CN112399861A - 在极性非水性溶剂中的交联的弹性体蛋白质及其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开了改进的交联的节肢弹性蛋白组合物和制备这些改进的组合物的方法。这些组合物和方法包括使节肢弹性蛋白组合物交联的新方法；极性非水性溶剂用于调节交联的节肢弹性蛋白固体组合物的材料特性的用途；以及节肢弹性蛋白泡沫组合物以及制备它的方法。

Description

在极性非水性溶剂中的交联的弹性体蛋白质及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年7月18日提交的第62/700,197号美国临时申请的优先权，该美国临时申请的全部内容以引用方式并入。

背景技术

弹性体蛋白质是表现出粘弹性机械特性的多肽，并且包括弹力蛋白(elastin)、节肢弹性蛋白、外展蛋白和章鱼动脉弹性体。节肢弹性蛋白是一种特别有趣的弹性体蛋白质，因为它在负载和卸载期间耗散非常少的能量。在许多昆虫中都发现了节肢弹性蛋白，并且低能量耗散使得许多昆虫物种具有非常有效地跳跃或扇动翅膀的非凡能力。节肢弹性蛋白的独特特性使其成为可具有许多工业应用的有趣的弹性体材料。因此，需要具有期望的机械特性并且适用于大规模、有效生产的新节肢弹性蛋白组合物以及制备所述新节肢弹性蛋白组合物的方法。

天然节肢弹性蛋白和节肢弹性蛋白样蛋白的变型(基于节肢弹性蛋白序列)已由许多小组在大肠埃希氏菌(E.coli)培养物中重组产生，并且已通过裂解细胞以提取重组表达的蛋白并使用亲和色谱技术进行纯化来分离(Elvin等人，2005；Charati等人，2009；McGann等人，2013)。重组产生的节肢弹性蛋白和节肢弹性蛋白样蛋白已经交联，从而靶向酪氨酸残基，所述酪氨酸残基也在天然节肢弹性蛋白中形成交联(参见例如Elvin等人，2005；Qin等人，2011)。重组产生的节肢弹性蛋白还被交联成靶向赖氨酸残基(Li等人，2011)或半胱氨酸残基(McGann等人，2013)。交联方法已包括酶催化的交联和光活化的交联。用于交联的酶促催化的酶可能难以从最终组合物中去除，而光活化的交联可能由于仅表面暴露于光而遭受低效率，同时还留下杂质。酶的杂质可使节肢弹性蛋白降解，而来自酶或光催化剂的留在最终固体交联组合物中的杂质可能会导致不期望的机械特性。因此，需要的是不会留下导致降解的杂质并且可以大规模有效地执行的使重组节肢弹性蛋白交联的新方法。

发明内容

本文公开了改进的交联的节肢弹性蛋白组合物和制备这些改进的组合物的方法。这些方法包括使节肢弹性蛋白组合物交联，以及使用极性非水性溶剂调节交联的节肢弹性蛋白固体组合物的材料特性的新方法。

在一些实施方案中，本文提供了一种使重组节肢弹性蛋白交联的方法，所述方法包括：提供包含纯化的重组节肢弹性蛋白的组合物；将所述重组节肢弹性蛋白置于包含过硫酸铵的交联溶液中；以及将在所述交联溶液中的所述重组节肢弹性蛋白在至少60℃的温度下孵育，从而产生交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物。

在一些实施方案中，孵育执行至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟、至少90分钟或至少2小时。

在一些实施方案中，将在所述交联溶液中的重组节肢弹性蛋白在60℃至85℃、70℃至85℃，或75℃至85℃的温度下孵育。

在一些实施方案中，孵育执行至少2小时。

在一些实施方案中，交联溶液不包含光催化剂或交联酶。

在一些实施方案中，交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物能够在室温下稳定超过5天、超过10天、超过20天，或超过40天。

在一些实施方案中，纯化的重组节肢弹性蛋白是通过如下方式来制备的：使编码所述重组节肢弹性蛋白的基因在培养物中的经修饰的生物体中重组表达，以及从所述培养物中纯化出表达的重组节肢弹性蛋白。

根据一些实施方案，本文还提供了一种组合物，所述组合物包含交联的重组节肢弹性蛋白，其中所述重组节肢弹性蛋白已经通过使所述节肢弹性蛋白暴露于过硫酸铵和热量中而发生交联。在一些实施方案中，所述组合物不包含交联酶。在一些实施方案中，所述组合物不包含光催化剂。

在一些实施方案中，本文提供了一种重组节肢弹性蛋白组合物，所述重组节肢弹性蛋白组合物包含在极性非水性溶剂中的交联的重组节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，极性非水性溶剂是质子溶剂。在一些实施方案中，质子溶剂选自由以下组成的组：甘油、丙二醇和乙二醇。在一些实施方案中，极性非水性溶剂是非质子溶剂。在一些实施方案中，非质子溶剂是DMSO。

在一些实施方案中，所述组合物包含20-40重量％的节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，所述节肢弹性蛋白为如通过尺寸排阻色谱法测得的以在所有节肢弹性蛋白中所占比例计的至少20％、至少50％、至少70％，或至少80％的全长节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，极性非水性溶剂为至少60体积％、至少70体积％、至少80体积％、至少90体积％、至少95体积％、至少98体积％，或至少99体积％的所述溶剂。

在一些实施方案中，所述重组节肢弹性蛋白组合物的弹性模量大于在水性溶剂中的相似的交联的重组节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物包含如使用Shore OO硬度计通过ASTM D2240测得的至少10的硬度。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物包含如使用Shore OO硬度计通过ASTM D2240测得的约10至约50的硬度。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物包含如通过ASTM D7121测得的约40％至约60％的反弹回复率(rebound resilience)。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物包含如通过ASTM D575测得的约6psi至约8psi的25％时的压缩应力。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物在如通过Zwick压缩测试所测量的低于2kN的压缩力下，没有经受从弹性到塑性的转变。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物是泡沫材料。

根据一些实施方案，本文还提供了一种制备重组节肢弹性蛋白固体的方法，所述方法包括：提供在水性溶剂中的交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物；以及用极性非水性溶剂交换所述水性溶剂。

在一些实施方案中，极性非水性溶剂是质子溶剂。在一些实施方案中，质子溶剂选自由以下组成的组：甘油、丙二醇和乙二醇。在一些实施方案中，极性非水性溶剂是非质子溶剂。在一些实施方案中，非质子溶剂是DMSO。

在一些实施方案中，溶剂交换执行至少8小时、至少16小时、至少24小时，或至少48小时。

在一些实施方案中，溶剂交换在约60℃下执行。

在一些实施方案中，所述交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物包含如通过尺寸排阻色谱法测得的以在所有节肢弹性蛋白中所占比例计的至少20％、至少50％、至少70％，或至少80％的全长节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，所述交联的重组固体组合物通过本文所述的过硫酸铵和热量方法来制备。

根据一些实施方案，本文还提供了一种调整包含交联的重组节肢弹性蛋白固体的固体组合物的材料特性的方法，所述方法包括：提供包含水性溶剂的交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物；以及执行溶剂交换以用极性非水性溶剂替换所述水性溶剂。在一些实施方案中，替换所述溶剂改变了交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物的弹性模量、回复率(resilience)、硬度、最大弹性压缩负荷或材料寿命。

根据一些实施方案，本文还提供了一种制备交联的重组节肢弹性蛋白固体的方法，所述方法包括：提供包含纯化的重组节肢弹性蛋白的组合物；将所述重组节肢弹性蛋白置于包含过硫酸铵的水性溶剂中；将在所述水性溶剂中的所述重组节肢弹性蛋白在至少60℃的温度下孵育，从而产生交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物；以及用选自由以下组成的组的极性非水性溶剂交换所述水性溶剂：甘油、丙二醇、乙二醇和DMSO。

根据一些实施方案，本文还提供了一种制备重组节肢弹性蛋白泡沫的方法，所述方法包括：提供在水性溶剂中的交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物；用极性非水性溶剂交换所述水性溶剂；以及将一个或多个气泡引入到交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物中。

在一些实施方案中，极性非水性溶剂是质子溶剂。在一些实施方案中，质子溶剂选自由以下组成的组：甘油、丙二醇和乙二醇。在一些实施方案中，极性非水性溶剂是非质子溶剂。在一些实施方案中，非质子溶剂是DMSO。

在一些实施方案中，溶剂交换执行至少8小时、至少16小时、至少24小时，或至少48小时。

在一些实施方案中，溶剂交换在约60℃下执行。

在一些实施方案中，所述交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物包含如通过尺寸排阻色谱法测得的以在所有节肢弹性蛋白中所占比例计的至少20％、至少50％、至少70％，或至少80％的全长节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，所述交联的重组固体组合物通过本文所述的过硫酸铵和热量方法(heat method)来制备。

在一些实施方案中，所述引入包括将发泡剂添加到交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物中。

在一些实施方案中，发泡剂包含化学发泡剂。在一些实施方案中，化学发泡剂包含碳酸氢钠、碳酸氢钾、铵、偶氮二甲酰胺、异氰酸酯、肼、异丙醇、5-苯基四唑、三唑、4,4'-氧双(苯磺酰肼)(OBSH)、三肼基均三嗪(THT)、磷酸氢盐、酒石酸、柠檬酸和甲苯磺酰氨基脲(TSS)。在一些实施方案中，化学发泡剂包含碳酸氢钠。

在一些实施方案中，发泡剂包含物理发泡剂。在一些实施方案中，物理发泡剂包含氯氟烃(CFC)、溶解的氮、N₂、CH₄、H₂、CO₂、Ar、戊烷、异戊烷、己烷、二氯甲烷和二氯四氟乙烷。在一些实施方案中，物理发泡剂包含溶解的氮。

根据一些实施方案，本文提供了一种用于生产包含重组节肢弹性蛋白的组合物的方法，所述方法包括：在发酵物中培养重组宿主细胞群，其中所述重组宿主细胞包含含有分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体，并且其中所述重组宿主细胞分泌由所述分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码的重组节肢弹性蛋白；以及从所述发酵物中纯化出所述重组节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白是全长或截短的天然节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，天然节肢弹性蛋白来自选自由以下组成的组的生物体：果蝇(Drosophilasechellia)、切叶蚁(Acromyrmex echinatior)、晏蜓属(Aeshna)、西方角蝇(Haematobiairritans)、猫栉首蚤(Ctenocephalides felis)、欧洲熊蜂(Bombus terrestris)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、西方蜜蜂(Apis mellifera)、丽蝇蛹集金小蜂(Nasoniavitripennis)、人体虱(Pediculus humanus corporis)、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)、刺舌蝇(Glossina morsitans)、巨首芭切叶蚁(Atta cephalotes)、达氏按蚊(Anopheles darlingi)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、黑果蝇(Drosophila virilis)、榕果蝇(Drosophila erecta)、长须罗蛉(Lutzomyia longipalpis)、长红锥蝽(Rhodniusprolixus)、红火蚁(Solenopsis invicta)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae)和短管赤眼蜂(Trichogramma pretiosum)。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含SEQ IDNO:4。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含α交配因子分泌信号。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含FLAG标签。在一些实施方案中，载体包含多于一个分泌的节肢弹性蛋白编码序列。

在一些实施方案中，重组宿主细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，酵母细胞是甲基营养型酵母细胞。在一些实施方案中，重组宿主细胞是选自由以下组成的组的物种：巴斯德毕赤酵母(巴斯德驹形氏酵母)(Pichia(Komagataella)pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、树干毕赤酵母(树干舍费尔斯氏酵母)(Pichia(Scheffersomyces)stipitis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

在一些实施方案中，重组宿主细胞以大于2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时的速率产生重组节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，重组宿主细胞具有大于50％的重组节肢弹性蛋白与由重组宿主细胞表达的总重组节肢弹性蛋白相比的分泌分数。在一些实施方案中，重组宿主细胞以大于2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时的速率分泌重组节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，在所述发酵物中，大于80％的重组节肢弹性蛋白在重组宿主细胞外部。在一些实施方案中，发酵物包含至少2g重组节肢弹性蛋白/L。

在一些实施方案中，纯化所述重组节肢弹性蛋白包括：通过对所述发酵物进行离心来产生第一沉淀级分和第一上清液级分；以及从所述第一沉淀级分中分离出重组节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，纯化所述重组节肢弹性蛋白进一步包括：向第一沉淀级分中添加离液剂以产生其中重组节肢弹性蛋白可溶的溶液；通过离心包含所述离液剂的第一沉淀级分来产生第二上清液级分和第二沉淀级分；以及从所述第二上清液级分中分离出可溶的全长节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，本文提供了一种包含分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码全长或截短的天然节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码经修饰的全长或截短的天然节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，经修饰的节肢弹性蛋白包括能够与另一种节肢弹性蛋白交联的氨基酸残基的添加、减去、替换或位置改变。

在一些实施方案中，全长或截短的天然节肢弹性蛋白来自选自由以下组成的组的生物体：果蝇(Drosophila sechellia)、切叶蚁(Acromyrmex echinatior)、晏蜓属(Aeshna)、西方角蝇(Haematobia irritans)、猫栉首蚤(Ctenocephalides felis)、欧洲熊蜂(Bombus terrestris)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、西方蜜蜂(Apis mellifera)、丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)、人体虱(Pediculus humanus corporis)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、刺舌蝇(Glossina morsitans)、巨首芭切叶蚁(Attacephalotes)、达氏按蚊(Anopheles darlingi)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、黑果蝇(Drosophila virilis)、榕果蝇(Drosophila erecta)、长须罗蛉(Lutzomyialongipalpis)、长红锥蝽(Rhodnius prolixus)、红火蚁(Solenopsis invicta)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae)和短管赤眼蜂(Trichogramma pretiosum)。

在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码包含SEQ ID NO:1的多肽。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码包含SEQ ID NO:4的多肽。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码包含一个或多个A重复序列或准A重复序列的重组节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码包含一个或多个B重复序列或准B重复序列的重组节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码包含一个或多个A重复序列或准A重复序列或者一个或多个B重复序列或准B重复序列，但不同时包含两者的重组节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码包含一个或多个A重复序列或准A重复序列以及一个或多个B重复序列或准B重复序列的重组节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白进一步包含几丁质结合结构域。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码包含α交配因子分泌信号的多肽。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列包含FLAG标签。

在一些实施方案中，载体包含多于一个分泌的节肢弹性蛋白编码序列。在一些实施方案中，载体包含3个分泌的节肢弹性蛋白编码序列。在一些实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列可操作地连接至组成型或诱导型启动子。

根据一些实施方案，本文还提供了一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含一种或多种含有分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体。在一些实施方案中，重组宿主细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，酵母细胞是甲基营养型酵母细胞。在一些实施方案中，重组宿主细胞是选自由以下组成的组的物种：巴斯德毕赤酵母(巴斯德驹形氏酵母)(Pichia(Komagataella)pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、树干毕赤酵母(树干舍费尔斯氏酵母)(Pichia(Scheffersomyces)stipitis)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

在一些实施方案中，重组宿主细胞包含3种含有分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体。

在一些实施方案中，重组宿主细胞以大于2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时的速率产生重组节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，重组宿主细胞具有大于50％的重组节肢弹性蛋白分泌分数。在一些实施方案中，重组宿主细胞以大于2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时的速率分泌重组节肢弹性蛋白。

根据一些实施方案，本文还提供了一种发酵物，所述发酵物包含重组宿主细胞和适合于使所述重组宿主细胞生长的培养基，所述重组宿主细胞包含一种或多种含有分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体。

在一些实施方案中，所述发酵物包含至少2g重组节肢弹性蛋白/L。

在所述发酵物的一些实施方案中，大于80％的重组节肢弹性蛋白在重组宿主细胞外部。

在所述发酵物的一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白是全长重组节肢弹性蛋白。

根据一些实施方案，本文还提供了一种组合物，所述组合物包含来源于发酵物的重组节肢弹性蛋白，所述发酵物包含重组宿主细胞和适合于使所述重组宿主细胞生长的培养基，所述重组宿主细胞包含一种或多种含有分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体。在一些实施方案中，所述组合物包含至少60重量％的重组节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，所述组合物与包含相似量的天然节肢弹性蛋白的组合物相比具有相似的特性。在一些实施方案中，所述组合物与包含相似量的天然节肢弹性蛋白的组合物相比具有不同的特性。

在一些实施方案中，所述组合物包含大于50％的回复率。在一些实施方案中，所述组合物具有小于10MPa的压缩弹性模量。在一些实施方案中，所述组合物具有小于10MPa的拉伸弹性模量。在一些实施方案中，所述组合物具有小于1MPa的剪切模量。在一些实施方案中，所述组合物具有大于1％的断裂伸长率。在一些实施方案中，所述组合物具有大于0.1kPa的最大拉伸强度。在一些实施方案中，所述组合物具有小于90的Shore OO硬度。在一些实施方案中，所述组合物包含全长节肢弹性蛋白。

