CN101157725B - 人胰岛素类似物的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于人药的领域，涉及一类治疗I型和II型糖尿病的药物，提供了一类人胰岛素类似物的制备方法和用途。本发明所涉及的人胰岛素类似物的特征具有如下形式：

其中R₁为Pro，Ala，Gly，Ser，Val，Leu中的任意一个氨基酸残基；R₂为任意所需要的遗传上可编码的氨基酸残基；R₃为n段-R2-R1-二肽片断，n取0、1、2、3、4之中的任意一个数字。本发明的人胰岛素类似物，用生物工程的方法制备得到，此类速效胰岛素类似物，优点为不易形成二聚体，皮下注射后主要以单体形式存在，局部吸收更快，起效时间更短，药物动力学特征更符合生理胰岛素和血糖变化谱。

Description

人胰岛素类似物的制备方法及用途

技术领域

本发明是属于人药的领域，特别是涉及一类治疗I型和II型糖尿病的药物。更具体地说，是涉及一类人胰岛素类似物的制备方法和用途。

背景技术

全球大约有1亿2千万人患有糖尿病，其中约1千2百万人是I型糖尿病，对这些人来说，利用外源性胰岛素替代所缺少的内分泌胰岛素是目前唯一可行的疗法。高血糖是引发各种糖尿病并发症的原因，所以必须严格控制每日24小时的血糖浓度在正常范围以防止或延缓糖尿病后期并发症。

正常人体内胰岛素的生理性分泌是受血糖浓度调控的，一般在进餐后30-60分钟后血胰岛素浓度达到峰值，4-5小时后恢复到基础值，这样才能保证血糖浓度不因进餐而有大的波动。

临床上，皮下注射天然人胰岛素后，胰岛素在皮下注射位置扩散并进入体循环中发挥作用。胰岛素在生理pH溶液中有多种聚集状态，包括单体、二聚体和六聚体等。单体胰岛素(insulin monomers)在皮下组织中能够迅速扩散并进入体循环中发挥降血糖作用，而二聚体胰岛素(insulin dimmers)的皮下扩散速度相对较慢，六聚体以上的胰岛素(insulin hexamer)的皮下吸收受到很大限制。临床上皮下或者肌肉注射使用的天然人胰岛素通常溶解于生理pH溶液中，浓度通常也高于100nM，在此条件下的胰岛素以形成二聚体为主，在有锌离子等二价离子的存在下形成六聚体。因此，皮下或者肌肉注射天然人胰岛素后，起效时间较慢(30-90分钟)，达峰后持续两个小时左右(2-4小时)，总起效时间较长(6-8小时)。由于餐前即时皮下或者肌肉注射天然人胰岛素后的作用性质的限制，使其不能有效地模拟餐后胰岛素的生理性分泌，故不能有效地进行胰岛素治疗(Dewitt DE，et al.，JAMA 2003，289：2254；Binder C.，et al.，New York：Raven Press，1983，6：53.)。

餐前即时皮下或者肌肉注射天然人胰岛素后不能有效地模拟餐后胰岛素的生理性分泌，而餐前半小时注射天然人胰岛素给患者生活上带来极大的不便，临床上需要药物动力学更符合生理餐时胰岛素分泌曲线的胰岛素制剂——速效胰岛素类似物。

发明内容

本发明的目的就是提供一类速效胰岛素类似物。

本发明的另一目的是提供该类速效胰岛素的制备方法。

本发明的再一个目的是提供该类速效胰岛素在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的第一方面，提供了一类新型的胰岛素类似物，具有如下的形式：

其中：

R₁为Pro；

R₂为lys；

R₃为n段-Arg-Pro-二肽片断，n为1。

此类胰岛素类似物是通过

在天然人胰岛素B链N端加上了Arg-Pro-Lys-Pro-四肽所形成的胰岛素类似物，命名为PIns，其胰岛素原命名为PPIns，前体胰岛素原命名为FPPIns。此例所提供的胰岛素类似物为一种速效胰岛素。

本发明的第二方面，提供了该类新型人胰岛素类似物的制备方法，步骤包括：

(1)构建一种可复制的表达载体，该载体包含一段编码具有氨基酸序列II的人胰岛素类似物的DNA序列：

Met-X² _b-Y-R₃-R₂-R₁-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-X¹ _a-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

