CN113880954A - 一种重组人生长激素及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组人生长激素及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明中，将hGH和RMP16通过连接肽（EAAAK)5连接，构建出重组人生长激素，记为hGH‑（EAAAK)5‑RMP16；所述重组人生长激素能够在大肠杆菌原核表达系统表达，具有自我高效纯化能力；同时，该重组人生长激素能够提高hGH稳定性、延长hGH的半衰期，能够增加hGH在体内的停留时间，进而减少给药频率。

Description

一种重组人生长激素及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组人生长激素及其构建方法和应用。
背景技术
随着经济的不断发展和人们生活水平的不断提高，儿童身高问题日益受到社会和家庭的关注，矮身材已成为影响儿童身心健康的主要疾病之一。导致患儿身材矮小的病因比较复杂，主要包括生长激素缺乏症（growth hormone deficiency，GHD），特发性矮小症(idiopathic short stature，ISS)，Turner综合征(Turner syndrome，TS)，生长激素不敏感或抵抗综合征，骨骼发育障碍，宫内发育迟缓、某些慢性疾病、营养不良及其他内分泌代谢病引起的生长落后等。其中生长激素缺乏症和特发性矮身小最为常见。FDA批准重组人生长激素（recombinant human growth hormone，rhGH）用于治疗GHD和ISS。
生长激素（Human growth hormone，hGH）是一种重要的非糖基化蛋白质激素。它包含有个氨基酸分子，是人类出生后促生长的最主要激素和体内代谢途径的最重要调节因子。生理功能主要包括：促进软骨、骨和组织的生长；调节代谢作用，促进脂肪分解和蛋白质合成；调节机体免疫，维持机体的正常运转。影响hGH应用的主要因素主要有以下3个方面：（1）天然人生长激素非常稀少，因此釆用基因工程方法大规模生产对满足临床大量需求具有重要的意义。（2）药物级重组人生长激素产品对纯度要求高，如何高效、高纯度纯化；（3）天然生长激素体内半衰期短，难以延长生长激素的半衰期、增加药物在组织内的停留时间，来实现长效以减少给药频率。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种重组人生长激素及其构建方法和应用。本发明中，将hGH和RMP16通过连接肽（EAAAK)5连接，构建出重组人生长激素，记为hGH -（EAAAK)5-RMP16；所述重组人生长激素能够在大肠杆菌原核表达系统表达，具有自我高效纯化能力；同时，该重组人生长激素能够提高hGH稳定性、延长hGH的半衰期，能够增加hGH在体内的停留时间，进而减少给药频率。
本发明中首先提供了一种重组人生长激素，记为hGH-（EAAAK)5-RMP16，所述hGH-（EAAAK)5-RMP16中hGH和RMP16通过连接肽（EAAAK)5连接；所述hGH-（EAAAK)5-RMP16的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明中还提供了编码上述hGH-（EAAAK)5-RMP16的核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示。
本发明中还提供了上述hGH-（EAAAK)5-RMP16的构建步骤，包括：将hGH与RMP16通过接头（EAAAK)5连接，得到所述hGH-（EAAAK)5-RMP16。
其中，hGH 的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；RMP16为十一个肽(GAPAQTPSSQY)的16个重复序列组成的模拟树脂蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述接头为连接肽(EAAAK)5，其核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明中还提供了一种重组表达质粒pET30a（+）-hGH-（EAAAK)5-RMP16，所述质粒包括SEQ ID NO:2所示hGH-（EAAAK)5-RMP16的核苷酸序列。
本发明中还提供了一种重组菌，所述重组菌中含有上述重组表达质粒。
本发明中，还提供了一种制备重组生长激素的方法，所述方法为发酵培养上述重组菌，得到重组人生长激素。
其中，所述发酵培养的条件为：向LB培养基中添加0.2 mM的IPTG，在25℃下诱导培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
树脂蛋白（Resilin）是弹性蛋白家族的成员，包括类弹性蛋白、面筋、醇溶蛋白、外展蛋白和蜘蛛丝。Resilin在大多数昆虫角质层的特殊区域发现，在昆虫飞行、跳蚤和八角虫跳跃其重要作用，使昆虫具有低刚度、高应变能力和能够高效储存能源。Resilin具有耐高温，在100 ℃以内不会降解；对众多的变性剂如尿素、盐酸胍都不会降解。RMP16是一种模拟树脂蛋白（resilin-mimetic protein），来自于冈比亚按蚊resilin基因的共有序列，是十一个肽(GAPAQTPSSQY)的16个重复序列组成。
本发明中，生长激素连接RMP16，使生长激素具有的热稳定性和冷却凝集性，这种特性使蛋白只需经过冷却凝集简单的纯化过程就能获得目标蛋白，避免了亲和色谱层析法繁琐的实验过程，通过该特性可以实现生长激素的纯化，得到10倍的纯化倍数。
本发明通过基因修饰技术使生长激素通过连接肽（EAAAK)5连接RMP16，构建了hGH-（EAAAK)5-RMP16重组人生长激素，所述重组人生长激素具有热稳定性和冷却凝集的特性，使蛋白的纯化简化，只需经过盐析冷却离心等简单的过程就能获得目标蛋白，进而使重组人生长激素可以简单、快速、高效地自我纯化，纯化方式在效率上优于传统的镍柱亲和层析纯化方式，本发明所述重组人生长激素纯化倍数能够达到10倍，回收率可达到80%。
本发明中制备得到的重组人生长激素注射去垂体大鼠注射，注射第15和20天后，hGH-（EAAAK)5-RMP16组大鼠血清中生长激素含量分别比hGH组增加72.45%和98.78%；体重分别增加5.25%和7.17%。这表明hGH-（EAAAK)5-RMP16重组人生长激素提高了hGH代谢稳定性，延长了hGH的半衰期，能够增加hGH在组织内的停留时间，延长hGH的效果，减少给药频率。
