WO2016163337A1 - 極性溶媒溶液及びその製造方法 - Google Patents

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WO2016163337A1
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solution
polar solvent
inorganic salt
solvent solution
water content
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PCT/JP2016/061026
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石田花菜
山本博規
鈴村寛昭
関山和秀
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
小島プレス工業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a polar solvent solution in which a solute containing a polyamino acid is dissolved in a polar solvent, and a method for producing the same.
  • polar solvents such as dimethyl sulfoxide (DMSO) easily dissolve substances such as polymers, they are used as acrylic fiber polymerization, spinning solution, or polyimide polymerization solvent.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the present applicant has proposed the application of the polar solvent as a solvent for polypeptides such as spider silk protein and silk protein in Patent Documents 1 and 2.
  • the present applicant has also proposed that the solubility of a polypeptide is enhanced by adding an inorganic salt to a polar solvent.
  • a polar solvent solution such as dimethyl sulfoxide (DMSO) in which polypeptides such as spider silk protein and silk protein are dissolved may decrease in viscosity depending on the management method, and is used as a dope solution for spinning or film.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the present invention provides a polar solvent solution capable of stable spinning and casting when used as a dope solution for spinning or film, and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a polar solvent solution in which a solute containing a polyamino acid is dissolved in a polar solvent, the solution containing an inorganic salt, and the value of the molar ratio of water to the inorganic salt (water / inorganic salt) in the solution is
  • the present invention relates to a polar solvent solution characterized in that it is 2.5 ⁇ m ⁇ n (m is the number of cations forming an inorganic salt and n is the number of charges of the cations) or less.
  • the present invention is also a method for producing a polar solvent solution in which a solute containing a polyamino acid is dissolved in a polar solvent, wherein an inorganic salt is added to the solution, and the water content in the solution and the inorganic salt
  • the present invention relates to a method for producing a polar solvent solution, characterized in that the viscosity of the solution is adjusted by changing at least one of the contents.
  • the present invention also relates to a method for producing a polar solvent solution in which a solute containing a polyamino acid is dissolved in a polar solvent, by adding an inorganic salt to the solution and reducing the water content in the solution. And a method for producing a polar solvent solution, wherein the viscosity of the solution is increased.
  • the polar solvent solution of the present invention has a water / inorganic salt molar ratio (water / inorganic salt) value of 2.5 ⁇ m ⁇ in a polar solvent solution obtained by dissolving a solute containing a polyamino acid and an inorganic salt in a polar solvent.
  • a polar solvent solution obtained by dissolving a solute containing a polyamino acid and an inorganic salt in a polar solvent.
  • the viscosity can be easily set to a desired value, whereby stable spinning or casting can be performed when used as a dope solution for spinning or film.
  • the inorganic salt is added to the solution, while the water content and the inorganic salt content in the polar solvent solution in which the solute containing the polyamino acid and the inorganic salt are dissolved in the polar solvent.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the addition amount of water and LiCl and the viscosity of some examples of the present invention and some comparative examples.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the presence / absence of moisture in the dope solution, the amount of LiCl added, and the viscosity in several other examples of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the H 2 O / LiCl molar ratio and the viscosity according to the temperature of the dope solution in some examples of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the H 2 O / CaCl 2 molar ratio and the viscosity according to the temperature of the dope solution in some examples of the present invention.
  • the present inventors have found that a polyamino acid (particularly a polypeptide) itself and a polar solvent solution obtained by dissolving a solute containing the polyamino acid in a polar solvent are likely to absorb moisture, and the absorption of moisture causes problems such as a decrease in viscosity.
  • the present inventors not only increase the solubility of polyamino acids (particularly polypeptides) by including an inorganic salt in the solution, but also increase the viscosity even if the solution absorbs moisture to some extent. It was also found that the viscosity of the solution can be maintained high with a smaller amount of inorganic salt in the solution by reducing the water content in the solution.
  • the water in the solution including the water brought into the solution by the polyamino acid (particularly the polypeptide) contained in the solute is included. It was conceived that the ratio between the water content and the inorganic salt content in the solution was set to a specific value by keeping the content low or increasing or decreasing the inorganic salt content.
  • the solution one or more kinds of inorganic salts are contained (added), but when the kinds of inorganic salts are contained in the solution, the molar ratio of water and inorganic salts in the solution
  • the value of (moisture / inorganic salt) is calculated using the total number of moles of a plurality of types of inorganic salts contained in the solution.
  • the value of the molar ratio of water to inorganic salt (water / inorganic salt) in the solution is 2.5 ⁇ m ⁇ n.
  • the content of each of the plurality of types of inorganic salts in the solution is adjusted so as to be as follows.
  • the polar solvent solution may be referred to as a dope solution.
  • a polypeptide that is a typical example of a polyamino acid will be mainly described as an example.
  • the value of the molar ratio of water and inorganic salt (water / inorganic salt) in the solution is preferably 2.0 ⁇ m ⁇ n (hereinafter referred to as Formula 1) or less.
  • Formula 1 the amount of variation in the viscosity of the solution due to the change in the content of inorganic salt and water in the solution becomes larger, and therefore, the content of the inorganic salt and water content in the solution is simply changed.
  • the viscosity of the solution can be easily set to a desired value.
  • the number of cations forming an inorganic salt represented by m is preferably 1
  • the number of charges of the cations represented by n is preferably 1 or 2.
  • the viscosity of the solution is preferably increased by adding an inorganic salt to the solution and reducing the water content in the solution.
  • the inorganic salt content in the solution can be reduced while the viscosity of the solution is set to a desired value.
  • the molar ratio of water and inorganic salt is preferably 2.5 ⁇ m ⁇ n or less, more preferably 2.0 ⁇ m ⁇ n or less.
  • the adjustment for reducing the water content in the solution is performed by, for example, pre-drying the solute or solvent, vacuum-drying, or during the production and storage of the solution. Adjust the relative humidity of the atmosphere in at least one of the above, or heat the manufactured solution to evaporate water, or absorb moisture using various hygroscopic agents (hygroscopic materials) such as zeolite. For example, or by appropriately combining these operations.
  • hygroscopic agents hygroscopic materials
  • zeolite zeolite
  • the relative humidity of the atmosphere in at least one of the production and storage of the solution is preferably 1.3. % RH or less is maintained.
  • processing such as solution preparation and storage in a so-called dry room.
  • the water content in the solution when the solution is 100% by mass is preferably 0.6% by mass or more and 9.1% by mass or less.
  • a more preferable water content is 0.6% by mass or more and 8.8% by mass or less, and a still more preferable water content is 0.8% by mass or more and 8.8% by mass or less. If the water content in the solution is within the above range, the value of the molar ratio of water and inorganic salt (water / inorganic salt) in the solution is more reliably set to 2.5 ⁇ m ⁇ n or less.
  • the viscosity of the solution can be set to the desired value stably and reliably, but also by specifying the molar ratio
  • the above-described characteristics to be exhibited can be advantageously ensured.
