis er fremgangsmåten kjennetegnet ved at vertscellen er en gjær, spesielt foretrukket kjennetegnet ved at gjæren er Saccharomyces cerevisiae.

For fremstilling av et insulinderivat med aminosyresekvensen SEQU ID NO 3 oppviser forløperen av dette insulinderivatet fortrinnsvis sekvensen

For fremstilling av et insulinderivat med aminosyresekvensen SEQU ID NO 5 oppviser forløperen av dette insulinderivatet fortrinnsvis sekvensen For fremstilling av et insulinderivat med aminosyresekvensen SEQU ED NO 4 oppviser forløperen av dette insulinderivatet fortrinnsvis sekvensen

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig også de nevnte forløperne av de foretrukne insulinderivatene, nemlig peptidene med sekvensnummeme SEQ ED NO.: 6,

SEQ ED NO.: 7 og SEQ ED NO.: 8, DNA-sekvensene, hvor hvilke de nevnte forløperne koder, ekspresjonsbæreme som inneholder disse DNA-sekvensene samt vertscellene som er transformert med disse ekspresjonsbæreme.

Fremstillingen av insulinderivatene med formel I foregår hovedsakelig genteknologisk ved hjelp av seterettet mutagenese ifølge standard fremgangsmåter.

For dette formålet konstrueres en for det ønskede insulinderivatet med formel I kodende genstruktur og bringes til ekspresjon i en vertscelle - fortrinnsvis i en bakterie som E. coli eller en gjær, spesielt Saccharomyces cerevisiae og - dersom genstrukturen koder for et fusjonsprotein - settes fra fusjonsproteinet insulinderivatet med formel I fri; ana-loge fremgangsmåter er f.eks. beskrevet i EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 og DE-patentsøknaden P 38 21 159.

Avspaltningen av fusjonsproteinandelen kan etter celleoppslutning foregå kjemisk ved hjelp av halogencyan (se EP-A-0 180 920).

Ved fremstillingen ved hjelp av en preproinsulinforløper som har en fusjonsproteinandel (presekvens) ifølge US 5,358,857, foregår avspaltningen av fusjonsproteinandelen på et senere trinn sammen med avspaltningen av C-peptidet.

Insulinforløperen underkastes så den oksidative sulfitolysen ifølge den av R.C. Marshall og A.S. Inglis i "Practical Protein Chemistry - A Handbook" (utgiver A. Darbre) 1986, sidene 49-53 beskrevne fremgangsmåten og renatureres deretter i nærvær av en tiol under dannelse av de korrekte disulfidbroene, f.eks. ved fremgangsmåten beskrevet av G.H. Dixon og A.C. Wardlow i Nature (1960), sidene 721-724.

Insulinforløperne kan imidlertid også være direkte foldet (EP-A-0 600 372; EP-A-0 668 292).

C-peptidet fjernes ved hjelp av tryptisk spaltning - f.eks. ifølge fremgangsmåten til von Kemmler et al., J.B.C. (1971), sidene 6786-6791 og insulinderivatet med formel I renses ved hjelp av kjente teknikker som kromatografi - f.eks. EP-A-0 305 760 - og krystallisa-sjon.

Dersom n i formel II er 0, tjener den tryptiske spaltningen til adskillelse av peptidbin-dingen mellom A- og B-kjeder.

Ved denne fremgangsmåten ender B-kjede C-terminalen med arginin eller to arginin-rester. Disse kan fjernes enzymatisk ved hjelp av karboksypeptidase B.

liisulinderivatene ifølge oppfinnelsen har full biologisk aktivitet. Dette ble vist ved int-ravenøs tilførsel til kaniner og den derav følgende blodglukosesenkningen (eksempler 5 og 6).