根据一些实施方案，本文还提供了一种用于生产包含重组节肢弹性蛋白的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在促进重组节肢弹性蛋白从重组宿主细胞分泌的条件下培养所述重组宿主细胞以产生发酵物，所述重组宿主细胞包含一种或多种含有分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体。

在一些实施方案中，用于生产包含重组节肢弹性蛋白的组合物的方法进一步包括纯化所述重组节肢弹性蛋白以产生全长天然节肢弹性蛋白的步骤。在一些实施方案中，纯化所述重组节肢弹性蛋白以产生全长天然节肢弹性蛋白包括：通过对所述发酵物进行离心以产生第一沉淀级分和第一上清液级分；以及从所述第一沉淀级分中分离出重组节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，从第一沉淀级分中分离出重组节肢弹性蛋白包括：向第一沉淀级分中添加离液剂以产生其中重组节肢弹性蛋白可溶的溶液；通过离心包含所述离液剂的第一沉淀级分来产生第二上清液级分和第二沉淀级分；以及从所述第二上清液级分中分离出重组节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，用于生产包含重组节肢弹性蛋白的组合物的方法进一步包括使多个所述重组节肢弹性蛋白交联的步骤。在一些实施方案中，所述交联是酶促交联。在一些实施方案中，所述交联是光化学交联。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含全长节肢弹性蛋白。

根据一些实施方案，本文还提供了一种发酵物，所述发酵物包含培养基和重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含载体，其中所述载体包含分泌的节肢弹性蛋白编码序列，并且其中所述重组宿主细胞以至少2mg/g干细胞重量/小时的速率分泌重组节肢弹性蛋白。

附图说明

如附图中所例示，根据以下对本发明的特定实施方案的描述，前述和其他目的、特征和优点将变得显而易见，在附图中，贯穿不同的视图相同的附图标记指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在说明本发明的各种实施方案的原理上。

图1示意性地示出了示例性节肢弹性蛋白的结构。

图2是用于生产包含重组节肢弹性蛋白的组合物的方法的流程图。

图3是包含3个分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体的例示性谱图。

图4示出了包含呈各种形状和形式的交联的经纯化重组节肢弹性蛋白的蛋白质性嵌段共聚物的照片。

图5示出了包含交联的重组节肢弹性蛋白的蛋白质性嵌段共聚物的压缩的照片。

图6示出了如使用对节肢弹性蛋白上的FLAG标签具有特异性的抗体通过ELISA测得的通过以下方式交联的节肢弹性蛋白固体组合物的总降解的节肢弹性蛋白：经由过硫酸铵加上热量(AP)交联；经由过硫酸铵加上热量交联并洗涤3次以去除过量的交联溶液(AP 3次洗涤)；以及经由辣根过氧化物酶(HRP)进行酶促交联而交联。

图7示出了具有10重量％的气相法二氧化硅(左)和5重量％的气相法二氧化硅(右)的节肢弹性蛋白泡沫的照片。

图8示出了具有5重量％的气相法二氧化硅的节肢弹性蛋白泡沫的照片。纳入25美分硬币以进行比较。

图9示出了基于甘油和基于水的交联的节肢弹性蛋白组合物在交联后(上)和7天不密封存储一周后(下)的的图像。

图10A、图10B和图10C描绘了如通过流变仪针对以下交联的节肢弹性蛋白组合物测得的应力应变曲线：通过60％的甘油溶剂交换以及之后100％的甘油溶剂交换制备的27重量％的在甘油溶剂中的节肢弹性蛋白(图10A)；27重量％的在丙二醇溶剂中的节肢弹性蛋白(图10B)；以及27％的在丙二醇溶剂中的全长节肢弹性蛋白(即，以在所有节肢弹性蛋白中所占比重计的约80％的全长节肢弹性蛋白)(图10C)。

图11示出了具有5重量％的气相法二氧化硅的节肢弹性蛋白泡沫的应力应变曲线。

图12示出了通过流变仪针对以下交联的节肢弹性蛋白固体组合物中的每一者测得的回复率和弹性模量的相对值的图：20重量％的节肢弹性蛋白，丙二醇(“A”)；27重量％的节肢弹性蛋白，丙二醇(“B”)；40重量％的节肢弹性蛋白，丙二醇(“C”)；节肢弹性蛋白凝聚体，丙二醇(“D”)；27重量％的全长节肢弹性蛋白，丙二醇(“E”)；27重量％的节肢弹性蛋白，60-100％的甘油(“F”)；27重量％的节肢弹性蛋白，100％的甘油(“H”)；以及27重量％的节肢弹性蛋白，乙二醇(“I”)。

图13示出了如从Zwick拉伸测试仪针对以下交联的节肢弹性蛋白固体中的每一者测得的施加力与应变曲线的图：27重量％的节肢弹性蛋白乙二醇固体(“A”)；27重量％的节肢弹性蛋白丙二醇固体(“C”)；凝聚节肢弹性蛋白丙二醇固体(“D”)；27重量％的节肢弹性蛋白60-100％的甘油固体(“G”)；以及27重量％的节肢弹性蛋白100％的甘油固体(“H”)。

这些附图仅出于说明的目的描绘了本公开的各种实施方案。本领域的技术人员将从下面的讨论中容易地认识到，在不脱离本文所描述的原理的情况下，可以采用本文所示的结构和方法的可替代实施方案。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了本发明的各种实施方案的细节。本发明的其他特征、目的和优点从说明书和附图以及从权利要求书中将显而易见。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

除非本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则如本文所用的术语“一个/种”和“一”和“该/所述”以及类似的指代均指单数和复数两者。

术语“约”、“大约”或“类似于”是指在如由本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述可接受误差范围可部分取决于如何测量或测定所述值，或者取决于测量系统的限制。应当理解的是，下面描述的所有范围和数量都是近似值，并且并非旨在限制本发明。在使用范围和数字的情况下，它们可以近似为包括统计范围或测量误差或变化。例如，在一些实施方案中，测量值可为正负10％。

氨基酸可以用它们的单字母代码或它们的三字母代码来指代。单字母代码、氨基酸名称和三字母代码如下：G-甘氨酸(Gly)、P-脯氨酸(Pro)、A-丙氨酸(Ala)、V-缬氨酸(Val)、L-亮氨酸(Leu)、I-异亮氨酸(Ile)、M-蛋氨酸(Met)、C-半胱氨酸(Cys)、F-苯丙氨酸(Phe)、Y-酪氨酸(Tyr)、W-色氨酸(Trp)、H-组氨酸(His)、K-赖氨酸(Lys)、R-精氨酸(Arg)、Q-谷氨酰胺(Gln)、N-天冬酰胺(Asn)、E-谷氨酸(Glu)、D-天冬氨酸(Asp)、S-丝氨酸(Ser)、T-苏氨酸(Thr)。

术语“包括”、“含有”、“具有”、“带有”或它们的变体旨在以类似于术语“包含”的方式为包含性的。

如本文所用的术语“微生物(microbe)”是指微生物体(microorganism)，并且是指单细胞生物体。如本文所用，所述术语包括所有细菌、所有古细菌、单细胞原生生物、单细胞动物、单细胞植物、单细胞真菌、单细胞藻类、所有原生动物和所有假菌界。

如本文所用的术语“天然”是指在自热中以其天然、未修饰状态存在的组合物。

术语“任选的”或“任选地”意指特征或结构可存在或可不存在，或者事件或情况可发生或可不发生，并且意指该描述包括特定特征或结构存在的实例以及该特征或结构不存在的实例，或者所述事件或所述情况发生的实例以及所述事件或所述情况不发生的实例。

如本文所用的术语“分泌分数”是指由细胞分泌的重组节肢弹性蛋白与由细胞产生的总节肢弹性蛋白相比的分数。

如本文所用的术语“分泌信号”是指短肽，所述短肽当与多肽融合时介导所述多肽从细胞的分泌。

如本文所用的术语“分泌的节肢弹性蛋白编码序列”是指编码如本文所提供的节肢弹性蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列在其N-末端与分泌信号融合并且任选地在其C-末端与标签肽或多肽融合。

如本文所用的关于多肽(例如，节肢弹性蛋白)的术语“重组”是指在重组宿主细胞中产生的多肽，或从重组核酸合成的多肽。

如本文所用的术语“重组宿主细胞”是指包含重组核酸的宿主细胞。

如本文所用的术语“重组核酸”是指被从其天然存在的环境中取出的核酸；或与当其在自然界中被发现时与其邻接或邻近的核酸的全部或部分不相关联的核酸；或与其在自然界中未连接至的核酸可操作连接的核酸；或在自然界中不存在的核酸；或含有在自然界中在其中未发现的修饰(例如，通过人工干预人工地引入的插入、缺失或点突变)的核酸；或在异源位点整合到染色体中的核酸。该术语包括克隆的DNA分离物和包含化学合成的核苷酸类似物的核酸。

如本文所用的术语“载体”是指这样的核酸分子，所述核酸分子能够转运已与所述核酸分子连接的另一核酸。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒一般是指附加DNA区段可被扎结到其中的环状双链DNA环，但是所述质粒也包括线性双链分子，诸如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增或用限制性酶处理环状质粒得到的那些分子。其他载体包括噬菌体、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将附加的DNA区段扎结到病毒基因组中。某些载体能够在它们引入到的细胞中自主复制(例如，具有在细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以在被引入到细胞中后被整合到细胞基因组中，并从而与细胞基因组一起被复制。

如本文所用的关于氨基酸或核酸序列的术语“重复序列”是指在多核苷酸或多肽(例如，串联序列)中多于一次地出现的子序列。多核苷酸或多肽可具有重复序列的直接重复而不含有任何间插序列，或者可以具有含有间插序列的重复序列的非连续重复。如本文所用的关于氨基酸或核酸序列的术语“准重复序列”是在多核苷酸或多肽上不精确重复的子序列(即，其中准重复子序列的一些部分在准重复序列之间是可变的)。重复多肽和DNA分子(或多肽或DNA分子的一部分)可以由重复子序列(即精确重复序列)或准重复子序列(即不精确重复序列)组成。

如本文所用的术语“天然节肢弹性蛋白”是指由昆虫产生的弹性体多肽或蛋白质。天然节肢弹性蛋白的非限制性示例的GenBank登录号包括以下NCBI序列号：NP 995860(果蝇)、NP 611157(果蝇)、Q9V7U0(果蝇)、AAS64829、AAF57953(果蝇)、XP 001817028(赤拟谷盗)和XP001947408(豌豆蚜)。

如本文所用的术语“经修饰的”是指在组成上与天然蛋白质或多肽序列不同的蛋白质或多肽序列，其中功能特性被保留在天然蛋白质或多肽特性的10％以内。在一些实施方案中，经修饰的蛋白质或多肽与天然蛋白质或多肽之间的差异可在一级序列中(例如，一个或多个氨基酸被去除、插入或取代)或者在翻译后修饰中(例如，糖基化、磷酸化)。氨基酸缺失是指一个或多个氨基酸从蛋白质中去除。氨基酸插入是指一个或多个氨基酸残基被引入在蛋白质或多肽中。氨基酸插入可包括N-末端和/或C-末端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。氨基酸取代包括非保守或保守取代，其中保守氨基酸取代表在本领域中是众所周知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编著))。在一些实施方案中，经修饰的蛋白质或多肽与天然蛋白质或多肽的氨基酸或核苷酸序列同一性为所述氨基酸或核苷酸碱基的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。

如本文所用的术语“截短的”是指长度比天然蛋白质或多肽短的蛋白质或多肽序列。在一些实施方案中，截短的蛋白质或多肽可以是天然蛋白质或多肽的长度的大于10％，或大于20％，或大于30％，或大于40％，或大于50％，或大于60％，或大于70％，或大于80％，或大于90％。

如本文所用的术语“同源物”或“基本上相似性”当关于多肽、核酸或其片段时，是指当在合适的氨基酸或核苷酸插入或缺失存在下与另一个氨基酸或核酸(或其互补链)进行最佳比对时，如通过如上所讨论的任何众所周知的序列同一性算法(例如FASTA、BLAST或Gap)所测得的，在至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％的氨基酸或核苷酸碱基中存在氨基酸或核苷酸序列同一性。

如本文所用的术语“节肢弹性蛋白”是指能够交联以形成弹性体的蛋白质或多肽，其中所述蛋白质或多肽是天然节肢弹性蛋白，或经修饰的天然节肢弹性蛋白，或被截短的天然节肢弹性蛋白。本发明的节肢弹性蛋白优选是重组节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含编码节肢弹性蛋白或节肢弹性蛋白片段(例如，从昆虫中分离的节肢弹性蛋白或节肢弹性蛋白片段)的天然或经修饰的(例如，截短的或串联的)核苷酸序列，其是由宿主细胞异源表达和分泌的。在优选的实施方案中，分泌的重组节肢弹性蛋白是从宿主细胞外部的溶液中收集的。在一些实施方案中，节肢弹性蛋白为泡沫材料，例如固体泡沫的形式。

如本文所用的术语“弹性体”是指这样的聚合物，其具有粘弹性并且通常具有弱的分子间力(分子之间的共价交联(如果分子之间的共价交联存在的话)除外)。粘弹性是材料在经历变形时表现出粘性和弹性特征两者，并且因此表现出时间依赖性应变的特性。弹性与有序固体中沿晶面的键伸展有关，而粘度是无定形材料内部的原子或分子扩散的结果。因此，与其他材料相比，粘弹性的弹性体一般具有低的杨氏模量和高的破坏应变。由于材料的粘性组分，粘弹性材料在施加载荷然后去除载荷时会耗散能量。这种现象被观察到为粘弹性材料的应力-应变曲线中的滞后。当施加载荷时，会出现特定的应力-应变曲线，而当载荷被移除时，卸载后的应力-应变曲线与负载期间的应力-应变曲线不同。耗散的能量是负载曲线与卸载曲线之间的面积。

如本文所用，术语“非水性”是指主要包含一种或多种非水的化合物的溶剂。这包括已经历与溶剂的溶剂交换过程的组合物，所述溶剂交换过程导致作为溶剂存在的水的比例总体降低，即水已经被作为溶剂的非水分子替换。在一些实施方案中，非水性溶剂是包含少于50％的水的溶剂。如本文针对交联的节肢弹性蛋白组合物的溶剂使用的极性非水性溶剂是指能够溶解节肢弹性蛋白的任何非水性溶剂。

除非本文另有指示，否则本文中对值范围的列举仅旨在用作单独地提及包含性地落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值均被并入在本说明书中，如同其在本文中被单独地列举一样。

节肢弹性蛋白组合物

本文提供了包含重组节肢弹性蛋白的组合物及其生产方法。

与基于石油的弹性体相比，节肢弹性蛋白具有许多独特的特性。最显著的是，节肢弹性蛋白具有极端的弹性效率(即，回复率)，其中输入到变形中的能量中的非常少的能量作为热量损失。节肢弹性蛋白的其他合乎需要的特性包括例如压缩弹性模量、拉伸弹性模量、剪切模量、硬度、反弹(rebound)和压缩永久变形。此外，节肢弹性蛋白是一种蛋白质，因此可以被生物降解，这使所述节肢弹性蛋白比基于石油的聚合物更环保。此外，节肢弹性蛋白是生物可相容的，因此可用于涉及与人或动物接触的应用中。最后，可以通过改变蛋白质序列、蛋白质结构、分子间交联的量和加工变量来调整重组节肢弹性蛋白的机械特性，以生产出针对各种特定用途设计的弹性体。

在一些实施方案中，本文提供了具有所需机械特性的交联的节肢弹性蛋白组合物以及生产它们的方法。在一些实施方案中，本文提供了使节肢弹性蛋白组合物交联以形成交联的节肢弹性蛋白固体的方法，所述交联的节肢弹性蛋白固体可以大批量有效地执行并且不易受由交联反应留下的杂质引起的降解的影响。在一些实施方案中，所述交联反应包括使所述节肢弹性蛋白暴露于过硫酸盐，例如过硫酸铵。可以施加热量以引发由过硫酸盐催化的交联反应。这种类型的交联反应不会在组合物中留下任何光活性的或酶促化合物。此外，该交联反应不需要光活化，因此可以有效地生产大批量，而无需光到达交联溶液的所有部分。在一些实施方案中，交联发生在器皿或模具中，使得获得的重组节肢弹性蛋白组合物具有特定的形状或形式。

本文所提供的交联的节肢弹性蛋白固体组合物还包括这样的交联的节肢弹性蛋白组合物，所述交联的节肢弹性蛋白组合物包含极性非水性溶剂以提供在某些应用中优选的期望机械特性，例如弹性模量、硬度、最大弹性压缩负荷、回复率和材料寿命/疲劳。在一些实施方案中，通过执行与节肢弹性蛋白组合物的溶剂交换以用非水性溶剂代替水性溶剂来制备组合物。能够与交联的节肢弹性蛋白进行溶剂交换的溶剂包括溶解非交联形式的节肢弹性蛋白的溶剂。

