CN104884463A - 亲水性重组蛋白的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种亲水性重组蛋白的提取方法，其为从表达亲水性重组蛋白的宿主中提取亲水性重组蛋白的方法，其包含：在上述表达亲水性重组蛋白的宿主中添加溶解用溶剂，获得宿主细胞的溶解物的溶解物获取工序，和在通过上述溶解物获取工序得到的上述宿主细胞的溶解物中添加稀释用溶剂，然后从得到的稀释液将不溶物分离，回收含有上述亲水性重组蛋白的上清液的工序；其中，上述亲水性重组蛋白的亲水性指数为0以下，上述溶解用溶剂为非质子性极性溶剂，上述稀释用溶剂为水系溶剂。

Description

亲水性重组蛋白的提取方法
技术领域
本发明涉及亲水性重组蛋白的提取方法，详细而言，本发明涉及从表达亲水性指数(hydropathy index)为0以下的重组蛛丝蛋白等亲水性重组蛋白的宿主中提取亲水性重组蛋白的方法。
背景技术
近年来，利用基因重组技术将目标外来基因导入大肠杆菌等宿主的细胞中、使目标蛋白表达成为可能，利用该技术进行了各种有用的重组蛋白的生产。蛛丝纤维是高强度和具有韧性的纤维，由于这样的特性，蛛丝作为新型原料受到关注，利用基因重组技术进行了使作为蛛丝原料的蛛丝蛋白在大肠杆菌等宿主细胞中的表达、回收。通常，使用大肠杆菌等宿主进行重组蛋白的生产时，通过将菌体破坏来回收目标蛋白。例如，专利文献1中记载了从宿主细胞中回收重组蛛丝蛋白的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2004-503204号公报
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献1中，通过使用甲酸、丙酸等有机酸使宿主细胞溶解来回收重组蛛丝蛋白，但当使用甲酸、丙酸等有机酸时，存在对酸没有耐受性的蛋白易于被分解的问题。
本发明为了解决上述以往的问题，提供一种能够在不使用有机酸的情况下从表达亲水性重组蛛丝蛋白等亲水性重组蛋白的宿主中提取亲水性重组蛋白的亲水性重组蛋白的提取方法。
用于解决课题的手段
本发明涉及一种亲水性重组蛋白的提取方法，其是从表达亲水性重组蛋白的宿主中提取亲水性重组蛋白的方法，其特征在于，其包含：向上述表达亲水性重组蛋白的宿主中添加溶解用溶剂，获得宿主细胞的溶解物的溶解物获取工序，和向通过上述溶解物获取工序获得的上述宿主细胞的溶解物中添加稀释用溶剂，然后从得到的稀释液中将不溶物分离，从而将含有上述亲水性重组蛋白的上清液回收的工序；其中，上述亲水性重组蛋白的亲水性指数为0以下，上述溶解用溶剂为非质子性极性溶剂，上述稀释用溶剂为水系溶剂。
本发明的亲水性重组蛋白的提取方法中，上述溶解用溶剂优选为不具有环状结构的非质子性极性溶剂，偶极矩优选为3.0D以上。上述溶解用溶剂更优选为选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、和N,N-二甲基乙酰胺中的一种以上的非质子性极性溶剂。上述溶解用溶剂优选为在上述非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂。上述稀释用溶剂优选为选自(1)水、(2)水与乙醇的混合液和(3)水溶性缓冲液中的一种水系溶剂。上述溶解用溶剂相对于上述宿主的质量以体积(mL)/质量(g)比计优选添加0.5倍以上，上述稀释用溶剂相对于上述宿主细胞的溶解物以体积比计优选添加0.5倍以上。上述亲水性重组蛋白优选为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白和重组胶原中的一种蛋白。
发明效果
根据本发明，通过使用非质子性极性溶剂作为溶解用溶剂、使用水系溶剂作为稀释用溶剂，用溶解用溶剂将表达亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白的宿主溶解，向得到的宿主细胞的溶解物中添加稀释用溶剂进行稀释、将不溶物分离，回收上清液，从而能够在不使用有机酸的情况下，简便且高效地从宿主提取亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白。
另外，根据本发明，通过使用不具有环状结构的非质子性极性溶剂，还能够以更高的纯度获得亲水性指数为0以下的重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重组胶原等亲水性重组蛋白。另外，根据本发明，通过使用在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂作为溶解用溶剂，还能够获得纯度更高的亲水性指数为0以下的重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重组胶原等亲水性重组蛋白。
附图说明
图1为表示实施例1中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果的照片。
图2为表示实施例2～5中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
图3为表示实施例6～8中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
图4为表示实施例9～13中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
图5为表示实施例16中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
图6为表示实施例17～21中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
图7为表示实施例22中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
图8为表示实施例23～26中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
图9为表示实施例28中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
图10为表示比较例1中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
图11A为表示实施例32中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片，图11B为表示实施例33中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
具体实施方式
本发明中，蛋白的亲水性指数(hydropathy index)是如下算出的数值。首先，求出蛋白中存在的氨基酸的亲水性指数的总和。接着，用该总和除以蛋白中的氨基酸残基数求出平均值，将算出的平均值作为蛋白的亲水性指数。其中，关于氨基酸的亲水性指数，使用公知的指标(Hydropathy index：Kyte，J.&Doolittle，R.F.(1982)A simple method for displaying thehydropathic character of a protein.J.Mol.Biol.157，105-132.)。具体而言，各氨基酸的亲水性指数(下文也记为HI)如下表1所示。
表1
氨基酸 HI 氨基酸 HI
丙氨酸(Ala) 1.8 亮氨酸(Leu) 3.8
精氨酸(Arg) -4.5 赖氨酸(Lys) -3.9
天冬酰胺(Asn) -3.5 蛋氨酸(Met) 1.9
天冬氨酸(Asp) -3.5 苯丙氨酸(Phe) 2.8
半胱氨酸(Cys) 2.5 脯氨酸(Pro) -1.6
谷氨酰胺(Gln) -3.5 丝氨酸(Ser) -0.8
谷氨酸(Glu) -3.5 苏氨酸(Thr) -0.7
甘氨酸(Gly) -0.4 色氨酸(Trp) -0.9
组氨酸(His) -3.2 酪氨酸(Tyr) -1.3
异亮氨酸(Ile) 4.5 缬氨酸(Val) 4.2
本发明者们发现：通过在表达亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白的宿主中添加非质子性极性溶剂、使宿主细胞溶解，然后在得到的宿主细胞的溶解物中添加水等水系溶剂进行稀释，能够将亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白通过上清液回收，从而完成了本发明。即发现了，通过将宿主细胞用非质子性极性溶剂溶解，能够获得亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白溶解在非质子性极性溶剂中而成的溶解物，当在该溶解物中添加水等水系溶剂时，亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白不发生凝聚、而除亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白以外的大部分蛋白发生凝聚，从而完成了本发明。下文中，在没有特别说明的情况下，亲水性蛋白是指亲水性指数为0以下的亲水性蛋白。另外，下文中，在没有特别说明的情况下，重组蛋白是指亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白。
上述非质子性极性溶剂没有特别限定，从降低夹杂物的观点出发，优选纯度为90％以上、更优选为95％以上。上述非质子性极性溶剂优选为不具有环状结构的非质子性极性溶剂。当使用不具有环状结构的非质子性极性溶剂时，能够以更高的纯度提取重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重组胶原等亲水性重组蛋白。作为不具有环状结构的非质子性极性溶剂，可列举出二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和N,N-二甲基乙酰胺(DMA)等。