附图说明
图1为重组表达质粒pET30a（+）hGH-（EAAAK)5-RMP16构建示意图。
图2为hGH-（EAAAK)5-RMP16诱导表达的SDS-PAGE图，图中，Ctrl：pET30a（+）质粒诱导表达的全菌；Lys：hGH-（EAAAK)5-RMP16诱导表达的裂解液；Pel：含hGH-（EAAAK)5-RMP16沉淀：Sup：含hGH-（EAAAK)5-RMP16的上清溶液。
图3为0 ℃下静置不同时间后hGH-（EAAAK)5-RMP16的SDS-PAGE图；图中，Ctrl：pET30a（+）质粒诱导表达的全菌；Lys：hGH-（EAAAK)5-RMP16诱导表达的裂解液；1，12，6，24为沉淀重悬Tris-HCl缓冲液置于0 ℃分别放置1、2、12、24 h出现的凝聚。
图4为0 ℃下静置不同时间后hGH-（EAAAK)5-RMP16回收率与纯化倍数。
图5为注射hGH-（EAAAK)5-RMP16和hGH后不同天数去垂体大鼠血液生长激素含量。
图6为注射hGH-（EAAAK)5-RMP16和hGH后不同天数去垂体大鼠体重变化图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法均是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂无特殊说明，均以首次表明的内容相同；所涉及到的是试剂、材料等如无特殊说明，均为商业途径获得。
实施例1：重组表达质粒pET30a（+）hGH-（EAAAK)5-RMP16的构建
生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成hGH-（EAAAK)5-RMP16，其中， hGH其核酸序列如SEQ ID NO:3；RMP16是一种模拟树脂蛋白（resilin-mimetic protein），其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码RMP16的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；接头（EAAAK)5为连接肽，其核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO:3：
ATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTC
SEQ ID NO:4：
GAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQY
SEQ ID NO:5：
GGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTAC
SEQ ID NO:6：
GAAGCTGCCGCAAAAGAGGCCGCAGCGAAGGAAGCCGCAGCTAAAGAGGCTGCAGCGAAGGAAGCGGCTGCAAAA。
将hGH-（EAAAK)5-RMP16构建到PUC18质粒（Novagen公司，美国）上，得到PUC-hGH-（EAAAK)5-RMP16质粒。将得到的hGH-（EAAAK)5-RMP16质粒序列的5’和3’分别带上Nde I和Xho I酶切位点，然后将带有Nde I和Xho I酶切位点的hGH-（EAAAK)5-RMP16核苷酸序列构建到pET30a（+）质粒（ Novagen公司，美国）上，记为pET30a（+）-hGH-（EAAAK)5-RMP16。
图1为重组质粒pET30a（+）- hGH-（EAAAK)5-RMP16的限制酶位点，具体操作为：使用Nde I和Xho I分别双酶切pET30a（+）质粒和PUC-hGH-（EAAAK)5-RMP16质粒，所述双酶切体系为：
Nde I：1 μL；
Xho I：1 μL；
10×Buffer：2 μL；
PUC- hGH-（EAAAK)5-RMP16或pET30a（+）：5 μL；
无菌水：补齐至20 μL；
将上述双酶切体系加入离心管中并混合均匀，在37 ℃下酶切2-3 h，然后按照胶回收试剂盒（宝生物工程有限公司，大连）的方法回收hGH-（EAAAK)5-RMP16基因片段和线性化的pET30a（+），接着把胶回收得到的hGH-（EAAAK)5-RMP16基因片段与质粒pET30a（+）通过T4连接酶（宝生物工程有限公司，大连）连接。所述连接体系为：
10×T4 Ligase buffer（宝生物工程有限公司，大连）：2 μL；
pET30a（+）：依回收浓度而定；
hGH-（EAAAK)5-RMP16：依回收浓度而定；
T4连接酶（10U/μL）（宝生物工程有限公司，大连）：1 μL；
无菌水：补齐至20μL；
按连接体系混合均匀后，在16 ℃的培养箱中进行连接反应，反应18 h左右，连接后得到重组质粒pET30a（+）-hGH-（EAAAK)5-RMP16，命名hGH-（EAAAK)5-RMP16重组质粒，所述hGH-（EAAAK)5-RMP16的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码hGH-（EAAAK)5-RMP16的核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1：
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQYGAPAQTPSSQY
SEQ ID NO:2：
ATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCGAAGCTGCCGCAAAAGAGGCCGCAGCGAAGGAAGCCGCAGCTAAAGAGGCTGCAGCGAAGGAAGCGGCTGCAAAAGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTACGGGGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTAC。
实施例2：扩大培养表达hGH-（EAAAK)5-RMP16的大肠杆菌