在优选的实施方案中，非水性溶剂是非挥发性的并且是水溶性的或极性的。在一些实施方案中，所述溶剂的分子量为约100或更小。在一些实施方案中，极性非水性溶剂包括甘油、丙二醇、乙二醇或DMSO。在一些实施方案中，使用极性非水性溶剂梯度(例如，从60％至100％的甘油)进行溶剂交换。

在一些实施方案中，本文所述的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于提供具有改善的物理特性的组合物，所述改善的物理特性包括例如根据需要从施加的力中吸收能量。在一些实施方案中，本文所述的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于改善含有橡胶的现有产品。具体地，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物中的一些交联的节肢弹性蛋白组合物可以吸收大量的力，而不会转变为非弹性材料。

在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用作中底(mid-sole)。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用作高尔夫球的芯的一部分。在其他实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于手柄或握把，例如运动装备(诸如高尔夫球杆或网球拍)的手柄或握把中、用作自行车握把或摩托车握把，或者用作用于工具和工业用途(例如锤子、射钉枪、手提钻和任何其他优选吸收并返回能量的工具)的握把。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于套管或阻尼器，例如滑板卡车或硬盘盘片振动阻尼器。在一些实施方案中，交联的节肢弹性蛋白组合物可用作用于轮子的优异材料，例如用于滑板、滚轴溜冰鞋或踏板车的优异材料。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于安全防护装置，例如用于防护装备(例如头盔、护肘或护膝或安全帽)的垫料，或者用作保护皮肤免受擦伤的防护性外层。

在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于汽车零件(例如悬架部件，诸如衬套或减震器)，或用于内部缓冲，例如座椅垫和腰部支撑。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于轮胎和内胎。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于超压轮胎(suberball)。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于鞋子的内底、中底和外底。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于有衬垫毡(padded mat)中。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于几种类型的垫圈或O形环。在一些实施方案中，可以将本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物添加到塑料物品中以增加它们的抗冲击性。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于保护性外壳，例如电话或平板电脑外壳。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于橡皮图章。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于辊。在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于橡胶带。

在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物可用于鞋底、地下室层面、录音室的噪声防护、车档、缓冲垫、门口毡、瑜伽毡、鼓垫、刮雨器、汽车轮胎、消防软管、电线绝缘层、橡胶带、橡皮鸭、弹性手套、炊具、雨鞋、磨牙玩具、自行车轮胎、手表、广口瓶、垫圈、发带、夹趾拖鞋、手机壳、健身球、弹力球、用于防止水或灰尘污染的电子设备密封件、冰箱或冰柜门密封条、用于防止空气流入或流出腔室的密封条、蹦床、奶嘴(pacifier)、窗户密封条、万圣节面具、花园用软管、乒乓球拍、传送带、管道、图章、气球、用于护理和保护皮肤和头发的化妆品组合物、指甲组合物，或用于装饰性化妆品的制备物。

合适的皮肤化妆品组合物为例如面部滋补品(face tonics)、面膜(例如片状面膜)、除臭剂和其他化妆品乳液。用于装饰性化妆品的组合物包括例如遮瑕棒、舞台化妆品、睫毛膏和眼影、口红、眼线笔、眼线膏、腮红、散粉和眉笔。

取决于使用领域，本文所述的组合物可以以适用于皮肤护理的形式施用，例如作为霜剂、泡沫、凝胶、棒、摩丝、奶液(milk)、喷雾剂(泵喷雾剂或含推进剂的喷雾剂)或乳液施用。

图1示出了天然节肢弹性蛋白的示例，所述天然节肢弹性蛋白含有N-末端A-结构域，所述N-末端A-结构域包含多个含有共有氨基酸序列YGXP的重复单元(“A重复序列”)，其中X为任何氨基酸；几丁质结合型RR-2(C)结构域(Pfam参考PF00379；Rebers JE&Willis,JH.A conserved domain in anthropod cuticular proteins binds chitin.InsectBiochem Mol Biol 31:1083-1093)；以及C-末端B结构域，所述C-末端B结构域包含多个含有共有氨基酸序列UYZXZ的重复单元(“B重复序列”)，其中U为甘氨酸或丝氨酸；Z为丝氨酸、甘氨酸、精氨酸或脯氨酸；并且X为任何氨基酸。并非所有天然存在的节肢弹性蛋白都具有A结构域、C结构域和B结构域。由各种昆虫产生的天然节肢弹性蛋白通常在A结构域和/或B结构域内具有不精确的重复序列(即准重复序列)，其中准重复序列之间存在一些氨基酸差异。

在一些实施方案中，本文提供的重组节肢弹性蛋白包含一个或多个A重复序列。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含N-末端A结构域，所述N-末端A结构域包含多个A重复和/或准A重复氨基酸子序列的嵌段，每个A重复和/或准A重复氨基酸子序列均具有共有序列SXXYGXP，其中S为丝氨酸，X为氨基酸，Y为酪氨酸，G为甘氨酸，并且P为脯氨酸。

在一些实施方案中，本文提供的重组节肢弹性蛋白包含一个或多个B重复序列。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含C-末端B结构域，所述C-末端B结构域包含多个B重复和/或准B重复氨基酸子序列的嵌段，每个B重复和/或准B重复氨基酸子序列均具有共有序列GYZXZZX和/或SYZXZZX，其中G为甘氨酸；Y为酪氨酸；Z为丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸或精氨酸；S为丝氨酸；并且X为任何氨基酸。

在一些实施方案中，本文提供的重组节肢弹性蛋白包含一个或多个A重复序列。在一些此类实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含介于1个与100个之间的A重复序列，或2个至50个A重复序列，或5个至50个A重复序列，或5个至20个A重复序列。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含一个或多个由下式描述的共有序列，

(X₁-X₂-X₃-X₄)_n (1)

其中括号描述了共有序列的重复序列或准重复序列；

其中n描述了A重复序列或准A重复序列的数目，并且为1至100，或2至50，或5至50，或5至20；

其中X₁为长度为4个氨基酸的基序，其中X₁的第一氨基酸为Y，并且其中X₁的剩余氨基酸为GAP、GLP、GPP、GTP，或GVP；

其中X₂为长度为3至20个氨基酸的基序；

其中X₂包含GGG、GGGG、N、NG、NN、NGN、NGNG、GQGG、GQGN、GQGQ、GQGQG，或3个或更多个甘氨酸残基，或者其中X₂的残基中的50％或更多为甘氨酸或天冬酰胺，或者其中X₂的残基中的60％或更多为甘氨酸或天冬酰胺，或者其中X₂的残基中的70％或更多为甘氨酸或天冬酰胺，或者其中X₂的残基中的80％或更多为甘氨酸或天冬酰胺；

其中X₃是长度为2个至6个氨基酸的基序，其中X₃为GG、LS、APS、GAG、GGG、KPS、RPS或GGGG；并且

其中X₄是长度为1个至2个氨基酸的基序，其中X₄为S、D、T、N、L、DS、DT、LS、SS、ST、TN或TS。

在一些此类实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含基序X₁、X₂、X₃和X₄，而在其他实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含基序X₁、X₂、X₃或X₄，或它们的组合。

在一些实施方案中，本文提供的重组节肢弹性蛋白包含一个或多个B重复序列。在一些此类实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含介于1个与100个之间的B重复序列，或2个至50个A重复序列，或5个至50个A重复序列，或5个至20个A重复序列。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含一个或多个由下式描述的共有序列，

(X₁₁-X₁₂-X₁₃)_m (2)

其中括号描述了共有序列的重复序列或准重复序列；

其中m描述B重复序列或准B重复序列的数量，并且为1至100；

其中X₁₁是长度为1个至5个氨基酸的基序，第一氨基酸为Y，并且其中其余氨基酸可包含GAP、GPP、SSG或SGG；

其中X₁₂是长度为2个至5个氨基酸的基序，并且包含GQ、GN、RPG、RPGGQ、RPGGN、SSS、SKG或SN；并且

其中X₁₃是长度为4个至30个氨基酸的基序，并且包含GG、DLG、GFG、GGG、RDG、SGG、SSS、GGSF、GNGG、GGAGG或3个或更多的甘氨酸残基，或者所述残基中的30％或更多的残基为甘氨酸，或者所述残基中的40％或更多的残基为甘氨酸，或者所述残基中的50％或更多的残基为甘氨酸，或者所述残基中的60％或更多的残基为甘氨酸。

在一些此类实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含基序X₁₁、X₁₂和X₁₃，而在其他此类实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含基序X₁₁、X₁₂或X₁₃，或它们的组合。

在一些实施方案中，本文提供的重组节肢弹性蛋白包含一个或多个A重复序列、一个或多个B重复序列和/或一个或多个C结构域。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含一个或多个A重复序列或者一个或多个B重复序列，但不包含两者。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含一个或多个A重复序列但不包含B重复序列或C结构域。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含一个或多个B重复序列但不包含A重复序列或C结构域。在重组节肢弹性蛋白包含C结构域的实施方案中，C结构域可位于A重复序列或B重复序列的N-末端或C-末端侧，或者位于A重复序列与B重复序列之间。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白进一步包含序列XXEPPVSYLPPS，其中X为任何氨基酸。在一些此类实施方案中，所述序列位于A重复序列或B重复序列的N-末端侧上。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白是在非天然环境中表达的全长天然节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包括天然节肢弹性蛋白的截短形式。在一些实施方案中，截短的天然节肢弹性蛋白包含至少一个A重复序列。在一些实施方案中，截短的天然节肢弹性蛋白包含至少一个B重复序列。全长和截短的天然节肢弹性蛋白的非限制性示例是以SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:44的形式提供的。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白是全长果蝇节肢弹性蛋白(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白是截短的切叶蚁节肢弹性蛋白(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白是以非天然方式交联(例如，更少或更多地交联、经由不同氨基酸残基交联)的全长或截短的天然节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白是经修饰的全长或截短的天然节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白与全长或截短的天然节肢弹性蛋白至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％同一。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白与全长果蝇节肢弹性蛋白(SEQ ID NO:1)至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％同一。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白与截短的切叶蚁节肢弹性蛋白(SEQ ID NO:4)至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％同一。

有许多本领域已知的不同算法可用于测量核苷酸序列或蛋白质序列同一性。例如，可以使用威斯康星州麦迪逊遗传学电脑集团(Genetics Computer Group,GCG)的Wisconsin软件包版本10.0中的程序FASTA、Gap或Bestfit比较多核苷酸序列。FASTA提供查询序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。参见例如Pearson,Methods Enzymol.183:63-98,1990(全部内容由此以引用方式并入)。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可以使用FASTA以其默认参数(为6的字长和用于评分矩阵的NOPAM因子)或使用Gap以其默认参数(如在GCG版本6.1中提供的，以引用方式并入本文)来确定。替代地，可以使用计算机程序BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990；Gish和States,Nature Genet.3:266-272,1993；Madden等人，Meth.Enzymol.266:131-141,1996；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Zhang和Madden,Genome Res.7:649-656,1997)，特别是blastp或tblastn(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)来比较序列。

在一些实施方案中，经修饰的节肢弹性蛋白与全长或截短的天然节肢弹性蛋白的不同之处在于经翻译后修饰(例如，糖基化、磷酸化)的氨基酸残基，使得与全长或截短的天然节肢弹性蛋白相比，经修饰的节肢弹性蛋白具有一个或多个不同的位置和/或不同的量和/或不同类型的翻译后修饰。在一些实施方案中，经修饰的节肢弹性蛋白与全长或截短的天然节肢弹性蛋白的不同之处在于参与交联的氨基酸残基，使得与全长或截短的天然节肢弹性蛋白相比，经修饰的节肢弹性蛋白具有一个或多个不同的位置和/或不同的量和/或不同类型的氨基酸参与交联。在一些此类实施方案中，经修饰的节肢弹性蛋白与全长或截短的天然节肢弹性蛋白的不同之处在于包含一个或多个额外的或更少的酪氨酸残基、一个或多个额外的或更少的赖氨酸残基，和/或一个或多个额外的或更少的半胱氨酸残基。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白包含串联的天然或截短的天然节肢弹性蛋白或串联的经修饰的节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，串联的天然或截短的天然节肢弹性蛋白或串联的经修饰的节肢弹性蛋白包含至少2个A重复序列(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)。在一些实施方案中，串联的截短的天然节肢弹性蛋白或串联的经修饰的节肢弹性蛋白包含至少2个B重复序列(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)。

蛋白质定量和纯度分析

在一些实施方案中，通过尺寸排阻色谱法(SEC)、反相高效液相色谱法或本领域中已知的其他方法(例如定量蛋白质印迹法)确定组合物中全长节肢弹性蛋白的总量。在各种实施方案中，相同或相似的测定可用于评定呈单体形式和聚集体形式的全长节肢弹性蛋白的相对量。

如本文所述，在特定实施方案中，表征节肢弹性蛋白组合物中节肢弹性蛋白的主要种类(即单体全长节肢弹性蛋白)的相对量的数据是如下通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定的：将节肢弹性蛋白粉末溶解在5M硫氰酸胍中，并注入到Yarra SEC-3000SEC-HPLC柱上，以基于分子量分离各成分。折射率用作检测模式。BSA用作一般蛋白质标准品，并且假设所有蛋白质中>90％的蛋白质表现出在彼此的约7％内的dn/dc值(折射率的响应因子)。聚(环氧乙烷)用作保留时间标准品，并且BSA校准器用作检查标准，以确保所述方法具有一致的表现。对应于单体全长节肢弹性蛋白的范围被评定为60-40kDa；该定量中不包括观察到的可能与聚集物或聚合的全长节肢弹性蛋白对应的较高峰。将该节肢弹性蛋白峰的相对百分比报告为质量％和面积％，以确定以在总节肢弹性蛋白中所占的比例计的组合物中全长节肢弹性蛋白的量。

交联

在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括使重组节肢弹性蛋白交联以获得本文提供的重组节肢弹性蛋白组合物的步骤(图2中的步骤1005)。可以将在含有交联剂的所需溶剂中的重组节肢弹性蛋白填充到小的成形模具中，以控制交联后所得固体的形状。所得的重组节肢弹性蛋白固体的示例如图4所示。

在一些实施方案中，交联通过酪氨酸残基实现。节肢弹性蛋白在其大部分的长度上每15-24个氨基酸有一个酪氨酸残基。在一些实施方案中，节肢弹性蛋白的交联在节肢弹性蛋白中产生二酪氨酸和三酪氨酸交联以形成节肢弹性蛋白固体。

在其他实施方案中，交联通过赖氨酸残基实现。在一些实施方案中，交联通过半胱氨酸残基实现。在一些实施方案中，交联采用转谷氨酰胺酶(参见例如Kim Y,Gill EE,LiuJC.Enzymatic Cross-Linking of Resilin-Based Proteins for Vascular TissueEngineering Applications.Biomacromolecules.17(8):2530-9)。在一些实施方案中，交联采用聚(乙二醇)(PEG)(McGann CL,Levenson EA,Kiick KL.Macromol.Chem.Phys.2013,214,203-13；McGann CL,Akins RE,Kiick KL.Resilin-PEG Hybrid Hydrogels YieldDegradable Elastomeric Scaffolds with Heterogeneous Microstructure.Biomacromolecules.2016；17(1):128-40)。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白通过酶促交联(例如，使用辣根过氧化物酶)而交联。虽然该方法可以有效地使大量的节肢弹性蛋白溶液交联，但是所得的交联产物在交联的节肢弹性蛋白固体中包含共价掺入的活性酶。这会产生使节肢弹性蛋白的蛋白质骨架降解的自由基链式反应。

在其他实施方案中，重组节肢弹性蛋白通过光化学交联而交联(参见例如ElvinCM,Carr AG,Huson MG,Maxwell JM,Pearson RD,Vuocolo T,Liyou NE,Wong DCC,MerrittDJ,Dixon NE.Nature 2005,437,999-1002；Whittaker JL,Dutta NK,Elvin CM,ChoudhuryNR.Journal of Materials Chemistry B 2015,3,6576-79；Degtyar E,Mlynarczyk B,Fratzl P,Harrington MJ.Polymer 2015,69,255-63)。

该交联反应还导致难以从材料中完全渗析出来的活性催化剂掺入到节肢弹性蛋白固体中，使用相对较高的催化剂负载量，并且对于可能难以在整个模具中进行光活化的反应而言效率不高。

本文提供了新的重组节肢弹性蛋白交联化学品，所述新的重组节肢弹性蛋白交联化学品能防止降解并能产生具有一些对于能量吸收的量和形式很重要的某些应用而言优选的机械特性的固体物质。

在优选的实施方案中，重组节肢弹性蛋白通过包含过硫酸铵的溶剂和施加热量而交联(例如，在约80℃的温度下孵育约2.5小时)。该交联反应是有效的，并且不会在节肢弹性蛋白固体中留下活性催化剂，从而产生具有较少的经降解蛋白质的组合物。

