PT2275439E - Novos derivados de insulina - Google Patents

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PT2275439E PT101744944T PT10174494T PT2275439E PT 2275439 E PT2275439 E PT 2275439E PT 101744944 T PT101744944 T PT 101744944T PT 10174494 T PT10174494 T PT 10174494T PT 2275439 E PT2275439 E PT 2275439E
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Svend Havelund
Ib Jonassen
Ulla Ribel-Madsen
Thomas Hoeg-Jensen
Tina Møller Tagmose
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Description

DESCRIÇÃO
NOVOS DERIVADOS DE INSULINA CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novos derivados de insulina humana que são solúveis em valores de pH fisiológicos e têm um perfil de acção prolongado. A invenção refere-se também a métodos para prover estes derivados, às composições farmacêuticas que os contêm, a um método de tratamento da diabetes e hiperglicemia usando os derivados de insulina da invenção e ao uso destes derivados de insulina no tratamento da diabetes e hiperglicemia.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Habitualmente, o tratamento da diabetes, tanto a diabetes tipo 1 quanto a diabetes tipo 2, está baseado cada vez mais no denominado tratamento de insulina intensivo. De acordo com este regime, os pacientes são tratados com várias injecções diárias de insulina que compreendem uma ou duas injecções diárias de uma insulina de acção prolongada para cobrir a necessidade de insulina básica complementada por injecções de bolo de uma insulina de acção rápida para cobrir a necessidade de insulina relacionada com as refeições.
As composições de insulina de acção prolongada são bem conhecidas na técnica. Deste modo, um tipo principal de composições de insulina de acção prolongada compreende suspensões aquosas injectáveis de cristais de insulina ou de insulina amorfa. Nestas composições, os compostos de 1/66 insulina geralmente utilizados são insulina protamina, insulina de zinco ou insulina zinco protamina.
Certas desvantagens são associadas ao uso das suspensões de insulina. Assim, para garantir uma dosagem precisa, as partículas de insulina devem ser suspensas homogeneamente por agitação suave antes de que um volume definido da suspensão seja retirada de um frasco ou expelida de um cartucho. Também, para o armazenamento das suspensões de insulina, a temperatura deve ser mantida dentro dos limites mais estreitos do que para as soluções de insulina para evitar a formação de grumos ou a coagulação.
Apesar de que no passado se pensasse que as protaminas não eram imunogénicas, foi agora descoberto que as protaminas podem ser imunogénicas no homem e que o seu uso para fins médicos podem levar à formação de anticorpos. Há também evidências de que o complexo protamina-insulina é por si só imunogénico. Portanto, com alguns pacientes deve ser evitado o uso de composições de insulina de acção prolongada que contenham protaminas.
Um outro tipo de composições de insulina de acção prolongada são soluções que têm um valor de pH abaixo do pH fisiológico a partir do qual a insulina precipitará devido ao aumento no valor do pH quando a solução é injectada. Uma desvantagem com estas soluções é que a distribuição do tamanho das partículas do precipitado formado no tecido durante a injecção, e deste modo o perfil de libertação da medicação, depende do fluxo sanguíneo no sítio da injecção e de outros parâmetros bastante imprevisíveis. Uma outra desvantagem é que as partículas sólidas da insulina podem actuar como um irritante local causando uma inflamação do tecido no sítio da injecção. 2/66 0 Pedido Internacional de Patente WO 91/12817 (Novo Nordisk A/S) descreve composições de insulina solúvel que compreendem complexos de insulina de cobalto (III) . 0 perfil de acção destes complexos é apenas moderadamente prolongado e a biodisponibilidade é reduzida em relação à insulina humana. A insulina humana tem três grupos amino primários: 0 grupo N-terminal da cadeia A e da cadeia B e o grupo ε-amino de LysB29. Vários derivados de insulina que são substituídos num ou mais destes grupos são conhecidos na técnica anterior. Assim, o Pedido de Patente US No. 3,528,960 (Eli Lilly) refere-se a insulinas N-carboxiaroíla em que um, dois ou três grupos amino primários da molécula de insulina têm um grupo carboxiaroíla.
De acordo com a Patente do Reino Unido GB No. 1.492.997 (Nat. Res. Dev. Corp.), foi descoberto que a insulina com uma substituição de carbamila no ΝεΒ29 tem um perfil melhorado de efeito hipoglicémico. O pedido de patente japonesa pública JP No. 1-254699 (Kodama Co., Ltd.) descreve insulina em que um ácido gordo está ligado ao grupo amina de PheB1 ou ao grupo ε-amino de LysB29 ou a ambos. O propósito declarado da derivação é o de obter uma preparação de insulina estável aceite na Indústria Farmacêutica.
As insulinas, que na posição B30 tem um aminoácido com pelo menos cinco átomos de carbono que não têm necessariamente que estar codificados por um grupo de três letras de nucleotídeos, estão descritas no pedido de patente aberto ao público JP N° 57-067548 (Shionogi) . Os análogos da 3/66 insulina são reivindicados como sendo úteis no tratamento da diabetes mellitus, particularmente em pacientes que são resistentes à insulina devido à geração de anticorpos de insulina bovina ou porcina. 0 Pedido Internacional de Patente WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S) descreve derivados da insulina humana em que o grupo ε-amino de LysB29 tem um substituinte lipofilico. Estes derivados de insulina têm um perfil de acção prolongada e são solúveis em valores de pH fisiológicos. O Pedido de Patente europeia EP 894095 descreve derivados de insulina em que o grupo N-terminal da cadeia B e/ou o grupo ε-amino de Lys na posição B28, B29 ou B30 tem um substituinte da fórmula -CO-W-COOH onde W pode ser um grupo hidrocarboneto de cadeia longa. Estes derivados de insulina têm um perfil de acção prolongada e são solúveis em valores de pH fisiológico. O Pedido Internacional de Patente WO 99/21888 descreve agregados solúveis na água da insulina humana insulina que têm um perfil de acção prolongada.
No entanto, há ainda uma necessidade de insulinas com um perfil de acção mais prolongada do que os derivados de insulina conhecidos até agora e que ao mesmo tempo sejam solúveis em valores de pH fisiológico e tenham um potencial que seja comparável ao da insulina humana.
RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção está baseada no reconhecimento de que a hidrofobicidade global de uma molécula derivada da insulina 4/66 tem uma função importante para a potência in vivo do derivado.
Num aspecto, a presente invenção refere-se a um derivado da insulina humana que é a insulina humana des(B30) que tem uma cadeia lateral ligada a um grupo ε-amino de um residuo Lys presente na cadeia B da insulina humana des(B30), sendo a cadeia lateral da fórmula geral:
-W-X-Y-Z em que W é: • um residuo de α-aminoácido com um grupo de ácido carboxilico na cadeia lateral cujo o aminoácido é seleccionado do grupo constituído por a-Asp, β-Asp, a-Glu, γ-Glu, a-hGlu e δ-hGlu e cujo residuo forma, com um dos seus grupos carboxilicos, um grupo amino em conjunto com o grupo ε-amino de um residuo Lys presente na cadeia B da insulina humana des(B30); X é: • -C0-; Y é: • -(CH2)m“ onde m é um número inteiro na margem de 12 a 16; e Z é: 5/66 -COOH; e quaisquer complexos Zn2+ destes.
Numa forma de realização, a cadeia lateral -W-X-Y-Z está ligada ao grupo ε-amino de um residuo Lys presente na posição 28 da cadeia B. Ainda noutro aspecto desta forma de realização, a cadeia lateral -W-X-Y-Z está ligada ao grupo ε-amino de um residuo Lys presente na posição 29 da cadeia B. Ainda noutro aspecto desta forma de realização, a cadeia lateral -W-X-Y-Z está ligada ao grupo ε-amino de um residuo Lys presente na posição 30 da cadeia B.
Numa forma de realização W pode estar conectado ao grupo ε-amino de um residuo Lys na cadeia B via um derivado de ureia. A subestrutura X da cadeia lateral -W-X-Y-Z pode ser um grupo da fórmula -CO- que, via uma ligação no carbono de carbonila sublinhado, forma uma ligação amida com um grupo amino em W.
Ainda noutra forma de realização W é seleccionado do grupo constituído por a-Asp, β-Asp, a-Glu, e γ-Glu; X é -CO-; Y é -(CH2)m- onde m é um número inteiro na margem de 12 a 16 e Z é -COOH. A fracção de insulina - no presente texto também referida como a insulina progenitora - de um derivado da insulina de acordo com a invenção é um análogo da insulina. O análogo da insulina progenitora é a insulina humana des(B30). 6/66
Os exemplos dos derivados de insulina de acordo com a invenção são os seguintes compostos:
Insulina humana des(B30)
Insulina humana des(B30)
Insulina humana des(B30)
Insulina humana des(B30)
Insulina humana des(B30)
Insulina humana des(B30)
Insulina humana des(B30)
Insulina humana des(B30)
Insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (Να- (HOOC (CH2) 14CO) -γ-Glu) ; ΝεΒ29- (Να- (HOOC (CH2) 15CO) -γ-Glu) ; N®29- (N“- (HOOC (CH2) isCO) -γ-Glu) ; N®29- (n“- (HOOC (CH2) 13C0) -γ-Glu) ; N®29- (N“- (HOOC (CH2) 13CO) -β-Asp; N®29- (Na- (HOOC (CH2) 13C0) -a-Glu; N®29- (Na- (HOOC (CH2) i6CO) -γ-D-Glu) ; N®29- (Na- (HOOC (CH2) i4CO) -β-D-Asp) ; N®29- (N- (HOOC (CH2) 16C0) -β-D-Asp) .
Os derivados de insulina de acordo com a invenção podem ser providos na forma de compostos essencialmente livres de zinco ou na forma de complexos de zinco. Quando os complexos de zinco de um derivado da insulina de acordo com a invenção são providos, dois iões de Zn2+, três iões Zn2+ ou quatro iões Zn2+ podem ser ligados a cada hexâmero da insulina. As soluções de complexos de zinco dos derivados de insulina conterão misturas destas espécies.
Noutro aspecto a invenção, pode prover uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente 7/66 eficaz de um derivado da insulina de acordo com a invenção juntamente com um portador aceite na Indústria Farmacêutica para o tratamento da diabetes tipo 1 e da diabetes tipo 2 e outros estados que causem hiperglicemia nos pacientes necessitados desse tratamento. Um derivado da insulina de acordo com a invenção pode ser usado para a fabricação de uma composição farmacêutica para ser usada no tratamento da diabetes tipo 1, da diabetes tipo 2 e outras condições que causem a hiperglicemia.
Ainda noutro aspecto da invenção, nela é provido uma composição farmacêutica para tratar a diabetes tipo 1, a diabetes tipo 2 e outros estados que causem hiperglicemia num paciente com necessidade desse tratamento, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado insulina de acordo com a invenção misturado com uma insulina ou um análogo da insulina que tenha um inicio de acção rápida, juntamente com os portadores e aditivos aceites na Indústria Farmacêutica.
Numa forma de realização a invenção provê uma composição farmacêutica que é uma mistura do derivado da insulina de acordo com a invenção e um análogo da insulina de acção rápida seleccionado do grupo constituído por insulina humana Asp ; insulina humana Lys Pro ; e insulina humana LysB3GluB29.
Numa forma de realização a invenção provê uma composição farmacêutica que compreende insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(Na- (HOOC (CH2) 14CO) -γ-Glu) e insulina humana AspB28 juntamente com os portadores e aditivos aceites na Indústria Farmacêutica. 8/66 0 derivado da insulina de acordo com a invenção e o análogo da insulina de acção rápida podem ser misturados a um rácio de cerca de 90/10 %; de cerca de 7 0/30 % ou de cerca de 50/50 %.
Noutro aspecto a invenção provê um método para tratar a diabetes tipo 1, a diabetes tipo 2 e outros estados que causem hiperglicemia a um paciente necessitado de esse tratamento, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado da insulina de acordo com a invenção juntamente com um portador aceite na Indústria Farmacêutica e aditivos aceites na Indústria Farmacêutica.
Noutro aspecto a invenção provê um método para tratar a diabetes tipo 1, a diabetes tipo 2 e outros estados que causem hiperglicemia a um paciente necessitado de esse tratamento, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado da insulina de acordo com a invenção misturado com uma insulina ou um análogo da insulina que tem um início de acção rápida, juntamente com um portador aceite na Indústria Farmacêutica e aditivos aceites na Indústria Farmacêutica.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a derivados de insulina que têm uma hidrofobicidade global que é essencialmente similar ao da insulina humana.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a derivados de insulina que têm um índice hidrofóbico, k'rei, que está na margem de cerca de 2 a cerca de 200. 9/66
Noutro aspecto, os derivados de insulina da presente invenção têm um índice hidrofóbico, k'rei, que está na margem de cerca de 0.02 a cerca de 10, de cerca de 0.1 a cerca de 5; de cerca de 0.5 a cerca de 5; ou de cerca de 0.5 a cerca de 2.
De acordo com uma forma de realizar a presente invenção os derivados de insulina compreenderão uma cadeia lateral -W-X-Y-Z como o acima definido que tem pelo menos uma região hidrofílica e pelo menos uma hidrofóbica.