另外，上述非质子性极性溶剂的偶极矩优选为3.0D以上。偶极矩被用作表示分子的极性强度的指标，偶极矩越大则极性强度也越大。通常，偶极矩为3.0D以上的分子的极性强，当溶解蛋白等具有极性的化合物时，极性大的溶剂是有效的。下表2中记载了基于讲谈社Scientific公司出版的溶剂手册(2007年)的各种有机化合物(有机溶剂)的偶极矩。作为偶极矩为3.0D以上的非质子性极性溶剂，可列举出二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、乙腈等。
表2
有机溶剂 偶极矩(D) 有机溶剂 偶极矩(D)
DMSO 4.3 NMP 4.09
DMF 3.86 乙腈 3.44
DMA 3.72 丙酮 2.69
DMI 4.05 异丙醇 1.68
从重组蛋白的提取纯度高的观点出发，上述非质子性极性溶剂更优选偶极矩为3.0D以上且不具有环状结构，进一步优选为选自二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中的一种以上的非质子性极性溶剂。
上述溶解用溶剂优选为在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂。当在非质子性极性溶剂中添加无机盐时，能够获得纯度更高的重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重组胶原等亲水性重组蛋白，因此优选。上述无机盐没有特别限定，从提高重组蛋白的纯度的观点出发，优选为碱金属卤化物、碱土类金属卤化物、碱土类金属硝酸盐和硫氰酸盐中的至少一种。作为上述碱金属卤化物，优选使用例如LiCl、LiBr等。作为上述碱土类金属卤化物，优选使用例如CaCl2等。作为上述碱土类金属硝酸盐，优选使用例如Ca(NO3)2等。作为上述硫氰酸盐，优选使用例如NaSCN等。
当上述溶解用溶剂为在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂时，没有特别限定，从提高重组蛋白的纯度的观点出发，无机盐的浓度优选为0.1M以上、更优选为0.25M以上、进一步优选为0.5M以上。另外，上述溶解用溶剂中，无机盐的浓度的上限没有特别限定，优选为饱和状态以下，例如可以为2.5M以下。
上述溶解用溶剂的添加量只要是能够溶解上述宿主的量即可，没有特别限定，从提高溶解性的观点出发，相对于上述宿主(细胞)的质量以体积(mL)/质量(g)比计优选为0.5倍以上、更优选为0.75倍以上、进一步优选为1倍以上。另外，从操作的简便性出发，上述溶解用溶剂的添加量相对于上述宿主的质量以体积(mL)/质量(g)比计优选为10倍以下、更优选为6倍以下、进一步优选为4倍以下。上述宿主(细胞)可以为干燥的状态、也可以为湿的状态。
将上述溶解用溶剂添加到宿主中、获得宿主细胞的溶解物的溶解物获取工序没有特别限定，从重组蛋白的溶解性的观点出发，优选在20℃以上的条件下进行、更优选在45℃以上的条件下进行、进一步优选在50℃以上的条件下进行。另外，从抑制重组蛋白分解的观点出发，上述溶解物获取工序优选在100℃以下的条件下进行、更优选在95℃以下的条件下进行。另外，上述溶解物获取工序没有特别限定，例如优选进行10～300分钟、更优选进行30～180分钟。在向通过溶解物获取工序得到的宿主细胞的溶解物中添加稀释用溶剂之前，可以将不溶物分离。不溶物的分离只要能够将沉降物(凝聚物)分离即可，没有特别限定。从操作的简便性出发，优选通过利用过滤的分离和/或离心分离来进行。利用过滤的分离例如可以使用滤纸、过滤膜等来进行。离心分离的条件没有特别限定。例如可以在室温(20±5℃)、8000×g～15000×g下进行5～20分钟。上述不溶物的分离可以进行2次以上。
上述稀释用溶剂为水系溶剂。本发明中，水系溶剂是指包含水的溶剂，可列举出例如水、水与水混和性有机溶剂的混合液、水溶性缓冲液、酸性水溶液、碱性水溶液等。作为酸性水溶液，可列举出甲酸、乙酸、稀盐酸等酸性水溶液；作为碱性水溶液，可列举出氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液等碱性水溶液。作为水混和性有机溶剂，只要是能够与水混合的有机溶剂即可，可以使用公知的有机溶剂。具体而言，可列举出甲醇、乙醇等醇类。
上述稀释用溶剂从获得纯度高的重组蛋白并且简便的观点出发，优选为水。作为上述水，没有特别限定，从降低夹杂物的观点出发，优选使用纯水、蒸馏水、超纯水等。从进一步提高重组蛛丝蛋白等重组蛋白的纯度的观点出发，优选上述稀释用溶剂为水与乙醇的混合液。从含有重组蛛丝蛋白等重组蛋白的上清液中重组蛋白的纯度高的观点出发，乙醇的添加量相对于稀释液总质量(宿主细胞的溶解物与稀释用溶剂的总质量)优选为5质量％以上、更优选为10质量％以上、进一步优选为15质量％以上、特别优选为25质量％以上。另外，从不使重组蛋白凝聚的观点出发，优选为50质量％以下、更优选为45质量％以下、进一步优选为40质量％以下。
上述稀释用溶剂可以为水溶性缓冲液。作为上述水溶性缓冲液，可以使用例如pH为3～9的磷酸系缓冲液、pH为3～9的Tris系缓冲液等。上述磷酸系缓冲液的浓度例如为10～200mM。上述Tris系缓冲液的浓度例如为10～100mM。例如，作为上述Tris系缓冲液，可以使用pH为3～9的50mM的Tris缓冲液。另外，作为上述磷酸系缓冲液，例如可以使用pH为3～9的50mM的磷酸钠缓冲液。
通过在上述宿主细胞的溶解物中添加稀释用溶剂进行稀释，使除重组蛛丝蛋白等重组蛋白以外的大部分夹杂蛋白凝聚，将凝聚的不溶物分离除去，从而将含有重组蛋白的蛋白溶液(上清液)回收。
上述稀释用溶剂的添加量只要能够使除重组蛋白以外的蛋白(下文中记为也记为其他蛋白)凝聚则没有特别限定。从均匀地进行稀释的观点出发，相对于宿主细胞的溶解物以体积比计优选为0.5倍以上、更优选为0.75倍以上、进一步优选为1倍以上。另外，从不使重组蛋白凝聚的观点出发，优选为10倍以下、更优选为6倍以下、进一步优选为4倍以下。
上文中，不溶物的分离只要能够将沉降物(凝聚物)分离即可，没有特别限定。从操作的简便性出发，优选通过利用过滤的分离和/或离心分离来进行。利用过滤的分离例如可以使用滤纸、过滤膜等来进行。离心分离的条件没有特别限定。例如，可以在室温(20±5℃)、8000×g～15000×g下进行5～20分钟。上述不溶物的分离可以进行2次以上。
上述重组蛋白只要是亲水性指数(HI)为0以下的亲水性重组蛋白即可，没有特别限定。从提取效率高的观点出发，上述重组蛋白的HI优选为－0.1以下、更优选为－0.3以下。
作为上述重组蛋白，没有特别限定，例如优选为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白和重组胶原等中的一种蛋白。
上述重组蛛丝蛋白只要是天然型蛛丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白即可，没有特别限定。例如包括天然型蛛丝蛋白的变异体、类似物或衍生物等。上述重组蛛丝蛋白从韧性优异的观点出发，优选为由蜘蛛的大壶状腺产生的大吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述大吐丝管拖丝蛋白，可列举出络新妇蛛(Nephila clavipes)来源的大壶状腺丝蛋白(spidroin)MaSp1、MaSp2、十字园蛛(Araneus diadematus)来源的ADF3、ADF4等。另外，上述重组蛛丝蛋白也可以是从蜘蛛的小壶状腺产生的小吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述小吐丝管拖丝蛋白，可列举出络新妇蛛来源的小壶状腺丝蛋白MiSp1、MiSp2。另外，上述重组蛛丝蛋白还可以是由蜘蛛的鞭状腺(flagelliform gland)产生的横丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述横丝蛋白，可列举出例如络新妇蛛来源的鞭毛状丝蛋白(flagelliform silk protein)等。
作为上述大吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出含有2个以上、优选4个以上、更优选6个以上的由式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽。其中，在上述大吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白中，由式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元可以相同也可以不同。
上述式1中，REP1表示聚丙氨酸。上述REP1中，连续排列的丙氨酸优选为2个残基以上、更优选为3个残基以上、进一步优选为4个残基以上、特别优选为5个残基以上。另外，上述REP1中，连续排列的丙氨酸优选为20个残基以下、更优选为16个残基以下、进一步优选为14个残基以下、特别优选为12个残基以下。上述式1中，REP2为由10～200个残基的氨基酸构成的氨基酸序列，上述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸及丙氨酸的总残基数相对于总氨基酸残基数为40％以上、优选为50％以上、更优选为60％以上。
大吐丝管拖丝中，上述REP1相当于纤维内形成晶体β折叠的晶体区域，上述REP2相当于纤维内更具有柔软性且大部分缺乏整齐排列结构的无定型区域。并且，上述[REP1-REP2]相当于由晶体区域和无定型区域构成的重复区域(反复序列)，其为拖丝蛋白的特征性序列。