在一些实施方案中，用于节肢弹性蛋白交联反应的过硫酸铵的最终浓度为约30mM至40mM。在一些实施方案中，将具有过硫酸铵和节肢弹性蛋白的交联溶液孵育(即，暴露于热量中)至少15分钟、至少30分钟、至少60分钟、至少90分钟或至少2小时以促进充分的交联，以形成具有所需机械特性的固体。在一些实施方案中，使用其他过硫酸盐。

在一些实施方案中，施加到过硫酸铵和节肢弹性蛋白组合物溶液中的热量为至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃，或至少80℃。在一些实施方案中，施加到过硫酸铵和节肢弹性蛋白的交联溶液中的热量为50℃-90℃，或60℃-90℃，或70℃-90℃，或75℃至85℃，或70℃至80℃。在一些实施方案中，交联溶液不包含酶促催化剂。在一些实施方案中，交联溶液不包含光活性催化剂。

在一些实施方案中，按总交联溶液的重量计，所述交联溶液包含至少1％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的节肢弹性蛋白，从1％至100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的节肢弹性蛋白；从10％至100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％的节肢弹性蛋白；从20％至100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％的节肢弹性蛋白；从30％至100％、90％、80％、70％、60％、50％或40％的节肢弹性蛋白；从40％至100％、90％、80％、70％、60％或50％的节肢弹性蛋白；从50％至100％、90％、80％、70％或60％的节肢弹性蛋白；从60％至100％、90％、80％或70％的节肢弹性蛋白；从70％至100％、90％或80％的节肢弹性蛋白；从80％至100％或90％的节肢弹性蛋白；或从90％至100％的节肢弹性蛋白。在优选的实施方案中，将节肢弹性蛋白溶于交联溶液中至节肢弹性蛋白的浓度介于20重量％至30重量％之间。在一些实施方案中，总节肢弹性蛋白包含如通过尺寸排阻色谱法(SEC)测得的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，或至少90％的全长节肢弹性蛋白。

经溶剂交换的节肢弹性蛋白固体

交联的节肢弹性蛋白可在水性溶剂中形成，从而产生具有低硬度和弹性模量的组合物，所述组合物不太适合于某些需要能量吸收和刚度的应用。在一些实施方案中，对交联的节肢弹性蛋白组合物执行溶剂交换，以用极性非水性溶剂代替水性溶剂以提供所需的材料特性。在一些实施方案中，极性非水性溶剂包括甘油、丙二醇、乙二醇或DMSO。在一些实施方案中，非水性溶剂是可与水混溶的。在一些实施方案中，非水性溶剂是非挥发性溶剂。在一些实施方案中，非水性溶剂包含具有多个醇官能团的分子。在一些实施方案中，非水性溶剂包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的一个或多个分子量小于约100g/mol的分子。如本文所述，可以使用溶剂交换来调整交联的节肢弹性蛋白组合物的材料特性，包括弹性模量、硬度、最大弹性压缩负荷、回复率和材料寿命/疲劳。能够与交联的节肢弹性蛋白进行溶剂交换的溶剂包括溶解呈非交联形式的节肢弹性蛋白的溶剂。

在一些实施方案中，在热量存在下(例如在约60℃的温度下)执行溶剂交换以用极性非水性溶剂代替节肢弹性蛋白的水性溶剂。在一些实施方案中，溶剂交换过程是在含有相对于节肢弹性蛋白固体的至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍体积的交换溶剂的溶液中执行的。在一些实施方案中，溶剂交换执行至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少16小时、至少24小时，或至少48小时。在一些实施方案中，甘油、丙二醇、乙二醇或DMSO用作交联的节肢弹性蛋白固体组合物的交换溶剂。

在一些实施方案中，根据溶剂设计选择对所使用的交换溶剂和浓度的选择，以实现所需的可调整机械特性，例如刚度。这可以根据所需的应用(例如鞋底、高尔夫球等)进行选择。

在一些实施方案中，由上面的溶剂交换过程形成并且在非水性溶剂中的交联的节肢弹性蛋白组合物能在室温下稳定至少10天、至少20天、至少30天、至少40天或至少50天。在一些实施方案中，由上面的溶剂交换过程形成并且在非水性溶剂中的交联的节肢弹性蛋白组合物能耐霉菌生长至少10天、至少20天、至少30天、至少40天或至少50天。在一些实施方案中，由上面的溶剂交换过程形成并且在非水性溶剂中的交联的节肢弹性蛋白组合物能耐脱水至少7天或至少14天。相比之下，观察到基于水的交联的节肢弹性蛋白固体在2周内完全脱水，并且当在开放环境中在环境条件下存储时会在5天至14天内生长出霉菌。另外，当施加220lb的力时，10mm乘5mm的基于水的节肢弹性蛋白固体盘状物破裂，而10mm乘5mm的基于甘油的节肢弹性蛋白固体盘状物在220lb的力下不破裂。

在一些实施方案中，可以使用流变仪来测试连续测试的材料之间的相对材料特性。例如，可以在圆柱形模具中形成交联的节肢弹性蛋白组合物，并且使所得节肢弹性蛋白圆柱体经受使用流变仪的压缩试验。可以将重组节肢弹性蛋白圆柱体从7.3mm的初始高度(平均宽度5.4mm)压缩到小于0.66mm而不出现任何破裂。如图5所示，在释放压缩载荷后，圆柱体返回到6.7mm的高度(平均宽度5.6mm)。

在一些实施方案中，按极性非水性溶剂的体积计，所述溶剂包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的极性非水性组合物。在一些实施方案中，按所述溶剂的体积计，所述溶剂包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的甘油、丙二醇、乙二醇或DMSO。

在一些实施方案中，本文提供的重组节肢弹性蛋白组合物的弹性模量比在水性溶剂中的交联的重组节肢弹性蛋白大。

在一些实施方案中，本文提供的交联的节肢弹性蛋白组合物具有50或更大、40或更大、30或更大、20或更大、10或更大、10至50、40、30或20；20至50、40或30；30至50或40；或40至50的Shore OO硬度；在一些实施方案中，根据ASTM D2240执行节肢弹性蛋白的硬度测量。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物包含如使用Shore OO硬度计经由ASTMD2240测得的至少10的硬度。在一些实施方式中，重组节肢弹性蛋白组合物包含如使用Shore OO硬度计经由ASTM D2240测得的至少30的硬度。在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物包含如使用Shore OO硬度计经由ASTM D2240测得的约10至约50的硬度。在一些实施方案中，交联的节肢弹性蛋白组合物的硬度与矫形鞋底相当。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物包含如通过ASTM D7121测得的约40％至约60％的反弹回复率。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物包含如通过ASTM D575测得的约6psi至约8psi的25％时的压缩应力。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物在如通过Zwick压缩测试所测量的低于2kN的压缩力下，没有经受从弹性到塑性的转变。

在一些实施方案中，可以基于所使用的溶剂以及如何执行溶剂交换来调整节肢弹性蛋白固体材料的特性，例如回复率、压缩弹性模量、拉伸弹性模量、剪切模量、断裂伸长率、最大拉伸强度、硬度、刚度和反弹。例如，甘油可以在存在梯度或不存在梯度的情况下交换到节肢弹性蛋白固体中，导致不同的所得材料特性。还可以调节节肢弹性蛋白固体中节肢弹性蛋白的浓度以及以在总节肢弹性蛋白中所占比例计的全长节肢弹性蛋白的量，以影响交联的节肢弹性蛋白固体组合物的材料特性。

在一些实施方案中，如本文所述的那样进行溶剂交换以用基于极性非水性溶剂的节肢弹性蛋白组合物(即，在极性非水性溶剂中的交联的节肢弹性蛋白组合物)替换基于水的节肢弹性蛋白组合物(即，在水性溶剂中的交联的节肢弹性蛋白组合物)，从而产生具有相似回复率和相似弹性的较硬材料。

在一些实施方案中，本文提供的组合物包含至少5重量％、至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％、至少95重量％；介于10重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％、60重量％、50重量％、40重量％、30重量％或20重量％之间；介于20重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％、60重量％、50重量％、40重量％或30重量％之间；介于30重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％、60重量％、50重量％或40重量％之间；介于40重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％、60重量％或50重量％之间；介于50重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％或60重量％之间；介于60重量％与100重量％、90重量％、80重量％或70重量％之间；介于70重量％与100重量％、90重量％或80重量％之间；介于80重量％与100重量％或90重量％之间；或者介于90重量％与100重量％之间的重组节肢弹性蛋白。重组节肢弹性蛋白可以是同一的重组节肢弹性蛋白或具有至少2个不同氨基酸序列的重组节肢弹性蛋白的混合物。

在一些实施方案中，本文提供的组合物包含以在每种组合物中的总节肢弹性蛋白中所占比例计的至少5重量％、至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％、至少95％；介于10重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％、60重量％、50重量％、40重量％、30重量％或20重量％之间；介于20重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％、60重量％、50重量％、40重量％或30重量％之间；介于30重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％、60重量％、50重量％或40重量％之间；介于40重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％、60重量％或50重量％之间；介于50重量％与100重量％、90重量％、80重量％、70重量％或60重量％之间；介于60重量％与100重量％、90重量％、80重量％或70重量％之间；介于70重量％与100重量％、90重量％或80重量％之间；介于80重量％与100重量％或90重量％之间；或者介于90重量％与100重量％之间的全长重组节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物是泡沫材料。在一些实施方案中，交联的节肢弹性蛋白组合物是泡沫材料，例如经发泡的固体。在一些实施方案中，泡沫材料包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的孔隙率。如本文所述，孔隙率是指材料的间隙的体积相对于材料的质量的体积的百分比。在一些实施方案中，如本文所述的泡沫材料的密度是非泡沫材料的密度的至少1/3，例如至少1/2、至少3/4，或者是非泡沫的交联的节肢弹性蛋白组合物的密度的至少两倍。在一些实施方案中，如本文所述的泡沫材料中的气泡的平均直径为约0.01mm至约3mm，例如约0.02mm至约1mm、约0.05mm至约2mm、约0.1mm至约3mm、约0.2mm至约4mm、约0.5mm至约5mm、约1mm至约1.5mm，或约1.5mm至约2mm。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物包含一层或多层泡沫材料。在一些实施方案中，该一层或多层泡沫材料以期望的次序配置(例如顺序或交替配置)，其中支撑层定位于两层泡沫材料之间。该一层或多层泡沫材料可以以本领域已知的任何方式(例如喷雾干燥、注射成型)定位。在一些实施方案中，该一层或多层泡沫材料包括一个或多个孔隙空间。每层的形貌和一层或多层泡沫材料嵌套在一起的倾向可能不同。在一些实施方案中，孔隙空间可在一侧或多侧上提供流动通道以帮助引导空气流动并提供附加的吸收能力。

机械特性

在其他实施方案中，与包含交联的节肢弹性蛋白的组合物相比，本文提供的组合物具有不同的特性。在一些实施方案中，与合成弹性材料相比，本文提供的组合物具有相似的特性。此类特性的非限制性示例包括回复率、压缩弹性模量、拉伸弹性模量、剪切模量、硬度、反弹和压缩永久变形。可经改进以获得具有特定机械特性的组合物的参数包括例如重组节肢弹性蛋白的长度和/或序列、重组节肢弹性蛋白的翻译后修饰的程度和/或类型、重组节肢弹性蛋白的交联程度和/或类型，以及交联的节肢弹性蛋白组合物的溶剂的性质。

在一些实施方案中，可以使用对弹性体样品进行应力-应变测量的许多不同类型的拉伸和压缩系统来测量机械特性，例如最大拉伸强度、压缩弹性模量、拉伸弹性模量、剪切模量、断裂伸长率和回复率。所得的应力-应变曲线(包括具有滞后的曲线)可以在拉伸或压缩下进行测量。在一些实施方案中，拉伸和压缩测试系统可以将应变施加到样品上，并使用载荷传感器(load cell)测量合力(resulting force)。在一些实施方案中，可以在宏观尺度(例如，使用宏观压缩测试仪)、微观尺度或纳米尺度(例如，使用原子力显微镜(AFM)或纳米压痕测量)上测量机械特性。在一些实施方案中，弹性体的压缩机械特性可以根据标准ASTM D575-91(2012)橡胶压缩特性标准测试方法来测量。拉伸下弹性体的机械测量可以使用ASTM D412-15a硫化橡胶和热塑性弹性体标准测试方法—张力执行。在一些实施方案中，可以使用ASTM D624-00常规硫化橡胶和热塑性弹性体的撕裂强度的标准测试方法来执行对弹性体的撕裂强度的测试。在一些实施方案中，可以使用ASTM D3574-11柔性微孔材料—板坯、粘结和模塑氨酯泡沫体的标准测试方法来执行对板坯、粘结和模塑弹性体的机械特性的测试。在一些实施方案中，可以使用ASTM D5992-96(2011)使用振动方法动态测试硫化橡胶和橡胶样材料的标准指南来测量弹性体的机械特性。

在一些实施方案中，本文提供的组合物具有大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％，或大于95％；从50％至100％、90％、80％、70％或60％；从60％至100％、90％、80％或70％；从70％至100％、90％或80％；从80％至100％或90％；从90％至100％；从95％至100％、从90％至99％，或从95％至99％的回复率。

在一些实施方案中，本文提供的组合物具有小于10MPa、小于7MPa、小于5MPa、小于2MPa、小于1MPa、小于0.5MPa，或小于0.1MPa；从0.01MPa至10MPa、7MPa、5MPa、2MPa、1MPa、0.5MPa或0.1MPa；从0.1MPa至10MPa、7MPa、5MPa、2MPa、1MPa或0.5MPa；从0.5MPa至10MPa、7MPa、5MPa、2MPa或1MPa；从1MPa至10MPa、7MPa、5MPa或2MPa；从2MPa至10MPa、7MPa或5MPa；从5MPa至10MPa或7MPa；或从7MPa至10MPa的压缩弹性模量。在一些实施方案中，组合物的压缩弹性模量可以如ASTM D575-91(2012)橡胶压缩特性标准测试方法所定义的来测量。

在一些实施方案中，本文提供的组合物具有小于10MPa、小于7MPa、小于5MPa、小于2MPa、小于1MPa、小于0.5MPa，或小于0.1MPa；从0.01MPa至10MPa、7MPa、5MPa、2MPa、1MPa或0.5MPa；从0.5MPa至10MPa、7MPa、5MPa、2MPa或1MPa；从1MPa至10MPa、7MPa、5MPa或2MPa；从2MPa至10MPa、7MPa或5MPa；从5MPa至10MPa或7MPa；或从7MPa至10MPa的拉伸弹性模量。

在一些实施方案中，本文提供的组合物具有小于1MPa、小于100kPa、小于50kPa、小于20kPa、小于10kPa，或小于1kPa；从0.1kPa至1MPa、100kPa、50kPa、20kPa、10kPa或1kPa；从1kPa至1MPa、100kPa、50kPa、20kPa或10kPa；从10kPa至1MPa、100kPa、50kPa或20kPa；从20kPa至1MPa、100kPa或50kPa；从50kPa至1MPa或100kPa；或从100kPa至1MPa的剪切模量。

在一些实施方案中，本文提供的组合物具有大于1％、大于10％、大于50％、大于100％、大于300％或大于500％；从1％至500％、300％、100％、50％或10％；从10％至500％、300％、100％或50％；从50％至500％、300％或100％；从100％至500％或300％；或从300％至500％的断裂伸长率。

在一些实施方案中，本文提供的组合物具有大于0.1kPa、大于1kPa、大于2kPa、大于5kPa或大于10kPa；从0.1kPa至100kPa、10kPa、5kPa、2kPa或1kPa；从1kPa至100kPa、10kPa、5kPa或2kPa；从2kPa至100kPa、10kPa或5kPa；从5kPa至100kPa或10kPa；或从10kPa至100kPa的最大拉伸强度。

在一些实施方案中，可以使用压痕和纳米压痕测量系统来测量诸如硬度和压缩弹性模量的机械特性。在一些实施方案中，使用利用尖端在样品上进行压痕至给定量的应变来进行的压痕测量来测量节肢弹性蛋白的硬度和压缩弹性模量，并且使用载荷传感器测量合力。在一些实施方案中，可以使用不同的尖端形状，包括Vickers和Berkovich形状的尖端。在一些实施方案中，通过压痕技术测得的硬度由以下关系表征：硬度＝(峰值力)/(接触面积)。

在一些实施方案中，可以使用硬度计来测量聚合物、弹性体和橡胶的硬度。在一些实施方案中，可以使用标准ASTM D2240来测量弹性体的硬度，所述标准ASTM D2240使用特定的弹簧力和压痕器构造的组合来识别十二种不同的硬度计标度。最常见的标度是ShoreOO、Shore A和Shore D硬度标度。硬度标度在0到100的范围内，其中0是较软的材料并且100是较硬的材料。