Den raskere virkningsinntreden etter subkutan tilførsel ble vist med den euglykemiske klemmeteknikken på fastende hund (eksempel 7). Det ble administrert 0,3 DS/kg. Refe-ransepreparat var humaninsulin. Ved klemmeteknikken måles etter insulininjeksjonen i korte tidsavstander blodglukoseverdien og det infuseres nøyaktig så mye glukose som er påkrevet for å kompensere senkningen. Dette har den fordelen at det hos dyrene ikke opptrer noen motregulering, hvilket ville være tilfelle ved et sterkt fall av blodglukosen etter tilførsel av insulin. Mengden og det tidsmessige forløpet for den infuserte glukosen karakteriserer virkningen av insulinet. Lys(B3), Glu(B29)- (SEQ ED NO 3) og LYs(B3), Ile(B28)- (SEQ ED NO 4) insulin oppviser en tydelig raskere virkningsinntreden enn human insulin. Den maksimale virkningen (glukoseinfusjonsraten) oppnås med humaninsulin etter 100 minutter, med Lys(B3), Glu(B29)-insulin (SEQ ED NO 3) derimot etter 80 minutter og med Lys(B3)-, De(B28)-insulin (SEQ ID NO 4) allerede etter 60 minutter. Følgelig skulle disse analogene, når de injiseres kort før et måltid, kompensere den postprandiale økningen av blodglukosen bedre enn human insulin.

De beskrevne insulinderivatene egner seg såvel for behandling av type 1- som også av type Et-Diabetes mellitus, fortrinnsvis i forbindelse med et basalinsulin.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig også anvendelsen av insulinderivatet og/eller dets fysiologisk godtagbare salt med formel I for fremstilling av et farmasøytisk preparat som oppviser en insulinaktivitet med rask virkningsinntreden.

Som fysiologisk godtagbart og med insulinderivatet kompatibelt bærermedium egner seg en steril vandig oppløsning som gjøres isotonisk til blod på vanlig måte, f.eks. ved hjelp av glyserol, koksalt, glukose og dessuten inneholder et av de vanlige konserve-ringsmidlene, f.eks. fenol, m-kresol eller p-hydroksybenzosyreester. Bærermediet kan i tillegg inneholde et bufferstoff, f.eks. natriumacetat, natriumsitrat, natriumfosfat. For innstilling av pH anvendes fortynnede syrer (typisk HC1) hhv. luter (typisk NaOH). Preparatet kan videre inneholde sinkioner.

Insulinderivatene kan i de farmasøytiske preparatene også anvendes i form av fysiologisk godtagbare salter, som alkali- eller som ammoniumsalter. En hvilken som helst andel av et eller flere insulinderivater med formel I eller et insulinderivat med formel II kan i en blanding av ytterligere av disse insulinderivatene uavhengig av hverandre fore-ligge i oppløst, amorf og/eller krystallinsk form.

Det er i mange tilfeller fordelaktig å tilsette preparatet ifølge oppfinnelsen en egnet mengde av en egnet stabilisator som forhindrer utfellingen av protein ved termisk me-kanisk belastning ved kontakt med forskjellige materialer. Slike stabilisatorer er eksempelvis kjente fra EP-A-18609, DE-A 32 40 177 eller fra WO-83/00288.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre et farmasøytisk preparat som er kjennetegnet ved at det inneholder minst et insulinderivat og/eller et fysiologisk godtagbart salt av det samme med formel I, fortrinnsvis i oppløst, amorf og/eller krystallinsk form.

Insulinderivatene ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved en rask virkningsinntreden. I den praktiske insulinbehandlingen er det i visse tilfeller vanlig å blande raskt virkende insuliner med preparater som inneholder et depothjelpestoff (f.eks. NPH-insulin). Det oppnås derved, avhengig av sammensetning, preparater hvis virkningsprofil tilsvarer de overlappende enkeltprofilene, såfremt enkeltkomponentene er stabile i blandingen og ikke påvirker hverandre gjensidig. Ved blandingen av insulinderivatet med humant NPH-insulin må det imidlertid ventes at spesielt ved langvarig lagring vil det finne sted en utbytting mellom det oppløste derivatet og det krystallinske NPH-insulinet. Derved forandres såvel farmakodynamikken for depotinsulinet som også den for det oppløste raskt virksomme insulinet på en måte som ikke kan forutses. For å unngå dette er det hensiktsmessig å tilberede det raskt virksomme derivatet under anvendelse av et depothjelpestoff - eksempelvis som NPH-insulin. Denne depotformen av insulinderivatet kan da fritt dannes med den oppløste, raskt virksomme formen uten at sammensetningen av den ene eller andre formen forandrer seg under lagring ved utveksling.