De acordo com uma outra forma de realizar a presente invenção, os derivados de insulina compreenderão uma cadeia lateral -W-X-Y-Z como o acima definido que tem pelo menos um grupo de ácido carboxílico livre e de acordo com outra forma de realização, a cadeia lateral terá pelo menos dois grupos de ácido carboxílico livres.
Noutra forma de realização, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um derivado da insulina de acordo com a invenção que é solúvel em valores de pH fisiológico.
Noutra forma de realização, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um derivado da insulina de acordo com a invenção que é solúvel em valores de pH no intervalo de cerca de 6.5 a cerca de 8.5.
Noutra forma de realização, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica com um perfil de acção prolongada que compreende um derivado da insulina de acordo com a invenção. 10/66
Noutra forma de realização, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que é uma solução que contém cerca de 120 nmol/ml a cerca de 2400 nmol/ml, de cerca de 400 nmol/ml a cerca de 2400 nmol/ml, de cerca de 400 nmol/ml a cerca de 1200 nmol/ml, de cerca de 600 nmol/ml a cerca de 2400 nmol/ml, ou de cerca de 600 nmol/ml a cerca de 1200 nmol/ml de um derivado da insulina de acordo com a invenção ou de uma mistura do derivado da insulina de acordo com a invenção com um análogo da insulina de acção rápida.
Dados de hidrofobicidade nos derivados de insulina de acordo com a invenção. A hidrofobicidade (índice hidrofóbico) dos derivados de insulina da invenção em relação à insulina humana k'rei foi medido numa coluna de HPLC LiChrosorb RP18 (5ym, 250x4 mm) por eluição isocrática a 40 °C usando misturas de A) 0.1 M de tampão de fosfato de sódio, pH 7.3, contendo 10 % acetonitrila, e B) 50 % acetonitrila em água como eluentes. A eluição foi monitorizada seguindo-se a absorção UV do eluído a 214 nm. 0 tempo de vazio, to, foi encontrado injectando-se 0.1 mM de nitrato de sódio. O tempo de retenção para a insulina humana, thumana/' foi ajustado a pelo menos 2to variando-se o rácio entre as soluções A e B. k' rei (tderivado-to) / (thUmana-to) · Os k' rei encontrados para os vários derivados de insulina de acordo com a invenção são dados no quadro 1.
Quadro 1
Derivado da insulina k rei Insulina humana des(B30) NEB29- (N-HOOC (CH2) 14CO-y-Glu) 0.87 Insulina humana des(B30) NEB29- (N-HOOC (CH2) 16CO-y-Glu) 1.15 Insulina humana des(B30) NEB29-(N-HOOC (CH2) 8CO-y-Glu) 0.45 Insulina humana des(B30) NEB29-(N-HOOC (CH2) 26CO-y-Glu-N-(y-Glu) 1.17 11/66
Insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N- (Asp-OC (CH2) i6CO) -γ-Glu) 0.70 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(Glu-OC (CH2) 14CO-y-Glu) 0.33 Insulina humana des(B30) Neb29-(N-(Glu-OC (CH2) i4CO-) 1.17 Insulina humana des(B30) NEB29-(N-HOOC (CH2) 16CO-a-Glu)-N-(β-Asp) 1.11 Insulina humana des(B30) NEB29-(N-(Gly-OC (CH2) 13CO-y-Glu) 0.58 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(Sar-OC (CH2) 13CO-y-Glu) 0.63 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 16CO-a-Glu)-N-(AspAsp) 1.07 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(Gly-OC (CH2) 14CO-y-Glu) 0.88 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 15CO-y-L-Glu) 1.13 Insulina humana des(B30) NEB29-(N-HOOC (CH2) 14CO-p-L-Asp) 0.69 Insulina humana des(B30) NEB29-(N-HOOC (CH2) 13CO-p-L-Glu) 0.54 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) 13CO-p-L-Asp) 0.47 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) i6CO-5-L-Aad) 0.84 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 16CO-y-D-Glu) 1.4 Insulina humana des(B30) neb29-(N-HOOC (CH2) 15CO-p-L-Asp) 1.09 Insulina humana des(B30) Neb29- (N-HOOC (CH2) i6CO-a-L-Asp) 1.49 Insulina humana des(B30) NEB29- (N-HOOC (CH2) 16CO-a-L-Glu) 1.51 Insulina humana des(B30) NEB29- (N- (HOOC (CH2) 14CO-s-L-LysCO-) 0.90 Insulina humana des(B30) N™29-(N-HOOC (CH2) 16CO-p-L-Asp) 1.54 Insulina humana des(B30) NEB29-(N-(Gly-OC (CH2) leCO-y-L-Glu) 1.57 Insulina humana des(B30) NEB29-[N-(HOOC (CH2) i6CO)-N-(carboximetil)-β-Ala] 1.13 Insulina humana des(B30) NEB29-[Na-(HOOC (CH2) n) NHCO (CH2) 3C0)-y-L-Glu] 0.42
Composições Farmacêuticas
As composições farmacêuticas que contêm um derivado da insulina de acordo com a presente invenção podem ser administradas parenteralmente a pacientes necessitados de esse tratamento. A administração parenteral pode ser executada por injecção subcutânea, intramuscular ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa do tipo caneta. Alternativamente, a administração parenteral pode ser executada por meio de uma bomba de infusão. Outras opções são a administração da insulina 12/66 nasal ou pulmonarmente, preferencialmente em composições, pós ou líquidos, especificamente desenhados para estes fins.
As composições injectáveis dos derivados de insulina da invenção podem ser preparados usando as técnicas convencionais da Indústria Farmacêutica que envolve a dissolução e a mistura dos ingredientes de forma apropriada para dar o produto final desejado. Assim, de acordo com um procedimento, um derivado da insulina de acordo com a invenção é dissolvido numa quantidade de água que é um tanto inferior ao volume final da composição a ser preparada. Um agente isotónico, um conservante e um tampão são adicionados como o necessário e o valor do pH da solução é ajustado - se necessário - usando um ácido, por exemplo, o ácido clorídrico, ou uma base, por exemplo, o hidróxido de sódio aquoso como o necessário. Finalmente, o volume da solução é ajustado com água para dar a concentração desejada dos ingredientes.
Noutra forma de realização da invenção o tampão é seleccionado do grupo constituído por acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato de sódio, fosfato de sódio, e tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas destes. Cada um destes tampões específicos constituem uma forma alternativa de realizar a invenção.
Noutra forma de realização da invenção a formulação ainda compreende um conservante aceite na Indústria Farmacêutica que pode ser selecionado do grupo constituído por fenol, o-13/66 cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propil, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butil, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol e tiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imidureia, cloroexidina, desidroacetato de sódio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloreto de benzetónio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-l,2-diol) ou misturas destes. Noutra forma de realização da invenção o conservante está presente numa concentração de 0.1 mg/ml a 20 mg/ml. Noutra forma de realização da invenção o conservante está presente numa concentração de 0.1 mg/ml a 5 mg/ml. Noutra forma de realização da invenção o conservante está presente numa concentração de 5 mg/ml a 10 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o conservante está presente numa concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um destes conservantes específicos constituem uma forma alternativa de realizar a invenção. O uso de um conservante nas composições farmacêuticas é bem conhecido dos técnicos especializados. Por conveniência, fazemos referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
Noutra forma de realização da invenção a formulação compreende também um agente isotónico que pode ser seleccionado do grupo constituído por um sal (por exemplo, cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), um alditol (por exemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietileno glicol (por exemplo, PEG400), ou misturas destes. Pode ser usado qualquer açúcar tal como mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glicanos solúveis em água, incluindo por exemplo frutose, glicose, manose, 14/66 sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pululana, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido hidroxietílico e carboximetilcelulose-Na. Numa forma de realização o aditivo de açúcar é a sacarose. 0 álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto C4-C8 com pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Numa forma de realização o aditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcares ou os álcoois de açúcar acima mencionados podem ser usados individualmente ou em combinação. Não há limite fixado para a quantidade usada, desde que o açúcar ou álcool de açúcar sejam solúveis na preparação liquida e não afectem adversamente os efeitos estabilizantes obtidos com o uso dos métodos da invenção. Numa forma de realização, a concentração de açúcar ou de álcool de açúcar é entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Noutra forma de realização da invenção o agente isotónico está presente numa concentração de 1 mg/ml a 50mg/ml. Noutra forma de realização da invenção o agente isotónico está presente numa concentração de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Noutra forma de realização da invenção o agente isotónico está presente numa concentração de 8 mg/ml a 24 mg/ml. Noutra forma de realização da invenção o agente isotónico está presente numa concentração de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um destes agentes isotónicos específicos constituem uma forma alternativa de realizar a invenção. O uso de um agente isotónico nas composições farmacêuticas é bem conhecido dos técnicos especializados. Por conveniência, fazemos referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
Os agentes isotónicos típicos são cloreto de sódio, manitol, dimetil sulfona e glicerol, e os conservantes 15/66 típicos são fenol, m-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo e álcool benzílico.
Exemplos de tampões apropriados são acetato de sódio, glicilglicina, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) e fosfato de sódio.
Uma composição para a administração nasal de um derivado da insulina de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, ser preparada como o descrito na Patente europeia No. 272097 (de Novo Nordisk A/S).
As composições que contêm as insulinas desta invenção podem ser usadas no tratamento dos estados que são sensíveis à insulina. Assim, estas podem ser usadas no tratamento da diabetes tipo 1, da diabetes tipo 2 e hiperglicemia por exemplo como às vezes observado em pessoas gravemente feridas e pessoas que foram submetidas a uma grande cirurgia. O nível de dosagem óptima para qualquer paciente dependerá de uma variedade de factores incluindo a eficácia do derivado da insulina específico empregue, a idade, o peso corporal, a actividade física, e a dieta do paciente, da possível combinação com outros medicamentos, e da severidade do estado a ser tratado. É recomendado que a dosagem diária do derivado da insulina desta invenção seja determinada para cada paciente individual pelos técnicos especializados de uma maneira similar às das composições de insulina conhecidas.
Quando adequado, os derivados de insulina desta invenção podem ser usados num mistura com outros tipos de insulina, por exemplo, análogos da insulina com um início de acção mais rápido. Exemplos destes análogos da insulina são descritos por exemplo, nos pedidos de patente europeia 16/66 tendo a publicação Nos. EP 214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordisk A/S) e EP 383472 (Eli Lilly & Co.). A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes que no entanto não devem ser considerados como uma limitação do âmbito da protecção. A invenção está resumida nos seguintes parágrafos: 1. Um derivado da insulina humana que é a insulina humana des(B30) que tem uma cadeia lateral ligada a um grupo ε-amino de um resíduo Lys presente na cadeia B da insulina humana des(B30), sendo a cadeia lateral da fórmula geral:
-W-X-Y-Z em que W é: • um resíduo de α-aminoácido com um grupo de ácido carboxílico na cadeia lateral cujo o aminoácido é seleccionado do grupo constituído por a-Asp, β-Asp, a-Glu, γ-Glu, a-hGlu e δ-hGlu e cujo resíduo forma, com um dos seus grupos carboxílicos, um grupo amino em conjunto com o grupo ε-amino de um resíduo Lys presente na cadeia B da insulina humana des(B30); X é: • -Ç0-; Y é: 17/66 • -(CH2)m onde m é um número inteiro na margem de 12 a 16; e Z é: • -COOH; e quaisquer complexos Zn2+ destes. 10. Um derivado da insulina de acordo com o parágrafo 1 seleccionado do grupo constituído por insulina humana des (B30) des (B30) des (B30) des (B30) des (B30) des (B30) Ν' EB 2 9 - (Na- (HOOC (CH2) 14CO) -γ-Glu) ; insulina humana gEB2 9 TEB2 9 N00""- (N“- (HOOC (CH2) 15CO) -γ-Glu) ; insulina NOD""- (N“_ (HOOC (CH2) i6CO) -γ-Glu) ; ΝεΒ29_ (n“- (HOOC (CH2) 13CO) -γ-Glu) ; N®29- (N«_ (H0Qc (ch2) 13CO) -P-Asp; ΝεΒ29_ (n“- (HOOC (CH2) 13CO) -a-Glu; humana insulina humana insulina humana insulina humana insulina humana insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (n“- (HOOC (CH2) i6CO) -γ-D-Glu) des(B30) ΝεΒ29-(Na-(HOOC (CH2) i4CO)-β-D-Asp) ; insulina humana des (B30) NEB29-(N-(HOOC(CH2)i6CO)-p-D-Asp) . 11. Um complexo de zinco de um derivado da insulina de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores em que cada cada hexâmero da insulina liga dois iões de zinco, três iões de zinco ou quatro iões de zinco. 12. Uma composição farmacêutica para tratar a diabetes num paciente com necessidade desse tratamento, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado de insulina de acordo com o parágrafo 1 juntamente com um portador aceite na Indústria Farmacêutica. 18/66 13. Uma composição farmacêutica para tratar a diabetes num paciente com necessidade desse tratamento, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado de insulina de acordo com o parágrafo 1 misturada com uma insulina ou um análogo da insulina que tenha um inicio de acção rápida, juntamente com um portador aceite na Indústria Farmacêutica. 14. Um método para tratar a diabetes a um paciente necessitado de esse tratamento, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado da insulina de acordo com o parágrafo 1 juntamente um portador aceite na Indústria Farmacêutica. 15. Um método para tratar a diabetes a um paciente necessitado de esse tratamento, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado da insulina de acordo com oparágrafo 1 misturado com uma insulina ou um análogo da insulina que tem um inicio de acção rápida, juntamente com um portador aceite na Indústria Farmacêutica.