在一些实施方案中，本文提供的组合物具有小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30或小于20；从10至90、80、70、60、50、40、30或20；从20至90、80、70、60、50、40或30；从30至90、80、70、60、50或40；从40至90、80、70、60或50；从50至90、80、70或60；从60至90、80或70；从70至90或80；或从80至90的Shore OO硬度。在一些实施方案中，根据ASTMD2240执行节肢弹性蛋白的硬度测量。

如本文所用，术语“反弹”是指回复率的特定度量。在一些实施方案中，可以使用包括摆锤工具和下坠球在内的许多不同工具来测量反弹。在摆锤式测量中，RB(通常称为反弹百分比)由以下公式确定：

反弹回复率可计算为：

其中h＝反弹的顶点高度，并且H＝初始高度。反弹回复率还可以通过测量反弹角度来确定。用于确定弹性体反弹的测试方法的一些示例是ASTM D2632-15和ASTM D7121-05(2012)。

在一些实施方案中，本文提供的组合物具有大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％，或大于95％；从50％至100％、90％、80％、70％或60％；从60％至100％、90％、80％或70％；从70％至100％、90％或80％；从80％至100％或90％；从90％至100％；从95％至100％、从90％至99％，或从95％至99％的反弹。在一些实施方案中，根据ASTMD2632-15或ASTM D7121-05(2012)执行节肢弹性蛋白的反弹测量。

如本文所用的，术语“压缩永久变形”是指在施加的力被去除之后剩余的永久变形的度量。在一些实施方案中，可以以不同的方式测量压缩永久变形，包括在空气中在恒定力下的压缩永久变形(称为压缩永久变形A)、在空气中在恒定变形下的压缩永久变形(称为压缩永久变形B)，以及考虑到材料硬度的在空气中在恒定变形下的压缩永久变形(称为压缩永久变形C)。压缩永久变形A(C_A)由以下表达式计算：C_A＝[(t_o-t_i)/t_o]×100，其中t_o是原始试样厚度，并且t_i是测试后的试样厚度)。压缩永久变形B(C_B)是由C_B＝[(t_o-t_i)/(t_o-t_n)]×100得出的，其中t_o是原始试样厚度，t_i是测试后的试样厚度，并且t_n是测试期间的垫片厚度或试样厚度。用于确定弹性体的压缩永久变形的测试方法的一些示例为ASTM D3574-11和ASTM D395-16。

在一些实施方案中，本文提供的组合物具有大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％，或大于95％；从50％至100％、90％、80％、70％或60％；从60％至100％、90％、80％或70％；从70％至100％、90％或80％；从80％至100％或90％；从90％至100％；从95％至100％、从90％至99％，或从95％至99％的压缩永久变形A或压缩永久变形B。在一些实施方案中，根据ASTM D3574-11和ASTM D395-16执行节肢弹性蛋白的压缩永久变形测量。

将节肢弹性蛋白加工和成型为产品可采用针对不同应用的许多形式。因此，本文提供的组合物可以具有任何形状和形式，包括但不限于凝胶、多孔海绵、膜、可机加工的固体、铸造形式、模塑形式和复合体。

如本文所用，术语“密度”是指样品的质量除以体积。在一些实施方案中，可以使用比重瓶用酒精代替水以消除气泡来确定弹性体的密度。在一些实施方案中，弹性体的密度可以使用流体静力学方法来确定。如本文所用，术语“压缩体积密度”是指样品质量与样品的压缩体积的比率，其中“压缩体积”被定义为当弹性体样品经受足以使所述样品流动直到所述样品完全符合活塞缸测试腔室外壳周围形状的压缩力时达到的最终平衡体积。在一些实施方案中，弹性体的压缩体积密度可以使用压缩体积密度计来确定。

在一些实施方案中，本文提供的组合物的密度或压缩体积密度为0.5mg/cm³至2.0mg/cm³，或从1.0mg/cm³至1.5mg/cm³，或从1.1mg/cm³至1.4mg/cm³，或从1.2mg/cm³至1.35mg/cm³。在一些实施方案中，可以使用ASTM D297-15橡胶产品标准测试方法—化学分析来执行对弹性体的密度或压缩体积密度的测定。

本文提供的组合物具有许多用途，包括但不限于尤其在航空航天、汽车、运动装备、隔振、鞋类和衣物中的应用。来自这些类别的一些应用被列出为非限制性示例。由于合乎需要的弹性效率，节肢弹性蛋白可以用作用于存储和回收机械能的能量存储设备(例如，橡胶带)。可以通过应用节肢弹性蛋白衬套以在越过颠簸处和高速穿越坑洼处时保持轮胎在路面上的更多接触来改善汽车悬架系统。另外，具有经不同地调整的机械特性的节肢弹性蛋白有许多运动装备应用，包括高尔夫球的芯、网球拍握把、高尔夫球杆握把和乒乓球拍。

由于本文提供的节肢弹性蛋白组合物的独特特性，特别受关注的应用是鞋类。作为内底或中底，节肢弹性蛋白可以通过缓和足部冲击并从该足部冲击中恢复更多的能量作为前进动力来提高鞋子的舒适性和生物效率。作为中底，节肢弹性蛋白可构成整个中底，或封装在另一种材料内以补充它的特性(例如，耐磨或耐磨损材料，或经调整以用于牵引的材料)。节肢弹性蛋白中底也可含有具有经不同地调整的机械特性的多种节肢弹性蛋白材料，该多种节肢弹性蛋白材料协同工作以提供增强的性能(例如，更软的足跟着地区域和更牢固的足弓支撑)。

载体、宿主细胞和发酵物

本文还提供了编码重组节肢弹性蛋白的载体；包含此类载体的重组宿主细胞；以及包含此类重组宿主细胞和重组节肢弹性蛋白的发酵物。

在一些实施方案中，本文提供的载体包含分泌的节肢弹性蛋白编码序列，所述分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码在其N-末端与分泌信号融合并且任选地在其C-末端与标签肽或多肽融合的节肢弹性蛋白多肽。在一些实施方案中，载体包含经密码子优化以在特定宿主细胞中表达的分泌的节肢弹性蛋白编码序列。

合适的分泌信号是介导本文提供的重组宿主细胞中的多肽分泌的分泌信号。合适的分泌信号的非限制性示例是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α交配因子(α-MF)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的酸性磷酸酶(PHO1)和来自普通豆菜豆(Phaseolus vulgaris)的植物凝集素(PHA-E)的分泌信号。另外的分泌信号是本领域中已知的，或者可以通过鉴定由宿主细胞分泌的蛋白质，随后对分泌的蛋白质进行基因组分析并鉴定非翻译的N-末端序列来鉴定(参见例如Huang等人，A proteomic analysis of thePichia pastoris secretome in methanol-induced cultures.Appl MicrobiolBiotechnol.2011年4月；90(1):235-47)。

由分泌的节肢弹性蛋白编码序列编码的节肢弹性蛋白可进一步与标签肽或多肽融合。标签肽或多肽的非限制性示例包括亲和标签(即，与某些剂或基质结合的肽或多肽)、增溶标签(即，有助于蛋白质正确折叠并防止沉淀的肽或多肽)、色谱标签(即，改变蛋白质的色谱特性以在特定分离技术上提供不同分辨率的肽或多肽)、表位标签(即，由抗体结合的肽或多肽)、荧光标签(即，在用短波长的光激发时发出高波长的光的肽或多肽)、发色标签(即，吸收可见光谱的特定区段的肽或多肽)、酶底物标签(即，作为特定酶促反应的底物的肽或多肽)、化学底物标签(即，作为特定化学修饰的底物的肽或多肽)，或它们的组合。合适的亲和标签的非限制性示例包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、聚(His)标签、SBP标签、Strep标签和钙调蛋白标签。合适的溶解性标签的非限制性示例包括硫氧还原蛋白(TRX)、聚(NANP)、MBP和GST。色谱标签的非限制性示例包括聚阴离子氨基酸(例如，FLAG标签[GDYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK(SEQ ID NO:45)])和聚谷氨酸盐标签。表位标签的非限制性示例包括V5标签、VSV标签、Myc标签、HA标签、E标签、NE标签和FLAG标签。荧光标签的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、橙色荧光蛋白(OFP)、红色荧光蛋白(RFP)，以及它们的衍生物。生色标签的非限制性示例包括蛋白的GFP样家族的非荧光成员(例如，BlitzenBlue、DonnerMagenta；DNA2.0,Neward,CA)。酶底物标签的非限制性示例包括在适合于生物素化的序列内包含赖氨酸的肽或多肽(例如，AviTag、生物素羧基载体蛋白[BCCP])。化学底物标签的非限制性示例包括适合与FIAsH-EDT2反应的底物。C-末端肽或多肽与节肢弹性蛋白的融合可为可切割的(例如，由TEV蛋白酶、凝血酶、因子Xa或肠肽酶切割)或不可切割的。

在一些实施方案中，载体包含单一分泌的节肢弹性蛋白编码序列。在其他实施方案中，载体包含2个或更多个(例如，3个、4个或5个)分泌的节肢弹性蛋白编码序列。在一些此类实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列是同一的。在其他此类实施方案中，分泌的节肢弹性蛋白编码序列中的至少2个分泌的节肢弹性蛋白编码序列是不同一的。在其中分泌的节肢弹性蛋白编码序列中的至少2个分泌的节肢弹性蛋白编码序列不同一的实施方案中，所述至少2个分泌的节肢弹性蛋白编码序列可以在节肢弹性蛋白上和/或在分泌信号和/或它们所编码的任选的标签肽或多肽上彼此不同。

在一些实施方案中，载体包含启动子，所述启动子与分泌的节肢弹性蛋白编码序列可操作连接，使得它们驱动分泌的节肢弹性蛋白编码序列的表达。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子的诱导通过葡萄糖阻抑、半乳糖诱导、蔗糖诱导、磷酸盐阻抑、硫胺素阻抑或甲醇诱导发生。合适的启动子包括介导蛋白质在本文提供的重组宿主细胞中的表达的启动子。合适的启动子的非限制性示例包括AOX1启动子、GAP启动子、LAC4-PBI启动子、T7启动子、TAC启动子、GCW14启动子、GAL1启动子、λPL启动子、λPR启动子、β-内酰胺酶启动子、spa启动子、CYC1启动子、TDH3启动子、GPD启动子、TEF1启动子、ENO2启动子、PGL1启动子、SUC2启动子、ADH1启动子、ADH2启动子、HXT7启动子、PHO5启动子和CLB1启动子。可用于促进分泌的节肢弹性蛋白编码序列表达的另外的启动子是本领域中已知的。

在一些实施方案中，载体包含终止子，所述终止子与分泌的节肢弹性蛋白编码序列可操作连接，使得它们实现分泌的节肢弹性蛋白编码序列的转录终止。合适的终止子包括终止本文提供的重组宿主细胞中的转录的终止子。合适的终止子的非限制性示例包括AOX1终止子、PGK1终止子和TPS1终止子。影响分泌的节肢弹性蛋白编码序列的转录终止的另外的终止子是本领域中已知的。

在其中载体包含2个或更多个节肢弹性蛋白编码序列的实施方案中，所述2个或更多个节肢弹性编码序列可以可操作地连接至同一启动子和/或终止子，或者可操作地连接至2个或更多个不同的启动子和/或终止子。

本文提供的载体可进一步包含适合于使载体在重组宿主细胞中繁殖的元件。此类元件的非限制性示例包括细菌的复制起点和选择性标记(例如，抗生素抗性基因、营养缺陷型标记)。细菌复制起点和选择性标记是本领域中已知的。在一些实施方案中，选择性标记是耐药性标记。耐药性标记使细胞能够对外源添加的药物进行解毒，否则所述药物会杀伤细胞。耐药性标记的例示性示例包括但不限于对抗生素(例如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、博来霉素、链霉素、潮霉素、新霉素、Zeocin^TM等)有耐药性的标记。在一些实施方案中，选择性标记是营养缺陷型标记。营养缺陷型标记使细胞能够在缺乏必需组分的培养基中生长时合成必需组分(通常是氨基酸)。可选择的营养缺陷型基因序列包括例如hisD，其允许在组氨醇存在下在无组氨酸的培养基中生长。适用于本发明载体的其他选择性标记包括博来霉素抗性基因、金属硫蛋白基因、潮霉素B磷酸转移酶基因、AURI基因、腺苷脱氨酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、二氢叶酸盐还原酶基因、胸苷激酶基因和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因。

本发明的载体可进一步包含靶向序列，所述靶向序列引导分泌的节肢弹性蛋白编码序列整合到宿主细胞基因组中的特定位置。此类靶向序列的非限制性示例包括与宿主细胞的基因组中存在的核苷酸序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，靶向序列与宿主细胞基因组中的重复元件是同一的。在一些实施方案中，靶向序列与宿主细胞基因组中的可转座元件是同一的。

在一些实施方案中，本文提供了重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本文所述的载体。在一些实施方案中，例如经由同源重组或靶向整合将载体稳定整合在重组宿主细胞的基因组(例如，染色体)内。用于基因组整合的合适位点的非限制性示例包括酿酒酵母基因组中的Ty1基因座、毕赤酵母基因组中的rDNA和HSP82基因座，以及具有散布在整个重组宿主细胞基因组中的拷贝的可转座元件。在其他实施方案中，载体没有稳定地整合在重组宿主细胞的基因组内，而是在染色体外。

重组宿主细胞可以是哺乳动物、植物、藻类、真菌或微生物来源的。合适的真菌的非限制性示例包括甲基营养型酵母、丝状酵母、解腺嘌呤阿氏酵母(Arxulaadeninivorans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉泡盛变种(Aspergillus nigervar.awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、埃切假丝酵母(Candida etchellsii)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、矮小假丝酵母(Candida humilis)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、拟热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、皱状假丝酵母(Candida versatilis)、汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)、栗疫菌(Endothia parasitica)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、葡酒色被孢霉raffinoseutilizer变种(Morteirella vinaceae var.raffinoseutilizer)、米黑毛霉(Mucor miehei)、米黑毛霉Cooney et Emerson变种(Mucor miehei var.Cooney etEmerson)、微小毛霉(Mucor pusillus Lindt)、娄地青霉(Penicillium roquefortii)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、巴斯德毕赤酵母(巴斯德驹形氏酵母)(Pichiapastoris(Komagataella phaffii)、树干毕赤酵母(树干舍费尔斯氏酵母)(Pichia(Scheffersomyces)stipitis)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、红酵母属某个种(Rhodotorula sp.)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉迪酵母(Saccharomycesbeticus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、薛瓦酵母(Saccharomyceschevalieri)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、葡萄酒酵母(Saccharomycesellipsoideus)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)、弗罗棱糖酵母(Saccharomycesflorentinus)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、清酒酵母(Saccharomyces sake)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、约氏掷孢酵母(Sporidiobolus johnsonii)、鲑色锁掷酵母(Sporidiobolus salmonicolor)、红色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、里氏木霉(Trichoderma reesi)、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)，以及它们的衍生物和杂交种。

合适的微生物的非限制性示例包括弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、密苏里游动放线菌(Actinoplane missouriensis)、钝顶螺旋藻(Arthrospira platensis)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌链球菌分型N(Lactococcus lactis Lancefield Group N)、噬柠檬酸明串珠菌(Leuconostoccitrovorum)、葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranicum)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)菌株NRRL B-512(F)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、螺旋藻属(Spirulina)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、乳酸链球菌(Streptococcuslactis)、乳酸链球菌双醋酸亚种(Streptococcus lactis subspecies diacetylactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、恰塔努加链霉菌(Streptomyceschattanoogensis)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatalensis)、橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)、橄榄产色链霉菌(Streptomycesolivochromogenes)、锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，以及它们的衍生物和杂交种。可用作重组宿主细胞的另外的菌株是本领域中已知的。应当理解的是，术语“重组宿主细胞”不仅旨在指特定的受试者细胞，而且还指此种细胞的后代。因为由于突变或环境影响而在后续世代中可能发生某些修饰，所以此种后代实际上可能与亲本细胞不是同一的，但仍包括在如本文所用的术语“重组宿主细胞”的范围内。

在一些实施方案中，重组宿主细胞包含遗传修饰，所述遗传修饰改善了本文提供的重组节肢弹性蛋白的产生。此类基因修饰的非限制性示例包括改变的启动子、改变的激酶活性、改变的蛋白质折叠活性、改变的蛋白质分泌活性、改变的基因表达诱导途径，以及改变的蛋白酶活性。