  • Polar solvents that can be used in the present invention include (i) dimethyl sulfoxide (DMSO), (ii) N, N-dimethylformamide (DMF), (iii) N, N-dimethylacetamide (DMA), and (iv) N— Those containing at least one aprotic polar solvent selected from the group consisting of methyl-2-pyrrolidone (NMP) are preferred. This is because these polar solvents easily dissolve the solute containing the polypeptide.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF N-dimethylformamide
  • DMA N-dimethylacetamide
  • NMP methyl-2-pyrrolidone
  • the polar solvent that can be used in the present invention includes those containing the aprotic polar solvent described above, as well as hexafluoroisopropanol (HFIP), formic acid, various alcohols (for example, methanol, ethanol, 2-propanol, etc.). Those containing a protic polar solvent such as 1 to 6 lower alcohols) are also included.
  • the polar solvent is such that the total amount of the solvent selected from the group consisting of (i) to (iv) is within the range of 10 to 100% by mass when the total amount of the polar solvent is 100% by mass. It is desirable to be a value. This increases the solubility of the solute containing the polypeptide.
  • the inorganic salt that can be used in the present invention include inorganic salts composed of the following Lewis acids and Lewis bases.
  • the Lewis base may be, for example, an oxoacid ion (nitrate ion, perchlorate ion, etc.), a metal oxoacid ion (permanganate ion, etc.), a halide ion, thiocyanate ion, cyanate ion, or the like.
  • the Lewis acid may be, for example, metal ions such as alkali metal ions and alkaline earth metal ions, polyatomic ions such as ammonium ions, complex ions, and the like.
  • inorganic salts include lithium salts such as lithium chloride, lithium bromide, lithium iodide, lithium nitrate, lithium perchlorate, and lithium thiocyanate, calcium chloride, calcium bromide, calcium iodide, calcium nitrate.
  • Calcium salts such as calcium perchlorate and calcium thiocyanate, iron salts such as iron chloride, iron bromide, iron iodide, iron nitrate, iron perchlorate and iron thiocyanate, and aluminum chloride, Aluminum salts such as aluminum bromide, aluminum iodide, aluminum nitrate, aluminum perchlorate, and aluminum thiocyanate, such as potassium chloride, potassium bromide, potassium iodide, potassium nitrate, potassium perchlorate, and potassium thiocyanate Potassium salt, sodium chloride, sodium bromide, yo Sodium salts such as sodium chloride, sodium nitrate, sodium perchlorate and sodium thiocyanate, zinc salts such as zinc chloride, zinc bromide, zinc iodide, zinc nitrate, zinc perchlorate and zinc thiocyanate, Magnesium salts such as magnesium chloride, magnesium bromide, magnesium iodide, magnesium nitrate, magnesium
  • At least one selected from the group consisting of alkali metal halides, alkaline earth metal halides, alkaline earth metal nitrates and thiocyanates is preferably used.
  • the alkali metal halide include LiCl and LiBr
  • examples of the alkaline earth metal halide include CaCl 2
  • examples of the alkaline earth metal nitrate include Ca (NO 3 ) 2 .
  • examples of thiocyanate include NaSCN.
  • LiCl is preferable because the viscosity of the solution can be maintained high.
  • the inorganic salt used in the present invention has a value of 2.5 ⁇ m ⁇ n (m is the number of cations forming the inorganic salt) of the molar ratio of water to inorganic salt (water / inorganic salt) in the solution. , N is used in an amount that is less than or equal to the number of charges of the cation).
  • N is used in an amount that is less than or equal to the number of charges of the cation.
  • an inorganic salt having a cation number of 1 and a cation charge number of 1, such as LiCl, LiBr, or NaSCN is used,
  • the value of the molar ratio of water to inorganic salt (water / inorganic salt) needs to be 2.5 or less.
  • the value of the molar ratio of the inorganic salt needs to be 5.0 or less.
  • the inorganic salt used in the present invention is preferably contained in the solution at a ratio of 1 w / v% or more and 15 w / v% or less in total when the solution is 100% by volume. Thereby, the solute containing the polypeptide can be more reliably dissolved in the polar solvent. Even when a plurality of types of inorganic salts are contained in the solution, the content of the plurality of types of inorganic salts is adjusted to be a ratio of 1 w / v% or more and 15 w / v% or less in total.
  • w / v (mass / volume)% represents the percentage of the mass (g) of the inorganic salt per unit volume (100 mL) of the solution.
  • the solute used in the present invention is not particularly limited as long as it contains a polyamino acid (particularly a polypeptide).
  • the polyamino acid refers to a polyamide compound obtained by polymerizing an amino group and a carboxyl group of a plurality of amino acids through an amide bond.
  • the amino acid constituting the polyamide compound is preferably 15 or more, more preferably 20 or more, further preferably 30 or more, still more preferably 100 or more, and particularly preferably 500 or more. preferable.
  • the polyamino acid is preferably 6000 or less, more preferably 5000 or less, still more preferably 3000 or less, and particularly preferably 2000 or less.
  • a polyamino acid may be used alone, or, for example, one or more of non-polyamino acids such as carbohydrates and synthetic resins may be combined with a polypeptide. It may be used.
  • the solute used in the present specification may be, for example, a polypeptide alone, or a combination of one or more of non-polypeptides such as carbohydrates and synthetic resins with a polypeptide. May be used.
  • This polypeptide is preferably a structural protein, and further preferably includes a crystalline region. Such a polypeptide can exhibit high strength and toughness when formed into a fiber or film.
  • the structural protein refers to a protein related to the structure of a living organism or a protein constituting a structure created by a living organism, and examples thereof include fibroin, sericin, collagen, keratin, elastin, and resilin.
  • the polypeptide is preferably a fibroin such as a spider silk protein or silk protein, and a spider silk protein is particularly preferred among them. This is because spider silk proteins have high affinity with polar solvents and are easily dissolved.
  • the concentration of the solute is preferably 2 to 50% by mass, more preferably 3 to 40% by mass, and particularly preferably 5 to 30% by mass.
  • the viscosity of the polar solvent solution of the present invention is preferably 10 to 100,000 mPa ⁇ s, more preferably 15 to 20000 mPa ⁇ s in a state where unnecessary matters such as dust and bubbles are removed. More preferably, the pressure is set to 100 to 10,000 mPa ⁇ s.
  • DMSO which is suitably used as a polar solvent for dissolving a solute containing a polypeptide is particularly advantageously used as a solvent for dissolving a solute containing a spider silk protein, for example.
  • DMSO has a melting point of 18.4 ° C. and a boiling point of 189 ° C. Compared to the boiling point of 59 ° C. of hexafluoroisopropanol (HFIP) used in the conventional method and the boiling point of hexafluoroacetone (HFAc) —26.5 ° C. Is much higher.
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • HFAc hexafluoroacetone
  • DMSO is also used as a polymerization and spinning solution for acrylic fibers in the general industrial field, and is also used as a polymerization solvent for polyimide. Therefore, DMSO is a material that is low in cost and safe.
  • the spider silk protein exemplified as the polypeptide contained in the solute in the present invention is not particularly limited as long as it is derived from or similar to the natural spider silk protein (hereinafter referred to as “derived”).
  • derived from natural spider silk protein has an amino acid sequence similar to or similar to the amino acid repetitive sequence of natural spider silk protein, such as recombinant spider silk protein and natural spider silk. Examples include protein variants, analogs, and derivatives.