Selv om oppfinnelsen i sin kjerne vedrører raskt virkende insulinderivater omfatter den dessuten også muligheten til å tilberede slike derivater for formålet blandbarhet som depotform, hvorved det depothjelpestoffet fortrinnsvis er protaminsulfat og insulinderivatet og/eller dets fysiologisk godtagbare salt foreligger med protaminsulfatet i et kokrystallisat.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en injiserbar oppløsning som inneholder de ovenfor omtalte farmasøytiske preparatetene i oppløst form.

Eksempler

Eksempel 1: Konstruksjon av Lys (B3)-proinsulin som utgangspunkt for de oppfinnel-sesrelevante plasmidene tilsvarende eksemplene 2-4

I US 5,358,857 er vektoren pINT 90d og PCR primeren TIR og Insu 11 beskrevet. Disse komponentene tjener som utgangsmateriale for konstruksjonen av et plasmid pEMT 125d, som koder for det ønskede Lys (B3)-proinsulinet.

I tillegg syntetiseres primeren Insu 35 med sekvensen

og Insu 36 med sekvensen

En PCR-reaksjon gjennomføres med primerne Tir og Insu 36 og en andre reaksjon med primerne Insu 11 og Insu 35. Som templat tjener dertil pENT 90d DNA.

Produktene av de to PCR-reaksjonene er partielt komplementære, slik at de når de forenes i en tredje PCR-reaksjon med primerne Tir og Insu 11 gir et fragment som koder for en proinsulinvariant som på posisjon 3 av B-kjeden inneholder lysin. Dette PCR-fragmentet utfelles for rensing i etanol, tørkes og nedbrytes deretter i henhold til fabri-kantens angivelse med restriksjonsenzymene Nco 1 og Sal 1. Reaksjonsblandingen opp-deles gelelektroforetisk og det ønskede Nco l/Sal 1-fragmentet isoleres.

I den siterte søknaden er det beskrevet et plasmid pINT 91 d som koder for et mino-proinsulin. Spalter man herfra den for mino-proinsulinkodende sekvensen ved hjelp av Nco 1 og Sal 1 og isolerer restplasmid-DNA, så kan man omsette dette restplasmid-DNA med det angitte Nco l/Sal 1-PCR-fragmentet i en T 4-ligasereaksjon til plasmidet pINT 125d. Dette transformeres ifølge E. coli K12, formerer seg der og reisoleres. Etter verifikasjon av plasmidstrukturen ved hjelp av DNA-sekvens- og restriksjonsanalyse tjener pINT 125d-DNA som templat-DNA for innføring av ytterligere mutasjoner i denne proinsulinvarianten.

Eksempel 2: Konstruksjon av Lys (B3) og Glu (B29)-proinsulin

For fremstilling av muteinet syntetiseres primeren 329a med sekvensen

og 329b med sekvensen

Som templater anvendes DNA av plasmider pINT125d og pINT91d.

Primer 329a omsettes med primer Insu 11 på templatet pINT91d og primer 329b med Tir (se eksemplet ovenfor) på templatet pINT125d i en PCR-reaksjon. Idet begge PCR-produkter er partielt komplementære, kan de forenes i en direkte PCR-reaksjon og på nytt omsettes med primerne Tir og Insu 11. Det oppstår et DNA-fragment som koder for det ønskede muteinet. Dette fragmentet dobbeltnedbrytes med restriksjonsenzymene Nco 1 og Sal 1 og det dannede Nco l/Sal 1-fragmentet inserteres i pENT91d restplasmid-DNA i en T4-ligasereaksjon.

Det oppstår plasmidet pINT 329, som etter amplifisering i E. coli K12 ved hjelp av rest-riksjons- og DNA-sekvensanalyse verifiseres med hensyn til den ønskede strukturen.