本文所提供的重组宿主细胞是通过用本文提供的载体转化合适来源的细胞来产生。对于此类转化，载体可以是环形的或线性的。包含所述载体的重组宿主细胞转化体可以容易地鉴定出来，例如通过表达由所述载体编码的允许针对细胞生长进行选择或抵抗细胞生长的耐药性或营养缺陷型标记，或通过其他手段(例如，检测包含在载体中的发光肽、对单个重组宿主细胞集落进行分子分析，例如通过限制酶标测、PCR扩增，或对分离的染色体外载体或染色体整合位点的序列分析)来进行鉴定。

在一些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞可以产生高滴度的本文提供的重组节肢弹性蛋白。在一些此类实施方案中，重组宿主细胞以大于2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、4mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、6mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、8mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、12mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、14mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、16mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、18mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、25mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或5mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从5mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；或从30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时的速率产生重组节肢弹性蛋白。在其他此类实施方案中，重组宿主细胞以大于2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、4mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、6mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、8mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、12mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、14mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、16mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、18mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、25mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时，或30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或5mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从5mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；或从30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时的速率分泌重组节肢弹性蛋白。可以通过HPLC定量、蛋白质印迹分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳和2维质谱(2D-MS/MS)序列鉴定来确认所产生的重组节肢弹性蛋白的性质。

在一些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞具有高的本文所提供重组节肢弹性蛋白分泌分数。在一些此类实施方案中，重组宿主细胞具有大于50％、60％、70％、80％或90％；从50％至100％、90％、80％、70％或60％；从60％至100％、90％、80％或70％；从70％至100％、90％或80％；从90％至100％或90％；或从90％至100％的重组节肢弹性蛋白分泌分数。

重组节肢弹性蛋白的产生和分泌可受到重组宿主细胞中所包含的分泌的节肢弹性蛋白编码序列的拷贝数和/或重组宿主细胞中所包含的分泌的节肢弹性蛋白编码序列的转录速率的影响。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含单个分泌的节肢弹性蛋白编码序列。在其他实施方案中，重组宿主细胞包含2个或更多个(例如，3个、4个、5个或更多个)分泌的节肢弹性蛋白编码序列。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含与强启动子可操作连接的分泌的节肢弹性蛋白编码序列。强启动子的非限制性示例包括巴斯德毕赤酵母的pGCW14启动子。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含与中等启动子可操作连接的分泌的节肢弹性蛋白编码序列。此类中等启动子的非限制性示例包括巴斯德毕赤酵母的pGAP启动子。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含在弱启动子控制下编码节肢弹性蛋白的编码序列。

本文提供的发酵物包含本文所述的重组宿主细胞和适合于使所述重组宿主细胞生长的培养基。

通过在培养基中培养重组宿主细胞来获得发酵物，所述培养基提供重组宿主细胞进行细胞存活和/或生长以及分泌重组节肢弹性蛋白所需的营养物。此类培养基通常含有过量的碳源。合适的碳源的非限制性示例包括单糖、二糖、多糖，以及它们的组合。合适的单糖的非限制性示例包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、核糖以及它们的组合。合适的二糖的非限制性示例包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖，以及它们的组合。合适的多糖的非限制性示例包括棉子糖、淀粉、糖原、聚糖、纤维素、几丁质，以及它们的组合。

在一些实施方案中，按总发酵物的重量计，所述发酵物包含至少1％、5％、10％、20％或30％；从1％至100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％；从10％至100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％；从20％至100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％；从30％至100％、90％、80％、70％、60％、50％或40％；从40％至100％、90％、80％、70％、60％或50％；从50％至100％、90％、80％、70％或60％；从60％至100％、90％、80％或70％；从70％至100％、90％或80％；从80％至100％或90％；或从90％至100％的量的重组节肢弹性蛋白。

在一些实施方案中，发酵物包含至少2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L或30g/L；从2g/L至300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L、40g/L、30g/L、20g/L或10g/L；从10g/L至300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L、40g/L、30g/L或20g/L；从20g/L至300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L、40g/L或30g/L；从30g/L至300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L或40g/L；从40g/L至300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L或50g/L；从50g/L至300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L或60g/L；从60g/L至300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L或70g/L；从70g/L至300g/L、200g/L、100g/L、90g/L或80g/L；从80g/L至300g/L、200g/L、100g/L或90g/L；从90g/L至300g/L、200g/L或100g/L；从100g/L至300g/L或200g/L；或从200g/L至300g/L的量的重组节肢弹性蛋白。

生产重组节肢弹性蛋白的方法

本文还提供了生产本文所述的重组节肢弹性蛋白的方法。

除非另外指出，否则所述方法一般根据在本领域中众所周知并且如在贯穿本说明书所引用和讨论的各种一般性和更具体参考文献中所描述的常规方法执行。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992，以及2002年的增刊)；Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1990；Taylor和Drickamer,Introduction toGlycobiology,Oxford Univ.Press,2003；Worthington Enzyme Manual,WorthingtonBiochemical Corp.,Freehold,N.J.；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins，第I卷，CRC Press,1976；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins，第II卷，CRCPress,1976；Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999。

在一些实施方案中，一种新型方法被用于从宿主细胞胞外分泌节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，该方法包括构建包含分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体(图2中的步骤1001)；将该载体转化到宿主细胞中(图2中的步骤1002)；以及然后培养所述重组宿主细胞以胞外分泌节肢弹性蛋白(图2中的步骤1003)。在一些实施方案中，该方法包括以大于2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、4mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、6mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、8mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、12mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、14mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、16mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、18mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、25mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从2mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或5mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从5mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从10mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时、30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；从20mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时或30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时；或从30mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时至40mg节肢弹性蛋白/g干细胞重量/小时的速率胞外分泌节肢弹性蛋白。在一些实施方案中，然后纯化分泌的节肢弹性蛋白(图2中的步骤1004)，并且使纯化的弹性蛋白交联以形成弹性体(图2中的步骤1005)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用本文提供的载体转化细胞以获得本文所提供的重组宿主细胞的步骤(图2中的步骤1002)。用载体转化细胞的方法是本领域中众所周知的。此类方法的非限制性示例包括磷酸钙转染、树状大分子转染、脂质体转染(例如，阳离子脂质体转染)、阳离子聚合物转染、电穿孔、细胞挤压、声孔效应、光学转染、原生质体融合、刺穿转染(impalefection)、水动力学递送(hyrodynamicdelivery)、基因枪、磁性转染和病毒转导。基于本领域中的知识，即用于引入载体的某些技术对于某些类型的细胞更好地起作用，本领域技术人员能够选择一种或多种合适的方法来用本文提供的载体转化细胞。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在适合于获得本文所提供的发酵物的条件下在培养基中培养本文提供的重组宿主细胞的步骤(图2中的步骤1003)。在一些实施方案中，所述条件和培养基适合于促进重组蛋白从重组宿主细胞分泌到培养基中。用于在这些方法中使用的合适的培养基是本领域中已知的，合适的培养条件也是如此。培养酵母宿主细胞的示例性细节描述于Idiris等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.86:403-417,2010；Zhang等人，Biotechnol.Bioprocess.Eng.5:275-287,2000；Zhu,Biotechnol.Adv.30:1158-1170,2012；Li等人，MAbs 2:466-477,2010中。

在一些实施方案中，该方法进一步包括从本文提供的发酵物中纯化出分泌的重组节肢弹性蛋白以获得本文提供的重组节肢弹性蛋白的步骤(图2中的步骤1004)。纯化可以通过本领域中已知的多种用于从发酵物中纯化分泌的蛋白质的方法进行。此类方法中的常见步骤包括离心(以去除细胞)，然后使用沉淀剂或其他合适的结构制造剂(cosmotrope)(例如硫酸铵)来沉淀蛋白质。然后可以将沉淀的蛋白质通过离心与上清液分离，然后重悬于溶剂(例如，磷酸盐缓冲盐水[PBS])中。可以对悬浮的蛋白质进行透析以去除溶解的盐。另外，可以将透析的蛋白质加热以使其他蛋白质变性，并且可以通过离心去除变性的蛋白质。任选地，可使纯化的重组节肢弹性蛋白凝聚。

在各种实施方案中，从发酵物中纯化分泌的重组蛋白的方法可包括将各种离心步骤与用已知的离液剂(诸如尿素或硫氰酸胍)使全细胞培养液或细胞沉淀中的蛋白质增溶相结合。

在一些实施方案中，可通过离心全细胞培养液以产生第一细胞沉淀和第一上清液，并提取第一上清液以产生澄清的细胞培养液来纯化重组节肢弹性蛋白。然后使用硫酸铵使第一上清液沉淀并对其进行离心以产生第二沉淀物，并弃去第二上清液。然后将第二沉淀重悬于PBS中以进行透析。在一些实施方案中，然后使经透析的溶液经受高温以使没有靶重组蛋白那么稳定的蛋白质变性。然后，通过离心经透析和变性的溶液来去除变性的蛋白质，以产生第三沉淀和第三上清液。将第三上清液从变性溶液中保留下来，然后通过冷却第三上清液来进行凝聚以诱导相分离成致密下层和上层，该致密下层含有目标重组节肢弹性蛋白。通过该方法纯化的样品可以称为“CCB”样品。在一些实施方案中，通过保留下层并在较低温度下孵育所述下层以诱发进一步的相分离来执行多次凝聚。

在一些实施方案中，可以通过如下方式来纯化重组节肢弹性蛋白：离心全细胞培养液以产生细胞和邻近所述细胞(例如粘附于所述细胞、在所述细胞的表面上)的蛋白质和/或不溶性蛋白质(例如，蛋白质聚集物)的第一沉淀及第一上清液，然后弃去所述第一上清液以获得第一沉淀。然后可以将第一沉淀重悬于硫氰酸胍中以使重组节肢弹性蛋白增溶。然后将重悬液再次离心以产生第二沉淀和第二上清液。然后将第二上清液用PBS透析，并经受高温以使重组节肢弹性蛋白以外的蛋白质变性，并离心以产生第三沉淀和第三上清液。在一些实施方案中，然后通过冷却使第三上清液凝聚，以产生相分离而形成致密下层和上层，所述致密下层含有重组节肢弹性蛋白。通过这种方法纯化的样品可称为“凝胶层”样品。在一些实施方案中，通过保留下层并在较低温度下孵育所述下层以诱发进一步的相分离来执行多次凝聚。

在一些实施方案中，可以通过如下方式来纯化重组节肢弹性蛋白：离心全细胞培养液以产生沉淀和上清液，然后弃去上清液以获得细胞和邻近所述细胞(例如粘附于所述细胞、在所述细胞的表面上)的蛋白质和/或不溶性蛋白质(例如蛋白质聚集物)的沉淀。然后将细胞沉淀重悬于硫氰酸胍中，以使邻近所述细胞的蛋白质增溶。将重悬液再次离心以产生第二细胞沉淀和第二上清液。然后使用硫酸铵使第二上清液沉淀并对其进行离心以产生第三沉淀和第三上清液。然后将第三沉淀物悬浮于硫氰酸胍中，然后用PBS透析，并经受高温以使重组节肢弹性蛋白以外的蛋白质变性，并离心以产生第四上清液和第四沉淀。然后通过冷却使第四上清液凝聚以产生相分离。通过这种方法纯化的样品可以称为“凝胶层沉淀的”样品。

在一些实施方案中，可以通过如下方式来纯化重组节肢弹性蛋白：将尿素添加到全细胞培养液中以使蛋白质增溶，然后离心所述全细胞培养液以产生第一沉淀和第一上清液。然后使用硫酸铵使第一上清液沉淀并对其进行离心以产生第二沉淀和第二上清液。弃去第二上清液，然后将第二沉淀重悬于硫氰酸胍中并用PBS透析，然后经受高温以使重组节肢弹性蛋白以外的蛋白质变性，并再次离心以产生第三沉淀和第三上清液。然后通过冷却第三上清液使第三上清液凝聚，以诱导相分离成致密下层和上层，所述致密下层含有重组节肢弹性蛋白。通过这种方法纯化的样品可以称为“尿素WCBE”样品。

在一些实施方案中，可以通过如下方式来纯化重组节肢弹性蛋白：离心全细胞培养液以产生第一沉淀和第一上清液，然后弃去第一上清液以获得细胞和邻近所述细胞(例如粘附于所述细胞、在所述细胞的表面上)的蛋白质和/或不溶性蛋白质(例如，蛋白质聚集物)的第一沉淀。然后将第一细胞沉淀重悬于硫氰酸胍中以使蛋白质增溶。将重悬液再次离心以产生第二细胞沉淀和第二上清液。然后将第二上清液用PBS透析，然后离心以产生蛋白质的重相、上清液的轻相以及将所述重相与所述轻相分开的膜。然后通过弃去所述轻相和所述膜来分离出蛋白质的重相。通过这种方法纯化的样品可以称为“致密层”样品。

在一些实施方案中，重组节肢弹性蛋白组合物是泡沫材料。在一些实施方案中，制备重组节肢弹性蛋白泡沫的方法包括：提供在水性溶剂中的交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物；用极性非水性溶剂交换所述水性溶剂；以及将一个或多个气泡引入到交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物中。本文中可以使用本领域已知的任何引入气泡的方法。例如，引入气泡的方法包括但不限于涡旋、混合、添加酵母和化学反应。在一些实施方案中，引入一个或多个气泡可以在提供交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物的同时发生。在一些实施方案中，引入一个或多个气泡可以在提供交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物之后发生。

通常将发泡剂引入到聚合物材料中以制备聚合物泡沫。根据一个实施方案，将化学发泡剂与聚合物混合在一起。化学发泡剂通常在聚合物熔融的条件下在聚合物材料中经历化学反应，从而导致气体的形成。化学发泡剂一般是在特定温度下分解并释放出诸如氮气、二氧化碳或一氧化碳的气体的低分子量有机化合物。

示例性化学发泡剂包括但不限于碳酸氢钠、碳酸氢钾、铵、偶氮二甲酰胺、异氰酸酯、肼、异丙醇、5-苯基四唑、三唑、4,4'-氧双(苯磺酰肼)(OBSH)、三肼基均三嗪(THT)、磷酸氢盐、酒石酸、柠檬酸和甲苯磺酰氨基脲(TSS)。

在一些实施方案中，将发泡剂、增稠剂和/或硬化剂添加到重组节肢弹性蛋白固体中。示例性发泡剂包括但不限于黄原胶、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸铵、牛血清白蛋白。示例性增稠剂包括但不限于气相法二氧化硅和黄原胶。示例性硬化剂包括但不限于脂肪族聚胺、脂肪聚酰胺、芳族聚胺硬化剂、酸酐硬化剂、三氟化硼硬化剂和固化剂(双氰胺)。

根据另一个实施方案，将物理发泡剂(即在环境条件下为气体的流体)注入到熔融的聚合物流中以形成混合物。使混合物经受压降，从而导致发泡剂膨胀并在聚合物中形成气泡(微孔)。在一些实施方案中，所需压力为约500psi至约2000psi，例如约600psi至约1000psi、约700psi至约1500psi，以及约800psi至约2000psi。在一些实施方案中，所需压力为约500psi。

示例性的物理发泡剂包括但不限于氯氟烃(CFC)、溶解的氮、N₂、CH₄、H₂、CO₂、Ar、戊烷、异戊烷、己烷、二氯甲烷和二氯四氟乙烷。

等同物和范围

本领域的技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能够确定本文所述的根据本发明的特定实施方案的许多等同物。本发明的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述。

在权利要求书中，诸如“一个/种”、“一”和“该/所述”的冠词可以表示一个/种或多于一个/种，除非相反地指出或根据上下文以其他方式显而易见。除非相反地指出或根据上下文以其他方式显而易见，否则如果组的成员中的一个成员、多于一个成员或所有成员存在于给定的产品或方法中，被用在给定的产品或方法中，或者以其他方式与所述给定的产品或方法相关，则认为在所述组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述得到了满足。本发明包括其中所述组中的恰好一个成员在给定产品或方法中存在、被用在给定产品或方法中，或者以其他方式与给定产品或方法相关的实施方案。本发明包括其中所述组成员中的多于一个成员或所有成员在给定产品或方法中存在、被用在给定产品或方法中，或者以其他方式与给定产品或方法相关的实施方案。

还应注意的是，术语“包括”旨在为开放的，并且允许但不要求包括额外的要素或步骤。当本文中使用术语“包括”时，术语“由……组成”由此也被涵盖和公开。

在给出范围的情况下，端点也被包括。此外，应当理解的是，除非另外指明或根据上下文和本领域的普通技术人员的理解以其他方式显而易见，否则表示为范围的值可以在本发明的不同实施方案中假定为所陈述范围内的任何特定值或子范围，直到该范围的下限的单位的十分之一，除非上下文另外明确指出。

所有引用的来源，例如本文引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术，即使未在引用中明确陈述，也都以引用方式并入到本申请中。在引用的来源的陈述与本申请的陈述冲突的情况下，则以本申请中的陈述为准。

小节标题和表格标题并非旨在进行限制。

实施例

以下是用于实施本发明的具体实施方案的实施例。提供这些实施例仅出于说明性目的，而并非旨在以任何方式限制本发明的范围。已经努力确保所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是当然应该允许一些实验误差和偏差。