  • the said spider silk protein is a large sphincter bookmark protein produced in the large bottle-like gland of a spider or a spider silk protein derived therefrom from the viewpoint of excellent toughness.
  • Examples of the large sputum bookmark thread protein include large bottle-shaped gland spiders MaSp1 and MaSp2 derived from Nephila clavipes, and ADF3 and ADF4 derived from two-banded spider (Araneus diadematus).
  • the spider silk protein may be a small sphincter bookmark silk protein produced in a spider small gland or a spider silk protein derived therefrom.
  • Examples of the small sputum dragline protein include small bottle-shaped gland spidroin MiSp1 and MiSp2 derived from Nephila clavipes.
  • the spider silk protein may be a weft protein produced in a flagellate gland or a spider silk protein derived therefrom.
  • the weft protein include flagellum silk protein derived from Nephila clavipes.
  • the unit of the amino acid sequence represented by Formula 1: REP1-REP2 (1) is 2 or more, preferably 4 or more, more preferably Includes 6 or more recombinant spider silk proteins.
  • the unit of the amino acid sequence represented by the formula (1): REP1-REP2 (1) may be the same or different.
  • REP1 means a polyalanine region mainly composed of alanine and represented by (X1) p, and preferably REP1 means polyalanine.
  • p is not particularly limited, but preferably represents an integer of 2 to 20, more preferably an integer of 4 to 12.
  • X1 represents alanine (Ala), serine (Ser), or glycine (Gly).
  • the total number of residues of alanine is preferably 80% or more, more preferably 85% or more of the total number of residues of amino acids in the region.
  • alanine arranged continuously is preferably 2 residues or more, more preferably 3 residues or more, still more preferably 4 residues or more, particularly preferably 5 residues or more. It is. In the REP1, the alanine arranged continuously is preferably 20 residues or less, more preferably 16 residues or less, still more preferably 12 residues or less, and particularly preferably 10 residues. Below the group.
  • REP2 is an amino acid sequence consisting of 10 to 200 amino acids, and the total number of residues of glycine, serine, glutamine, proline and alanine contained in the amino acid sequence is the total number of amino acid residues. Is 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more.
  • the REP1 corresponds to a crystalline region that forms a crystalline ⁇ -sheet in the fiber
  • the REP2 is an amorphous region that is more flexible in the fiber and largely lacks a regular structure.
  • [REP1-REP2] corresponds to a repetitive region (repetitive sequence) composed of a crystal region and an amorphous region, and is a characteristic sequence of a bookmark thread protein.
  • Examples of the spider silk protein containing two or more units of the amino acid sequence represented by the formula 1: REP1-REP2 (1) include, for example, the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of ADF3 in which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) consisting of a start codon, a His10 tag and an HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminus.
  • the 13th repeat region was increased to approximately double and the translation was mutated to terminate at the 1154th amino acid residue.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a start codon at the N-terminus of the amino acid sequence of the partial amino acid sequence of ADF3 obtained from the NCBI database (NCBI Genebank accession number: AAC47010, GI: 1263287), His10 It is an amino acid sequence to which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) consisting of a tag and an HRV 3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence of ADF3 in which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) consisting of a start codon, a His10 tag and an HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminus.
  • the thirteenth repeat area is increased to approximately double.
  • the polypeptide containing two or more units of the amino acid sequence represented by the formula 1: REP1-REP2 (1) is 1 or 2 in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added and having a repeating region consisting of a crystalline region and an amorphous region may be used.
  • Examples of the spider silk protein (polypeptide) derived from the small splint bookmark silk protein include a recombinant spider silk protein comprising an amino acid sequence represented by Formula 2: REP3-REP4-REP5 (2).
  • REP3 means an amino acid sequence represented by (Gly-Gly-Z) s
  • REP4 means an amino acid sequence represented by (Gly-Ala) l
  • REP5 represents (Ala) r.
  • the amino acid sequence represented by In REP3, Z means any one amino acid, but is particularly preferably one amino acid selected from the group consisting of Ala, Tyr and Gln.
  • s is preferably 1 to 4
  • REP4 l is preferably 0 to 4
  • REP5, r is preferably 1 to 6.
  • small splint bookmark yarn is spirally wound from the center of the spider's web, and is used as a reinforcing material for the web or as a yarn that wraps the captured prey. It is known that the tensile strength is inferior to that of the large spout tube bookmark thread, but the stretchability is high. This is because in the small spout bookmark thread, many crystal regions are formed from regions in which glycine and alanine are alternately arranged, so that the crystal region is larger than the large spout bookmark yarn in which the crystal region is formed only with alanine. This is thought to be because the hydrogen bond of the sulfite tends to be weak.
  • Examples of the recombinant spider silk protein (polypeptide) derived from the weft protein include a recombinant spider silk protein containing an amino acid sequence represented by Formula 3: REP6 (3).
  • REP6 means an amino acid sequence represented by (U1) t or (U2) t.
  • U1 means an amino acid sequence represented by Gly-Pro-Gly-XX (SEQ ID NO: 12), and U2 is represented by Gly-Pro-Gly-Gly-X (SEQ ID NO: 13).
  • X means any one amino acid, but is preferably one amino acid selected from the group consisting of Ala, Ser, Tyr, Gln, Val, Leu, and Ile.
  • t represents a number of at least 4 or more, preferably 10 or more, more preferably 20 or more.
  • a great feature of spider silk is that the weft does not have a crystal region but has a repeating region consisting of an amorphous region. It is presumed that the large splint bookmark yarn has both high stress and stretchability because it has a repetitive region consisting of a crystal region and an amorphous region. On the other hand, the weft yarn is inferior in stress to the large splint guide yarn, but has high stretchability. This is considered to be because most of the weft is composed of amorphous regions.
  • the recombinant spider silk protein can be produced using a host transformed with an expression vector containing a gene encoding a natural spider silk protein to be recombined.
  • the gene production method is not particularly limited, and a gene encoding a natural spider silk protein is cloned from a spider-derived cell by polymerase chain reaction (PCR) or the like, or chemically synthesized.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the method of chemical synthesis of the gene is not particularly limited. For example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) based on the amino acid sequence information of the natural spider silk protein obtained from the NCBI web database.
  • Oligonucleotides automatically synthesized by a company can be synthesized by ligation by PCR or the like.
  • a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N-terminus of the amino acid sequence may be synthesized.
  • the expression vector a plasmid, phage, virus or the like capable of expressing a protein from a DNA sequence can be used.
  • the plasmid type expression vector is not particularly limited as long as it can express a target gene in a host cell and can amplify the gene itself.
  • a pET22b (+) plasmid vector when Escherichia coli Rosetta (DE3) is used as a host, a pET22b (+) plasmid vector, a pCold plasmid vector, or the like can be used. Among these, it is preferable to use a pET22b (+) plasmid vector from the viewpoint of protein productivity.
  • the host examples include animal cells, plant cells, and microorganisms.
  • Viscosity Viscosity was measured using an EMS viscometer (EMS-01S) manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.
  • Relative humidity The temperature and dew point temperature of the experimental environment were measured and calculated by a known calculation formula.
  • Moisture content in dope solution Measured using a hybrid Karl Fischer moisture meter (MKH-700) manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.