作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号1所示的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛛丝蛋白。序列号1所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI：1263287)的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列的第1个残基～第136个残基。具有序列号1所示的氨基酸序列的ADF3Kai-small-M蛋白的HI为－0.948。另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，可以使用由在序列号1所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成、具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的蛋白。
本发明中，“1个或多个”是指例如1～40个、1～35个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、或者1个或数个。另外，本发明中，“1个或数个”是指1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个。
另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号2所示的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛋白。序列号2所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI：1263287)的N末端添加由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列的第1个残基～第542个残基。具有序列号2所示的氨基酸序列的ADF3Kai-NN蛋白的HI为－0.92。另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，还可以使用由在序列号2所示的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加有1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的多肽。
另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号6所示的氨基酸序列的ADF4来源的重组蛛丝蛋白。序列号6所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的ADF4的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47011、GI：1263289)的N末端添加由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列的第1个残基～第318个残基。具有序列号6所示的氨基酸序列的ADF4Kai-W蛋白的HI为－0.357。另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，还可以使用由在序列号6所示的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加有1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的多肽。
作为上述小吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出包含式2：(Gly-Gly-Z)m(Gly-Ala)l(Ala)o所示的氨基酸序列的多肽。
上述式2中，Z是指任意一种氨基酸，特别优选为选自Ala、Tyr和Gln中的一种氨基酸。另外，m优选为1～4范围的整数、l优选为0～4范围的整数、o优选为1～6范围的整数。
蛛丝中，小吐丝管拖丝从蜘蛛网的中心以螺旋状卷绕，其被用作网的补强材料或者用作包裹所捕捉的猎物的丝。已知与大吐丝管拖丝相比，拉伸强度差但伸缩性高。这考虑是由于在小吐丝管拖丝中，大量的晶体区域由甘氨酸与丙氨酸交替连接的区域形成，与仅由丙氨酸形成晶体区域的大吐丝管拖丝相比，晶体区域的氢键更易于变弱的原因。
作为上述横丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出包含式3：(Gly-Pro-Gly-Gly-X)n所示的氨基酸序列的多肽。Gly-Pro-Gly-Gly-X所示的氨基酸序列单元可以相同也可以不同。
上述式3中，X是指任意一种氨基酸，特别优选为选自Ala、Ser、Tyr和Val中的一种氨基酸。另外，n为4以上的整数、优选为10以上的整数、更优选为20以上的整数。
作为包含上述式3：(Gly-Pro-Gly-Gly-X)n所示的氨基酸序列的多肽，可列举出例如具有序列号8所示的氨基酸序列的鞭毛状丝蛋白来源的重组蛋白。序列号8所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的络新妇蛛的鞭毛状丝蛋白的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：AAF36090、GI：7106224)的相当于重复部分及基序的第1220个残基～第1659个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列。具有序列号8所示的氨基酸序列的Flag92-short2-UU蛋白的HI为－0.482。另外，作为包含上述式3：(Gly-Pro-Gly-Gly-X)n所示的氨基酸序列的多肽，可以使用由在序列号8所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成、具有由无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的多肽。
蛛丝中，横丝的一大特征是不具有晶体区域而具有由无定形区域构成的重复区域。大吐丝管拖丝等中，由于具有由晶体区域和无定形区域构成的重复区域，因此推测同时具有高的应力和伸缩性。另一方面，横丝虽然比大吐丝管拖丝的应力差，但具有高的伸缩性。这考虑是由于横丝的大部分由无定形区域构成的原因。
上述重组蛛丝蛋白优选为十字园蛛(Araneus diadematus)的两个主要拖丝蛋白之一的ADF3来源的重组蛛丝蛋白。关于ADF3来源的重组蛛丝蛋白，作为其优点，还可列举出强伸度(strength elongation)和韧性基本上高、易于合成。
作为重组节肢弹性蛋白，可以使用例如天然节肢弹性蛋白来源的重组节肢弹性蛋白。作为天然节肢弹性蛋白来源的重组节肢弹性蛋白，优选包含多个式4：REP3所示的氨基酸序列单元、优选4个以上、更优选10个以上、进一步优选20个以上的多肽。REP3所示的氨基酸序列单元可以相同也可以不同。
上述式4中，REP3是指由(Ser-J-J-Tyr-Gly-U-Pro)构成的氨基酸序列，J是指任意一种氨基酸，特别优选选自Asp、Ser和Thr中的一种氨基酸。另外，U是指任意一种氨基酸，特别优选选自Pro、Ala、Thr和Ser中的一种氨基酸。
作为包含多个上述式4：REP3所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号10所示的氨基酸序列的重组节肢弹性蛋白等。序列号10所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI的web数据库获得的节肢弹性蛋白的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：NP_611157、GI：24654243)中将第87个残基Thr替换为Ser、将第95个残基Asn替换为Asp，切取替换后的序列的第19个残基～第321个残基，在切取的序列的N末端添加由起始密码子、His6标签构成的氨基酸序列(序列号12)而成的氨基酸序列(序列号10)。具有序列号10所示的氨基酸序列的重组节肢弹性蛋白的HI为－1.229。另外，作为包含多个上述式4：REP3所示的氨基酸序列单元的多肽，可以使用由在序列号10所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成、且HI为0以下的多肽。其中，序列号10所示的氨基酸序列与公知文献《Synthesisand properties of crosslinked recombinant pro-resilin》《Christopher M.Elvin，Andrew G.Carr，Mickey G.Huson，Jane M.Maxwell，Roger D.Pearson，Tony Vuocolo，Nancy E.Liyou，Darren C.C.Wong，David J.Merritt&Nicholas E.Dixon，Nature 437，999-1002(13October 2005)》中记载的rec1-resilin的氨基酸序列是同样的。