                                II

其中

X² _b为含有b个氨基酸残基的肽链，b为非负整数；X¹ _a为含有a个氨基酸残基的肽链，a为非负整数；

Y为Arg或Lys；其它变量与权利要求1所述相同，

(2)人胰岛素类似物前体的表达，其中宿主细胞采用优选的宿主菌，检测方法用SDS-PAGE电泳法。

(3)分离得到人胰岛素类似物前体，命名为FPPIns。

(4)用酶学方法从人胰岛素类似物前体FPPIns释放人胰岛素类似物命名为PIns。

(5)得到人胰岛素类似物PIns，其中步骤为纯化-除盐-冻干-分离。

步骤(1)中所提到的宿主细胞优选细菌，特别优选大肠杆菌(E.coli)。

步骤(2)中所述的前体若是在大肠杆菌中表达时，表达的融合蛋白通常形成不溶性的包涵体，可以在细胞破碎后离心分离，用变性剂(例如8M尿素或6M盐酸胍)重新溶解，然后用亚硫酸盐处理融合蛋白，将巯基(SH)转变为S-磺酸盐(例如，实用蛋白质化学手册，A.Darbre编写，1986，49-53页)，改善该融合蛋白的溶解性，易于纯化(利用阴离子交换或凝胶层析方法)。

步骤(3)在稀释的水溶液中，加入巯基试剂(如β-巯基乙醇、CySH或谷胱甘肽)，随后进行空气氧化作用，使纯化后的前体转变为具有天然空间结构式和形成正确的二硫键(折叠)的前胰岛素原(preproinsulin)。

步骤(4)酶学方法即通过特异性的蛋白裂解作用，将前体转变成具有生物活性的人胰岛素类似物。用胰蛋白酶将式II的Met-X² _b-Y-去除，在X¹ _a-Arg所示的肽链处形成断裂，使B链和A链分开，同时用羧肽酶B除去羧基端的碱性氨基酸。

步骤(5)把裂解过程中形成的人胰岛素类似物用层析的方法(例如离子交换等)进行纯化，最后通过除盐、冻干得以分离。

本发明的第四方面，提供了一种对病人具有有效量的胰岛素类似物给药，以控制病人的血糖浓度。其中“有效量”是指本发明的一种或者多种胰岛素类似物用于治疗、预防糖尿病或是保持正常血糖水平所必要的剂量。该胰岛素类似物的实际给药量应由医生按照病人具体的情况而确定，上述剂量范围不认为是以任何方式限制本发明的范围。

本发明的有益效果体现在此类速效胰岛素类似物不易形成二聚体，皮下注射后主要以单体形式存在，其主要特点为：可溶性，自我结合力较低，皮下注射后局部吸收更快，起效时间更短(10～20分钟)，达峰时间30-90分钟，作用持续时间3～5小时。这一药物动力学特征更符合生理胰岛素和血糖变化谱。

附图说明

图1质粒pET28a-ProIns结构图。

图2质粒pET28a-FPTH结构图。

图3重组质粒pET28a-FPPIns结构图。

图4重组质粒pET28a-FPPIns部分基因测序结果。

图5SDS-PAGE电泳显示FPPIns的表达和纯化。

图6SDS-PAGE电泳显示FPPIns前体胰岛素原蛋白转化为PIns。

图7PIns的Autoflex ToF/ToF(Bruker Daitonics)质谱图。

图8新西兰大白兔肌肉注射PIns降血糖活性时效关系图。

图9 a Du Pont Zorbax GF-250分子筛层析图。

具体实施方式

以下通过附图及实施例对本发明做进一步说明

一种具有以下特征的人胰岛素类似物：(I式)

其中：

R₁为Pro，Ala，Gly，Ser，Val，Leu中的任意一个氨基酸残基；

R₂为任意所需要的遗传上可编码的氨基酸残基；

R₃为n段-R2-R1-二肽片断，n取0、1、2、3、4之中的任意一个数字，R₁和R₃中的R₁为Pro，R₂为lys，R₃中的R₂为Arg，n为1。

该人胰岛素类似物的制备方法由以下步骤完成：

(1)构建一种可复制的表达载体，该载体包含一段编码具有氨基酸序列II的人胰岛素类似物的DNA序列：

Met-X² _b-Y-R₃-R₂-R₁-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-X¹ _a-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

                                II

其中X² _b为含有b个氨基酸残基的肽链，b为非负整数；X¹ _a为含有a个氨基酸残基的肽链，a为非负整数；Y为Arg或Lys；R₁为Pro，Ala，Gly，Ser，Val，Leu中的任意一个氨基酸残基；R₂为任意所需要的遗传上可编码的氨基酸残基；R₃为n段-R2-R1-二肽片断，n取0、1、2、3、4之中的任意一个数字，所用的引物P1和P2的核苷酸序列为