  • a pUC57 vector (with an Nde I site immediately upstream of the 5 ′ end and an Xba I site immediately downstream of the 5 ′ end) into which the ADF3Kai gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 had been introduced was obtained. Thereafter, the gene was treated with restriction enzymes with Nde I and EcoR I and recombined into a pET22b (+) expression vector.
  • a PCR reaction was performed using ADF3Kai as a template using a T7 promoter primer (SEQ ID NO: 8) and Rep Xba I primer (SEQ ID NO: 9), and the 5 ′ half of the ADF3Kai gene sequence
  • sequence A The sequence (hereinafter referred to as “sequence A”) was amplified, and the fragment was subjected to restriction enzyme treatment with Nde I and Xba I in advance using a Mighty Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Recombined.
  • PCR reaction was performed using ADF3Kai as a template and an Xba I Rep primer (SEQ ID NO: 10) and a T7 terminator primer (SEQ ID NO: 11), and the sequence of the 3 ′ half of the gene sequence of ADF3Kai (hereinafter referred to as sequence B and The fragment was recombined into a pUC118 vector previously treated with Xba I and EcoR I using a Mighty Cloning Kit (Takara Bio Inc.).
  • the pUC118 vector into which the sequence A was introduced was treated with Nde I and Xba I
  • the pUC118 vector into which the sequence B was introduced was treated with restriction enzymes with Xba I and EcoR I, respectively, and the target DNA fragments of the sequences A and B were obtained by cutting out the gel.
  • the DNA fragments A and B and pET22b (+) previously treated with Nde I and EcoR I were subjected to a ligation reaction and transformed into E. coli DH5 ⁇ .
  • ADF3Kai-Large gene shown in SEQ ID NO: 6 was confirmed.
  • the amino acid sequence of ADF3Kai-Large is as shown in SEQ ID NO: 3.
  • pET22b (+) expression vector containing the ADF3Kai-Large-NRSH1 gene sequence obtained above was transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3). After culturing the obtained single colony in 2 ml of LB medium containing ampicillin for 15 hours, 1.4 ml of the same culture solution was added to 140 ml of LB medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C. and 200 rpm. The culture was continued until the OD 600 was 3.5. Then, OD 600 of the culture broth of 3.5, added with 50% glucose 140ml to 2 ⁇ YT medium 7L containing ampicillin, and further cultured until an OD 600 of 4.0.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • ⁇ Purification> (1) About 50 g of E. coli cells expressing the ADF3Kai-Large-NRSH1 protein and 300 ml of buffer AI (20 mM Tris-HCl, pH 7.4) are added to a centrifuge tube (1000 ml), and a mixer (IKA) is added. Disperse the cells with “T18 Basic Ultra Thalax”, Level 2), and centrifuge (11,000 g, 10 minutes, room temperature) with a centrifuge (“Model 7000” manufactured by Kubota). Abandoned Qing.
  • the mixture was stirred with a shaker (manufactured by Taitec Corporation, 200 rpm, 37 ° C.) for 60 minutes. Then, it centrifuged with the said Kubota centrifuge (11,000g, 30 minutes, room temperature), the supernatant liquid was thrown away, and the SDS washing
  • the SDS washed granules were suspended in a DMSO solution containing 1M lithium chloride to a concentration of 100 mg / ml and heat-treated at 80 ° C. for 1 hour. Then, it centrifuged with the said Kubota centrifuge (11,000g, 30 minutes, room temperature), and collect
  • the degree of purification of the target protein ADF3Kai-Large-NRSH1 (about 56.1 kDa) in the obtained freeze-dried powder was obtained by using the total lab (nonlinear dynamics ltd.) Of the results of polyacrylamide gel electrophoresis (CBB staining) of the powder. This was confirmed by analysis. As a result, the purification degree of ADF3Kai-Large-NRSH1 was about 85%.
  • the LiCl concentration of 4.0 w / v% means that 4 g of LiCl is contained in 100 mL of the solution.
  • the dried dry spider silk protein (powder) obtained above was added to each of the four DMSO solvents prepared in predetermined amounts. While dissolving at a rate of 15% by mass, only pure water was added to three of the DMSO solvents in which the four spider silk proteins were dissolved in different amounts as shown in Table 1 below to contain LiCl.
  • three types of dope liquids (Comparative Examples 2 to 4) having different water contents (addition amounts) and dope liquids (Comparative Example 1) containing neither water nor LiCl were prepared.
  • Example 4 and Comparative Example 1 when Example 4 and Comparative Example 1 are compared, their viscosities are approximately the same. If the water content and the LiCl content in the dope liquid are both zero, the viscosity is the same as that of the dope liquid having a water content of 3.0 mass% and a LiCl content of 4.0 w / v%. It shows that a dope solution having a size of about a degree is obtained. From this, when manufacturing the dope liquid which has a desired viscosity, it has confirmed that the addition amount of the inorganic salt to a dope liquid could also be reduced by reducing the water content in a dope liquid.
  • the viscosity of the dope liquid can be easily set to a desired value simply by changing the LiCl content or the water content in the dope liquid.
  • Example 4 the relationship between the molar ratio of the H 2 O / CaCl 2 and the viscosity of the dope solution was examined for each temperature. Except for using CaCl 2 as an inorganic salt in place of LiCl, three types of dope solutions (Examples 10 and 9) were prepared in the same manner as in the preparation of the three types of dope solutions of Examples 8 and 9 and Comparative Example 5.
  • Comparative Example 6 and Comparative Example 7 were prepared, and then a dope solution (Comparative Example 6) containing 3.0% by mass of water and 1.0 w / v% of CaCl 2 , and 3.0% by mass of water
  • a dope solution (Comparative Example 6) containing 3.0% by mass of water and 1.0 w / v% of CaCl 2 , and 3.0% by mass of water
  • the viscosity of the dope solution was measured at temperatures of 25 ° C., 30 ° C., 40 ° C., 50 ° C., 60 ° C., and 70 ° C., respectively. The results are as shown in FIG.
  • the amount of change in viscosity due to changes in the CaCl 2 content and water content in the dope solution can be reduced.
  • the viscosity of the dope liquid can be easily set to a desired value simply by changing the CaCl 2 content or the water content in the dope liquid.
  • the polar solvent solution of the present invention is useful for wet spinning, film casting, gels, particles, mesh bodies, and various molded products.