（1）将新鲜转化的重组大肠杆菌BL21转移至有50 μg/mL卡那霉素的固体LB培养基（琼脂粉15g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4）中，在37 ℃下培养过夜，然后将过夜培养后的单个菌落转移至5ml含有50 μg/ mL卡那霉素的液体LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4）中，并在37 ℃、00 rpm的轨道振荡器中培养过夜，接着将3 mL过夜培养的大肠杆菌BL21接种在300 mL含50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基在37 ℃，200 rpm下生长3小时或细菌的OD600达到0.4-0.6之间。
（2）将步骤（1）中最终得到的含重组大肠杆菌的液体LB培养基置于冰上20分钟，向其中添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度0.2 mM。然后将上述液体LB培养基分成三份，分别在16、25和37 ℃以180 rpm摇动培养16-20 h（过夜）来诱导重组hGH-（EAAAK)5-RMP16表达。最后将液体培养基在3000 rpm，4 ℃下离心20分钟弃上清，得到不同温度下培养的细胞沉淀物，将其保存在-80 ℃备用。
（3）将步骤（2）中三种培养温度下得到的细胞沉淀物解冻，分别重悬于10 mLTris-HCl（50 mM，pH 8.0）中，并在3000 rpm，4 ℃下离心20分钟后弃上清，收集菌体，菌体用50 mM pH值为8.0的Tris-HCl洗涤两次。然后将细胞重悬于含1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）（200 μL）的20 mL Tris-HCl缓冲液中，并使用超声细胞破碎仪在冰上超声裂解30分钟，接着6 s交替超声处理，并间歇冷却6 s，整个反应保证在冰水浴下进行，得到裂解液。超声结束后，裂解液4 ℃，14,000 rpm离心30 min，得到上清和沉淀，上清移至新的EP管中，保存上清和沉淀。
本实施例中，为了确定表达的hGH-（EAAAK)5-RMP16以可溶形式或包涵体形式存在将上述得到的裂解液、上清液和沉淀用于SDS-PAGE分析。图2为hGH-（EAAAK)5-RMP16诱导表达SDS-PAGE图，从图中可以看出，在25 ℃诱导条件下，hGH-（EAAAK)5-RMP16上清中目标大小45 kDa位置处明显增加一条条带，表达的蛋白有可能是包涵体，也有可能可溶性的。只有可溶性的蛋白才有活性，此处证明该蛋白存在于上清中，是可溶性表达。综上，表明诱导成功，获得可溶性重组hGH-（EAAAK)5-RMP16。
实施例3：冷却凝集纯化hGH -（EAAAK)5-RMP16
本实施例中利用冷却凝集法来纯化hGH-（EAAAK)5-RMP16，以此验证实施例2中制备的hGH的自纯化性能及其纯化效率。具体的操作步骤为：
将浓度为0.4-1.0 M的(NH4)2SO4加到500 μL含有可溶性蛋白的上清液中，混匀后置于冰上30-60 min，然后4 ℃、12000 rmp的条件下离心15 min，分离上清和沉淀，将沉淀重悬于Tris-HCl（50 mM，pH 8.0）缓冲液。将重悬的Tris-HCl缓冲液置于0℃放置1、2、12、24h，观察在不同温度下放置不同时间出现的凝聚层，吸取凝聚层即目标蛋白hGH-（EAAAK)5-RMP16。将凝聚层转移到新的EP管中，保存一部分纯化的样品用于SDS-PAGE分析。
图2为将重悬的Tris-HCl缓冲液置于0 ℃放置不同时间的SDS-PAGE图，结果表明静置1-24 h可以纯化GH-（EAAAK)5-RMP16蛋白，且12-24 h效果比较好。
图3是0℃放置不同时间化GH-（EAAAK)5-RMP16回收率与纯化倍数图，结果表明静置12-24 h后的GH-（EAAAK)5-RMP16纯化倍数和回收率分别可达到9.43、10.14倍和73.12%、79.12%，综上所述0 ℃放置12-24 h纯化效果最佳。
实施例4：生物学活性及长效检测
2 d内无菌条件下对幼龄大鼠（江苏大学实验动物中心提供）经咽旁入路手术摘除脑垂体，每只标记并称重，2 周后按中国药典法方法筛选合格动物。中国药典法：与术前体重相比，去脑垂体大鼠手术2周内(0~14 d) 体重变化小于10％的健康大鼠。
将上述方法筛选得到合格的去脑垂体大鼠随机分为空白对照（生理盐水）组、hGH实验组（1 mg/kg）和hGH-（EAAAK)5-RMP16组（1 mg/kg），每组30只。具体实验步骤为：实验前一天早晨大鼠开始禁食水，24 h后各组大鼠给予相应药物，药物用量为1 mg/kg，注射部位为大鼠的左后肢股四头肌处，连续注射3天。3次给药后于同一时间称重，与给药前体重相比，计算大鼠增重，绘制生长曲线。同时在3次注射结束后的第1天、第5天、第10天、第15天和第20天每组分别随机取5只，从眼球放血，分离血清后置-20 ℃待测。
生长激素酶联免疫试剂盒（Immunodiagnostic systems limited, USA）由上海鑫乐生物科技公司购得。使用该试剂盒检测血液中hGH的含量，血清中hGH浓度的检测按试剂盒说明进行。具体检测方法如下：将血液样本以不同稀释度进行稀释，最高达2000倍，然后将标准品和不同稀释度的标本加于反应板上，每孔100 μL，再加50 μL的抗体-生物素结合物，室温条件下以500-700 rpm在微量震荡器上振摇2 h，用洗液洗板5次，每孔加100 μl的酶反应物室温振摇30 min，再次洗板5次，每孔加100 μL的显色剂TMB，室温振摇10 min，每孔再加100 μl的终止液，即刻在酶标仪上于450 nm下测OD值，以620 nm为参考波长。以标准品绘制标准曲线，根据标本的OD值即可读出其生长激素含量。
图5为大鼠注射hGH和hGH-（EAAAK)5-RMP16后不同天数后血清中生长激素的含量。从图中可以看出注射第15和20天后，hGH-（EAAAK)5-RMP16组的血清中生长激素含量分别比hGH 组高72.45%和98.78%，显示hGH-（EAAAK)5-RMP16在大鼠体内停留时间显著长于hGH。表明 RMP16融合蛋白可提高蛋白代谢稳定性，延长蛋白半衰期，增加蛋白在组织内的停留时间，实现长效以减少给药频率。
图6为去垂体大鼠体重变化图。给药期间模型组大鼠由于生长激素缺乏，体重无变化，与模型组相比，各给药组大鼠体重均显著增加(P<0.01)，这是因为本发明得到的重组人生长激素长效，能够持久发挥作用，持续增加体重。此外，注射第15和20天后，hGH-（EAAAK)5-RMP16组体重分别比hGH增加5.25%和7.17%。