DEFINIÇÕES
Por "análogo da insulina" como usado neste documento entende-se um polipeptídeo que tenha uma estrutura molecular que formalmente possa ser derivada da estrutura de uma insulina de origem natural, por exemplo a da insulina humana, com a delecção e/ou mudança de pelo menos um resíduo de aminoácido presente na insulina de origem natural e/ou adicionando pelo menos um resíduo de 19/66 aminoácido. Os resíduos de aminoácido adicionados e/ou mudados podem também ser resíduos de aminoácido codificáveis ou outros resíduos de origem natural ou resíduos de aminoácido puramente sintéticos. Exemplos de análogos da insulina são insulina humana des(B30; análogos da insulina humana.
Por "derivado da insulina" como é usado neste documento entende-se uma insulina de origem natural ou um análogo da insulina que foi quimicamente modificado, por exemplo, com a introdução de uma cadeia lateral numa ou mais posições da cadeia principal da insulina ou com a oxidação ou com a redução dos grupos dos resíduos de aminoácido na insulina ou com a conversão de um grupo carboxílico livre para um grupo éster ou com a acilação de um grupo amino livre ou um grupo hidróxi. A expressão "um aminoácido codificável" ou "um resíduo de aminoácido codificável" é usada para indicar um aminoácido ou um resíduo de aminoácido que pode ser codificado por um grupo de três letras ("codão") de nucleotídeos. hGlu é ácido homoglutámico. α-Asp é a forma L de -HNCH(C0-)CH2COOH. β-Asp é a forma L de -HNCH(COOH)CH2CO-. α -Glu é a forma L de -HNCH(C0-) CH2CH2COOH. γ-Glu é a "forma L de -HNCH (COOH) CH2CH2CO-. α-hGlu é a forma L de -HNCH(C0-)CH2CH2CH2COOH. δ-hGlu é a forma L de -HNCH(COOH)CH2CH2CH2CO-. β-Ala é -NH-CH2-CH2-COOH.
Sar é sarcosina (N-metilglicina). A expressão "um resíduo de aminoácido tendo um grupo de ácido carboxílico na cadeia lateral" designa resíduos de 20/66 aminoácido como Asp, Glu e hGlu. Os aminoácidos também podem estar na configuração L- ou D-. Se nada for especificado será entendido que o residuo de aminoácido está na configuração L. A expressão "um residuo de aminoácido tendo uma cadeia lateral neutra" designa resíduos de aminoácidos como Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Tyr, Asn e Gin.
Quando um derivado da insulina de acordo com a invenção é definido como "solúvel em valores de pH fisiológico" significa que o derivado da insulina pode ser usado para preparar composições de insulina injectáveis que são totalmente dissolvidas em valores de pH fisiológico. Esta solubilidade favorável pode ser devida às propriedades inerentes do derivado da insulina sozinho ou um resultado de uma interacção favorável entre o derivado da insulina e um ou mais ingredientes contidos no veiculo.
As seguintes abreviações foram usadas nas especificações e nos exemplos:
Aad: Ácido Alfa-amino-adípico (ácido homoglutámico)
Bzl = Bn: benzila DIEA: N,N-diisopropiletilamina DMF: N,N-dimetilformamida IDA: Ácido Iminodiacético
Sar: Sarcosina (N-metil-glicina) tBu: terc-butila TSTU: tetrafluoroborato de 0-(N-succinimidil)-1,1,3, 3- tetrametilurónio THF: Tetxaidrofurano
EtOAc: Acetato de etila 21/66 DIPEA: Diisopropiletilamina HOAt: l-Hidróxi-7-azabenzotriazol TEA: trietil amina
Su: succinimidil = 2,5-dioxo-pirrolidin-l-il TFA: Ácido trifluoracético DCM: diclorometano DMSO: dimetilsulfóxido TLC: cromatografia de camada fina RT: temperatura ambiente
EXEMPLOS EXEMPLO 1 Síntese da insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(Na-(HOOC (CH2) i4CO) - γ-Glu) 200 mg de insulina humana des(B30) foram dissolvidas em 10 ml de 50 mM de Na2C03 (pH 10,2) contidas num tubo que foi colocado num banho de água a 15 °C. O Metil hexadecandioil-Glu(OSu)-OMe (37.90 mg, preparado como o abaixo descrito), foi dissolvido em 10 ml de acetonitrila e subsequentemente adicionado à solução de insulina. A reacção foi interrompida após 30 min com a adição de 3.8 ml de 0.2 M etanolamina ajustada ao pH 9.0 com HC1 diluído. O rendimento da reacção foi de 37 % como determinado pelo RP-HPLC. O produto precipitou após a adição de 2.5 volumes de água e o ajustamento do pH para 5.5. O precipitado foi então dissolvido em 10 ml de água ao pH 8 e colocado em gelo. A esta solução foi adicionada 10 ml de 0.2 M de NaOH gelado para a saponificação e a mistura foi incubada durante 40 min com o arrefecimeto com gelo e então ajustada para o pH 5.5 para precipitar o produto. O precipitado foi isolado e dissolvido em 5 ml de tampão A (ver abaixo) e 22/66
diluído com 33 ml 42.5 % p/p de etanol aquoso dividido em três e submetido a cromatografia de troca de aniões empregando uma coluna de troca de aniões 6 ml Resource™ eluída com um sistema de tampões que consistia num tampão A: Tris 0.24 % p/p, NH4Ac 0.25 %, 42 % p/p de etanol a pH 7.5 e tampão B: Tris 0.24 % p/p, NH4Ac 1.25 %, 42 % p/p etanol, pH 7.5. A amostra foi eluída por um fluxo de 6 ml/min num gradiente de 0 a 100 % do tampão B durante 30 min. As fracções que continham o composto desejado foram identificadas por RP-HPLC. O rendimento do produto desejado foi de 15.3 mg (pureza: 72.9 %). O volume das fracções agrupadas que continham o composto desejado foi reduzido a 20 ml sob vácuo e esta solução foi então submetida a uma purificação por RP-HPLC empregando uma coluna de HPLC de fase reversa Nucleosil, C4 250/10 mm, 10 ym, 300A. O sistema de tampão consistiu de tampão A: 10 mM Tris, 15mM (NH4) 2S04, 10 % etanol, pH 7.3 e tampão B: 70 % vol/vol de etanol. 0 produto foi eluído com um gradiente de 10 % a 60 % do tampão B durante 120 min num fluxo de 2 ml/min. As fracções apropriadas foram agrupadas e o composto foi precipitado e liofilizado. O rendimento foi de 7.7 mg (pureza: 99.4 %). O peso molecular, encontrado pela espectroscopia de massa: 6097.2, calculado 6104.1. O peptídeo B-terminal que continha a cadeia lateral foi obtido após a digestão com protease de Staphylococcus aureus. O peso molecular, encontrado por espectroscopia de massa: 1413.1, calculado: 1413.5.
Preparação do metil hexadecandioil-Glu(OSu)-OMe 23/66 0 hexadecandioato de dimetila foi saponificado em MeOH usando 1.0 equivalente de NaOH, e o éster mono-metilico foi isolado na acidificação com HC1 pela recristalização do heptano. O hexadecandioato de mono-metila (275 mg, 0.91 mmoles) foi dissolvido em THF (3 ml) e tratado com tetrafluoroborato de succinimidiltetrametilurónio (331 mg, 1.1 mmol) e N,N-diisopropiletilamina (188, yL, 1.1 mmol), e a mistura foi agitada durante 20 horas. O solvente foi removido in vacuo, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila e lavado com 0.1 M HC1 (duas vezes) e água. A fase orgânica foi seca em MgS04, filtrada e evaporada in vacuo para dar 350 mg (96 %) de hexadecandioato de metilsuccinimidila. 1H -NMR(CDC13) : 3.66 (s , 3H) , 2.83 (s, 4H) , , 2.60 (t, 2H) , 2 . 30 (t, 2h) , 1.74 (p, 2H) , 1.62 (P/ 2H) , 1.40 (m, 2H) , 1. 35-1.22 (m, 18 H) . 0 hexadecandioato de metilsuccinimidila (240 mg, 0.58 mmoles) em dimetilformamida (5 ml) foi tratado com GluOMe (93 mg, 0.58 mmoles) e N, N-diisopropiletilamina (200 pL, 1.16 mmol). A mistura foi agitada durante 20 horas e depois evaporada in vacuo. O resíduo foi redissolvido em acetato de etila. Lavando com 0.1 M HC1 e água, seguido da secagem (MgSCh) e a evaporação in vacuo, deu 226 mg (88 %) de metil hexadecandioil-Glu-OMe. 1H-NMR: 6. 22 (d, 1H), 4.65 (m, 1H), 3.76 (s, 3H) , 3.66 (s 3H) , 2 .42 (t, 2H), 2.29 (m, 4H) , 2.22 (t, 2H) , 1.97 (m 2H), 1. 62 (m, 4H), 1.35-1.22 (m, 20 H). O metil hexadecandioil-Glu-OMe (200 mg, 0.45 mmoles) foi dissolvido em diclorometano (4 ml), arrefecido com um banho 24/66 de gelo e tratado com dicicloexilcarbodiimida (93 mg, 0.45 mmoles) e N-hidroxissuccinimida (52 mg, 0.45 mmoles). A mistura foi agitada durante 20 horas, filtrada e evaporada in vacuo, para dar 243 mg (100 %) do intermediário desej ado. 1H -NMR(CDC13) 6.34 (d, 1H) , 4 . 67 (m, 1H) , 3. 73 (s, 3H) , 3. 64 (s, 3H) , 2.81 (s, 4H) , 2 . 66 (m, 2H) , 2 , .27 (m, 4H) , 2 . 20 (t, 2H) , 1.89 (m, 1H) , 1 .70 (m, 1H) , 1 , .58 (m, 4H) , 1.29-1,20 (m, 20 H). EXEMPLO 2 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(Να-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu) 300 mg de insulina humana des(B30) foram aciladas, purificadas e isoladas como o descrito no exemplo 1, excepto que no presente exemplo o metil octadecandioil-Glu(OSu)-OMe (preparado como o abaixo descrito) foi usado como agente de acilação em vez de metil hexadecandioil-Glu(OSu)-OMe usado no exemplo 1. 25.5 mg do composto do titulo foram obtidos (pureza: 97.4 %) . Peso molecular, encontrado pela espectroscopia de massa: 6136.6, calculado: 6132. O ligando que continha o peptídeo B-terminal foi obtido depois da digestão com protease Staphylococcus aureus. Peso molecular, encontrado pela espectroscopia de massa: 1439.1, Calculado: 1442.5.
Preparação do metil octadecandioil-Glu(OSu)-OMe
Este composto foi preparado a partir octadecandioato de dimetila em analogia com o derivado de hexadecandioila descrito no exemplo 1. 25/66 1H-NMR (CDC13) : 6. 20 (d, 1H) , 4.70 (m, 1H) , 3.78 (s, 3H) 3.67 (s, 3H) , 2.84 (s, 4H) , 2.70 (m, 2H) , 2.30 (m, 4H) 2.22 (t, 2H) , 1.93 (m, 1H) , 1.70 (m, 1H) , 1.62 (m, 4H) 1.33-1.23 (m, 24 Η). EXEMPLO 3 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (Να-(HOOC (CH2) 16C0) -γ-Glu-N- (γ-Glu) )
De maneira similar como descrito no exemplo 1, 300 mg de insulina humana des(B30) foi acilada com metil octadecandioil-Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe. A purificação pela troca aniónica foi realizada como o acima descrito. No entanto, a eluição prolongada com 100 % de tampão B foi conduzida para eluir o produto desejado. As fracções gue continham o produto desejado foram identificadas por RP-HPLC e 47.5 mg foram obtidas a uma pureza de 55 %. O volume das fracções que continham o produto desejado foi reduzido in vacuo e a solução resultante foi submetida à purificação por RP-HPLC usando uma coluna de HPLC de fase reversa Júpiter, C4 250/10 mm, 10 ym, 300A de Phenomerex. O sistema de tampão consistiu de Tampão A: 0.1 % TFA, 10 % vol/vol de etanol e Tampão B: 80 % vol/vol de etanol. A amostra foi eluída por um gradiente de 40 % a 60 % de Tampão B a 40 °C durante 120 min com um fluxo de 2 ml/min. As fracções apropriadas foram agrupadas e liofilizadas e 31.1 mg do composto do título foram obtidos (pureza: 94 %).
Peso molecular do composto do título encontrado pela espectroscopia de massa: 6259.65, calculado: 6261.2. O peso molecular (pela espectroscopia de massa) da a cadeia lateral que continha o peptídeo B-terminal, obtido depois 2 6/66 da digestão com protease Staphylococcus aureus foi verificado ser 1569.88, calculado: 1569.88.