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Abstract

　本発明の極性溶媒溶液は、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液であって、前記溶液中に無機塩が添加されていると共に、前記溶液中の水分と無機塩のモル比の値が２．５×ｍ×ｎ（ｍは無機塩を形成する陽イオンの数で、ｎは該陽イオンの電荷数）以下とされている。本発明製法は、前記溶液の製造方法であって、前記溶液中の水分の含有量と前記無機塩の含有量のうちの少なくとも何れか一方を変えることにより、前記溶液の粘度を調節する。本発明は、紡糸やフィルムなどのドープ液として使用する際などに、粘度を容易に所望の値とすることができ、それによって安定した紡糸やキャスティングができる極性溶媒溶液及びその製造方法を提供する。

Description

極性溶媒溶液及びその製造方法
　本発明は、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液とその製造方法に関する。
　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性溶媒はポリマーなどの物質を溶解し易いことから、アクリル繊維の重合、紡糸液、又はポリイミドの重合溶媒などとして使用されている。本出願人はクモ糸タンパク質及びシルクタンパク質などのポリペプチドの溶媒として前記極性溶媒の適用を特許文献１～２で提案している。また、本出願人は、それら特許文献１～２において、極性溶媒に無機塩を添加することによって、ポリペプチドの溶解性を高めることも提案している。
特許第５４２７３２２号公報 特許第５５８４９３２号公報
　しかし、クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質などのポリペプチドを溶解させたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性溶媒溶液は、管理の仕方によっては粘度低下することがあり、紡糸やフィルムなどのドープ液として使用する際に、安定した紡糸やキャスティングを行うという観点からは、改善の余地があった。
　本発明は、紡糸やフィルムなどのドープ液として使用する際に、安定した紡糸やキャスティングができる極性溶媒溶液及びその製造方法を提供する。
　本発明は、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液であって、前記溶液は無機塩を含み、前記溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値が２．５×ｍ×ｎ（ｍは無機塩を形成する陽イオンの数であり、ｎは該陽イオンの電荷数である。）以下であることを特徴とする極性溶媒溶液に関する。
　また、本発明は、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液の製造方法であって、前記溶液中に無機塩を添加し、かつ前記溶液中の水分の含有量と前記無機塩の含有量のうちの少なくとも何れか一方を変えることにより、前記溶液の粘度を調節することを特徴とする極性溶媒溶液の製造方法に関する。
　また、本発明は、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液の製造方法であって、前記溶液中に無機塩を添加し、かつ前記溶液中の水分の含有量を減らすことにより、前記溶液の粘度を増加させることを特徴とする極性溶媒溶液の製造方法に関する。
　本発明の極性溶媒溶液は、ポリアミノ酸を含む溶質と無機塩とを極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値が２．５×ｍ×ｎ以下されていることで、粘度を容易に所望の値とすることができ、それによって、紡糸やフィルムなどのドープ液として使用された際などに安定した紡糸やキャスティングができる。また、本発明の製造方法によれば、前記溶液中に無機塩を添加する一方、ポリアミノ酸を含む溶質と無機塩とを極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液中の水分含有量と無機塩含有量のうちの少なくとも何れか一方を変えて、前記溶液の粘度を調整することにより、安定した紡糸やキャスティングが可能な極性溶媒溶液を得ることができる。
図１は本発明の幾つかの実施例と幾つかの比較例のドープ液の水とＬｉＣｌの添加量と粘度の関係を示すグラフである。 図２は本発明の別の幾つかの実施例におけるドープ液の水分の有無とＬｉＣｌの添加量と粘度の関係を示すグラフである。 図３は本発明の幾つかの実施例におけるドープ液の温度別のＨ2Ｏ／ＬｉＣｌモル比と粘度との関係を示すグラフである。 図４は本発明の幾つかの実施例におけるドープ液の温度別のＨ2Ｏ／ＣａＣｌ２モル比と粘度との関係を示すグラフである。
　本発明者らは、ポリアミノ酸（特にポリペプチド）自体も、前記ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液も吸湿し易く、吸湿すると粘度低下などが問題となることを見出した。また、本発明者らは、前記溶液中に無機塩を含ませるとことによって、単にポリアミノ酸（特にポリペプチド）の溶解度が高まるだけでなく、前記溶液がある程度水分を吸収してしまっても粘度を高く維持することができること、更には、前記溶液中の水分含有量を減らすことによって、前記溶液中の無機塩含有量がより少ない状態で前記溶液の粘度を高く維持できることも見出した。これらのことから、前記溶液の粘度を所望の値に安定的に維持するために、溶質に含まれるポリアミノ酸（特にポリペプチド）によって前記溶液中に持ち込まれる水分を含めて、前記溶液中の水分含有量を低く抑えたり、無機塩含有量を増減したりして、前記溶液中の水分含有量と無機塩含有量との比率を特定の値とすることを着想した。
　前記溶液中には１種類又は複数種類の無機塩が含まれる（添加される）が、前記溶液中に複数種類の無機塩が含まれる場合には、前記溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値が、前記溶液中に含まれる複数種類の無機塩の総モル数を用いて算出される。換言すれば、前記溶液中に複数種類の無機塩を含める（添加する）場合には、前記溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値が２．５×ｍ×ｎ以下となるように、複数種類の無機塩のそれぞれの前記溶液中の含有量が調整される。なお、本明細書においては、前記極性溶媒溶液をドープ液と言う場合もある。以下、主として、ポリアミノ酸の代表例であるポリペプチドを例に説明する。
　また、前記溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値は、好ましくは２．０×ｍ×ｎ（以下において、数式１と記す。）以下とされる。これによって、前記溶液中の無機塩や水分の含有量の変化による前記溶液の粘度の変動量がより大きくなり、以って、単に、前記溶液中の無機塩含有量や水分含有量を変えるだけで、前記溶液の粘度を更に容易に所望の値と為すことができる。なお、前記数式１において、ｍで表される、無機塩を形成する陽イオンの数は、好ましくは１であり、ｎで表される陽イオンの電荷数は、好ましくは１又は２である。それによって、前記溶液の粘度を更に容易に且つ確実に所望の値と為すことができる。
　前記溶液中の水分と無機塩のモル比の値を小さくするには、前記溶液中の水分含有量を低下させることが望ましい。そうすることで、無機塩の使用量を低減できる。それ故、本発明の極性溶媒溶液の製造方法では、好ましくは、前記溶液中に無機塩を添加し、かつ前記溶液中の水分の含有量を減らすことにより、前記溶液の粘度を増加させる。これによって、前記溶液の粘度を所望の値と為しつつ、前記溶液中の無機塩含有量を減少させることができる。その結果、紡糸やフィルムなどのドープ液として使用された際などに安定した紡糸やキャスティングが可能となると共に、無機塩の過剰な使用によるコストの増大を効果的に抑制することができる。
　そして、本発明の製造方法では、前記溶液中の水分含有量と無機塩の含有量のうちの何れか一方を変えることにより、あるいは前記溶液中の水分含有量のみを減らすことによって、前記溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値が、好ましくは２．５×ｍ×ｎ以下、より好ましくは２．０×ｍ×ｎ以下とされる。これによって、無機塩の添加量を抑えつつ、前記溶液の粘度をより確実に所望の値と為すことが可能となり、その結果、更なるコスト低減が図られ得る。
　本発明の製造方法においては、前記溶液中の水分含有量を減らすための調整が、例えば、前記溶質や溶媒を予め加熱乾燥したり、真空乾燥したり、前記溶液の製造時と貯蔵時のうちの少なくとも何れか一方における雰囲気の相対湿度を調整したり、若しくは製造された前記溶液を加熱して水分を蒸発させたり、ゼオライトを始めとした各種の吸湿剤（吸湿材）などを用いて吸湿したりすることなどによって、又はそれらの操作を適宜に組み合わせたりすることなどによって実現される。なお、前記溶液中の水分含有量を減らすための調整方法としては、前記溶質を前記溶媒に溶解させる前に乾燥させる方法が好適に採用される。これによって、前記溶液中の水分含有量をより確実且つ効率的に減らすことができる。また、雰囲気の相対湿度の調整によって前記溶液中の水分含有量を変える場合には、前記溶液の製造時と貯蔵時のうちの少なくとも何れか一方における雰囲気の相対湿度が、有利には１．３％ＲＨ以下の条件に保たれる。雰囲気を相対湿度１・３％ＲＨ以下の条件に保つには、溶液作製や保存などの処理をいわゆるドライルーム内でするのが好ましい。
　本発明においては、前記溶液を１００質量％としたときの前記溶液中の水分含有量が、好ましくは０．６質量％以上、９．１質量％以下とされる。より好ましい水分含有量は０．６質量％以上、８．８質量％以下であり、更に好ましい水分含有量は０．８質量％以上、８．８質量％以下である。前記溶液中の水分含有量が前記の範囲であれば、前記溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値を、より確実に２．５×ｍ×ｎ以下とすることができ、それによって、単に、前記溶液中の無機塩含有量を減らすだけで、前記溶液の粘度を安定的に且つ確実に所望の値と為し得るだけでなく、モル比を特定したことによって発揮される前記した特徴を有利に確保し得る。