另外，作为包含多个上述式4：REP3所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号13所示的氨基酸序列的重组节肢弹性蛋白。序列号13所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：从NCBI的web数据库获得果蝇(Drosophila melanogaster)的节肢弹性蛋白的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：Q9V7U0.1、GI：75026432)，在该序列中相当于重复部分和基序的第19个残基～第321个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子和His6标签构成的氨基酸序列(序列号12)而成的氨基酸序列。具有序列号13所示的氨基酸序列的重组节肢弹性蛋白的HI为－1.229。另外，作为包含多个上述式4：REP3所示的氨基酸序列单元的多肽，可以使用由在序列号12所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成、且HI为0以下的多肽。
节肢弹性蛋白是存在于昆虫角质层的特定区域的橡胶样蛋白，是优异的弹性材料。该物质的弹力(elasticity)据测为97％，贮藏能量中仅3％以热的形式损失。该弹力考虑是由节肢弹性蛋白中的酪氨酸相互间交联所产生的。二酪氨酸交联而成的节肢弹性蛋白赋予角质层以优异的弹性，在昆虫的飞行系统、跳跃系统中发挥重要的作用。
作为重组胶原，可以使用例如天然胶原来源的重组胶原。作为天然胶原来源的重组胶原，可列举出连续包含5个以上式5：REP4所示的氨基酸序列单元、优选8个以上、更优选10个以上的多肽。
上述式5中，REP4是指由Gly-X-Y构成的氨基酸序列，X和Y是指除Gly以外的任意一种氨基酸。上述式5中，REP4所示的氨基酸序列可以相同也可以不同。
作为连续含有10个以上的上述式5：REP4所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号16所示的氨基酸序列的重组胶原。序列号16所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的人的4型胶原的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：CAA56335.1、GI：3702452)的相当于重复部分和基序的第301个残基～第540个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His6标签和Ser-Ser-Gly-Ser-Ser构成的氨基酸序列(序列号15)而成的氨基酸序列。另外，作为连续含有10个以上上述式5：REP5所示的氨基酸序列单元的多肽，还可以使用由在序列号16所示的氨基酸序列中1或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成的多肽。
胶原是构成真皮、韧带、肌腱、骨、软骨等的蛋白之一，是多细胞动物的细胞外基质的主成分。人的胶原据报告有30种以上，但在任意胶原中，均具有被称为胶原样序列的REP4所示的氨基酸序列的重复序列，这可列举为其序列特征。
上述重组蛋白可使用采用含有编码重组蛋白的基因的表达载体进行了转化的宿主来制造。基因的制造方法没有特别限制，从基因来源的细胞将编码重组蛋白的基因通过聚合酶链反应(PCR)等进行扩增、克隆或进行化学合成。基因的化学合成方法也没有特别限制，例如可以以重组蛋白的氨基酸序列信息为基础，用AKTA oligopilot plus 10/100(GEHealthcare Japan株式会社制)等将自动合成的寡核苷酸通过PCR等连接来合成。此时，容易进行蛋白的精制和确认，因此可以合成编码由在上述对象蛋白的氨基酸序列的N末端添加由His标签构成的氨基酸序列而成的氨基酸序列构成的蛋白的基因。
作为上述表达载体，可以使用能够从DNA序列表达蛋白的质粒、噬菌体、病毒等。作为上述质粒型表达载体，只要在宿主细胞内能够表达目标基因且自身能够进行扩增即可，没有特殊限定。例如作为宿主使用大肠杆菌Rosetta(DE3)时，可以使用pET22b(+)质粒载体、pCold质粒载体等。其中，从蛋白生产率的观点出发，优选使用pET22b(+)质粒载体。作为上述宿主(细胞)，可以使用蛋白表达体系中使用的动物细胞、植物细胞、微生物等，从生产成本的观点出发，优选使用微生物，从安全性和操作性的观点出发，更优选使用大肠杆菌。
当将大肠杆菌等微生物作为宿主进行重组蛋白生产时，从生产率的观点出发，上述重组蛋白的分子量优选为500kDa以下、更优选为300kDa以下、进一步优选为200kDa以下。
在含有上述重组蛋白的上清液中，重组蛋白相对于蛋白总体的纯度(精制度)优选为40质量％以上、更优选为45质量％以上、进一步优选为50质量％以上、更进一步优选为60质量％以上、特别优选为65质量％以上。本发明中，纯度可通过将SDS-PAGE后的聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝(CBB)或Oriole Fluorescent Gel Stain染色，用分析软件ImageLab(Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的电泳图像进行图像分析而求出。
含有上述重组蛋白的上清液可进一步通过透析等进行精制。另外，还可以向含有上述重组蛋白的上清液中添加乙醇，使最终浓度达到50质量％以上、优选70质量％以上、更优选90质量％以上，使重组蛋白凝聚。另外，还可以将含有上述重组蛋白的上清液粉末化。粉末化的方法没有特别限定。通过将用乙醇凝聚的重组蛋白冷冻干燥，可以进行粉末化。或者，还可以通过将含有上述重组蛋白的上清液喷雾干燥而直接进行粉末化。得到的重组蛛丝蛋白的粉末可用于湿式纺丝、流延膜的制作等。得到的重组节肢弹性蛋白和重组胶原的粉末可用于凝胶、流延膜、多孔质体的制作等。
实施例
以下，用实施例对本发明进一步具体地进行说明。需要说明的是，本发明并不限于下述实施例。
(大肠杆菌中的重组蛋白的表达)
<基因合成>
(1)ADF3Kai-small-M的基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得作为十字园蛛的两种主要的拖丝蛋白之一的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI：1263287)，在该序列的N末端添加由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)，由该序列的第1个残基～第136个残基的氨基酸(序列号1)构成的多肽。其结果，获得了导入了由序列号4所示的碱基序列构成的ADF3Kai-small-M基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用NdeI和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了ADF3Kai-small-M基因的pET22b(+)载体。
(2)ADF3Kai-NN基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得作为十字园蛛的两种主要的拖丝蛋白之一的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI：1263287)，在该序列的N末端添加由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)，由该序列的第1个残基～第542个残基的氨基酸(序列号2)构成的多肽。其结果，获得了导入了由序列号5所示的碱基序列构成的ADF3Kai-NN基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了ADF3Kai-NN基因的pET22b(+)载体。
(3)ADF4Kai-W基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得作为十字园蛛的两种主要的拖丝蛋白之一的ADF4的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47011、GI：1263289)，在该序列的N末端添加由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)，由该序列的第1个残基～第318个残基的氨基酸(序列号6)构成的多肽。其结果，获得了导入了由序列号7所示的碱基序列构成的ADF4Kai-W基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了ADF4Kai-W基因的pET22b(+)载体。
(4)Flag92-short2-UU的基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得络新妇蛛的鞭毛状丝蛋白的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：AAF36090、GI：7106224)，由在该序列中相当于重复部分和基序的第1220个残基～第1659个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列(序列号8)构成的多肽。其结果，获得导入有由序列号9所示的碱基序列构成的Flag92-short2-UU基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了Flag92-short2-UU基因的pET22b(+)载体。
(5)Resilin-Kai的基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得节肢弹性蛋白的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：NP_611157、GI：24654243)，将该序列的第87个残基Thr替换成Ser、将第95个残基Asn替换成Asp，切取替换后的序列的第19个残基～第321个残基，由在切取的序列的N末端添加由起始密码子和His6标签构成的氨基酸序列(序列号12)而成的氨基酸序列(序列号10)构成的多肽(Resilin-Kai)。其结果，获得了导入有由序列号11所示的碱基序列构成的Resilin-Kai基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了Resilin-Kai基因的pET22b(+)载体。