P1：5’ACAGGATCCAAGCGTCCGAAACCGTTTGTCAATCAGCACCTT 3’

P2：5’TTAAAGCTTAGTTGCAGTAGTTCTCC 3’

载体质粒选用PET28a质粒；

(2)人胰岛素类似物前体的表达，其中人胰岛素类似物的前体从氨基端到羧基端分别含有融合肽段、胰岛素B链、连接肽和胰岛素A链；

(3)分离得到人胰岛素类似物前体，其中优选大肠杆菌作为宿主菌；

(4)用酶学方法从人胰岛素类似物前体释放人胰岛素类似物，主要是利用胰蛋白酶和羧肽酶B释放人胰岛素类似物；

(5)得到人胰岛素类似物，其中步骤为纯化-除盐-冻干-分离，纯化步骤采用的层析方法为阴离子交换层析法，经SDS-PAGE电泳检测达到电泳纯。

材料

(1)菌株和质粒：

宿主菌Escherichia coli(DE3)是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。

质粒pET28a-ProIns和质粒pET28a-FPTH均由本实验室构建并保存。

(2)酶和试剂：

分子克隆工具酶和试剂、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品，PCR回收试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品。

标准品天然人胰岛素、胰蛋白酶和羧肽酶B购至上海生物工程有限公司。

(3)培养基：

LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh EF，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。

(4)Cellouse-DEAE：DEAE-52为Whatman公司产品。

方法

质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些在基因工程研究领域都是常规操作方法，参见Sambrook J，FristshEF，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。

重组蛋白表达量的测定：参见Sambrook J，Fristsh EF，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。

实施例1FPPIns重组基因工程菌的构建

1.PPIns基因的获得

借助于计算机软件设计两条引物P1和P2，两条引物核苷酸序列如下：

P1：5’ACAGGATCCAAGCGTCCGAAACCGTTTGTCAATCAGCACCTT 3’

P2：5’TTAAAGCTTAGTTGCAGTAGTTCTCC 3’

引物P1中引入了BamH I酶切位点，引物P2中引入了Himd III酶切位点。引物由上海英俊公司合成。

以pET28a-ProIns质粒为模板见附图1，以P1和P2为上下游引物进行PCR扩增获得PPIns基因片段。

PCR反应体系：100pmol P1，100pmol P2，2μl dNTP(10nM)，5单位的Pfu

DNA聚合酶，0.5μl的pET28a-ProIns质粒，5μl 10x Pfu DNA聚合酶反应缓冲液，总体系为50μl。

PCR反应条件：94℃10min；94℃45s，58℃45s，72℃ 1min，循环数30；72℃10min。

2.pET28a-FPPIns质粒的构建及相应重组基因工程菌的构建

将扩增纯化后的PPIns基因片段用BamH I和Himd III进行双酶切，酶切后产物用PCR产物纯化试剂盒回收酶切产物。

采用碱裂解法对pET28a-FPTH质粒进行抽提，抽提得到的质粒也用BamH I和Himd III进行双酶切，酶切反应结束后用琼脂糖胶回收试剂盒回收大片段DNA。

将上述酶切回收后得到的PPIns基因片段和pET28a-FPTH质粒大片段用T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，筛选后得到含有FPPIns前体胰岛素原蛋白基因的重组质粒的基因工程菌，称为pET28a-FPPIns重组基因工程菌，其结构示意图见附图2。从该工程菌中提取重组质粒，委托上海英俊公司进行核酸序列分析，进一步验证FPPIns前体胰岛素原蛋白基因及其读码框的正确性，其结果见附图3。

实施例2FPPIns基因在大肠杆菌中的表达

从pET28a-FPPIns重组基因工程菌的培养平板上挑取单菌落，接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温振荡培养过夜，按1％比例转接种入LB液体培养基(50μg/ml卡那霉素)中，37℃培养4小时后，加入终浓度为0.5mmol/L的α-乳糖诱导大肠杆菌表达T7RNA聚合酶，继续培养从而表达融合蛋白FPPIns。诱导后6小时离心回收菌体，SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了FPPIns前体胰岛素原蛋白基因的表达，表达的蛋白占细菌总蛋白的40％左右，结果见附图4。