　本発明で使用できる極性溶媒は、（i）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、（ii）Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、（iii）Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、及び（iv）Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの非プロトン性極性溶媒を含むものが好ましい。これらの極性溶媒はポリペプチドを含む溶質を溶解させ易いからである。また、本発明で使用できる極性溶媒には、前記した非プロトン性極性溶媒を含むものの他、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）やギ酸、各種のアルコール（例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノールなどの炭素数１～６の低級アルコール）などのプロトン性極性溶媒を含むものも含まれる。なお、前記極性溶媒は、前記極性溶媒の全体を１００質量％としたとき、前記（i）～（iv）からなる群から選ばれる溶媒の合計量の割合が１０～１００質量％の範囲内の値とされることが望ましい。これによって、ポリペプチドを含む溶質の溶解度が高められる。
　本発明で使用できる無機塩としては、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基は、例えば、オキソ酸イオン(硝酸イオン、過塩素酸イオン等)、金属オキソ酸イオン(過マンガン酸イオン等)、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオンなどであってもよい。ルイス酸は、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオンなどであってもよい。無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウムのようなリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウムのようなカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄のような鉄塩、並びに、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウムのようなカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウムのようなナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛のような亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウムのようなマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウムのようなバリウム塩、塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウムのようなストロンチウム塩などが挙げられる。そして、それらの中でも、本発明では、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩及びチオシアン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも一つが好適に用いられる。アルカリ金属ハロゲン化物としては、例えばＬｉＣｌ，ＬｉＢｒなどがあり、アルカリ土類金属ハロゲン化物としては、例えばＣａＣｌ２などがあり、アルカリ土類金属硝酸塩としては、例えばＣａ（ＮＯ３）２などがあり、チオシアン酸塩としては、例えばＮａＳＣＮなどがある。この中でもＬｉＣｌは、前記溶液の粘度を高く維持できることから好ましい。
　本発明で使用される無機塩は、前記溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値が２．５×ｍ×ｎ（ｍは無機塩を形成する陽イオンの数で、ｎは該陽イオンの電荷数）以下となる量において用いられる。本発明で使用される無機塩のうち、例えばＬｉＣｌやＬｉＢｒ，ＮａＳＣＮなどのように、陽イオンの数が１で、かかる陽イオンの電荷数が１である無機塩を用いる場合には、前記溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値は２．５以下となる必要がある。また、例えばＣａＣｌ２やＣａ（ＮＯ３）２のなどのように、陽イオンの数が１で、かかる陽イオンの電荷数が２である無機塩を用いる場合には、前記溶液中の水分と無機塩のモル比（水分／無機塩）の値が５．０以下となる必要がある。
　本発明で使用される無機塩は、前記溶液を１００体積％としたとき、前記溶液中に合計で１ｗ／ｖ％以上、１５ｗ／ｖ％以下の割合で含有されているのが好ましい。これによって、ポリペプチドを含む溶質を極性溶媒に対してより確実に溶解させることができる。前記溶液中に複数種類の無機塩が含まれる場合にあっても、それら複数種類の無機塩の含有量が、合計で１ｗ／ｖ％以上、１５ｗ／ｖ％以下の割合となるように調整される。なお、ｗ／ｖ（質量／体積）％は、前記溶液の単位体積当たり（１００ｍＬ）の無機塩の質量（ｇ）の百分率を表す。
　本発明で使用される溶質は、ポリアミノ酸（特にポリペプチド）を含むものであればよく、特に限定されない。本明細書において、ポリアミノ酸とは、複数のアミノ酸のアミノ基とカルボキシル基とがアミド結合して重合したポリアミド化合物を言う。ポリアミノ酸としては、ポリアミド化合物を構成するアミノ酸が、１５以上であることが好ましく、２０以上であることがより好ましく、３０以上であることがさらに好ましく、１００以上がよりさらに好ましく、５００以上が特に好ましい。ポリアミノ酸としては、６０００以下であることが好ましく、５０００以下であることがより好ましく、３０００以下であることがさらに好ましく、２０００以下であることが特に好ましい。本明細書で使用される溶質は、例えば、ポリアミノ酸を単独で用いてもよく、或いは例えば炭水化物や合成樹脂等のポリアミノ酸以外のもののうちの１種又は２種以上とポリペプチドとを組み合わせて用いてもよい。また本明細書で使用される溶質は、例えば、ポリペプチドを単独で用いてもよく、或いは例えば炭水化物や合成樹脂等のポリペプチド以外のもののうちの１種又は２種以上とポリペプチドとを組み合わせて用いてもよい。このポリペプチドは、構造タンパク質であることが好ましく、更に結晶領域を含むものが好ましい。このようなポリペプチドは繊維やフィルムにしたときに高い強度やタフネスを発揮できる。なお、構造タンパク質とは、生物体の構造に関わるタンパク質、或いは生物体が作り出す構造体を構成するタンパク質を言い、例えば、フィブロイン、セリシン、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、レシリンなどが挙げられる。
　前記ポリペプチドは、クモ糸タンパク質やシルクタンパク質などのフィブロインが好ましく、その中でも特にクモ糸タンパク質が好ましい。クモ糸タンパク質は極性溶媒と親和性が高く、溶解し易いからである。
　本発明の極性溶媒溶液を１００質量％としたとき、溶質（例えば、クモ糸タンパク質）の濃度は２～５０質量％であることが望ましく、更に好ましくは３～４０質量％であり、特に好ましくは５～３０質量％である。このような濃度とすることによって、極性溶媒溶液の粘度の低下や過剰な上昇を効果的に防止できる。
　また、本発明の極性溶媒溶液は、粘度が、好ましくはゴミなどの不要物や泡などを取り除いた状態で１０～１０００００ｍＰａ・ｓとされることが望ましく、より好ましくは１５～２００００ｍＰａ・ｓとされ、更に好ましくは１００～１００００ｍＰａ・ｓとされる。このような範囲内の粘度の極性溶媒溶液をドープ液として用いることで、良好に湿式紡糸したりフィルムキャスト成形したりすることができる。
　本発明において、ポリペプチドを含む溶質を溶解する極性溶媒として好適に用いられるＤＭＳＯは、例えば、クモ糸タンパク質を含む溶質を溶解する溶媒として、特に有利に使用される。ＤＭＳＯは融点１８．４℃、沸点１８９℃であり、従来法で使用されているヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）の沸点５９℃、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）の沸点－２６．５℃に比べると、沸点ははるかに高い。また、ＤＭＳＯは、一般産業分野においてもアクリル繊維の重合、紡糸液として使用され、ポリイミドの重合溶媒としても使用されていることから、コストも安く安全性も確認されている物質である。
　本発明において溶質に含まれるポリペプチドとして例示されるクモ糸タンパク質は、天然クモ糸タンパク質と、天然クモ糸タンパク質に由来又は類似（以下、由来と言う。）するものであればよく、特に限定されない。また、ここで言う天然クモ糸タンパク質に由来するものとは、天然クモ糸タンパク質が有するアミノ酸の反復配列と同様乃至類似のアミノ酸配列を有するものであって、例えば組換えクモ糸タンパク質や天然クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などが挙げられる。なお、前記クモ糸タンパク質は、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質やそれに由来するクモ糸タンパク質であることが好ましい。前記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。
　前記クモ糸タンパク質は、クモの小瓶状腺で産生される小吐糸管しおり糸タンパクやそれに由来するクモ糸タンパク質であってもよい。前記小吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する小瓶状腺スピドロインＭｉＳｐ１やＭｉＳｐ２が挙げられる。