(6)Drosophila-Resilin-Kai的基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得果蝇的节肢弹性蛋白的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：Q9V7U0.1、GI：75026432)，由在该序列中相当于重复部分和基序的第19个残基～第321个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子和His6标签构成的氨基酸序列(序列号12)而成的氨基酸序列(序列号13)构成的多肽。其结果，获得了导入有由序列号14所示的碱基序列构成的Drosophila-Resilin-Kai基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了Drosophila-Resilin-Kai基因的pET22b(+)载体。
(7)Collagen-type4-Kai的基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得人的4型胶原的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：CAA56335.1、GI：3702452)，由在该序列中相当于重复部分和基序的第301个残基～第540个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His6标签和Ser-Ser-Gly-Ser-Ser构成的氨基酸序列(序列号15)而成的氨基酸序列(序列号16)构成的多肽。其结果，获得了导入有由序列号17所示的碱基序列构成的Collagen-type4-Kai基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了Collagen-type4-Kai基因的pET22b(+)载体。
<蛋白的表达>
将导入有ADF3Kai-small-M基因的pET22b(+)表达载体、导入有ADF3Kai-NN基因的pET22b(+)表达载体A、导入有ADF4Kai-W基因的pET22b(+)表达载体、导入有Flag92-short2-UU基因的pET22b(+)载体、导入有Resilin-Kai基因的pET22b(+)载体、导入有Drosophila-Resilin-Kai基因的pET22b(+)载体和导入有Collagen-type4-Kai基因的pET22b(+)载体分别转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中。将得到的各单菌落在含有氨苄青霉素的2mL的LB培养基中培养15小时后，将该培养液1.4ml添加到含有氨苄青霉素的140mL的LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下进行培养，直至培养液的OD600达到3.5。接着，将OD600为3.5的培养液与50％葡萄糖140mL一起加入到含有氨苄青霉素的7L的2×YT培养基中进一步进行培养，直至OD600达到4.0。其后，向得到的OD600为4.0的培养液中添加异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)并使终浓度达到0.5mM，诱导蛋白的表达。在IPTG添加后的2小时的时刻，将培养液离心分离，回收菌体。使用由IPTG添加前和IPTG添加后的菌体制备的蛋白溶液，按照通常的操作规程用SDS-PAGE确认了依赖于IPTG添加的目标蛋白(ADF3Kai-small-M为约12.5kDa、ADF3Kai-NN为约47.5kDa、ADF4Kai-W为约26.4kDa、Flag92-short2-UU为约36.9kDa、Resilin-Kai为约28.5kDa、Drosophila-Resilin-Kai为约28.5kDa、Collagen-type4-Kai为约24.5kDa)的表达。将表达ADF3Kai-small-M蛋白的大肠杆菌、表达ADF3Kai-NN蛋白的大肠杆菌、表达ADF4Kai-W蛋白的大肠杆菌、表达Flag92-short2-UU蛋白的大肠杆菌、表达Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌、表达Drosophila-Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌和表达Collagen-type4-Kai蛋白的大肠杆菌保存在冰箱(－20℃)中。
下表3中示出了ADF3Kai-small-M、ADF3Kai-NN、ADF4Kai-W、Flag92-short2-UU、Resilin-Kai、Drosophila-Resilin-Kai和Collagen-type4-Kai蛋白的亲水性指数(HI)。ADF3Kai-small-M、ADF3Kai-NN、ADF4Kai-W、Flag92-short2-UU、Resilin-Kai、Drosophila-Resilin-Kai和Collagen-type4-Kai蛋白均是HI为0以下的亲水性蛋白。
表3
重组蛋白 HI
ADF3Kai-small-M -0.948
ADF3Kai-NN -0.92
ADF4Kai-W -0.357
Flag92-short2-UU -0.482
Resilin-Kai -1.229
Drosophila-Resilin-Kai -1.229
Collagen-type4-Kai -0.792
(实施例1)
(1)向表达ADF3Kai-small-M蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1ml含有1M的LiCl的DMSO，使菌体分散，在60℃下静置30分钟，得到大肠杆菌(细胞)的溶解物。
(2)将得到的大肠杆菌的溶解物用超纯水等倍稀释，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)将得到的稀释液在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
(实施例2)
(1)在表达ADF3Kai-NN蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1mL含有0.5M的LiCl的DMSO，使菌体分散，在60℃下静置30分钟，得到大肠杆菌的溶解物。
(2)将得到的大肠杆菌的溶解物用超纯水等倍稀释，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)将得到的稀释液在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例3)
代替超纯水、用浓度为10质量％的乙醇水溶液(下文中记为10％乙醇)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例2同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例4)
代替超纯水、用浓度为30质量％的乙醇水溶液(下文中记为30％乙醇)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例2同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例5)
代替超纯水、用浓度为50质量％的乙醇水溶液(下文中记为50％乙醇)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例2同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例6)
代替超纯水、用浓度为70质量％的乙醇水溶液(下文中记为70％乙醇)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例2同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例7)
代替超纯水、用浓度为80质量％的乙醇水溶液(下文中记为80％乙醇)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例2同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例8)
代替超纯水、用浓度为90质量％的乙醇水溶液(下文中记为90％乙醇)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例2同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例9)
(1)在表达ADF3Kai-NN蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1ml含有0.5M的LiCl的DMSO，使菌体分散，在60℃下静置30分钟，得到大肠杆菌的溶解物。
(2)将得到的大肠杆菌的溶解物用超纯水等倍稀释，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)将得到的稀释液在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例10)