除非另外指明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。文献中对此类技术进行了充分的解释。参见例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,currentaddition)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编著，Academic Press,Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton,Pennsylvania:MackPublishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry，第3版(Plenum Press)，第A卷和第B卷(1992)。

实施例1：重组节肢弹性蛋白的生产

通过用包含分泌的节肢弹性蛋白编码序列的载体转化GS115(NRRL Y15851)巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(巴斯德驹形氏酵母(Komagataella phaffii))的HIS+衍生物来产生分泌重组节肢弹性蛋白的巴斯德毕赤酵母重组宿主细胞。

载体各自包含3个节肢弹性蛋白编码序列，所述节肢弹性蛋白编码序列符合读框地与N-末端分泌信号(α交配因子前导序列和pro序列)融合，并且在一些实例中与C-末端3xFLAG标签(SEQ ID NO:45)融合(参见图3)。分泌的节肢弹性蛋白编码序列中的每个节肢弹性蛋白编码序列侧接启动子(pGCW14)和终止子(tAOX1 pA信号)。载体进一步包含靶向区域，所述靶向区域可指导3个分泌的节肢弹性蛋白编码序列整合到巴斯德毕赤酵母基因组的HSP82基因座上；用于选择细菌和酵母转化体的显性抗性标记物；以及细菌复制起点。

节肢弹性蛋白编码序列是从科学文献和搜索公共序列数据库获得的。将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，然后进行密码子优化。选择全长和截短的节肢弹性蛋白序列。表1列出了选定的分泌的节肢弹性蛋白编码序列。

表1-示例性的全长和截短的节肢弹性蛋白氨基酸序列和重组宿主菌株

使用电穿孔将载体转化到巴斯德毕赤酵母中，以产生包含每个分泌的节肢弹性蛋白编码序列的3个整合拷贝的宿主菌株。将转化体铺在补充有抗生素的YPD琼脂平板上，并在30℃孵育48小时。

将来自每个最终转化的克隆接种到96孔块中的400μL缓冲甘油-复合培养基(BMGY)中，并在30℃下在1,000rpm搅拌下孵育24小时。取出样品，通过离心沉淀重组宿主细胞，并且回收上清液并将其在SDS-PAGE凝胶上跑电泳以通过考马斯凝胶和蛋白质印迹分析(针对包含3xFLAG标签的多肽)分析节肢弹性蛋白的含量。对于具有FLAG标签的蛋白质，将剩余的培养物一式两份地接种到基本培养基中，以进行ELISA测量。对一份重复品进行沉淀并直接测量上清液。用硫氰酸胍提取第二重复品，并测量细胞内和细胞外级分。

来自许多物种的重组节肢弹性蛋白在巴斯德毕赤酵母重组宿主细胞中成功表达。重组宿主细胞分泌所产生的重组节肢弹性蛋白中的高达90％。

序列表的SEQ ID NO:49提供了全长果蝇节肢弹性蛋白序列(Ds_ACB)，该序列与后来被切割的信号序列一起表达。第一序列(斜体)是α交配因子前体蛋白信号序列(SEQ IDNO:46)，其在转录后被信号肽酶切割两次，之后经Kex2切割。第二序列(粗体)是EAEA重复序列，其被Ste13切割(SEQ ID NO:47)。第三序列(小写体)对应于果蝇全长节肢弹性蛋白(SEQID NO 1)。第四序列(加粗并斜体)对应于接头序列(SEQ ID NO:46)。第五序列(加下划线的)对应于3X FLAG标签(SEQ ID NO:45)。

Edman测序证实了在约110kDa条带处的蛋白质序列的N-末端对应于全长长度的果蝇节肢弹性蛋白序列。具体地，N-末端测序显示N-末端对应于“EAEA”或“GRPE”，分别是具有或不具有EAEA重复序列的全长果蝇节肢弹性蛋白序列。

实施例2：重组节肢弹性蛋白的纯化

如下纯化无FLAG标签的Ds_ACB和Ae_A重组节肢弹性蛋白多肽：使菌株RMs1221(表达Ds_ACB)和RMs1224(表达Ae_A)在烧瓶中的500mL BMGY中于30℃在300rpm搅拌下生长48小时。

纯化方案改编自Lyons等人(2007)。将细胞离心沉淀，并收集上清液。通过添加硫酸铵使蛋白质沉淀。将沉淀的蛋白重悬于少量体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后将重悬的样品用PBS透析以去除盐。然后将经透析的样品加热以使天然蛋白质变性，并且通过离心去除变性的蛋白质。保留的上清液含有纯化的节肢弹性蛋白多肽。任选地，将保留的上清液冷却，这会引起凝聚，从而产生浓缩的下部相和稀释的上部相。

通过如下方式制备第二组样品：离心全细胞培养液以产生细胞和邻近所述细胞(例如粘附于所述细胞、在所述细胞的表面上)的蛋白质和/或不溶性蛋白质(例如，蛋白质聚集物)的第一沉淀和第一上清液，然后弃去所述第一上清液以获得第一沉淀。将第一沉淀重悬于硫氰酸胍中以使Ds_ACB增溶。将重悬液再次离心以产生第二沉淀和第二上清液。然后将第二上清液用PBS透析，并经受高温以使除Ds_ACB以外的蛋白质变性，并离心以产生第三沉淀和第三上清液。通过冷却使第三上清液凝聚，以产生相分离而形成致密下层和上层，所述致密下层包含Ds_ACB。这在本文中也称为凝胶层分离或凝聚样品。在一些凝胶层样品中，通过保留下层并在较低温度下孵育所述下层以诱发进一步的相分离来执行多次凝聚。

表2-交联的节肢弹性蛋白的稳定性

实施例3：纯化的、分泌的重组节肢弹性蛋白的交联

将纯化的节肢弹性蛋白通过以下三种方法中的一种方法来交联：光交联(改编自Elvin等人，2005)、酶促交联(改编自Qin等人，2009)或本文所述的方法(即，暴露于过硫酸铵和热量中)。

光交联

为了进行光交联，将节肢弹性蛋白与过硫酸铵和三(联吡啶)钌(II)([Ru(bpy)3]2+)混合在一起。将该混合物暴露于亮白光下，在此之后混合物形成橡胶状固体。

具体地，制备10mM Ru(II)光催化剂(CAS 50525-27-4)在水中的储备溶液和100mM过硫酸铵在水中的储备溶液。将纯化的节肢弹性蛋白粉末溶于磷酸盐缓冲盐水中至节肢弹性蛋白浓度介于20-30重量％之间，以制备节肢弹性蛋白储备溶液。

将2μL的10mM Ru(II)光催化剂溶液和2μL的100mM过硫酸铵添加到10μL的节肢弹性蛋白储备溶液中并与之混合，以形成光交联溶液。通过离心从光交联溶液中去除气泡，并将光交联溶液倒入模具中。

然后将光交联溶液暴露于白光(白色LED泛光灯，Zochlon USPT100W 110V)下30秒至1分钟。

酶促交联

对于酶促交联，将节肢弹性蛋白与辣根过氧化物酶(HRP)和过氧化氢混合在一起。将混合物在37℃下孵育，在此之后混合物形成橡胶状固体。

具体地，制备10mg/mL辣根过氧化物酶(1型，P8125 Sigma)在水中的储备液(HRP储备液)和100mM H₂O₂在水中的储备液。将纯化的节肢弹性蛋白粉末溶于磷酸盐缓冲盐水中至节肢弹性蛋白浓度介于20-30重量％之间，以制备节肢弹性蛋白储备溶液。

将6μL的HRP储备液添加到21μL的节肢弹性蛋白储备溶液中并与之混合。然后添加3uL H₂O₂储备液，并通过涡旋混合以形成酶促交联溶液。通过离心从酶促交联溶液中去除气泡，并在保持溶液在4℃下的同时将酶促交联溶液倒入模具中。为了执行交联，将酶促交联溶液在37℃孵育15分钟。所得的交联的节肢弹性蛋白组合物包含与节肢弹性蛋白固体共价结合的活性酶。

过硫酸盐和热交联

使用过硫酸铵和热量使纯化的节肢弹性蛋白交联。

具体地，将纯化的节肢弹性蛋白粉末溶于磷酸盐缓冲盐水中至节肢弹性蛋白浓度介于20-30重量％之间，以制备节肢弹性蛋白储备溶液。将4μL的200mM在水中的过硫酸铵与18μL的节肢弹性蛋白储备溶液混合在一起至最终浓度为36mM过硫酸铵。通过离心从过硫酸盐交联溶液中去除气泡，并将过硫酸盐交联溶液倒入模具中。

为了执行交联，将过硫酸盐交联溶液在密封的潮湿环境中在80℃孵育2.5小时。所得的交联的节肢弹性蛋白组合物没有在节肢弹性蛋白固体中留下活性催化剂，并且产生具有较少的经降解蛋白质的组合物。

HRP交联组合物的降解

通过经由每天观察确定每个交联样品保持固体的持续时间来评定交联样品随时间推移的稳定性。表3给出了经由光交联(Ru+hv)、酶促交联(HRP)以及经由过硫酸铵和热交联(AP+热量)制备的每个交联样品作为固体的时间。如表3中所示，在室温下，经由光交联而交联或经由过硫酸铵交联的节肢弹性蛋白组合物的稳定性持续时间比经由酶促交联而交联的节肢弹性蛋白组合物的稳定性持续时间长得多。

表3—通过不同的交联程序交联的节肢弹性蛋白组合物的降解

如通过ELISA测得的来自过硫酸铵交联的节肢弹性蛋白组合物(AP)和酶促交联的节肢弹性蛋白组合物(HRP)的总降解的节肢弹性蛋白如图6所示。与AP样品相比，在HRP样品中观察到了来自交联的节肢弹性蛋白组合物的节肢弹性蛋白片段的降解和分泌增加。

该数据表明，对于制备稳定的节肢弹性蛋白组合物，过硫酸铵交联优于酶促交联。对于酶促交联的节肢弹性蛋白组合物，交联酶保留在组合物中并导致组合物降解。

实施例4：交联的全长节肢弹性蛋白与节肢弹性蛋白混合物的稳定性的对比

使生成的具有不同水平的降解产物和全长节肢弹性蛋白的节肢弹性蛋白样品经受如上所述的酶促交联。通过经由每天观察确定每个交联样品保持固体的持续时间来评定交联样品随时间推移的稳定性。表4给出了每个交联样品作为固体的时间。如表4所示，包含全长节肢弹性蛋白的样品的稳定性持续时间比不包含全长节肢弹性蛋白的样品的稳定性持续时间长。

表4-交联的节肢弹性蛋白的稳定性

实施例5：节肢弹性蛋白泡沫

使节肢弹性蛋白在增稠添加剂(例如，气相法二氧化硅)和碳酸氢钠存在下交联，得到具有相对均匀的气泡分布的经发泡的节肢弹性蛋白。改变气相法二氧化硅的量能影响平均气泡大小，这给我们提供了调整经发泡的节肢弹性蛋白固体的杠杆。结果在表5中给出。

表5-关于节肢弹性蛋白泡沫的数据

制备节肢弹性蛋白的溶液。将0.81g节肢弹性蛋白溶于2.19mL pH 7.4的PBS中。添加发泡剂，并将溶液涡旋以引入气泡，并通过热量或光交联。将50mg黄原胶添加到溶液中，然后加入0.65mL的225mM过硫酸铵。黄原胶用作发泡剂，因为它也增加了粘度，该粘度有助于将气泡困在溶液中。然后将溶液涡旋并在80℃加热3.5小时。

在一些样品中，利用钌(II)和白光使节肢弹性蛋白交联。在此类实验中，将0.405g节肢弹性蛋白批次3溶于1.10mL PBS中。然后，添加0.3mL的100mM过硫酸铵和0.3mL的10mMRu(II)催化剂。在其他样品中，将0.405g节肢弹性蛋白批次3溶于1.10mL PBS中。然后，添加25mg的黄原胶，随后添加0.3mL的100mM过硫酸铵和0.3mL的10mM Ru(II)催化剂。

在一些样品中，将碳酸氢钠用作化学发泡剂。将碳酸氢钠添加到节肢弹性蛋白溶液中并进行交联。在一些样品中添加了增稠剂气相法二氧化硅。过多的碳酸氢钠(33mg/mL或更多)会抑制胶凝。将介于6-20mg/mL之间的碳酸氢钠用在节肢弹性蛋白溶液中会导致在80℃下3.5小时后的节肢弹性蛋白固体具有大气泡。添加增稠剂气相法二氧化硅至介于4-10重量％之间会得到具有均匀气泡分布的节肢弹性蛋白泡沫(图7和图8)。过少的气相法二氧化硅会得到经半发泡的节肢弹性蛋白固体，而添加超过5重量％的气相法二氧化硅则会得到具有较小气泡的经发泡的节肢弹性蛋白(图7)。具有5重量％的气相法二氧化硅的节肢弹性蛋白泡沫的气泡直径为0.2mm至2mm。具有10重量％的气相法二氧化硅的节肢弹性蛋白泡沫的气泡直径为0.05mm至0.2mm。

具体地，将0.27g节肢弹性蛋白批次3溶于0.73mL pH 7.4的PBS中。然后，将37mg、18mg、10mg或6mg碳酸氢钠添加到溶液中，之后添加0.22mL的225mM过硫酸铵和介于0-10重量％之间的气相法二氧化硅。将该溶液涡旋并在80℃加热3.5小时。在加盖的2mL管中执行实验。

在一些样品中，在于83℃下使节肢弹性蛋白交联的同时，使用ISCO泵在1600psi或500psi下引入溶解的氮气。在这些压力下进行交联的速度比在大气压下进行交联的速度慢，这可能是由于溶解氧的量增加所致。

具体地，将1.1mL的225mM或550mM过硫酸铵在水中的溶液添加到5mL的27重量％的节肢弹性蛋白在PBS中的溶液中。然后将该溶液在7197rcf下离心5分钟，然后添加到ISCO泵中。然后将泵与氮气室(house nitrogen)接通，并将ISCO泵设置为其最大体积266mL，用氮气吹扫3分钟，然后密封。然后，将泵设置为500psi或1600psi，并在83℃加热2-6小时。在释放压力后，将弹性蛋白在83℃下再加热1-2小时。

实施例6：溶剂交换以及在水性溶剂中的交联的节肢弹性蛋白与在极性非水性溶 剂中的交联的节肢弹性蛋白的比较

如以下详细描述的，用溶剂交换处理重组节肢弹性蛋白在水性溶剂中的交联的混合物以用极性非水性溶剂替换所述溶剂，以形成具有更好地适合于某些应用的材料特性的组合物。

制备包含如经由SEC(尺寸排阻色谱法)测得的19质量％的全长节肢弹性蛋白的节肢弹性蛋白粉末，其中所述粉末的剩余部分包含部分降解的节肢弹性蛋白。

然后将节肢弹性蛋白粉末溶于1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，所报告的节肢弹性蛋白的重量百分比为重量比重量(w/w)。通过将0.27g的节肢弹性蛋白添加到0.73g的PBS溶液中来制备1g的27重量％的节肢弹性蛋白溶液。然后使节肢弹性蛋白溶液在模具中交联以形成基于水的节肢弹性蛋白固体组合物。所形成的节肢弹性蛋白固体是直径15mm×高度5mm的盘状物。

为了产生基于甘油的节肢弹性蛋白固体，使该基于水的固体在密闭容器中在60℃下在20倍其体积的60％甘油(60:40甘油:水(v:v))中进行交换。然后，使该固体在未密封的容器中在60℃下在20倍其体积的甘油中交换16小时。

将基于水和基于甘油的节肢弹性蛋白固体样品在室温下不密封地存储1周。如图9所示，基于水的节肢弹性蛋白固体在仅1周后就会脱水，而基于甘油的节肢弹性蛋白固体则保持其原始形状，而没有任何可见的降解或脱水。

实施例7：溶剂交换以及多种极性非水性节肢弹性蛋白溶剂的特性的比较

在极性非水性溶剂中的节肢弹性蛋白固体是如下从在1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的交联的节肢弹性蛋白制备的：

通过如下方式制备在丙二醇溶剂中的节肢弹性蛋白固体：使节肢弹性蛋白固体在未密封的容器中在60℃下在20倍其体积的丙二醇中交换16小时或2天(即，包括2天)。

通过如下方式制备在60-100％甘油溶剂中的节肢弹性蛋白固体：使节肢弹性蛋白固体在密闭容器中在60℃下在20倍其体积的60％甘油(60:40甘油:水(v:v))中交换16小时。然后，使固体在未密封的容器中在60℃下在20倍其体积的甘油中交换16小时。