　その他にも、前記クモ糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ　ｇｌａｎｄ）で産生される横糸タンパク質やそれに由来するクモ糸タンパク質であってもよい。前記横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。
　前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するクモ糸タンパク質（ポリペプチド）としては、例えば、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは４以上、より好ましくは６以上含む組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。なお、前記組換えクモ糸タンパク質において、式（１）：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
　前記式（１）において、ＲＥＰ１は、主としてアラニンにより構成され（Ｘ１）ｐで表されるポリアラニン領域を意味し、好ましくは、ＲＥＰ１はポリアラニンを意味する。ここで、ｐは特に限定されるものではないが、好ましくは２～２０の整数，より好ましくは４～１２の整数を示す。Ｘ１は、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、又はグリシン（Ｇｌｙ）を示す。（Ｘ１）ｐで表されるポリアラニン領域において、アラニンの合計残基数が該領域のアミノ酸の合計残基数の８０％以上であることが好ましく、より好ましくは８５％以上である。前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２残基以上であることが好ましく、より好ましくは３残基以上であり、更に好ましくは４残基以上であり、特に好ましくは５残基以上である。また、前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下であることが好ましく、より好ましくは１６残基以下であり、更に好ましくは１２残基以下であり、特に好ましくは１０残基以下である。前記式（１）において、ＲＥＰ２は１０～２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン、プロリン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。
　大吐糸管しおり糸において、前記ＲＥＰ１は繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、前記ＲＥＰ２は繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、前記［ＲＥＰ１－ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。
　前記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むクモ糸タンパク質としては、例えば、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の何れかに示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号２に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列である。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やしたものである。また、前記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の何れかに示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドを用いてもよい。
　前記小吐糸管しおり糸タンパク質に由来するクモ糸タンパク質（ポリペプチド）としては、式２：ＲＥＰ３－ＲＥＰ４－ＲＥＰ５（２）で示されるアミノ酸配列を含む組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。前記式２において、ＲＥＰ３は（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｚ）ｓで表されるアミノ酸配列を意味し、ＲＥＰ４は、（Ｇｌｙ－Ａｌａ）ｌで表されるアミノ酸配列を意味し、ＲＥＰ５は（Ａｌａ）ｒで表されるアミノ酸配列を意味する。ＲＥＰ３において、Ｚは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｔｙｒ及びＧｌｎからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。またＲＥＰ３において、ｓは１～４であることが好ましく、ＲＥＰ４においてｌは０～４であることが好ましく、ＲＥＰ５においてｒは１～６であることが好ましい。
　クモ糸において、小吐糸管しおり糸はクモの巣の中心から螺旋状に巻かれ、巣の補強材として使われたり、捉えた獲物を包む糸として利用されたりする。大吐糸管しおり糸と比べると引っ張り強度は劣るが伸縮性は高いことが知られている。これは小吐糸管しおり糸において、多くの結晶領域がグリシンとアラニンが交互に連なる領域から形成されているため、アラニンのみで結晶領域が形成されている大吐糸管しおり糸よりも結晶領域の水素結合が弱くなり易いためと考えられている。
　前記横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質（ポリペプチド）としては、例えば、式３：ＲＥＰ６（３）で示されるアミノ酸配列を含む組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。前記式３において、ＲＥＰ６は（Ｕ１）ｔ、又は、（Ｕ２）ｔで表されるアミノ酸配列を意味する。ＲＥＰ６において、Ｕ１は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘ－Ｘ（配列番号１２）で表されるアミノ酸配列を意味し、Ｕ２は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘ（配列番号１３）で表されるアミノ酸配列を意味する。また、Ｕ１及びＵ２において、Ｘは任意の一つのアミノ酸を意味するが、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましく、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ及びＶａｌからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることがより好ましく、複数あるＸは、同一であっても異なってもよい。またＲＥＰ６において、ｔは少なくとも４以上の数字を表し、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上である。
　クモ糸において、横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。大吐糸管しおり糸などにおいては結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。一方、横糸については、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。
　前記組換えクモ糸タンパク質（ポリペプチド）は、組換えの対象となる天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅してクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、前記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。前記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。前記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。前記宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。
　以下実施例を用いて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
＜各測定方法＞
（１）粘度：　京都電子工業株式会社製のＥＭＳ粘度計（ＥＭＳ－０１Ｓ）を使用して測定した。
（２）相対湿度：実験環境の温度と露点温度を測定し、公知の計算式にて算出した。
（３）ドープ液中の水分率：京都電子工業株式会社製のハイブリッドカールフィッシャー水分計(ＭＫＨ－７００)を使用して測定した。
　＜実験１＞
１．クモ糸タンパク質の準備
　＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
　ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成委託した。その結果、配列番号５で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ　Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ　Ｉサイトあり）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。
（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
　ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号８）とＲｅｐ　Ｘｂａ　Ｉプライマー（配列番号９）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａ　Ｉ　Ｒｅｐプライマー（配列番号１０）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１１）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６　ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号６に示すＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号３で示すとおりである。