Det av plasmidet kodede proinsulinderivatet er kjennetegnet ved de to aminosyreutbyt-tingene og et C-forbindelsesledd som består av aminosyren arginin.

Eksempel 3: Konstruksjon av Lys (B3) Ile (B27) proinsulin

Konstruksjonen foregår ifølge foregående eksempel med primerparene KB3 JB 27A

og Insu 11

samt

KB3 J27B

og Tir.

Som templat tjener i begge PCR-reaksjoner DNA av plasmidet pINT125d. PCR-produktene i begge reaksjoner forenes i en tredje reaksjon, som beskrevet i eksempel 1 og produktet klones tilsvarende eksemplet.

Det oppstår plasmidet pINTT332.

Eksempel 4: Konstruksjon av Lys (B3) De (B28)-proinsulin

Konstruksjonen foregår ifølge eksempel 3 med primerparene:

KB3 JB 28A

og Insu 11 samt KB JB28B

og Tir.

Det oppstår plasmidet pINT 333.

Ekspresjon av de konstruerte insulinvariantene.

Plasmidene pINT 329, 332 og 333 transformeres eksempelvis i hvert tilfelle ifølge E coli Kl 2 W3110. Rekombinante bakterier, som inneholder plasmidene som koder for de aktuelle variantene fermenteres så ifølge eksempel 4 av US-patentet med patentnr. S227293 og det derved ønskede råstoffet oppnås for frembringelse av de aktuelle insulinvariantene.

Eksempel 5: Konstruksjon av Lys (B3), Ile (B28), Asp (A21)-proinsulin

Konstruksjonen foregår ifølge eksempel 3.1 steden for pINT125d tjener imidlertid som templater for PCR-reaksjon DNA av plasmid pINT333, som ble konstruert i eksempel 4. Følgende primerpar finner derved anvendelse:

P-pint365

og Tir.

Det oppstår plasmidet pINT365.

Eksempel 6: Biologisk aktivitet av Lys(B3), Glu(B29)-insulin etter intravenøs tilførsel til kaniner.

8 kaniner fikk intravenøst de angitte insulinene (0,2 IE/kg). Under forløpet av de føl-gende 4 timene ble det til de angitte tidspunktene bestemt glukosekonsentrasjonen og beregnet på prosent av utgangsverdien ved tid 0. Middelverdiene viser ingen signifikan- te forskjeller for den biologiske aktiviteten mellom humaninsulin og Lys(B3), Glu(B29)-insulin.

Eksempel 7: Biologisk aktivitet av Lys(B3), Ile(B27)- og Lys(B3), Ile(B28)-insulin etter intravenøs tilførsel til kaniner.

6 kaniner fikk intravenøst de angitte insulinene (0,2 ffi/kg). Under forløpet av de føl-gende 4 timene ble til de angitte tidspunktene blodglukosekonsentrasjonen bestemt og beregnet som prosent av utgangsverdien ved tid 0. Middelverdiene viser ingen signifi-kante forskjeller av biologisk aktivitet mellom humaninsulin, Lys(B3), He(B27)- og Lys(B3), He(B28)-insulin.

Eksempel 8: Farmakodynamikk av Lys(B3), Glu(B29)-insulin og Lys(B3), Ile(B28)-insulin etter subkutan tilførsel til hund.

I hvert tilfelle 4 hunder fikk subkutane injeksjoner av de angitte insulinene (0,3 IE/kg). Blodglukosen ble ved kontinuerlig infusjon av glukose holdt ved 3,7 til 4 mmol/1. Vist er denmidlere glukoseinfusjonsraten ± SEM ved tidspunktet for injeksjon (t = 0) over 240 minutter.