代替超纯水、用50mM Tris缓冲液(pH为3)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例9同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例11)
代替超纯水、用50mM Tris缓冲液(pH为5)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例9同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例12)
代替超纯水、用50mM Tris缓冲液(pH为7)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例9同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例13)
代替超纯水、用50mM Tris缓冲液(pH为9)将大肠杆菌的溶解物等倍稀释，除此以外，与实施例9同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例14)
代替含有0.5M的LiCl的DMSO、将1mL含有0.25M的LiCl的DMSO添加到表达ADF3Kai-NN蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中，除此以外，与实施例2同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例15)
代替含有0.5M的LiCl的DMSO、将1mL的DMSO添加到表达ADF3Kai-NN蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中，与实施例2同样地操作，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
使用实施例1中得到的含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液、和实施例2～15中得到的含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液进行SDS-PAGE。具体而言，在各实施例中得到的上清液30μL中加入2xSDS缓冲液(4w/v％SDS、20w/v％甘油、10w/v％2-巯基乙醇、0.004w/v％溴酚蓝、0.125M Tris、pH为6.8)30μL，在95℃下热处理10分钟，使用在室温下冷却了的经热变性的蛋白溶液，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确认条带。电泳后，将实施例1的凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染色，将其他实施例的凝胶用考马斯亮蓝(CBB)染色，将其结果示于图1～图4。另外，通过用分析软件ImageLab(Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出目标蛋白(重组蛛丝蛋白)的纯度。其结果示于下表4中。作为对照，图2和图4中分别也一并示出了实施例2中的使用了大肠杆菌的溶解物的SDS-PAGE的结果。其中，Oriole Fluorescent Gel Stain时使用1.5μg蛋白、CBB时使用7μg蛋白进行电泳。
表4
图1中示出了实施例1中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图1中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1表示实施例1中得到的上清液中所含的蛋白。图1中，用箭头表示的为与ADF3Kai-small-M(分子量为约12.5kDa)对应的蛋白的条带。从图1和表4确认了，通过用含有1M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，然后将大肠杆菌的溶解物用超纯水稀释，得到了含有目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-small-M)的上清液。上清液中所含的蛋白中，目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-small-M)的纯度为60％以上、精制率高。
图2中示出了实施例2～5中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图2中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1表示实施例2的大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Lane 2、3、4、5分别表示实施例2、3、4、5中得到的上清液中所含的蛋白。图3中示出了实施例6～8中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图3中，Lane M表示分子量标记物、Lane I、II、III分别表示实施例6、7、8中得到的上清液中所含的蛋白。图2和图3中，用箭头表示的为与ADF3Kai-NN(分子量为约47.5kDa)对应的蛋白的条带。从图2、图3和表4确认了，通过用含有0.5M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，将大肠杆菌的溶解物用各种水系溶剂稀释，得到了含有目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-NN)的上清液。另外，当使用水与乙醇的混合液作为稀释用溶剂、且稀释液(大肠杆菌的溶解物与稀释用溶剂的混合液)中的乙醇浓度为35质量％以下时，与仅使用纯水作为稀释用溶剂时相比，在得到的上清液中所含的蛋白中，目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-NN)的纯度更高。特别是，当稀释液中的乙醇浓度为10～30质量％时，在得到的上清液中所含的蛋白中，目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-NN)的纯度更高。另一方面可知，稀释液中，当乙醇的浓度达到45质量％以上时，目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-NN)的纯度与仅使用纯水作为稀释用溶剂时相比变低。这推测是由于当稀释液中的乙醇浓度过高时，目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-NN)发生凝聚。
图4中示出了实施例9～13中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图4中，Lane M表示分子量标记物、Lane a表示实施例9的大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Lane b、c、d、e、f分别表示实施例9、10、11、12、13中得到的上清液中所含的蛋白。图4中，用箭头表示的为与ADF3Kai-NN(分子量为约47.5kDa)对应的蛋白的条带。从图4和表4确认了，通过用含有0.5M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，将大肠杆菌的溶解物用各种水系溶剂稀释，得到了含有目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-NN)的上清液。另外可知，当稀释用溶剂为pH为3～9的50mM的Tris缓冲液时，与使用了纯水时同样地可提取目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-NN)。
另外，从表4的实施例1、2、14和15的结果可知，使用含有无机盐(LiCl)的DMSO作为溶解用溶剂时比仅使用不含有无机盐的DMSO时可提取纯度更高的重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-NN)。
(实施例16)
使用表达ADF4Kai-W蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g，除此以外，与实施例2同样地回收含有ADF4Kai-W蛋白的上清液。
使用实施例16中得到的含有ADF4Kai-W蛋白的上清液，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝(CBB)染色，将其结果示于图5中。其中，图5中还一并示出了使用了实施例16中的大肠杆菌的溶解物、和回收含有ADF4Kai-W蛋白的上清液后的沉淀的SDS-PAGE的结果。向回收含有ADF4Kai-W蛋白的上清液后的沉淀中添加含有2M的LiCl的DMSO，在60℃下静置30分钟，使用溶解后的溶液进行SDS-PAGE。
图5中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1表示大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Lane 2表示上清液中所含的蛋白、Lane 3表示沉淀中所含的蛋白。图5中，用箭头表示的为与ADF4Kai-W(分子量为约26.4kDa)对应的蛋白的条带。从图5确认了，通过用含有0.5M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，然后将大肠杆菌的溶解物用纯水稀释，得到了含有目标重组蛛丝蛋白(ADF4Kai-W)的上清液。
(实施例17)