Preparação do metil octadecandioil-Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe 0 metil octadecandioil-Glu(OSu)-OMe (preparado como descrito no exemplo 2, 200 mg, 0.35 mmoles) em dimetilformamida (5 ml) foi tratado com GluOMe (62 mg, 0.39 mmoles) e N,N-diisopropiletilamina (90, pL, 53 mmoles), e a mistura foi agitada durante 20 horas. O solvente foi removido in vacuo, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila e lavado duas vezes com 0.2 M HC1, água e solução salina. A secagem em MgS04 e a evaporação deram metil octadecandioil-Glu(Glu-OMe)-OMe, 180 mg (83 %). O metil octadecandioil-Glu(Glu-OMe)-OMe (180 mg, 0.29 mmoles) foi dissolvido em THF (9 ml) e tratado com tetrafluoroborato de succinimidiltetrametilurónio (106 mg, 0.35 mmoles) e N,N-diisopropiletilamina (60 pL, 0.35 mmoles). A mistura foi agitada durante a noite, evaporada, redissolvida em acetato de etila e lavada com 2x 0.1 M HC1 e água. A secagem em MgS04 e a evaporação deram 190 mg (93 %) do intermediário desejado. 1H-NMR (CDC13) δ: 6. 73 (d, 1H), , 6.43 (d, 1H) , 4.69 (m, 1H) 4.56 (m, 1H) , 3. 77 (s, r 3H) , 3.74 (s, 3H) , 3.66 (s, 3H) 2.85 (s, 4H), 2. 72 (m / 2H) , 2.41-2.12 (m, 8H) , 2.95 (m 2H) , 1.72-1.56 (m / 6H) , 1.35-1 .22 (m, 22 H) . EXEMPLO 4 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29 (Na-(HOOC (CH2) i4CO)-γ-L-Glu) 27/66 A insulina humana des(B30) (500 mg, 0.088 mmoles) foi dissolvida em 100 mM de Na2C03 (5 ml, pH 10.2) à temperatura ambiente. 0 terc-butil hexadecandioil-Glu(OSu)-OtBu (66 mg, 0.105 mmoles, preparado como o abaixo descrito), foi dissolvido em acetonitrila (5 ml) e subsequentemente adicionado à solução de insulina. Depois de 30 min, 0.2 M metilamina (0.5 ml) foi adicionada. 0 pH foi ajustado com HC1 até 5.5, e o precipitado isoeléctrico foi recolhido pela centrifugação e secagem in vacuo para dar 525 mg. 0 rendimento de acoplamento foi de 78 % (RP- HPLC, coluna C4; Tampão A: 10 % de MeCN em 0.1 % de TFA- água, Tampão B: 8 0 % de MeCN em 0.1 % de TFA-água; gradiente 20 % a 90 % B em 16 minutos). O produto protegido foi dissolvido em TFA (10 ml), deixado 30 min, e evaporada in vacuo. O produto bruto foi dissolvido em água e liofilizado (610 mg). 0454 foi purificado pela RP-HPLC na coluna C4, tampão A: 20 % de EtOH + 0.1 % TFA, tampão B: 80 % EtOH + 0.1 % TFA; gradiente 15 a 60 % B, seguido pela HPLC na coluna C4, tampão A: 10 mM Tris + 15 mM de sulfato de amónio em 20 % de EtOH, pH 7.3, tampão B: 80 % de EtOH, gradiente 15 a 60 % B. As fracções recolhidas foram dessalinizadas em Sep-Pak com 70 % de acetonitrila + 0.1 % de TFA, neutralizadas pela adição de amónia e liofilizadas. O rendimento não optimizado foi de 64 mg, 12 %. A pureza como avaliada pela HPLC foi de 99.2 %. LCMS 6102.9, C274H411N65O81S6 requer 6104.1. A cadeia lateral que contém o peptideo B-terminal (RGFFYTPK (Νε- (Να- (HOOC (CH2) 14CO) -γ-L-Glu) foi obtido depois da digestão com protease Staphylococcus aureus. MALDI-MS: 1413.1, calculado: 1412.7.
Preparação do terc-butil hexadecandioil-L-Glu(OSu)-OtBu O ácido hexadecadióico (40.0 g, 140 mmoles) foi colocado em suspensão em tolueno (250 ml) e a mistura foi aquecida ao 28/66 refluxo. N,IT-dimetilformamida di-terc-butil acetal (7 6.3 g, 375 mmoles) foi adicionado gota a gota durante 4 horas. A mistura foi submetida a refluxo durante noite" 0 solvente foi removido in vacuo a 50 °C, e o material bruto foi colocado em suspensão em DCM/AcOEt (500 ml, 1:1) e agitada durante 15 min. Os sólidos foram recolhidos por filtração e triturados com DCM (200 ml) . O filtrado foi evaporado in vacuo para dar o hexadecandioato de mono-terc-butila bruto, 30 gramas. Este material foi colocado em suspensão em DCM (50 ml), arrefecido com gelo durante 10 min, e filtrado. O solvente foi removido in vacuo para deixar 25 gramas de hexadecandioato de mono-terc-butila bruto, que foi recristalizado do heptano (200 ml) para dar o hexadecandioato de mono-terc-butila, 15.9 g (33 %) . Alternativamente à recristalização, o mono-éster pode ser purificado pela cromatografia em sílica em AcOEt/heptano. 1H-NMR (CDC13) δ: 2.35 (t, 2H) , 2.20 (t, 2H) , 1.65-1.55 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.34-1.20 (m, 20 H) . 0 éster mono terc-butílico (2 g, 5.8 mmoles) foi dissolvido em THF (20 ml) e tratado com TSTU (2.1 g, 7.0 mmoles) e DIEA (1.2 ml, 7.0 mmoles) e agitados durante a noite. A mistura foi filtrada, e o filtrado foi evaporado in vacuo. O resíduo foi dissolvido em AcOEt e lavado duas vezes com 0.1 M HC1 frio e água. A secagem em MgS04 e a evaporação in vacuo deu o hexadecandioato de succinimidil terc-butila, 2.02 g (79 %) . 1H-NMR (CDCI3 )δ: 2.84 (s, 4H), 2.60 (t, 2H) , 2.20 (t, 2H) 1.74 (p, 2H) , 1.56 (m, 2H) , 1.44 (s, 9H) , 1.40 (m, 2H) 1.30-1.20 (m, 18H)). 29/66 0 hexadecandioato de succinimidil terc-butila (1 g, 2.27 mmoles) foi dissolvido em DMF (15 ml) e tratado com L-Glu-OtBu (0.51 g, 2.5 mmoles) e DIEA (0.58 ml, 3.41 mmoles) e a mistura foi agitada durante a noite. O solvente foi evaporado in vacuo, e o produto bruto foi dissolvido em AcOEt, e lavado duas vezes com 0.2 M HC1, com água e solução salina. A secagem em MgS04 e a evaporação in vacuo deu terc-butil hexadecandioil-L-Glu-OtBu, 1.2 g (100 %) . 1H-NMR (CDC13) δ: 6.25 (d, 1H) , 4.53 (m, 1H) , 2.42 (m, 2H) , 2.21 (m, 4H), 1.92 (m, 1H) , 1.58 (m, 4H) , 1.47 (s, 9H) , 1.43 (s, 9H), 1.43-1.22 (m, 18H). O terc-butil hexadecandioil-L-Glu-OtBu (1.2 g, 2.27 mmoles) foi dissolvido em THF (15 ml) e tratado com TSTU (0.82 g, 2.72 mmoles) e DIEA (0.47 ml, 2.72 mmoles) e agitado durante a noite. A mistura foi filtrada, e o filtrado foi evaporado in vacuo. O resíduo foi dissolvido em AcOEt e lavado duas vezes com 0.1 M HC1 frio e água. A secagem em MgSOí e a evaporação in vacuo deu o terc-butil hexadecandioil-L-Glu-(OSu)-OtBu, 1.30 g (92 %) . -NMR (CDCI3) δ : 6.17 (d, 1H) , 4.60 (m, 1H) , 2.84 (s, 4H) 2 . 72 (m, 1H) , 2.64 (m, 1H) , 2.32 (m, 1H) , 2.20 (m, 4H) 2 . 08 (m, 1H) , 1.6 (m, 4H) , 1.47 (s, 9H) , 1.43 (s, 9H) 1.33-1.21 (m, 20 H). EXEMPLO 5 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (Να-(HOOC (CH2) ieCO) - γ-L-Glu) A insulina desB30 (50 mg, 9 ymol) foi dissolvida em 0.1 M Na2C03 aquoso (0.65 ml), pH 10.5. Octadecandioil-L-Glu(OSu) 30/66 (50.1 mg, 9.9 ymoles, preparado como o abaixo descrito) foi dissolvido em acetonitrila (0.65 ml) e adicionado à solução de insulina; o pH foi 10.3. Depois de 30 min, metilamina 0.2 M (50 μΐ) foi adicionada. O pH foi ajustado por HC1 a 5.5, e o precipitado isoeléctrico foi recolhido por centrifugação e seco in vacuo. O HPLC mostrou o rendimento de acoplamento bruto era de 52 % (não optimizado); coluna C4; Tampão A: 10 % MeCN em 0.1 % TFA - água, Tampão B: 80 % de MeCN em 0.1 % TFA-água; gradiente 20 % a 90 % B em 16 minutos). LCMS 6133.2, C276H415N65O81S6 requer 6132.2.
Preparação do octadecandioil-L-Glu( OSu) 0 ácido octadecanodióico (2.5 g, 8.0 mmoles) foi colocado em suspensão em DCM (60 ml), tratado com trietilamina (1.16 ml, 8.3 mmoles) e arrefecido com gelo. Cloroformiato de benzila (1.14 ml) foi adicionado gota a gota sob nitrogénio e a mistura foi agitada durante 10 min, quando DMAP (0.097 g, 0.80 mmoles) foi adicionado. Depois de agitar durante 20 min a 4 °C (TLC, 1:1 AcOEt:heptano), a reacção foi evaporada até ficar seca. O material bruto (3.9 g) foi dissolvido em DCM (60 ml), tratado com sílica (15 g) e evaporado. A sílica foi carregada numa coluna de sílica (175 g) , e o produto foi eluído com AcOEt/heptano 1:7 a 1:1. Evaporação das fracções desejadas deu octadecandioato de mono-benzila (1.15 g, 36 %) . 1H-NMR (CDCI3) δ: 7.35 (m, 5H) , 5.11 (s, 2H) , 2.35 (t, 4H) , 1.63 (t, 4H), 1.30-1.22 (m, 24). 0 octadecandioato de mono-benzila foi dissolvido em DMF (3.5 ml) e THF (7 ml) e arrefecido com banho de gelo. DIEA (0.103 ml) e TSTU foram adicionados e a mistura foi agitada 1 hora em banho de gelo e à temperatura ambiente durante a 31/66 noite. 0 solvente foi evaporado in vacuo e o resíduo foi dissolvido em AcOEt e lavado duas vezes com 0.2 N HC1, NaHC03 saturado, secado, filtrado e evaporado até ficar seco para dar o mono-benzil octadecandioato de succinimidila (0.25 g, 100 %). 1H-NMR (CDCI3) δ: 7.35 (m, 5H) , 5.11 (s, 2H) , 2.83 (s, 4H), 2.60 (t, 2H), 2.35 (t, 2H), 1.80-1.60 (m, 4H) , 1.40-1.20 (m, 24) . O mono-benzil octadecandioato de succinimidila (95 mg, 0.19 mmoles) foi dissolvido em DMF (1.5 ml) e tratado com L-Glu-OBzl (49 mg, 0.21 mmoles) e DIEA (50 1, 0.28 mmoles) e a mistura foi agitada durante a noite. O solvente foi evaporado in vacuo, e o produto bruto foi dissolvido em
AcOEt, e lavado duas vezes com 0.2 M HC1, com água e solução salina. A secagem em MgSO^ e a evaporação in vacuo deu BzlO-octadecandioil-L-Glu-OBzl, 114 mg (97 %). 1H-NMR (CDC13) δ: 7.35 (m, 5H) , 6.22 (d, 2H) , 5.17 (s, 2H) , 5.11 (s, 2H) , 4.71 (m, 1H) , 2.37 (m, 4H) , 2.22 (m, 3H) , 1.98 (m, 1H), 1.63 (m, 4H), 1.31-1.20 (m, 24H). O BzlO-octadecandioil-L-Glu-OBzl (110 g, 0.18 mmoles) foi dissolvido em THF (2 ml) e tratado com TSTU (64 mg, 0.21 mmoles) e DIEA (36 μΐ, 0.21 mmoles) e agitada durante a noite. A mistura foi filtrada, e o filtrado foi evaporado in vacuo. 0 resíduo foi dissolvido em AcOEt e lavado duas vezes com 0.1 M HC1 frio e água. A secagem em MgSOí e evaporação in vacuo deu BzlO-octadecandioil-L-Glu(OSu)-OBz1, 119 g (94 %). 1H-NMR (CDCI3) 5:7.36 (m, 5H) , 6.40 (d, 2H) , 5.19 (s, 2H) 5.11 (s, 2H) , 4.75 (m, 1H) , 2.82 (s, 4H) , 2.68 (m, 1H) 32/66 2.59 (m, 1H) , 2.35 (t, 2H) , 2.19 (t, 2H) , 1.62 (m, 4H) , 1.32-1.21 (m, 24H). 0 BzlO-octadecandioil-L-Glu(OSu)-OBzl (59 mg, 0.082 mmoles) foi dissolvido em acetona/0.1 % TFA (1 ml). Pd/C foi adicionado (20 mg) . O frasco foi evacuado e enchido com N2 diversas vezes, e um balão cheio com H2 foi conectado. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas, e depois filtrada através de celite. A precipitação do heptano e a evaporação de solventes residuais deram octadecandioil-L-Glu(OSu) (27 mg, 61 %). 1H-NMR (CDCI3) δ: 6.32 (d, 1H) , 4.70 (m, 1H) , 3.70 (m, 1H) , 3 .06 (m, 2H) , 2.88 (s, 4H) , 2.62 (m, 2H) , 2.35 (m, 2H) , 2 .24 (m, 1H) , 1.74 (m, 1H) , 1.64 (m, 2H), 1 .50-1.20 (m, 26 H) . EXEMPLO 6 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(L-Asp- OC (CH2) i6CO) -γ-L-Glu)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de L-Asp(OtBu)-OtBu com octadecandioato de succinirnidila seguido pela activação com TSTU, a reacção com L-GluOtBu, activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e a desprotecção por TFA. LCMS 6247.5, calculado 6247.3. EXEMPLO 7 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N- (L-Glu- OC (CH2) i4CO-y-L-Glu) 33/66
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de L-Glu(OtBu)-OtBu com hexadecandioato de succinirnidila seguido pela activação com TSTU, reacção com L-GluOtBu, activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6261.3, calculado 6261.3. EXEMPLO 8
Sintese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(L-Glu-OC (CH2) 14CO-)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de L-Glu(OtBu)-OtBu com hexadecandioato de succinirnidila seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6130.8, calculado 6132.2. EXEMPLO 9 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) i6CO-a-L-Glu)-N-(β-L-Asp)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de octadecandioato de terc-butilsuccinimidila com L-Glu(OtBu) seguido pela activação com TSTU, reacção com L-AspOtBu, activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6246.9, calculado 6247.3. EXEMPLO 10 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) isCO-γ-L-Glu) 34/66