通过如下方式制备在100％甘油溶剂中的节肢弹性蛋白固体：使节肢弹性蛋白固体在未密封的容器中在60℃下在20倍其体积的甘油中交换16小时或2天(即，包括2天)。

通过如下方式制备在乙二醇溶剂中的节肢弹性蛋白固体：使节肢弹性蛋白在未密封的容器中在60℃下在20倍其体积的乙二醇中交换固体16小时。

通过如下方式制备在丙二醇溶剂中的节肢弹性蛋白固体：使节肢弹性蛋白固体在未密封的容器中在60℃下在20倍其体积的丙二醇中交换16小时。

为了基于经由凝聚的纯化形成节肢弹性蛋白固体，将27重量％(w/w)的节肢弹性蛋白溶液在-5℃下孵育，并发生液-液相分离。分离出底部凝聚层，并将过硫酸铵(APS)粉末混合到凝聚体中至最终浓度为36mM APS。然后将该溶液在80℃下交联2.5小时。然后按照典型的溶剂交换程序对所述固体进行交换。

除非另有说明，否则所用节肢弹性蛋白粉末为如经由尺寸排阻色谱法(SEC)测得的19质量％的全长节肢弹性蛋白，所述粉末的其余部分由部分降解的节肢弹性蛋白构成。27重量％的“全长节肢弹性蛋白”样品是由这样的节肢弹性蛋白粉末制备的，该节肢弹性蛋白粉末是如经由SEC测得的87质量％的全长单体节肢弹性蛋白。

为了使用SEC表征节肢弹性蛋白组合物中主要节肢弹性蛋白种类的相对量，将节肢弹性蛋白粉末溶于5M硫氰酸胍中，然后注入到Yarra SEC-3000SEC-HPLC柱上以基于分子量分离各成分。折射率用作检测模式。将BSA用作一般蛋白质标准品，并且假设所有蛋白质中>90％的蛋白质表现出在彼此的约7％内的dn/dc值(折射率的响应因子)。将聚(环氧乙烷)用作保留时间标准品，并且将BSA校准器用作检查标准，以确保所述方法的一致性能。对应于节肢弹性蛋白的范围被评定为60-40kDa；观察到的可能与聚集物或聚合的节肢弹性蛋白对应的较高峰不包括在该定量中。将该节肢弹性蛋白峰的相对百分比报告为质量％和面积％，以确定以在总节肢弹性蛋白中所占比例计的组合物中的全长节肢弹性蛋白的量。

然后，使用Malvern Kinexus流变仪RNX2110生成如上所述的那样产生的组合物中的每种组合物的应力应变曲线。在22℃的温度下应用以下方案：步骤1：初始间隙—6.5mm；步骤2：下降到最终间隙。将步骤1和步骤2重复5次。如通过流变仪测得的弹性模量值仅是相对的，并且不能与在不同条件下或使用不同仪器测试的材料进行比较。

生成应力-应变曲线，绘制工程应力与工程应变的关系图。工程应力是通过下面的公式计算的：工程应力＝(与流变仪几何形状接触的节肢弹性蛋白固体的法向力(N)/A(mm²))×10⁶。工程应变是压缩应变的绝对值＝ABS((节肢弹性蛋白固体的当前压缩高度(mm)-未压缩固体的高度(mm))/未压缩固体的高度(mm))*100。

图10A示出了27重量％的在60-100％甘油中的交联的节肢弹性蛋白的应力-应变曲线。图10B示出了27重量％的在丙二醇中的交联的节肢弹性蛋白的应力-应变曲线。图10C示出了27重量％的在丙二醇中的全长交联的节肢弹性蛋白的应力-应变曲线。为了进行比较，还根据Sholl博士的插入件生成了流变测量学数据。

如图11所示，经发泡的节肢弹性蛋白的应力-应变曲线的形状更像曲棍球球棍。这是由于经发泡的节肢弹性蛋白中的气穴首先被压缩，然后节肢弹性蛋白材料被压缩的结果。

由流变测量学数据确定了弹性模量和回复率的相对值，如表5所示。相对回复率(％)是通过如下方式计算的：取得载荷曲线下的面积，并将其除以工程应力与应变图上的卸载曲线下的面积，然后将该值乘以100。相对弹性模量是从介于10％与20％之间的绝对压缩应变得出载荷曲线的斜率来计算的。

如所示的，交联的节肢弹性蛋白溶剂从基于水的溶剂到极性非水性溶剂的交换产生了具有相似回复率和相似弹性的较硬材料。所有交联的节肢弹性蛋白组合物在测试条件(＜20N的力)下都是有弹性的。

还使用流变仪来测量如实施例5中所述的那样用气相法二氧化硅作为发泡剂在100％甘油溶剂中产生的5重量％的经发泡的节肢弹性蛋白的回复率。结果也在表6中给出。

表6-在不同溶剂中的交联的节肢弹性蛋白的弹性模量和回复率的相对值

绘制了来自表6的回复率和弹性模量的相对值，如图12所示。该图示出了当经由溶剂交换调整交联的节肢弹性蛋白特性时回复率与弹性模量之间的关系。

还使用流变仪测量单独制备的在丙二醇中的交联的节肢弹性蛋白固体的相对回复率和弹性模量。结果在表7中给出。

表7-来自同一地制备的丙二醇固体的流变仪数据

还使用流变仪来通过重复施加力测量在不同溶剂中的交联的节肢弹性蛋白固体的相对回复率和弹性模量，以确定重复施加力对这些参数的影响。结果在表8中给出。

表8—流变仪数据：来自多次压缩的回复率和模量数据

实施例8：节肢弹性蛋白固体的刚度与典型中底的刚度的对比

如实施例6中所述的那样，在水、60-100％甘油、100％甘油、丙二醇(16小时孵育)和丙二醇(2天孵育)中制备交联的丝固体组合物。使用Shore OO硬度计(AD-100-00)通过ASTM:D-2240测试这些材料的刚度。出于比较目的，还测试了Scholl博士的内底和典型的中底。结果在表9中给出。

表9-不同的节肢弹性蛋白组合物的刚度与典型中底的刚度的对比

实施例9：通过Zwick压缩曲线测得的弹性到塑性的转变

获得以下物质的Zwick压缩数据：27重量％的节肢弹性蛋白乙二醇固体(“A”)；27重量％的节肢弹性蛋白丙二醇固体(“C”)；凝聚节肢弹性蛋白丙二醇固体(“D”)；27重量％的节肢弹性蛋白、60-100％的甘油固体(“G”)；以及27重量％的节肢弹性蛋白、100％的甘油固体(“H”)。这些样品中的每一个样品均如实施例5中所述的那样制备。

具体地，使用具有5kN载荷传感器和5kN压板的Zwick拉伸测试仪(Zwick/RoellZ5.0)测试以上样品的压缩数据。每个固体的固体尺寸为15mm×5mm的盘状物。使用D695刚性塑料压缩特性压缩程序(D695 Compressive Properties of Rigid Plasticscompression program)在22℃(环境)和65％(环境)湿度下对材料进行测试。

如由Zwick拉伸测试仪测得的每种固体的力与应变关系曲线如图13所示。在所施加的至多2kN的压缩力下，对于任何节肢弹性蛋白固体，都没有看到从弹性到塑性的转变。相反，当节肢弹性蛋白固体在压缩应力下破裂时，所述破裂是通过撕裂而不是弹性变形发生的。

实施例10：对丙二醇节肢弹性蛋白固体的回复率和压缩的分析

使用ASTM D7121和ASTM D575测试，测量如在实施例5中制备的交换到丙二醇中的27重量％的节肢弹性蛋白固体在25％应变时的反弹回复率和压缩应力。测试的固体的尺寸是直径为1.125英寸并且高度为0.8英寸的盘状物。提交了具有这些尺寸的3个不同样品。结果在表10中给出。

表10-关于丙二醇节肢弹性蛋白固体的回复率和压缩的数据

可以将表10中给出的数据与通过同一ASTM测试所测试的其他橡胶或弹性体进行比较。ASTM测试编号足以再现结果。该数据和硬度计数据是唯一可以直接与其他橡胶或弹性体进行比较的数据。

其他注意事项

已经出于说明的目的给出了本公开的实施方案的前述描述；但是前述描述并非旨在为穷举性的或将权利要求限制为所公开的精确形式。相关领域的技术人员应当理解，根据以上公开内容，许多修改和变化是可能的。

说明书中使用的语言主要是出于可读性和指导性目的而选择的，并且它可能不是被选择用于描绘或约束本发明的主题。因此，意图本公开的范围不受该详细描述限制，而是由根据基于此的申请提出的任何权利要求限制。因此，实施方案的公开内容旨在为是说明性的，而不限制权利要求书中阐述的本发明的范围。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献全文以引用方式并入。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，小节标题、材料、方法和示例仅为说明性的，而非旨在为限制性的。

序列表

Claims (58)

1.一种使重组节肢弹性蛋白交联的方法，所述方法包括：

提供包含纯化的重组节肢弹性蛋白的组合物；

将所述重组节肢弹性蛋白置于包含过硫酸铵的交联溶液中；以及

将在所述交联溶液中的所述重组节肢弹性蛋白在至少60℃的温度下孵育，从而产生交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述孵育执行至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟、至少90分钟或至少2小时。

3.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中将在所述交联溶液中的所述重组节肢弹性蛋白在60℃至85℃、70℃至85℃，或75℃至85℃的温度下孵育。

4.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述孵育执行至少2小时。

5.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述交联溶液不包含光催化剂或交联酶。

6.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物能够在室温下稳定超过5天、超过10天、超过20天，或超过40天。

7.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组节肢弹性蛋白是通过如下方式来制备的：使编码所述重组节肢弹性蛋白的基因在培养物中的经修饰的生物体中重组表达，以及从所述培养物中纯化出表达的重组节肢弹性蛋白。

8.一种组合物，所述组合物包含交联的重组节肢弹性蛋白，其中所述重组节肢弹性蛋白已经通过使所述节肢弹性蛋白暴露于过硫酸铵和热量中而发生交联。

9.一种组合物，所述组合物包含交联的重组节肢弹性蛋白，其中所述组合物不包含交联酶。

10.一种组合物，所述组合物包含交联的重组节肢弹性蛋白，其中所述组合物不包含光催化剂。

11.一种重组节肢弹性蛋白组合物，所述重组节肢弹性蛋白组合物包含在极性非水性溶剂中的交联的重组节肢弹性蛋白。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述极性非水性溶剂是质子溶剂。

13.如权利要求12所述的组合物，其中所述质子溶剂选自由以下组成的组：甘油、丙二醇和乙二醇。

14.如权利要求11所述的组合物，其中所述极性非水性溶剂是非质子溶剂。

15.如权利要求14所述的组合物，其中所述非质子溶剂是DMSO。

16.如权利要求11-15中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含20-40重量％的节肢弹性蛋白。

17.如权利要求11-16中任一项所述的组合物，其中所述节肢弹性蛋白为如通过尺寸排阻色谱法测得的以在所有节肢弹性蛋白中所占比例计的至少20％、至少50％、至少70％，或至少80％的全长节肢弹性蛋白。

18.如权利要求11-17中任一项所述的组合物，其中所述极性非水性溶剂为至少60体积％、至少70体积％、至少80体积％、至少90体积％、至少95体积％、至少98体积％，或至少99体积％的所述溶剂。

19.如权利要求11-18中任一项所述的组合物，其中所述重组节肢弹性蛋白组合物的弹性模量比在水性溶剂中的相似的交联的重组节肢弹性蛋白大。

20.如权利要求11-19中任一项所述的组合物，其中所述重组节肢弹性蛋白组合物包含如使用Shore OO硬度计经由ASTM D2240测得的至少10的硬度。

21.如权利要求11-20中任一项所述的组合物，其中所述重组节肢弹性蛋白组合物包含如使用Shore OO硬度计经由ASTM D2240测得的约10至约50的硬度。

22.如权利要求11-21中任一项所述的组合物，其中所述重组节肢弹性蛋白组合物包含如通过ASTM D7121测得的约40％至约60％的反弹回复率。

23.如权利要求11-22中任一项所述的组合物，其中所述重组节肢弹性蛋白组合物包含如通过ASTM D575测得的约6psi至约8psi的25％时的压缩应力。

24.如权利要求11-23中任一项所述的组合物，其中所述重组节肢弹性蛋白组合物在如通过Zwick压缩测试所测量的低于2kN的压缩力下，没有经受从弹性到塑性的转变。

25.如权利要求11-24中任一项所述的组合物，其中所述重组节肢弹性蛋白组合物是泡沫材料。

26.一种制备重组节肢弹性蛋白固体的方法，所述方法包括：

提供在水性溶剂中的交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物；以及

用极性非水性溶剂交换所述水性溶剂。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述极性非水性溶剂是质子溶剂。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述质子溶剂选自由以下组成的组：甘油、丙二醇和乙二醇。

29.如权利要求26所述的方法，其中所述极性非水性溶剂是非质子溶剂。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述非质子溶剂是DMSO。

31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述溶剂交换执行至少8小时、至少16小时、至少24小时，或至少48小时。

32.如权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述溶剂交换在约60℃下执行。

33.如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物包含如通过尺寸排阻色谱法测得的以在所有节肢弹性蛋白中所占比例计的至少20％、至少50％、至少70％，或至少80％的全长节肢弹性蛋白。

34.如权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述交联的重组固体组合物是通过如权利要求1-7中任一项所述的方法制备的。

35.一种调整包含交联的重组节肢弹性蛋白固体的固体组合物的材料特性的方法，所述方法包括：

提供包含水性溶剂的交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物；以及

执行溶剂交换以用极性非水性溶剂替换所述水性溶剂。

36.如权利要求35所述的方法，其中替换所述溶剂改变了所述交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物的弹性模量、回复率、硬度、最大弹性压缩负荷或材料寿命。

37.一种制备交联的重组节肢弹性蛋白固体的方法，所述方法包括：

提供包含纯化的重组节肢弹性蛋白的组合物；

将所述重组节肢弹性蛋白置于包含过硫酸铵的水性溶剂中；

将在所述水性溶剂中的所述重组节肢弹性蛋白在至少60℃的温度下孵育，从而产生交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物；以及

用选自由以下组成的组的极性非水性溶剂交换所述水性溶剂：甘油、丙二醇、乙二醇和DMSO。

38.一种制备重组节肢弹性蛋白泡沫的方法，所述方法包括：

提供在水性溶剂中的交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物；

用极性非水性溶剂交换所述水性溶剂；以及

将一个或多个气泡引入到所述交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物中。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述极性非水性溶剂是质子溶剂。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述质子溶剂选自由以下组成的组：甘油、丙二醇和乙二醇。

41.如权利要求38所述的方法，其中所述极性非水性溶剂是非质子溶剂。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述非质子溶剂是DMSO。

43.如权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述溶剂交换执行至少8小时、至少16小时、至少24小时，或至少48小时。

44.如权利要求38-43中任一项所述的方法，其中所述溶剂交换在约60℃下执行。

45.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其中所述交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物包含如通过尺寸排阻色谱法测得的以在所有节肢弹性蛋白中所占比例计的至少20％、至少50％、至少70％，或至少80％的全长节肢弹性蛋白。

46.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其中所述交联的重组固体组合物是通过如权利要求1-7中任一项所述的方法制备的。

47.如权利要求38-46中任一项所述的方法，其中所述引入包括将发泡剂添加到所述交联的重组节肢弹性蛋白固体组合物中。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述发泡剂包括化学发泡剂。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述化学发泡剂包含碳酸氢钠、碳酸氢钾、铵、偶氮二甲酰胺、异氰酸酯、肼、异丙醇、5-苯基四唑、三唑、4,4'-氧双(苯磺酰肼)(OBSH)、三肼基均三嗪(THT)、磷酸氢盐、酒石酸、柠檬酸和甲苯磺酰氨基脲(TSS)。

50.如权利要求48所述的方法，其中所述化学发泡剂包含碳酸氢钠。

51.如权利要求47所述的方法，其中所述发泡剂包含物理发泡剂。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述物理发泡剂包含氯氟烃(CFC)、溶解的氮、N₂、CH₄、H₂、CO₂、Ar、戊烷、异戊烷、己烷、二氯甲烷和二氯四氟乙烷。

53.如权利要求51所述的方法，其中所述物理发泡剂包含溶解的氮。

54.一种鞋内底，所述鞋内底包含通过如权利要求1-7、25-36和38-53中任一项所述的方法制备的组合物。

55.一种组合物，所述组合物包含在极性非水性溶剂中的交联的节肢弹性蛋白组合物，其中所述交联的节肢弹性蛋白是经发泡的。

56.如权利要求55所述的组合物，其中所述经发泡的交联的节肢弹性蛋白包含至少50％的孔隙率。

57.如权利要求55所述的组合物，其中所述经发泡的交联的节肢弹性蛋白的平均气泡直径为约0.01mm至约3mm。

58.一种鞋内底，所述鞋内底包含如权利要求8-25和权利要求55-57中任一项所述的组合物。

Images