(1)在表达ADF3Kai-NN蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1mL含有0.5M的LiCl的DMSO，使菌体分散，在60℃下静置30分钟，得到大肠杆菌的溶解物。
(2)将得到的大肠杆菌的溶解物用超纯水等倍稀释，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)将得到的稀释液在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
(实施例18～21)
将大肠杆菌的溶解物用下表5所示的磷酸缓冲液等倍稀释，除此以外，与实施例17同样地回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
使用实施例17～21中得到的含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝(CBB)染色，将其结果示于图6。另外，通过用分析软件ImageLab(Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出目标蛋白(ADF3Kai-NN)的纯度。将其结果示于下表5。其中，图6中还一并示出使用了实施例17中的大肠杆菌的溶解物的SDS-PAGE的结果。
表5
稀释用溶剂 纯度(％)
实施例17 超纯水 63.6
实施例18 50mM磷酸钠缓冲液(pH为3) 56.8
实施例19 50mM磷酸钠缓冲液(pH为5) 53.1
实施例20 50mM磷酸钠缓冲液(pH为7) 55.5
实施例21 50mM磷酸钠缓冲液(pH为9) 54.7
图6中示出了实施例17～21中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图6中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1表示实施例17的大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Lane 2、3、4、5、6分别表示实施例17、18、19、20、21中得到的上清液中所含的蛋白。图6中，用箭头表示的为与ADF3Kai-NN(分子量为约47.5kDa)对应的蛋白的条带。从图6和表5可知，当稀释用溶剂为pH为3～9的50mM的磷酸钠缓冲液时，与使用纯水时同样地能够提取目标重组蛛丝蛋白(ADF3Kai-NN)。
(实施例22)
使用表达Flag92-short2-UU蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g，除此以外，与实施例2同样地回收含有Flag92-short2-UU蛋白的上清液。
使用实施例22中得到的含有Flag92-short2-UU蛋白的上清液，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝(CBB)染色，将其结果示于图7。其中，图7中还一并示出使用了实施例22中的大肠杆菌的溶解物、和回收含有Flag92-short2-UU蛋白的上清液后的沉淀的SDS-PAGE的结果。通过在回收含有Flag92-short2-UU蛋白的上清液后的沉淀中添加含有2M的LiCl的DMSO，在60℃下静置30分钟，使用该溶解后的溶液进行SDS-PAGE。
图7中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1表示大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Lane 2表示上清液中所含的蛋白、Lane 3表示沉淀中所含的蛋白。图7中，用箭头表示的为与Flag92-short2-UU(分子量为约36.9kDa)对应的蛋白的条带。从图7确认了，通过用含有0.5M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，然后将大肠杆菌的溶解物用纯水稀释，能够得到含有目标重组蛛丝蛋白(Flag92-short2-UU)的上清液。
(实施例23)
(1)在表达ADF3Kai-small-M蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1mL含有1M的LiCl的DMSO，使菌体分散，在60℃下溶解40分钟，得到大肠杆菌的溶解物。
(2)将得到的大肠杆菌的溶解物用超纯水等倍稀释，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)将得到的稀释液在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
(实施例24)
代替含有1M的LiCl的DMSO，使用含有1M的LiCl的DMF，除此以外，与实施例23同样地回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
(实施例25)
代替含有1M的LiCl的DMSO，使用含有1M的LiCl的DMA，除此以外，与实施例23同样地回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
(实施例26)
代替含有1M的LiCl的DMSO，使用含有1M的LiCl的NMP，除此以外，与实施例23同样地回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
使用实施例23～26中得到的含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染色，将其结果示于图8。另外，通过用分析软件ImageLab(Bio-RADLaboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出上清液中的ADF3Kai-small-M蛋白的纯度。将其结果示于下表6。
图8中，下部分的SDS-PAGE结果为使用了含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液的SDS-PAGE结果，上部分的SDS-PAGE结果为使用了对应的大肠杆菌的溶解物的SDS-PAGE的结果。图8中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1、2、3、4分别对应于实施例23、24、25、26。图8中，用箭头表示的为与ADF3Kai-small-M(分子量为约12.5kDa)对应的蛋白的条带。
表6
溶解用溶剂 纯度(％)
实施例23 DMSO(含有1M的LiCl) 71.7
实施例24 DMF(含有1M的LiCl) 67.1
实施例25 DMA(含有1M的LiCl) 49.5
实施例26 NMP(含有1M的LiCl) 28
从图8和表6可知，使用DMSO、DMF、DMA作为溶解用溶剂时，目标亲水性重组蛋白的纯度高。而使用NMP作为溶解用溶剂时，目标亲水性蛋白(重组蛋白)的纯度低。当使用不具有环状结构的非质子性极性溶剂作为溶解用溶剂时，能够从表达HI为0以下的亲水性重组蛋白的宿主细胞中以高纯度提取重组蛋白(HI为0以下)。
(实施例27)
(1)在表达Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1mlDMSO，使菌体分散，在60℃下溶解40分钟，得到大肠杆菌(细胞)的溶解物。
(2)将得到的大肠杆菌的溶解物用超纯水等倍稀释，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)将得到的稀释液在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收含有Resilin-Kai蛋白的上清液。
(实施例28)
代替DMSO，使用含有1M的LiCl的DMSO，除此以外，与实施例27同样地回收含有Resilin-Kai蛋白的上清液。
(实施例29)
代替DMSO，使用含有1M的LiCl的DMF，除此以外，与实施例27同样地回收含有Resilin-Kai蛋白的上清液。
(实施例30)
代替DMSO，使用含有1M的LiCl的NMP，除此以外，与实施例27同样地回收含有Resilin-Kai蛋白的上清液。
(实施例31)
代替DMSO，使用含有1M的LiCl的DMI，除此以外，与实施例27同样地回收含有Resilin-Kai蛋白的上清液。
使用实施例27～31中得到的含有Resilin-Kai蛋白的上清液，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染色，通过用分析软件ImageLab(Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出上清液中的Resilin-Kai的纯度，将其结果示于下表7。
另外，将使用实施例28中得到的含有Resilin-Kai蛋白的上清液进行SDS-PAGE的结果示于图9。其中，图9中还一并示出使用了实施例28中的大肠杆菌的溶解物、和回收含有Resilin-Kai蛋白的上清液后的沉淀的SDS-PAGE的结果。在回收含有Resilin-Kai蛋白的上清液后的沉淀中添加含有2M的LiCl的DMSO、在60℃下使其溶解30分钟，使用经溶解的溶液进行SDS-PAGE。
图9中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1表示大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Lane 2表示上清液中所含的蛋白、Lane 3表示沉淀中所含的蛋白。图9中，用箭头表示的为与Resilin-Kai(分子量为约28.5kDa)对应的蛋白的条带。从图9确认了，通过用含有1M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，然后将大肠杆菌的溶解物用纯水稀释，得到了含有目标重组节肢弹性蛋白(Resilin-Kai)的上清液。