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de heptadecandioato de terc-butil succinirnidila (A. C. Cope, U. Axen, E. P. Burrows, J. Weinlich, J. Am. Chem Soc. 1966, 88, 4228) com L-GluOtBu seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6118.3, calculado 6118.1. EXEMPLO 11 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(Gly-OC (CH2) isCO-y-L-Glu)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de L-GlyOtBu com pentadecandioato de succinirnidila seguido pela activação com TSTU, reacção com LGluOtBu, activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6147.5, calculado 6147.1. EXEMPLO 12 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(L-Sar-OC (CH2) isCO-y-L-Glu)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de L-Sar-OtBu com octadecandioato de succinirnidila, seguido pela activação com TSTU, reacção com L-GluOtBu, activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6161.0, calculado 6161.1. EXEMPLO 13 35/66 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) i6CO-a-L-Asp)-N-(β-L-Asp)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de octadecandioato de terc-butil succinimidila com L-Asp(OtBu) seguido pela activação com TSTU, reacção com L-AspOtBu, activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6233.8, calculado 6233.2. EXEMPLO 14 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N- (Gly-OC (CH2) i4CO-y-L-Glu)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de L-GlyOtBu com hexadecandioato de succinimidila seguido pela activação com TSTU, reacção com L-GluOtBu, activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6160.7, calculado 6161.1. EXEMPLO 15 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) ι400-β-L-Asp)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de hexadecandioato de terc-butil succinimidila com L-AspOtBu seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6089.8, calculado 6089.8. 3 6/66 EXEMPLO 16 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) xgCO-β-L-Asp)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de octadecandioato de terc-butil succinimidila com L-AspOtBu seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6117.8, calculado 6118.1. EXEMPLO 17 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(Gly-OC (CH2) leCO-y-L-Glu)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de L-GlyOtBu com octadecandioato de succinimidila seguido pela activação com TSTU, reacção com L-GluOtBu, activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6189.2, calculado 6189.2. EXEMPLO 18 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N- (HOOC (CH2) 14CO-ε-L-LysCO-)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de hexadecandioato de terc-butil succinimidila com L-Lys(Z)-OtBu, seguido pela hidrogenação em Pd/C e a activação in situ pelo cloroformato de 4-nitrofenilo, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6189.2, calculado 6189.2. 37/66 EXEMPLO 19 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) i6CO-a-L-Glu)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de octadecandioato de terc-butil succinimidila com L-Glu (OtBu) seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6132.1, calculado 6132.2. EXEMPLO 20 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) ιεΟΟ-α-L-Asp)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via reacção de octadecandioato de terc-butil succinimidila com L-Asp (OtBu) seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6117.8, calculado 6118.1. EXEMPLO 21 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) ι500-β-L-Asp)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de heptadecandioato de terc-butil succinimidila com L-AspOtBu seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6104.2, calculado 6104.1. 38/66 EXEMPLO 22 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (0¾) ιβΟΟ-γ-D-Glu)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de octadecandioato de terc-butil succinimidila com D-GluOtBu seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6132.4, calculado 6132.2. EXEMPLO 23 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) i6C0-õ-L-Aad)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de octadecandioato de terc-butil succinimidila com L-AadOtBu (preparado a partir da L-Aad(OMe) comercial pela terc-butilação com AcOtBu/BF3.0Et2 e saponificação do éster metílico), seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6116.9, calculado 6118.1. EXEMPLO 24 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) i3C0-p-L-Asp)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de pentadecandioato de terc-butilsuccinimidila com L-AspOtBu seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6074.7, calculado 6076.1. 39/66 EXEMPLO 25 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) ΐ3<00-β-L-Glu)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de pentadecandioato de terc-butil succinimidila com L-GluOtBu seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. MALDI-MS 6080.6, calculado 6076.1. EXEMPLO 26 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) ι^Ο-β-D-Asp)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de hexadecandioato de terc-butil succinimidila com D-AspOtBu seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6089.1, calculado 6090.1. EXEMPLO 27 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) ΐδΟΟ-β-D-Asp)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de octadecandioato de terc-butil succinimidila com D-AspOtBu seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6117.1, calculado 6118.1. 40/66 EXEMPLO 28 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 14CO-IDA)
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 4, via a reacção de hexadecandioato de terc-butil 3,4-diidro-4-oxo-l,2,3-benzotriazin-3-il com ácido iminodiacético seguido pela activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por TFA. LCMS 6089.1, calculado 6090.1. EXEMPLO 29 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- [N- (HOOC (CH2) i6CO) -N- (carboximetil)-β-Ala] A insulina humana DesB30 Al N, BlN-diBoc (Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr B; Larsen UD; Ribel U; Markussen J Biochemical Journal, 1995, 312, 725-731) (186 mg, 0.031 mmoles) foi dissolvida em DMSO (1.8 ml). Uma solução de terc-butil octadecandioil-N-(terc- butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OSu (27 mg, 0.04 mmoles) em THF (1.8 ml) e trietilamina (0.045 ml, 0.31 mmoles) foi adicionada (o pH era 10) . Depois de agitar lentamente à temperatura ambiente durante 45 min a reacção foi extinta com 0.2 M metilamina em THF (0.20 ml) . Água (5 ml) foi adicionada e o pH foi ajustado a 5.5 com 1 N de HC1. O precipitado isoeléctrico foi recolhido por centrifugação e liofilizado para dar 150 mg. O rendimento do acoplamento foi 74 % (LCMS m/z: 2148.9 [ (M+3) /3] , rt 5.04). O produto protegido foi dissolvido em TFA (2.5 ml) e deixado durante 1 hora e evaporado in vacuo. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC em coluna C4, tampão A: 0.1 % TFA, tampão B: 41/66
MeCN + 0.1 % TFA; gradiente 10 a 70 % B. As fracções recolhidas foram liofilizadas. O rendimento foi 75 mg, 52 %. A pureza como avaliada por HPLC foi de 97.2%. MALDI-MS: 6132.1, calculado: 6132.2.
Preparação_do_terc-butil_octadecandioil-N- (terc- butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OSu O ácido octadecanodióico (5.64 g, 17.9 mmoles) foi dissolvido em tolueno (80 ml) a 115 °C. N,N- dimetilformamida di-terc-butilacetal (12.9 ml, 53.8 mmoles) foi adicionado gota a gota durante 1.5 h. Depois de submeter a refluxo durante 3 h mais N,N-dimetilformamida di-terc-butilacetal (2.15 ml) foi adicionado durante 20 min. O refluxo foi continuado durante a noite e mais N,N-dimetilformamida di-terc-butilacetal (2.15 ml) foi adicionado durante 20 min. Depois de agitar durante mais 2 h. a mistura da reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente. Água e DCM foi adicionado. O diácido foi removido por filtração. O filtrado foi concentrado em sílica gel (40 g) e purificado numa coluna sílica gel de 1.5 litros usando DCM/MeOH 14:1. O éster mono-terc-butílico do ácido octadecanodióico foi isolado a um rendimento de 53 % (3.52 g) · LC-MS: 393 (M+Na), rt 6.40. 1H-NMR (DMSO-de) : δ 1.22 (br s, 24H), 1.38 (s, 9H),1.47 (m, 4H), 2.14 (t, 2H), 2.18 ppm (t, 2H). A uma solução de octadecandioato de mono-terc-butila (1.00 g, 2.7 mmoles) em THF seco (8 ml), foi adicionado DIPEA (0.555 ml, 3.2 mmoles) seguido por TSTU (1.00 g, 3.2 42/66 mmoles). A mistura da reacção foi agitada sob nitrogénio durante 18 horas. 0 solvente foi evaporado. AcOEt foi adicionado ao resíduo e a suspensão resultante foi filtrada. 0 filtrado foi lavado com 0.1 M HC1 frio (2x) e água, secado e concentrado para dar terc-butil octadecandioato de succinimidila como um sólido branco. 1H-NMR (CDCI3) : δ 1.25 (m s , 20H), 1.39 (m, 2H) , 1.44 (s 9H), 1. .58 (m, 4H), 1.74 (p, 2H), 2. 2 (t, 2H) , 2.60 (t, 2H) 2.85 ppm (m, 2H). A uma suspensão de H-Gly-OtBu (1.00 g, 6.0 mmoles) em DMF seco (6 ml) foi adicionada trietilamina (0.835 ml, 6.0 mmoles). Uma precipitação de cloridreto de trietilamina foi observada. Uma solução de acrilato de benzila (0.910 ml, 6.0 mmoles) em DMF (6 ml) foi adicionada. A suspensão resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 2 dias. 0 precipitado foi removido pela filtração e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi dissolvido e AcOEt e lavado com NaHC03 saturado. A camada orgânica foi seca (MgS04) , filtrada e concentrada para dar um óleo transparente, que foi purificado por cromatografia flash usando AcOEt/heptano 1:3 e 1:1 como eluente. N-terc-butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OBn foi isolado a um rendimento de 29 % (0.505 g). 1H-NMR (CDC13) δ: ppm 1.43 (s, 9H) , 2.55 (t, 2H) , 2.92 (t, 2H), 3.30 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 7.65 (m, 5H). O terc-butil octadecandioato de succinimidila (0.15 g, 0.32 mmoles) e o N-(terc-butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OBn (0.10 g, 0.32 mmoles) foram dissolvidos em DMF seco (2.5 ml) e DIEA (0.070 ml, 0.38 mmoles) foi adicionado. Depois de agitar sob nitrogénio durante 30 min HOAt (0.045 g, 0.32 mmoles) 43/66 foi adicionado e a mistura tornou-se amarela. A agitação foi continuada à temperatura ambiente sob nitrogénio por razões de conveniência durante 13 dias. A mistura da reacção foi concentrada. 0 resíduo dissolvido em AcOEt, lavado com 0.1 N HC1 (2x) e água, seco (Na2S04) e concentrado para dar terc-butiloctadecandioil-N-(terc-butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OBn como um óleo branco. 205 mg, rendimento 99 %. 1H-NMR (CDC13) δ: ppm 1.25 (m, 26H), 1.45 (s, 9H) , 1.50 (s, 9H), 1.6 (m, 4H), 2.20 (t, 2H), 2.40 (t, 2H), 2.75 (q, 2H), 3.62 (t, 2H) , 3.97 (s, 2H), 5.20 (s, 2H); 7.35 (m, 5H) O terc-butiloctadecandioil-N-(terc-butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OBn (200 mg, 0.31 mmoles) foi dissolvido em EtOAc (10 ml) e THF (5 ml). 10 % Pd/C foi adicionado e a mistura foi hidrogenada a 1 atm durante 16 horas. A mistura da reacção foi filtrada e concentrada para dar terc-butiloctadecandioil-N- (terc-butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OH como um óleo transparente. Rendimento 180 mg, 100 %. 1H-NMR (CDCI3) δ: ppm 1.25 (m, 26H) , 1.45 (s, 9H) , 1.50 (s, 9H), 1.6 (m, 4H), 2.20 (t, 2H), 2.40 (t, 2H), 2.70 (m, 2H), 3.65 (m, 2H), 4.05 (s, 2H). O terc-butiloctadecandioil-N-(terc-butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OH (0.110 g, 0.2 mmoles) foi dissolvido em THF seco (2 ml). DIEA (0.045 ml, 0.24 mmoles) e TSTU (0.075 g, 0.24 mmoles) foi adicionado. A mistura foi agitada sob nitrogénio durante 18 h. A mistura da reacção foi filtrada. AcOEt foi adicionado ao filtrado e lavado com 0.2 M HC1 (2x), solução salina (lx), secado (Na2S04) e concentrado para dar terc-butiloctadecandioil-N-(terc-44/66 butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OSu como um xarope transparente. Rendimento 124 mg, 96 %. 1H-NMR (CDC13) δ: ppm 1.25 (m, 26H), 1.40 (s, 9H) , 1.57 (s, 9H) , 1.6 (m, 4H), 2.40 (m, 4H) , 2.58 (br s, 4H) , 3.0 (t, 2H), 3.7 (t, 2H), 4.103 (s, 2H). EXEMPLO 30 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-[N-(HOOC (CH2) 16CO) -N- (2-carboxietil)-Gly] A insulina humana DesB30 Al N, BlN-diBoc (Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr B; Larsen UD; Ribel U; Markussen J Biochemical Journal, 1995, 312, 725 a 731) (120 mg, 0.020 mmoles) foi dissolvida em DMSO (1.2 ml). Uma solução de terc-butiloctadecandioil-N-(2-(terc- butoxicarbonil)etil)-Gly-OSu (16 mg, 0.025 mmol) em THF (1.2 ml) e trietilamina (0.033 ml, 0.24 mmoles) foi adicionada (o pH era 10) . Depois de agitar lentamente à temperatura ambiente durante 3 horas e 20 min foi adicionada água (4 ml) e o pH foi ajustado a 5.5 com 1 N HC1. O precipitado isoeléctrico foi recolhido por centrifugação, lavado com água e isolado por centrifugação. O produto foi liofilizado. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC em coluna C18, tampão A: 0.1 % TFA, tampão B: MeCN + 0.1 % TFA; gradiente 20 a 90 % B. As fracções recolhidas foram liofilizadas. 0 rendimento de acoplamento não optimizado foi de 15 mg, 11 % (MALDI-MS 6441, calculado: 6444.5). O produto protegido foi dissolvido em TFA (1 ml) e deixado durante 1 hora e evaporado in vacuo. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC em coluna C4, tampão A: 0.1 % TFA, tampão B: MeCN + 0.1 % TFA; gradiente 10 a 80 % B, e por RP-HPLC em coluna C4, tampão A: 20 % 45/66
EtOH + 0.1 % TFA, tampão B: 8 0 % EtOH + 0.1 % TFA; gradiente 15 a 60 % B, seguido por HPLC em coluna C4, tampão A: 10 mM Tris + 15 mM sulfato de amónia em 20 % de EtOH, pH 7.3, tampão B: 80 % EtOH, gradiente 15 a 60 % B. As fracções recolhidas foram dessalgadas em Sep-Pak com 70 % de acetronilo + 0.1 % de TFA, neutralizadas pela adição de amónia e liofilizadas. O rendimento não optimizado foi de 1.8 mg, 13 %. A pureza como avaliada por HPLC foi de 96.4 %. MALDI: 6132.1, calculado: 6132.2.