GLUKOSEKLEMME VED FASTENDE HUND MED RASKT VIRKSOMME

INSULINDERIVATER

Dose: 1 x 0,3 IU/kg s.c. ved %

(middelverdi ± sem, n = 4)

Claims

1. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette,karakterisert vedformelen

hvori (A1-A5) betyr aminosyrerestene i posisjonene Al til A5 av A-kjeden av humanin sulin eller animalsk insulin, (A12-A19) betyr aminosyrerestene i posisjonene A12 til A19 av A-kjeden av human insulin eller animalsk insulin, A21 betyr Asn, (B8-B18) betyr aminosyrerestene i posisjonene B8 til B18 av B-kjeden av human insulin eller animalsk insulin, (B20-B26) betyr aminosyrerestene i posisjonene B20 til B26 av B-kjeden av human insulin eller animalsk insulin, A8, A9, A10 betyr aminosyrerestene i posisjonene A8, A9 og A10 av A-kjeden av hu maninsulin eller animalsk insulin, B30 betyr -OH eller aminosyreresten i posisjon B30 av B-kjeden av humanin sulin eller animalsk insulin, B1 betyr en fenylalaninrest (Phe) eller et hydrogenatom, B3 betyr en naturlig opptredende basisk aminosyrerest, B27, B28 og B29 betyr aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden av humaninsulin eller animalsk insulin og i hvert tilfelle en annen naturlig opptredende aminosyrerest, hvorved minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er byttet ut med en annen naturlig opptredende aminosyrerest, som er valgt fra gruppen av nøytrale eller sure aminosyrer.

2. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 1,karakterisert vedat A8 betyr Alanin (Ala), A9 betyr Serin (Ser), Al 0 betyr Valin (Val) og B30 betyr alanin (Ala).

3. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 1,karakterisert vedat A8 betyr Treonin (Thr), A9 betyr Serin (Ser) og Al 0 betyr Isoleucin (Ile).

4. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 3,karakterisert vedat B30 betyr Alanin (Ala).

5. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 3,karakterisert vedat B30 betyr Treonin (Thr).

6. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge et eller flere av kravene 1 til 5,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon Bl av B-kjeden er en fenylalaninrest (Phe).

7. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge et eller flere av kravene 1 til 6,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B3 av B-kjeden er en histidin- (His), Lysin- (Lys) eller argininrest (Arg).

8. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 7,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B3 av B-kjeden er en histidinrest (His).

9. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 7,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B3 av B-kjeden er en argininrest (Arg).

10. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 7,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B3 av B-kjeden er en lysinrest (Lys).

11. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge et eller flere av kravene

1 til 10,karakterisert vedat minst en av aminosyrerestene i posisjon B27, B28 og B29 av B-kjeden er en naturlig opptredende aminosyrerest, som er valgt fra gruppen isoleucin (Ile), asparaginsyre (Asp) og glutaminsyre (Glu).

12. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge et eller flere av kravene 1 til 11,karakterisert vedat minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er en naturlig opptredende aminosyrerest, som er valgt fra gruppen av sure aminosyrer.

13. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 12,karakterisert vedat minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er en asparaginsyrerest (Asp).

14. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 12,karakterisert vedat minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er en glutaminsyrerest (Glu).

15. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge et eller flere av kravene 1 til 10,karakterisert vedat minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 av B-kjeden er byttet ut med en naturlig opptredende aminosyrerest som er valgt fra gruppen av nøytrale aminosyrer.

16. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 15,karakterisert vedat minst en av aminosyrerestene i posisjonene B27, B28 og B29 av B-kjeden er en isoleucinrest (Ile).

17. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 13,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B27 av B-kjeden er en asparaginsyrerest (Asp).

18. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 13,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B28 av B-kjeden er en asparaginsyrerest (Asp).

19. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 13,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B29 av B-kjeden er en asparaginsyrerest (Asp).

20. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 14,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B27 av B-kjeden er en glutaminsyrerest (Glu).

21. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 14,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B28 av B-kjeden er en glutaminsyrerest (Glu).

22. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 14,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B29 av B-kjeden er en glutaminsyrerest (Glu).

23. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 18,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B28 av B-kjeden er en isoleucinrest (Ile).

24. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 22,karakterisert vedat B-kjeden oppviser sekvensen

25. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 15,karakterisert vedat aminosyreresten i posisjon B27 av B-kjeden er en isoleucinrest (Ile).

26. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 25,karakterisert vedat B-kjeden oppviser sekvensen

27. Insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge krav 23,karakterisert vedat B-kjeden oppviser sekvensen

28. Fremgangsmåte for fremstilling av et insulinderivat eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge et eller flere av kravene 1 til 27,karakterisertved at den omfatter konstruksjonen av en replikerbar ekspresjonsbærer som inneholder en DNA-sekvens, som koder for en forløper av insulinderivatet, hvori aminosyreresten i posisjon Al av A-kjeden er sammenføyet med aminosyreresten B30 av B-kjeden over en peptidkjede med formel II

hvori R\ er en peptidkjede med n aminosyrerester og n er et helt tall fra 0 til 34, og B-kjeden ved posisjon Bl er forlenget med en peptidkjede med formel IQ

hvori R2m er en peptidkjede med m aminosyrerester, m er et helt tall fra 0 til 40 og p betyr 0,1 eller 2, ekspresjon i en vertscelle og frigivelse av insulinderivatet fra dets for-løper med kjemiske og/eller enzymatiske fremgangsmåter.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28,karakterisert vedat vertscellen er en bakterie.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29,karakterisert vedat bakterien er E. coli.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 28,karakterisert vedat vertscellen er en gjær.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 31,karakterisert vedat gjæren er Saccharomyces cerevisiae.

33. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 28 til 32 for fremstilling av en insulinderivat ifølge krav 24,karakterisert vedat forløperen av insulinderivatet oppviser sekvensen

34. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 28 til 32 for fremstilling av et insulinderivat ifølge krav 26,karakterisert vedat forløperen av insulinderivatet oppviser sekvensen

35. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 28 til 32 for fremstilling av et insulinderivat ifølge krav 27,karakterisert vedat forløperen av insulinderivatet oppviser sekvensen

36. Forløper av insulinderivat,karakterisert vedsekvensen

37. Forløper av insulinderivat,karakterisert vedsekvensen

38. Forløper av insulinderivat,karakterisert vedsekvensen

39. DNA-sekvens,karakterisert vedat den koder for en forløper av insulinderivatet ifølge krav 36.

40. DNA-sekvens,karakterisert vedat den koder for en forløper av insulinderivatet ifølge krav 37.

41. DNA-sekvens,karakterisert vedat den koder for en forløper av insulinderivatet ifølge krav 38.

42. DNA-sekvens,karakterisert vedat den koder for en forløper av insulinderivatet ifølge krav 39.

43. Ekspresjonsbærer,karakterisert vedat den inneholder en DNA-sekvens ifølge krav 40.

44. Ekspresjonsbærer,karakterisert vedat den inneholder en DNA-sekvens ifølge krav 41.

45. Vertscelle,karakterisert vedat den er transformert med en ekspresjonsbærer ifølge et av kravene 42 til 44.

46. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat den inneholder minst en insulinderivat og/eller et fysiologisk godtagbart salt av dette ifølge et eller flere av kravene 1 til 27.

47. Farmasøytisk preparat ifølge krav 46,karakterisertv e d at den inneholder insulinderivatet og/eller dets fysiologisk godtagbare salt i oppløst, amorf og/eller krystallinsk form.

48. Farmasøytisk preparat ifølge krav 47,karakterisertved at den videre inneholder et depothjelpestoff.

49. Farmasøytisk preparat ifølge krav 48,karakterisertv e d at depothjelpestoffet er protaminsulfat, hvorved insulinderivatet og/eller det fysiologisk godtagbare saltet av dette foreligger med protaminsulfatet i et kokrystallisat.

50. Injiserbar oppløsning med insulinaktivitet,karakterisertved at den inneholder det farmasøytiske preparatet ifølge et av kravene 46 til 49 i oppløst form.

51. Anvendelse av insulinderivatet og/eller dets fysiologisk godtagbare salt ifølge et eller flere av kravene 1 til 27 for fremstilling av et farmasøytisk preparat som oppviser en insulinaktivitet med rask virkningsinntreden.