表7
溶解用溶剂 纯度(％)
实施例27 DMSO 62.9
实施例28 DMSO(含有1M的LiCl) 69.7
实施例29 DMF(含有1M的LiCl) 60.6
实施例30 NMP(含有1M的LiCl) 25.4
实施例31 DMI(含有1M的LiCl) 22.0
从上述表7的结果可知，使用DMSO、DMF作为溶解用溶剂时，目标亲水性重组蛋白的纯度高。特别是，使用添加了无机盐的DMSO作为溶解用溶剂时，纯度更高。而使用NMP或DMI作为溶解用溶剂时，目标亲水性重组蛋白的纯度低。当使用不具有环状结构的非质子性极性溶剂作为溶解用溶剂时，能够从表达HI为0以下的亲水性重组蛋白的宿主细胞中以更高纯度提取重组蛋白(HI为0以下)。
(比较例1)
(1)在表达Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1ml含有1M的LiCl的异丙醇，使菌体分散，在60℃下溶解40分钟，得到大肠杆菌(细胞)的溶解物。
(2)将得到的大肠杆菌的溶解物用超纯水等倍稀释，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)将得到的稀释液在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收上清液。
使用比较例1中得到的大肠杆菌的溶解物和上清液，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染色，将其结果示于图10。图10中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1表示大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Lane 2表示上清液中所含的蛋白。图10中，箭头表示与Resilin-Kai(分子量为约28.5kDa)对应的蛋白的条带的位置。
另外，通过用分析软件ImageLab(Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出比较例1中得到的大肠杆菌的溶解物和上清液中的Resilin-Kai蛋白的纯度。其结果，大肠杆菌的溶解物中的Resilin-Kai蛋白的纯度为5.5％、上清液中的Resilin-Kai蛋白的纯度为0％。
使用了异丙醇时，无法从大肠杆菌提取Resilin-Kai蛋白。即，使用质子性极性溶剂时，无法从表达HI为0以下的亲水性重组蛋白的宿主细胞提取重组蛋白(HI为0以下)。
(实施例32)
(1)向表达Drosophila-Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1ml含有1M的LiCl的DMSO，使菌体分散，在60℃下静置30分钟，使其溶解，得到大肠杆菌(细胞)的溶解物。
(2)将得到的大肠杆菌的溶解物用离心分离机(TOMY精工公司制的”MX-305”)在20℃、11000×g下离心分离5分钟。将得到的大肠杆菌的溶解物的上清液用超纯水等倍稀释，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)将得到的稀释液在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收含有Drosophila-Resilin-Kai蛋白的上清液。
使用实施例32中得到的含有Drosophila-Resilin-Kai蛋白的上清液，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染色，将染色后的蛋白的电泳照片示于图11A。图11A中，用箭头表示的为与Drosophila-Resilin-Kai(分子量为约28.5kDa)对应的蛋白的条带。从图11A确认了，通过用含有1.0M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，然后将大肠杆菌的溶解物用纯水稀释，能够获得含有目标重组节肢弹性蛋白蛋白(Drosophila-Resilin-Kai)的上清液。用分析软件ImageLab(Bio-RADLaboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，结果上清液中Drosophila-Resilin-Kai的纯度为69.7％。
(实施例33)
(1)在表达Collagen-type4-Kai蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1mL含有1M的LiCl的DMSO，使菌体分散，在60℃下静置30分钟，使其溶解，得到大肠杆菌(细胞)的溶解物。
(2)将得到的大肠杆菌的溶解物用离心分离机(TOMY精工公司制的”MX-305”)在20℃、11000×g下离心分离5分钟。将得到的大肠杆菌的溶解物的上清液用超纯水等倍稀释，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)将得到的稀释液在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收含有Collagen-type4-Kai蛋白的上清液。
使用实施例33中得到的含有Collagen-type4-Kai蛋白的上清液，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝(CBB)染色，将其结果示于图11B。图11B中，用箭头表示的为与Collagen-type4-Kai(分子量为约24.5kDa)对应的蛋白的条带。从图11B确认了，通过用含有1.0M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，然后将大肠杆菌的溶解物用纯水稀释，能够得到含有目标重组胶原蛋白(Collagen-type4-Kai)的上清液。用分析软件ImageLab(Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，结果上清液中的Collagen-type4-Kai的纯度为43.7％。
产业上的可利用性
根据本发明，能够从表达作为重组蛋白的亲水性指数为0以下的亲水性蛋白的宿主中提取亲水性蛋白
序列表自由文本
序列号1、2、3、6、8、10、12、13、15、16：氨基酸序列
序列号4、5、7、9、11、14、17：碱基序列

Claims (9)

1.一种亲水性重组蛋白的提取方法，其为从表达亲水性重组蛋白的宿主提取亲水性重组蛋白的方法，其特征在于，其包含：
在所述表达亲水性重组蛋白的宿主中添加溶解用溶剂，获得宿主细胞的溶解物的溶解物获取工序，和
在通过所述溶解物获取工序得到的所述宿主细胞的溶解物中添加稀释用溶剂，然后从得到的稀释液将不溶物分离，回收含有所述亲水性重组蛋白的上清液的工序；
其中，所述亲水性重组蛋白的亲水性指数为0以下，所述溶解用溶剂为非质子性极性溶剂，所述稀释用溶剂为水系溶剂。
2.根据权利要求1所述的亲水性重组蛋白的提取方法，其中，所述溶解用溶剂为不具有环状结构的非质子性极性溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的亲水性重组蛋白的提取方法，其中，所述溶解用溶剂的偶极矩为3.0D以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的亲水性重组蛋白的提取方法，其中，所述溶解用溶剂为选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的一种以上的非质子性极性溶剂。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的亲水性重组蛋白的提取方法，其中，所述溶解用溶剂为在所述非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的亲水性重组蛋白的提取方法，其中，所述稀释用溶剂为选自(1)水、(2)水与乙醇的混合液和(3)水溶性缓冲液中的一种水系溶剂。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的亲水性重组蛋白的提取方法，其中，所述溶解用溶剂相对于所述宿主的质量以体积/质量比计添加0.5倍以上，其中体积的单位为mL、质量的单位为g。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的亲水性重组蛋白的提取方法，其中，所述稀释用溶剂相对于所述宿主细胞的溶解物以体积比计添加0.5倍以上。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的亲水性重组蛋白的提取方法，其中，所述亲水性蛋白为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白和重组胶原中的一种蛋白。
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Denomination of invention: Extraction method of hydrophilic recombinant protein

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Pledgee: Contract Club Eve

Pledgor: SPIBER Inc.

Registration number: Y2021990001112