Preparação_do_terc-butiloctadecandioil-N- (2- (terc- butoxicarbonil)etil)-Gly- OSu H-Gly-OBn, HC1 (3.03 g, 15 mmoles) foi dissolvido em DMF seco (15 ml) e arrefecido num banho de gelo. TEA (2, 10, 15 mmoles) foi adicionado sob precipitação de cloridreto de TEA. A suspensão foi agitada durante 5 min antes que o acrilato de t-butila (2.20 ml, 15 mmoles) fosse adicionado. O banho foi deixado arrefecer lentamente até atingir a temperatura ambiente e a agitação foi continuada sob nitrogénio durante 2 dias. A mistura da reacção foi filtrada e o filtrado foi concentrado. O resíduo, que continha ainda DMF, foi dissolvido em AcOEt e lavado com NaHC03 saturado aquoso (2x) e água (1 x). A camada orgânica foi filtrada antes da secagem (Na2S04) e a concentração para dar um óleo amarelo. A purificação pela cromatografia flash ou HPLC preparativa deu N-(2-(terc-butoxicarbonil)etil)-Gly-OBn como um óleo transparente (0.739 g, 17 %). 4 6/66 2.61 (m, 2H) 2.82 1H-NMR (CDC13) δ: ppm 1.46 (s, 9H) 2.50 -- 2.99 (m, 2H) 3.31 (s, 2H) 5.14 (s, 2H) 7.29 - 7.43 (m, 5 H) . N- (2-(terc-butoxicarbonil)etil)-Gly-OBn (0.030 g, 0.1 mmol) e succinimidil terc-butiloctadecanodioato (descrito no exemplo 29, 0.050 mg, 0.1 mmol) foram colocados em suspensão em DMF seco (1 ml) . HOAt (0.01-4 g, 0.1 mmol) e DIEA (0.21 ml, 1.2 mmol) foram adicionados. A mistura da reacção amarela foi agitada sob nitrogénio durante 42 horas. A mistura da reacção foi concentrada. O resíduo foi redissolvido em AcOEt e lavado com 0.1 N HC1 x (2x) , água (lx), seco (Na2S04) e concentrado para dar terc- butiloctadecandioil-N-(2-(terc-butoxicarbonil)etil)-Gly-OBn a um rendimento de 85 % (55 mg). 1H-NMR (CDCI3) δ: ppm 1.3 (m, 26H) 1.38 (s, 9H), 1.46 (s, 9 H) , 1.6 (m, 4H) , 2.2 (m, 2H) , 2.35 (m, 2 H), 2.65 (m, 2H), 2.85 (s, 2 H) 3.65 (m, 2H), 5.15 (s, 2 H) 7.35 (m, 5 H).
Terc-butiloctadecandioil-N-(2-(terc-butoxicarbonil)etil)-Gly-OBn (0.054 g, 0.08 mmol) foi dissolvido em THF (2 ml). 10 % de paládio em carvão vegetal foi adicionado e a mistura foi hidrogenada a 1 atm e à temperatura ambiente durante todo o fim de semana. A mistura da reacção seca foi dissolvida em AcOEt e filtrada 3 vezes para remover o carbono. O filtrado foi concentrado para dar terc-butiloctadecandioil-N-(2-(terc-butoxicarbonil)etil)- Gly-OH a um rendimento de 80 % (37 mg). 1H-NMR (CDCI3) δ: ppm 1.3 (m, 26H) 1.40 (s, 9H), 1.46 (s, 9 H) , 1.6 (m, 4H), 1.75 (p, 2H), 2.2 (m, 2H), 2.35 (m, 2 H) , 2.63 (m, 2H), 2.83 (s, 2 H) . 47/66
Terc-butiloctadecandioil-N-(2-(terc-butoxicarbonil)etil)-Gly-OH (0.07 mmol) foi dissolvido em THF seco (2 ml). TSTU (24 mg, 0.08 mmol) e DIPEA (15 yL, 0.08 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada à temperatura ambiente sob nitrogénio. Depois de 19 horas a reacção não tinha terminado de acordo com a TLC (DCM/MeOH 10:1). Mais DIEA foi adicionado (20 yL, 0.11 mmol) e a agitação foi continuada. Depois de 42 horas a mistura da reacção foi filtrada. O filtrado foi diluído com AcOEt e lavado com 0.1 N HC1 (2x) e solução salina (lx) , seco (Na2S04) e concentrado para dar terc-butiloctadecandioil-N-(2-(terc-butoxicarbonil) etil) -Gly-OSu como um sólido branco a um rendimento de 84 % (36 mg). 1H-NMR (CDC13) δ: ppm 1 .3 (m, 26H) 1.40 (m, 2H), 1.44 (s 9H) , 1 .46 (s, 9 Η) , 1. ,58 (m, 2H) , 1.73 (P/ 2H), 2.2 (t 2H), 2. 60 (t, 2H) , 2.8 (m, 6 H) EXEMPLO 31 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- [N- (HOOC (CH2) i4CO) -N- (carboxietil)-Gly]
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 30, via a reacção de N-(2-(terc-butoxicarbonil)etil)-Gly-OBn com hexadecandioato de succinimidila (descrito no exemplo 4) seguido pela desbenzilação, activação com TSTU, acoplameto com a insulina humana AlN.BlN-diBOC-Des (B30) e desprotecção por TFA. MALDI-MS: 6093.0, calculado 6104.1. EXEMPLO 32 48/66 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29-[N-(HOOC (CH2) 14CO)-N-(carboximetil-p-Ala]
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 29 via a reacção de N-(terc-butoxicarbonilmetil)-β-Ala-OBn com hexadecandioato de succinimidila (descrito no exemplo 4) seguido pela desbenzilação, activação com TSTU, acoplamento com a insulina humana AlN. BlN-diBOC-Des(B30) e desprotecção por TFA. MALDI-MS: 6097.6, calculado 6104.1. EXEMPLO 33 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- [Na-(HOOC (CH2) u) NHCO (CH2) 3CO) -γ-L-Glu]
Este composto foi preparado similarmente como o descrito no exemplo 1 usando (MeOOCCH2) n)NH-CO(CH2) 3CO)-Glu(OSu)-OMe, preparados como o abaixo descrito, como agente de acilação. LCMS (eletropulverização) : M+3: 2049, calculado 2050; M+4: 1538, calculado 1537.8; M+5: 1231, calculado 1230.4. MALDI-TOF MS: Calculado: 6147; encontrado: 6153.
Preparação de (MeOOCCH2) n)NHCO(CH2) 3CO)-Glu(OSu)-OMe
MeOH (40 ml) foi arrefecido entre 0 e 5 °C, e S0C12 (4 ml) foi adicionado gota a gota com agitação durante 30 minutos. O ácido 12-aminododecanóico (3 g, 13.9 mmoles) foi adicionado e a suspensão resultante a 0 e 5 °C foi agitada enquanto que o gelo do banho de arrefecimento se derretia e deixado aquecer até à temperatura ambiente durante 16 49/66 horas. A mistura foi filtrada e o sólido foi seco pela sucção para produzir 2.23 g (60 %) de cloridreto do éster metilico do ácido 12-aminododecanóico. A partir do liquido mãe um outro lote de 0.92 g (25 %) foi isolado. 1H-NMR (DMSO-de) δ: 7.97 (bs, 3H) , 3.58 (s, 3H) , 2.73 (m, 2H, 2.28 (t, 2H) , 1.52 (m, 4H), 1.25 ("s", 14H). O cloridreto do éster metilico do ácido 12-aminododecanóico (1 g, 3.8 mmoles) foi colocado em suspensão em THF (15 ml) e anidrido do ácido glutárico (1.29 g, 3.8 mmoles) e TEA (0.52 ml, 3.8 mmoles) foram adicionados e a mistura resultante (suspensão) foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Água (75 ml) foi adicionada gradualmente. Depois de 25 ml, uma solução foi obtida uma solução e mais tarde apareceu uma suspensão. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e filtrada. O sólido foi lavado com água e seco in vacuo. Isto produziu 1.02 g (80 %) de éster metilico do ácido 12-(4-carboxibutirilamino)dodecanóico. 1H-NMR (DMSO-de) δ: 12 (bs, 1H) , 7.73 (t, 1H) , 3.57 (s 3H), 3, .00 (q, 2H), 2.28 (t, 2H) , 2.18 (t, 2H) , 2.06 (t 2H), 1. 69 (P, 2H), 1.50 (p, 2H) , 1.36 (p, 2H), 1 .23 ( "s" 14H) . O éster metilico do ácido 12- (4-carboxibutirilamino) dodecanóico (0.33 g, 0.95 mmol) foi dissolvido numa mistura de THF e DMF (2:1, 6ml), e adicionado DIEA (0.178 ml, 1.04 mmol) . A mistura foi arrefecida entre 0 e 5 °C e TSTU (0.314 g, 1.04 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada entre 0 e 5 °C durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi concentrada até à secura in vacuo. O residuo (éster metilico do ácido 12-(4-50/66 carboxibutirilamino) dodecanóico activado por OSu) foi dissolvido em DMF (10 ml) e adicionado DIEA (0.24 ml, 1.4 mmol) e H-Glu-OMe (0.168 g, 1.04 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi concentrada in vacuo e o resíduo foi dissolvido em AcOEt (100 ml) e lavado com 0.2 M ácido clororídrico (3 x 50 ml) . A fase orgânica foi seca (Na2S04) e concentrada in vacuo. Isto produziu 0.358 g (78 %) de (MeOOCCH2) ii) NHCO (CH2) 3CO) -Glu-OMe. 1H-NMR (DMSO-de) , δ: 12 (bs, 1 H) , 8.22 (d, 1 H) , 7.73 (t, 1H) , . 4.24 (m, 1 H) , 3.61 (s, 3H) , 3.57 (s, 3H) , 3.00 (q, 2H) , . 2.27 (m, 4H), 2.10 (t, 2H), 2.04 (t, 2H) , 1.9 (m, 1 H) , 1.8 (m, , 1H), 1. 68 (t, 2H), 1.50 (m, 2H) , 1.36 (m, 2H), 1.23 ("s", 14H). (MeOOC (CH2) n) NHCO (CH2) 3CO)-Glu-OMe (0.36 g, 0.36 mmol) foi dissolvido em THF (10 ml) e arrefecido entre 0 e 5 °C. DIEA (0.13 ml) e TSTU (0.129 g, 0.43 mmol) foram adicionados e a mistura foi agitada entre 0 e 5 °C durante algumas horas e à temperatura ambiente durante 3 dias. A mistura foi concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em AcOEt (100 ml) e lavado com ácido clorídrico 0.2 N (3 x 50 ml) e NaHC03 aquoso saturado (3 x 100 ml) . A secagem (Na2S04) e a concentração in vacuo produziram 0.17 g (84 %) de (MeOOC (CH2) u) NHCO (CH2) 3CO) -Glu (OSu) -OMe . ΧΗ -NMR (DMSO-d6 ) , picos seleccionados, Ô: 8. 27 (d, 1H) 7 . 72 (t, 1 H), 4 .31 (m, 1 H) , 3.63 (s, 3H) , 3 .57 (s, 3H) 3. 00 (q, 2H) , 2 . 81 (s, 4H) , 2.28 (t, 2H) , 2 .12 (t, 2H) 2 . 05 (t, 2H) , 1. 70 (m, 2H) , 1.50 (m, 2H) , 1 .35 (m, 2H) 1. 23 ("s" , 14H) . EXEMPLO 34 51/66 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- [Να-(HOOC (CH2) n) NHCO (CH2) 2C0) -γ-L-Glu]
Este composto foi preparado similarmente como o descrito no exemplo 1 usando (MeOOC(CH2) u)NHCO(CH2) 2C0)-Glu(OSu)-OMe, que por seu lado foi preparado similarmente como o descrito no exemplo 33 usando anidrido do ácido succínico em vez de anidrido do ácido glutárico, como agente de acilação. MALDI-TOF MS: Calculado: 6133; encontrado: 6134. EXEMPLO 35 Síntese da insulina humana des(B30) ΝεΒ29- [Να-(HOOC (CH2) i6CO) ] -Gly-y-L-Glu
Este composto foi preparado similarmente como o descrito no exemplo 4 usando terc-butiloctadecandioil-Gly-Glu(OSu)-O^u, preparado como abaixo descrito como agente de acilação. MALDI-TOF MS: Calculado: 6189; encontrado: 6191.