实施例3FPPIns前体胰岛素原蛋白的分离纯化

诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在菌体裂解液(pH8.0，50mM Tris-Cl，0.5％Triton X-100，0.02％溶菌酶)中，37℃搅拌过夜。离心回收沉淀，沉淀经包涵体洗涤液(pH8.0，50mM Tris-Cl，0.2％Triton X-100)、低浓度尿素溶液(pH8.0，50mM Tris-Cl，3M尿素)洗涤，洗涤后离心回收沉淀。沉淀裂解于高浓度尿素中(pH8.0，50mM Tris-Cl，7M尿素)，离心回收上清。上清经亚硫酸盐解(亚硫酸钠、连四硫酸钠)，阴离子交换(DEAE-52)层析纯化。层析用缓冲液包含pH8.0，50mM Tris-Cl，7M尿素，梯度洗脱用0-0.3M NaCl梯度进行，目的蛋白层析峰经SDS-PAGE电泳检测已达到电泳纯，结果见附图5，图中1.标准分子量蛋白(kDa)；2.载荷pET28a-FPPIns质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导前)；3.载荷pET28a-FPPIns质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；4.包涵体(FPPIns)洗涤前；5.包涵体(FPPIns)洗涤后；6.阴离子交换层析(DEAE-52)纯化后的FPPIns。

实施例4FPPIns前体胰岛素原蛋白转化为PIns

为形成正确的二硫键，将纯化后的FPPIns前体胰岛素原蛋白(-S-磺酸盐)溶解于含有50mM甘氨酸的缓冲液pH10.6中，浓度为0.3g/l。在β-巯基乙醇(5-50mol/mol前体胰岛素原)作用下，4℃搅拌过夜，然后用磷酸调节pH至3.5，离心去除沉淀。上清液用50mM Tris调节pH至9.0，按质量比1∶400～1∶600(E/S，即酶/前体胰岛素原)分别加入胰蛋白酶和羧肽酶B，37℃反应5h，产物经阴离子交换层析(DEAE-52)纯化。层析用缓冲液包含pH9.0，50mMTris-Cl，梯度洗脱用0-0.3M NaCl梯度进行，目的蛋白层析峰(PIns)经SDS-PAGE电泳检测已达到电泳纯，结果见附图6，图中1.酶解前的FPPIns；2.酶解0.5小时后的产物；3.酶解5小时后的产物；4.阴离子交换层析(DEAE-52)纯化后的PIns(氧化态)；5.标准品天然人胰岛素(氧化态)；6.阴离子交换层析(DEAE-52)纯化后的PIns(还原态)；7.标准品天然人胰岛素(还原态)。目的峰经脱盐、冻干后保存。冻干品经Autoflex ToF/ToF(Bruker Daitonics)质谱测定分子量为6286.5Da，与理论分子量相比误差为0.1％，见附图7。

实施例5新西兰大白兔肌肉注射PIns降血糖活性研究

精密称取PIns和天然人胰岛素，用生理盐水配置成浓度为1.5mg/ml(约40U/mg)的注射液。取体重2-2.5kg的健康新西兰大白兔雌兔6只，分置笼中并随机分为两组，每组三只，一组为PIns组，另一组为天然人胰岛素组。实验前18～20小时移去饲料，但仍给予饮水。每只新西兰大白兔以肌肉注射的方式给药(大腿内侧肌肉)，剂量为0.3U/kg。在实验过程中，应停止饮水，注意避免惊扰，分别自各兔耳静脉于0h，0.16h，0.33h，0.5h，0.75h，1h，1.25h，2h，3h，4h，5h，6h，7h耳缘静脉取血，供测定血糖值用。血糖值以各自的起始值作百分比标准化换算，并取平均值。降血糖活性时效关系见附图8，可以得出结论PIns具有速效胰岛素药代动力学的特点。

实施例6PIns自聚合性质的测定

在中性溶液中较高浓度胰岛素聚合后形成单体、二聚体、六聚体的混合物，使用分子筛层析：a Du Pont Zorbax GF-250柱，流动相为200mM NaCl，20mMNa₂HPO₄，流速为1ml/min，上样量为5μl(PIns和天然人胰岛素浓度都配置成3mg/ml)，室温，220nm检测。层析图见附图9，图中的色谱峰从左至右为：IgG-Hsp65(Mw：150kDa)，Rt＝9.111s；天然人胰岛素，Rt＝11.482s；PIns，Rt＝11.654s；还原型谷胱甘肽(Mw：307)Rt＝11.978s，可以得出结论：PIns的自身缔合性弱于天然人胰岛素。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种人胰岛素类似物，其特征在于具有这样的形式：(I式)

其中：

R₁为Pro；

R₂为lys；

R₃为n段-Arg-Pro-二肽片断，n为1。

2.根据权利要求1所述的人胰岛素类似物在制备用于治疗糖尿病药物中的用途。

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