综上，本发明制备的hGH-（EAAAK)5-RMP16提高hGH代谢稳定性，延长hGH的半衰期，增加药物在组织内的停留时间，实现长效减少给药频率，同时可以简单、快速、高效地自我分离纯化。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种重组人生长激素及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50 55 60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
210 215 220
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
225 230 235 240
Ala Lys Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro
245 250 255
Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser
260 265 270
Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala
275 280 285
Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro
290 295 300
Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly
305 310 315 320
Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr
325 330 335
Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr
340 345 350
Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln
355 360 365
Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln
370 375 380
Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala
385 390 395 400
Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser
405 410 415
Gln Tyr
<210> 2
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg 60
cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg 120
ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc 180
tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc 240
tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag 300
ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg 360
agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta 420
aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg 480
actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac 540
gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag 600
acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt cgaagctgcc 660
gcaaaagagg ccgcagcgaa ggaagccgca gctaaagagg ctgcagcgaa ggaagcggct 720
gcaaaagggg caccggcgca aaccccgtct agccagtacg gggcaccggc gcaaaccccg 780
tctagccagt acggggcacc ggcgcaaacc ccgtctagcc agtacggggc accggcgcaa 840
accccgtcta gccagtacgg ggcaccggcg caaaccccgt ctagccagta cggggcaccg 900
gcgcaaaccc cgtctagcca gtacggggca ccggcgcaaa ccccgtctag ccagtacggg 960
gcaccggcgc aaaccccgtc tagccagtac ggggcaccgg cgcaaacccc gtctagccag 1020
tacggggcac cggcgcaaac cccgtctagc cagtacgggg caccggcgca aaccccgtct 1080
agccagtacg gggcaccggc gcaaaccccg tctagccagt acggggcacc ggcgcaaacc 1140
ccgtctagcc agtacggggc accggcgcaa accccgtcta gccagtacgg ggcaccggcg 1200
caaaccccgt ctagccagta cggggcaccg gcgcaaaccc cgtctagcca gtac 1254
<210> 3
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg 60
cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg 120
ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc 180
tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc 240
tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag 300
ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg 360
agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta 420
aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg 480
actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac 540
gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag 600
acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt c 651
<210> 4
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln
1 5 10 15
Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln
20 25 30
Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala
35 40 45
Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser
50 55 60
Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro
65 70 75 80
Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser
85 90 95
Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala
100 105 110
Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro
115 120 125
Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly
130 135 140
Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr
145 150 155 160
Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Ala Pro Ala Gln Thr Pro Ser Ser Gln Tyr
165 170 175
<210> 5
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggcaccgg cgcaaacccc gtctagccag tacggggcac cggcgcaaac cccgtctagc 60
cagtacgggg caccggcgca aaccccgtct agccagtacg gggcaccggc gcaaaccccg 120
tctagccagt acggggcacc ggcgcaaacc ccgtctagcc agtacggggc accggcgcaa 180
accccgtcta gccagtacgg ggcaccggcg caaaccccgt ctagccagta cggggcaccg 240
gcgcaaaccc cgtctagcca gtacggggca ccggcgcaaa ccccgtctag ccagtacggg 300
gcaccggcgc aaaccccgtc tagccagtac ggggcaccgg cgcaaacccc gtctagccag 360
tacggggcac cggcgcaaac cccgtctagc cagtacgggg caccggcgca aaccccgtct 420
agccagtacg gggcaccggc gcaaaccccg tctagccagt acggggcacc ggcgcaaacc 480
ccgtctagcc agtacggggc accggcgcaa accccgtcta gccagtac 528
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagctgccg caaaagaggc cgcagcgaag gaagccgcag ctaaagaggc tgcagcgaag 60
gaagcggctg caaaa 75

Claims (8)

1. 一种重组人生长激素，其特征在于，所述重组人生长激素记为hGH-（EAAAK)5-RMP16，所述hGH-（EAAAK)5-RMP16中hGH和RMP16通过连接肽（EAAAK)5连接；所述hGH-（EAAAK)5-RMP16的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码所述重组人生长激素hGH-（EAAAK)5-RMP16的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的重组人生长激素hGH-（EAAAK)5-RMP16，其特征在于，所述hGH的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3. 根据权利要求1所述的重组人生长激素hGH-（EAAAK)5-RMP16，其特征在于，所述RMP16氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4. 根据权利要求1所述的重组人生长激素hGH-（EAAAK)5-RMP16，其特征在于，所述接头为连接肽(EAAAK)5，其核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5. 一种重组表达质粒，其特征在于，所述质粒包括SEQ ID NO:2所示hGH-（EAAAK)5-RMP16的核苷酸序列。
6.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌中含有权利要求5所述重组表达质粒。
7.一种制备重组生长激素的方法，其特征在于，所述方法为发酵培养权利要求6所述的重组菌，得到重组人生长激素。
8.根据权利要求7所述的制备重组生长激素的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：向LB培养基中添加IPTG，在25℃下诱导培养。
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