Preparação do terc-butil octadecandioil-Gly-Glu(OSu)-OtBu Z-Gly-OH (1.0 g, 4.78 mmoles) foi adicionado THF (10 ml), DIEA (0.98 ml, 5.74 mmoles), e TSTU (1.7 g, 5.74 mmoles) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. AcOEt (100 ml) foi adicionado e a mistura foi lavada com ácido clorídrico 0.2 N (100 ml) e água (2 x 100 ml). A fase orgânica foi seca (Na2S04) e concentrada in vacuo para produzir 1.34 g (92 %) de Z-Gly-OSu como um óleo. 52/66 1H-NMR (CDC13) , δ: 7.35 (s, 5H) , 5.32 (t, 1H) , 5.15 (s, 2H), 4.35 (d, 2H), 2.83 (s, 4H) . Z-Gly-OSu (1.3 g, 4.25 mmoles) foi dissolvido em DMF (15 ml) e DIEA (1.82 ml, 10.6 mmoles) e H-Glu-O^u (0.949 g, 4.67 mmoles) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas. AcOEt (100 ml) foi adicionado e a mistura foi lavada com ácido clorídrico 0.2 N (100 ml) e água (2 x 100 ml) . A fase orgânica foi seca (Na2SC>4) e concentrada in vacuo para produzir 1.7 g (quant.) de Z-Gly-Glu-OtBu como um óleo. 1H-NMR (CDCI3) , δ: 7.33 (s, 5H) , 7.1 (d, 1 Η) , 5.80 (t, 1 Η), 5.12 (s, 2H), 4.53 (m, 1H), 3.90 (d, 2H) , 2.36 (t, 2H) , 2.22 (m, 1 Η), 1.95 (m, 1 Η), 1.45 (s, 9H). Z-Gly-Glu-0tBu (1.7 g, 4.3 mmoles) foi dissolvido em 1.4-dioxano (15 ml) e sob N2 10% de paládio negro (0.6 g) foi adicionado. A mistura foi hidrogenada sob pressão atmosférica durante 5 horas. A mistura foi filtrada e o paládio foi agitado com água (200 ml) durante 2 horas, filtrado e o filtrado foi liofilizado. Este produziu 0.65 g (58 %) de H-Gly-Glu-OtBu. 1H-NMR (DMSO-dõ) , picos seleccionados, δ: 8.31 (d, IH) , 2.20 (t, 2H), 1.91 (m, 1H), 1.80 (m, 1H), 1.40 (s, 9H). H-Gly-Glu-O^u (0.15 g, 0.58 mmol) foi colocado em suspensão em DMF (5 ml) e DIEA (0.15 ml, 0.86 mmol) e terc-butil octadecandioato de succinimidila (0.27 g, 0.58 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. AcOEt (50 ml) foi adicionado e a mistura foi lavada com ácido clorídrico 0.2 53/66 Ν (100 ml) e água (3 x 100 ml) . A fase orgânica foi seca (Na2S04) e concentrada in vacuo para produzir 0.34 g (quant.) de terc-butil octadecandioil-Gly-Glu-C^Bu. 1H-1 NMR (CDCI3) , Ô: 7.11 (d, 1H) , 6.55 (t, 1H) , 4.55 (dt, 1H) , 4. 00 (dq, 2H) , 2.40 (t, 2H) , 2.26 (t, 2H) , . 2.20 (t, 4H) , 2. ,00 (m, 1H) , 1.57-1.65 (m, 5H) , 1.47 (s, 9H) , 1.44 (s, 9H) , 1 .25 ("s", 22H, sobreposto com HDO) φ
Terc-butil octadecandioil-Gly-Glu-OtBu (0.32 g, 0.52 mmoles) foi dissolvido em THF (5 ml) e DIEA (0.11 ml, 0.63 mmol) e TSTU (0.19 g, 0.63 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente sob N2 durante 3 dias. AcOEt (100 ml) foi adicionado e a mistura foi lavada com ácido clorídrico 0.15 N (100 ml) e água (3 x 100 ml) . A fase orgânica foi seca (Na2S04) e concentrada in vacuo para produzir 0.3 g (81 %) de terc-butiloctadecandioil-Gly-Glu(OSu)-0tBu. ^-NMR (CDC13) , picos selecionados, δ: 6.89 (d, 1 H) , 6.44 (t, 1 H), 4.60 (m, 1 H), 3.95 (dq, 2H), 2.86 (s, 4H) , 2.68 (q, 2H), 2.24 (t, 2H) , 2.20 (t, 4H) , 1.57 - 1.65 (m, 5H) , 1.48 (s, 9H) , 1.44 (s, 9H) , 1.25 ("s", 22H, sobreposição com HDO) . EXEMPLO 36 Síntese da insulina humana des B30 ΝεΒ29- [N- (HOOC (CH2) i4CO) -N- (2-carboxietil) -β-Ala]
Este composto foi preparado em analogia com o exemplo 1, via o acoplamento do éster metílico do ácido 15-[[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-l-iloxicarbonil)-etil]-(2-metoxicarbonil-54/66 etil)-carbamoil]-pentadecanóico com a insulina humana Des(B30) e a desprotecção por NaOH. LC-MS: M+4, 1530.3, calculado 1529.5
Preparação_do_metil_hexadecandioil_N- (2- (metoxicarbonil) etil) -β-Ala-Osu
Cloridreto de Η-β-Ala-OMe (5.45 g, 39 mmoles) foi dissolvido em DMSO (100 ml) e acrilato de terc-butila (5.71 ml, 39 mmoles) e DIEA (13.4 ml, 78 mmoles) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 6 dias. A mistura foi dividida entre água (500 ml) e AcOEt (2 x 250 ml) . As fases orgânicas combinadas foram lavadas com NH4C1 aquoso saturado, secas (MgS04) e concentradas in vacuo. Isto produziu 7.24 g (80 %) de N-(2-(metoxicarbonil) etil) - β-
Ala-OtBu. 1H-NMR (CDC13) , δ: 3.58 (s, 3H) , 2.72 (t, 2H) , 2.67 (t, 2H), 2.41 (t, 2H), 2.29 (t, 2H),1.39 (s, 9H).
Ester monometilico do ácido hexadecanodióico (150 mg, 0.5 mmol) foi dissolvido em DMF (5 ml). HOAt (102 mg, 0.75 mmol) e EDAC (143 mg, 0.75 mmol) foram adicionados e a reacção foi agitada a 50 °C durante 1 hora. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, DIEA (0.256 ml, 1.5 mmol) e N-(2-(metoxicarbonil)etil)-β-Ala-OtBu (139 mg, 0.6 mmol) foi adicionado. A reacção foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. A mistura foi dividida entre água (2 x 50 ml) e AcOEt (100 ml) . A fase orgânica foi seca (Na2S04) e concentrada in vacuo até um óleo. DCM (10 ml) e TFA (10 ml) foram adicionados e a mistura foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente, o solvente removido 55/66 in vacuo para produzir 170 mg (87 %) de metil hexadecandioil-N 2-(metoxicarboml)etil-p-Ala-OH. LC-MS: 458 (M+l).
Metil hexadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil-β-Αΐβ-ΟΗ (161 mg, 0.351 mmol) foi dissolvido em THF (10 ml), DIEA (0.073 ml, 0.42 mmol) e TSTU (127 mg, 0.42 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada durante o seu arrefecimento num banho de gelo durante 30 min, seguido pela agitação durante 2 horas à temperatura ambiente. A mistura foi dividida entre AcOEt (100 ml) e HC1 aquoso (0.2 N, 2x80 ml). A fase orgânica foi seca (Na2S04) e concentrada in vacuo. Isto produziu 140 mg (72 %) de metil hexadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil)-β-Ala-OSu como um óleo. LC-MS: 555 (M+l). EXEMPLO 37 Síntese da insulina humana des B30 ΝεΒ29-[N-(HOOC (CH2) i6CO)-N- (2-carboxietil) -β-Ala]
Este composto foi preparado em analogia com os exemplos 1 e 36 via o acoplamento de metil octadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil)- β-Ala-OSu com a insulina humana Des(B30) e desprotecção por NaOH.
Preparação_do_metil_octadecandioil_N- (2- (metoxicarbonil)etil) -β-Ala-QSu 56/66 metil
Este composto foi sintetizado em analogia com hexadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil)-β-Ala-OSu usando o éster monometilico do ácido octadecanodióico. MALDI-TOF MS: Calculado 6146; encontrado: 6151 LC-MS: 583 (M+l)
MÉTODOS FARMACOLÓGICOS
Ensaio (I)
Ligação do receptor de insulina dos derivados da insulina da invenção A afinidade dos análogos da insulina da invenção para o receptor da insulina humana foi determinada por um ensaio de SPA (Ensaio de Proximidade de Cintilação) ensaio de captura de anticorpo em placa de microtitulação. As pérolas de ligação do anticorpo SPA-PVT, reagente anti-ratazana (Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017) foram misturadas com 25 ml de tampão de ligação (100 mM HEPES pH 7.8; 100 mM de cloreto de sódio, 10 mM de MgS04, 0.025% Tween-20). A mistura da reacção para um único Packard Optiplate (Packard No. 6005190) é composta de 2.4 yl de um receptor da insulina humana recombinante purificada diluída 1:5000 - exão 11, uma quantidade de uma solução mãe A14 Tyr[125I]-insulina humana correspondendo a 5000 cpm por 100 μΐ da mistura do reagente, 12 μΐ de uma diluição 1 : 1000 de anticorpo F12, 3 ml de pérolas SPA e tampão de ligação a um total de 12 ml. Um total de 100 μΐ foi depois adicionado e uma série de diluição foi feita a partir das amostras apropriadas. À série de diluições foi depois adicionado 100 μΐ da mistura do reagente e as amostras foram incubadas 57/66 durante 16 horas com agitação suave. As fases foram depois separadas por centrifugação durante 1 min e as placas contadas em um Topcounter. Os dados de ligação foram ajustados usando um algoritmo de regressão não linear no GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA).
Preparação dos anticorpos mlR monoclonais
Os anticorpos específicos (F12) foram produzidos pela técnica monoclonal: ratazanas RBF foram imunizadas pela injecção de 50 pg de mlR purificada em FCA seguido de duas injecções subcutâneas com 20 pg de mlR em FIA. As ratazanas altamente responsivas foram estimuladas por via intravenosa com 25 pg de mlR e os baços foram colhidos depois de 3 dias. As células dos baços foram fundidas com a linha celular de mieloma de raposa (Kõhler, G & Milstein C. (1976), European J. Immunology, 6:511-19; Taggart RT et al (1983), Science 219:1228-30). Os sobrenadantes foram rastreados quanto à produção de anticorpos numa ELISA específica de mlR. Os poços positivos foram clonados e testados no Western blotting.
Quadro 2
Produto Ligação ao receptor (% da insulina humana) Insulina humana 100 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 14CO-y-G1u) 26 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) 16CO-y-Glu) 9.2 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) 16CO-y-Glu-N- (γ-Glu) 11 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N- (Asp-OC (CH2) 16CO) -γ-Glu) 13 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(Glu-OC (CH2) 14CO-y-Glu) 13 Insulina humana des (B30 ) ΝεΒ29- (N- (Glu-OC (CH2) 14CO-) 9.4 Insulina humana des (Β30)ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) 16CO-a-Glu) -N- (β-Asp) 11 58/66
Insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N- (Gly-OC (CH2) 13CO-y-Glu) 22 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-(Sar-OC (CH2) 13CO-y-Glu) 20 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) i6CO-a-L-Asp) -N- (β—L— Asp) 14 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-(Gly-OC (CH2) 14C0-y-G1u) 32 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) i5CO-y-L-Glu) 4 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) i4CO-p-L-Asp) 16 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) i4CO-p-D-Asp) 37 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) i3CO-p-L-Asp) 15 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) i3CO-p-L-Asp) 11 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) 16CO-ô-L-Aad) 7 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) i6CO-y-D-Glu) 13 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 15CO-p-L-Asp) 5.4 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) i6CO-a-L-Asp) 13 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) i6CO-a-L-Glu) 16 Insulina humana des (B30 ) ΝεΒ29-(N-(HOOC (CH2) 14CO-8-L-LysCO-) 5.7 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-HOOC(CH2) 16CO-p-L-Asp) 11 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N- (Gly-OC (CH2) i6CO-y-L-Asp) 9.1 Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-[N-(HOOC (CH2) 16CO-N-(carboximetil)-p-Ala] 9.4 Insulina humana des (B30 ) ΝεΒ29- [Να- (HOOC (CH2) n) NHCO (CH2) 3C0) -γ-L-Glu) 46
Ensaio (II)
Potência dos derivados da insulina da invenção em relação à insulina humana
Ratazanas machos Sprague Dawley pesando 238 a 383 g no dia do experimento foram utilizados para o experimento de fixação. As ratazanas tiveram livre acesso à ração sob condições de ambiente controladas e estiveram em jejum 59/66 durante a noite (a partir das 3 horas da tarde) antes do experimento de fixação.
Protocolo Experimental
As ratazanas foram aclimatizadas nas instalações para animais durante pelo menos 1 semana antes do procedimento cirúrgico. Aproximadamente 1 semana antes do experimento de fixação foram inseridos catéteres Tygon sob anestesia com halotano na veia jugular (para infusão) e na artéria carótida (para amostra de sangue) e exteriorizados e fixados no dorso do pescoço. Às ratazanas foi dada Estreptocilina vet. (Boehringer Ingelheim, 0.15 ml/ratazana, i. m.) pós-cirurgicamente e colocados numa unidade de cuidados de animais (25 °C) durante o período de recuperação. Para obter analgesia, Anorfina (0.06 mg/ratazana, s. c.) foi administrada durante a anestesia e Rimadyl (1.5 mg/kg, s.c.) foi administrado depois da recuperação total da anestesia (2 a 3 horas) e novamente uma vez ao dia durante 2 dias. A técnica de fixação utilizada foi adaptada de (1). Às 7 da manhã no dia do experimento, em jejum durante a noite (a partir das 3 da tarde do dia anterior) as ratazanas foram pesadas e conectadas para recolher as amostras às seringas e ao sistema de infusão (bombas Harvard 22 Basic, Harvard, e seringa de vidro Perfectum Hypodermic, Aldrich) e depois colocadas em gaiolas de fixação individuais onde elas estiveram durante cerca de 45 min antes do inicio do experimento. As ratazanas podiam mover-se livremente no seu leito habitual durante todo o experimento e tinham livre acesso à água de beber. Depois de um período basal de 30 min durante o qual os níveis de glicose plasmática foram medidos em intervalos de 10 min, o derivado da insulina a 60/66 ser testado e a insulina humana (um nivel de dose por ratazana, n = 6 a 7 por nivel de dose) foram injectados (i.v.) a uma velocidade constante durante 300 min. Os níveis de glicose no plasma foram medidos em intervalos de 10 min do começo ao fim e a infusão de glicose aquosa a 20 % foi ajustada consequentemente de modo a manter a euglicemia. As amostras de eritrócitos ressuspendidos foram agrupadas de cada ratazana e restituídos em volumes de cerca de V2 ml via o cateter da carótida.
Em cada dia de experimento, as amostras das soluções dos derivados da insulina individuais a serem testadas foram recolhidas e a solução de insulina humana antes e no final dos experimentos de fixação e as concentrações dos peptídeos foram confirmadas por HPLC. As concentrações plasmáticas de insulina de ratazana e peptídeo C assim como do derivado da insulina a ser testado e da insulina humana foram medidas em momentos relevantes antes e no final dos estudos. Os ratazanas foram mortas no final do experimento usando uma dose excessiva de pentobarbital.
Compostos e doses de teste: As insulinas a serem testadas foram diluídas de uma solução mãe contendo 97 μΜ do derivado da insulina em 5 mM de fosfato pH 7.7. A concentração final na solução pronta para a ser usada foi de 0.45 μΜ do derivado da insulina, 5 mM de fosfato, 100 mM de cloreto de sódio, 0.007 % de polissorbato 20. O pH foi 7.7 e a velocidade de infusão i.v. foi de 15 e 20 pmol -min” '•kg-1.
Uma solução mãe de insulina humana que foi usada como composto de referência foi formulada num meio similar e infundido i.v. a 6, 15 ou 30 pmol.min .kg . 61/66
Ambas as soluções mãe foram armazenadas a -20 °C e descongeladas durante a noite a 4 °C antes de serem usadas. As soluções foram suavemente agitadas por inversão diversas vezes 15 min antes de que elas fossem transferidas para as seringas de infusão.
Quadro 3
Derivado da insulina Potência em relaçao à insulina humana Insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) i4CO-y-Glu) >50 % Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) i6CO-y-Glu) >50 % Insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) 46CO-y-Glu-N- (γ-Glu) >50 % Insulina humana des (B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 14CO-p-L-Asp) >50 % Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-(Gly-OC (CH2) 14CO-y-Glu) >50 % Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 14C0-0-L-Asp) >50 %
Ensaio (III)
Determinação em porcos de T5o% dos derivados de insulina da invenção T5o% é o tempo quando 50 % de uma quantidade injectada do derivado marcado A14 com Tyr[125I] de uma insulina a ser testada desapareceu do local de injecção como o medido com um γ-contador externo.
Os princípios de cuidados de animal de laboratório foram seguidos, foram usados porcos fêmeas não diabéticos, livres de patógeno específico LYYD, cruzados com Danish Landrace, Yorkshire e Duroc (Holmenlund, Haarloev, Denmark) para estudos farmacocinéticos e farmacodinâmicos. Os porcos estavam conscientes, tinham de 4 a 5 meses de idade e um peso de 70 a 95 kg. Os animais estiveram em jejum durante a noite durante 18 horas antes do experimento. 62/66
As preparações formuladas dos derivados de insulina rotulados em TyrA14 com 125I foram injectadas s.c. nos porcos como o descrito anteriormente (Ribel U., Jorgensen, K, Brange, J, e Henriksen, U. The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man. Serrano-Rios, M and Lefèbvre, P. J. 891-896. 1985. Amsterdam; New York; Oxford, Elsevier Science Publishers. 1985 (Conference Proceeding)).
No inicio dos experimentos uma dose de 60 nmol do derivado da insulina de acordo com a invenção (composto de teste) e uma dose de 60 nmoles de insulina detemir (ambas I25I marcadas em Tyr A14) foram injectadas em dois sítios separados no pescoço de cada porco. 0 desaparecimento do marcador radioactivo do sítio da injecção sc. foi monitorizado usando uma modificação do método de contagem de gama externo tradicional (Ribel, U. Subcutaneous absorption of insulin analogues. Berger, M. and Gries, F. A. 70-77 (1993). Stuttgart; New York, Georg Thime Verlag (Conference Proceeding)). Com este método modificado foi possível medir continuamente o desaparecimento da radioactividade de um depósito subcutâneo drante vários dias usando um dispositivo portátil sem fios (Scancys Laboratorieteknik, Vaerlçse, DK-3500, Denmark). As medições foram executadas em intervalos de 1 min, e os valores contados foram corrigidos para a actividade de fundo.
No quadro 4, a coluna " test/detemir" mostra o T50% encontrado para cada um dos compostos testados ("teste") e o T50% encontrado para a insulina detemir ("detemir") no mesmo experimento. 63/66
Quadro 4
Derivado da insulina T50%horas teste/detemir Insulina humana des (B30 ) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) ^CO-y-Glu) 9.0/9.5 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 16CO-y-Glu) 10.6/9.7 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29-(N-HOOC (CH2) 16CO-y-Glu-N-(γ-Glu) 7.8/7.4 Insulina humana des (B30 ) ΝεΒ29- (N- (Asp-OC (CH2) 16CO-y-Glu) 3.5/7.4 Insulina humana des (B30 ) ΝεΒ29- (N- (Asp-OC (CH2) 16CO-) 4.1/7.4 Insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (N-HOOC (CH2) 16CO-a-Glu) -N- (β-Asp) 8.7/9.1
Lisboa, 11 de Junho de 2014 64/66
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.
Documentos de Pedidos de Patente citadas na descrição
WO 9112817 A US 3528960 A, Eli Lilly
GB 1492997 A
JP 1254699 A JP 57067548 A, Shionogi
WO 9507931 A
EP 894095 A
WO 9921888 A
EP 272097 A
EP 214826 A EP 375437 A EP 383472 A 65/66
Literatura citada na descrição que não é Pedido de Patente
Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 1995 A. C. COPE; U. AXEN; E. P. BURROWS; J. WEINLICH. J. Am. Chem Soc., 1966, vol. 88, 4228 KURTZHALS P; HAVELUND S; JONASSEN I; KIEHR B; LARSEN UD; RIBEL U; MARKUSSEN J. Biochemical Journal, 1995, vol. 312, 725-731 KÕHLER, G; MILSTEIN C. J. Immunology, 1976, vol. 6, 511-19 TAGGART RT et al. Science, 1983, vol. 219, 1228-30 [0152] RIBEL, U.; J0RGENSEN, K; BRANGE, J; HENRIKSEN, U. The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man. Elsevier Science Publishers, 1985, 891-896 RIBEL, U. Subcutaneous absoption of insulin analogues. Georg Thime Verlag, 1993, 70-77 66/66

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um derivado da insulina da insulina humana des(B30) que tem um cadeia lateral presa ao grupo ε-amino do resíduo Lys presente na cadeia B da insulina humana des(B30), sendo a cadeia lateral da fórmula geral: -w-X-Y-z em que W é: • um resíduo de α-aminoácido com um grupo de ácido carboxílico na cadeia lateral cujo o aminoácido é seleccionado do grupo constituído por a-Asp, β-Asp, a-Glu, γ-Glu, a-hGlu e δ-hGlu e cujo resíduo forma, com um dos seus grupos carboxílicos, um grupo amino juntamente com o grupo ε-amino de um resíduo Lys presente na cadeia B da insulina humana des(B30); X é: • -C0-; Y é: • -(0¾) m_ onde m é um número inteiro na margem de 12 a 16; e Z é: • -COOH; 1/3 e quaisquer complexos Zn2+ deste.
  2. 2. Um derivado da insulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o derivado da insulina ser a insulina humana des (B30) ΝεΒ29- (Να- (HOOC (CH2) i4CO) -γ-Glu) .
  3. 3. Um complexo de zinco de um derivado da insulina de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por cada hexámero de insulina ligar dois iões de zinco.
  4. 4. Um complexo de zinco de um derivado da insulina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, caracterizado por cada hexámero de insulina ligar três iões de zinco.
  5. 5. Um complexo de zinco de um derivado da insulina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por cada hexámero de insulina ligar quatro iões de zinco.
  6. 6. Uma composição farmacêutica para o tratamento da diabetes num paciente que tenha necessidade de esse tratamento, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado da insulina de acordo com a reivindicação 1 juntamente com um portador aceite na Indústria Farmacêutica.
  7. 7. Uma composição farmacêutica para o tratamento da diabetes num paciente que tenha necessidade de esse tratamento, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado da insulina de acordo com a reivindicação 1 misturado com uma insulina ou um análogo da 2/3 insulina que tenha um inicio de acção rápida, juntamente com um portador aceite na indústria Farmacêutica.
  8. 8. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o derivado da insulina ser a insulina humana des(B30) ΝεΒ29- (Να- (HOOC (CH2) 14CO) -γ-Glu) e o análogo da insulina que tem um inicio de acção RO q rápida ser a insulina humana Asp
  9. 9. Derivado da insulina de acordo com a reivindicação 1 para ser usado na forma de medicamento para tratar a diabetes num paciente que tenha necessidade de esse tratamento, caracterizado por este compreender a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado da insulina de acordo com a reivindicação 1 juntamente com um portador aceite na Indústria Farmacêutica.
  10. 10. Derivado da insulina de acordo com a reivindicação 1 para ser usado na forma de medicamento para tratar a diabetes num paciente que tenha necessidade de esse tratamento, caracterizado por este comprender a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado da insulina de acordo com a reivindicação 1 misturado com uma insulina ou um análogo da insulina que tenha um inicio de acção rápida, juntamente com um portador aceite na Indústria Farmacêutica. Lisboa, 11 de Junho de 2014 3/3
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