（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
　前記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号３）における１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号７に示すＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号１で示すとおりである。
　＜タンパク質の発現＞
　前記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍｌのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍｌと共に加え、ＯＤ６００が４．０になるまで更に培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約１０１．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。
　＜精製＞
（１）遠沈管（１０００ｍｌ）にＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１のタンパク質を発現している大腸菌の菌体約５０ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３００ｍｌを添加し、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシック　ウルトラタラックス」、レベル２）で菌体を分散させた後、遠心分離機（クボタ製の「Ｍｏｄｅｌ　７０００」）で遠心分離（１１，０００ｇ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（２）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３００ｍｌと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を３ｍｌ添加し、前記ＩＫＡ社製のミキサー（レベル２）で３分間分散させた。その後、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓａｏｖｉ社製の「Ｐａｎｄａ　Ｐｌｕｓ　２０００」）を用いて菌体を繰り返し３回破砕した。
（３）破砕された菌体に、３ｗ／ｖ％のＳＤＳを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　ＴｒｉｓーＨＣＬ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）３００ｍｌを加え、前記ＩＫＡ社製のミキサー（レベル２）で良く分散させた後、シェイカー（タイテック社製、２００ｒｐｍ、３７℃）で６０分間攪拌した。その後、前記クボタ製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、上清を捨て、ＳＤＳ洗浄顆粒（沈殿物）を得た。
（４）ＳＤＳ洗浄顆粒を１００ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう１Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ溶液で懸濁し、８０℃で１時間熱処理した。その後、前記クボタ製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、上清を回収した。
（５）回収した上清に対して３倍量のエタノールを準備し、エタノールに回収した上清を加え、室温で１時間静置した。その後、前記クボタ製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、凝集タンパク質を回収した。次に純水を用いて凝集タンパク質を洗浄し、遠心分離により凝集タンパク質を回収するという工程を３回繰り返した後、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１（約５６．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＣＢＢ染色）の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。
２．ドープ液の調整と粘度測定
　前記で得られたクモ糸タンパク質（粉体）を真空乾燥（絶乾）した後、この絶乾状態のクモ糸タンパク質を、予め所定量ずつ準備しておいた４つのＤＭＳＯ溶媒に、それぞれ濃度１５質量％の割合で溶かす一方、それら４つのクモ糸タンパク質が溶解したＤＭＳＯ溶媒に、下記表１に示すように、ＬｉＣｌ（無機塩）を濃度４．０w/v％（質量/体積％）となるように溶かすと共に、純水を互いに異なる量で添加（１つにはＬｉＣｌのみを溶かして純水は添加しなかった）して、ＬｉＣｌを含有しかつ水分含有量（添加量）が互いに異なる４種類のドープ液（実施例１～４）を作製した。なお、ここでいうＬｉＣｌ濃度４．０w/v％とは、溶液１００ｍL中にＬｉＣｌが４ｇ含まれていることを意味する。また、それら実施例１～４のドープ液とは別に、前記で得られた絶乾状態のクモ糸タンパク質（粉体）を、予め所定量ずつ準備しておいた４つのＤＭＳＯ溶媒に、それぞれ濃度１５質量％の割合で溶かす一方、それら４つのクモ糸タンパク質が溶解したＤＭＳＯ溶媒のうちの３つに、下記表１に示すように純水のみを互いに異なる量で添加して、ＬｉＣｌを含有せずに水分含有量（添加量）が互いに異なる３種類のドープ液（比較例２～４）と水分もＬｉＣｌも含有しないドープ液（比較例１）を作製した。なお、それら実施例1～４及び比較例１～４の８種類のドープ液を作製する際には、シェイカーを使用して、クモ糸タンパク質を５時間掛けてＤＭＳＯ溶媒に溶解させた後、ゴミと泡を取り除いた。この処理はすべて相対湿度１．３％ＲＨ以下のドライルームで行った。保存も相対湿度１．３％ＲＨ以下のドライルームで行った。そして、それら実施例１～４のドープ液と比較例１～４のドープ液のそれぞれの粘度を、温度２５℃、で測定した。それらの結果を下記表１と図１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１及び図１から明らかなとおり、ＬｉＣｌを含有する実施例１～４のドープ液では、水分含有量が低いほど粘度が高く、水分含有量０質量％の実施例１の粘度が最も高くなっている。ＬｉＣｌを含まない比較例１～４のドープ液も、水分含有量が低いほど粘度が高くなっているものの、実施例１～４と比較例１～４との間で同じ水分含有量同士のものを比較した場合、前者の方が後者よりも粘度が高く、しかも、水分含有量の低下に伴う粘度の上昇率の大きさも、前者の方が、後者に比して同等以上となっている。このことから、ドープ液中の水分含有量を減らすことによって粘度を高めることができ、その上、ドープ液にＬｉＣｌを添加することによって、粘度をより高く維持し得ることが確認できた。なお、実施例１～４のドープ液を用いたときに安定した紡糸やキャスティングができることも確認した。
　また、実施例４と比較例１とを比較した場合、それらの粘度が互いに略同程度の大きさとなっている。これは、ドープ液中の水分含有量とＬｉＣｌ含有量とを共にゼロとすれば、水分含有量が３．０質量％でＬｉＣｌ含有量が４．０ｗ／ｖ％であるドープ液と粘度が同程度の大きさのドープ液が得られることを示している。このことから、所望の粘度を有するドープ液を製造する際には、ドープ液中の水分含有量を減らすことによって、ドープ液への無機塩の添加量をも減少させ得ることが確認できた。
　＜実験２＞
　この実験は、水分の有無及びＬｉＣｌ含有量の違いと粘度との関係を調べた。前述のようにして得られた絶乾状態のクモ糸タンパク質（粉体）を、予め所定量ずつ準備しておいた３つのＤＭＳＯ溶媒に濃度１５質量％の割合で溶かす一方、それら３つのクモ糸タンパク質を溶解したＤＭＳＯ溶媒に、下記表２に示すようにＬｉＣｌ（無機塩）を添加して、水分含有量がゼロでかつＬｉＣｌ含有量が互いに異なる３種類のドープ液（実施例５～７）を作製した。それら３種類のドープ液（実施例５～７）の作製は、相対湿度１．３％ＲＨ以下のドライルームで行った。保存も相対湿度１．３％ＲＨ以下のドライルームで行った。また、それらとは別に、前述のようにして得られた絶乾状態のクモ糸タンパク質（粉体）を、予め所定量ずつ準備しておいた３つのＤＭＳＯ溶媒に濃度１５質量％の割合で溶かす一方、それら３つのクモ糸タンパク質を溶解したＤＭＳＯ溶媒に、下記表２に示すように水分とＬｉＣｌ（無機塩）を添加して、水分含有量が３質量％でかつＬｉＣｌ含有量が互いに異なる３種類のドープ液（比較例５、実施例８及び９）を製造した。その後、作製された実施例５～９と比較例５の６種類のドープ液のそれぞれの粘度を、温度２５℃で測定した。それらの結果を下記表２と図２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２及び図２から明らかなとおり、ドープ液中の水分含有量を減らせば、ドープ液の粘度を高めることができ、また、ドープ液中に水分が混入しても、より多くのＬｉＣｌを添加すれば目的粘度のドープ液が得られることが確認できた。これは、ドープ液中の水分含有量や無機塩含有量を変えることによって、ドープ液の粘度を容易に所望の粘度に為し得ることを如実に示している。
　＜実験３＞
　この実験は、ドープ液のＨ２Ｏ／ＬｉＣｌのモル比と粘度の関係を温度別に調べた。前述のようにして得られた実施例８及び９と比較例５の３種類のドープ液を用い、それら３種類のドープ液の粘度を２５℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃の温度でそれぞれ測定した。結果は図３に示すとおりである。
　図３から明らかなように、Ｈ２Ｏ／ＬｉＣｌのモル比が２．５以下となるように制御すれば、ドープ液中のＬｉＣｌ含有量や水分含有量の変化による粘度の変動量をより大きく為すことができ、それによって、単に、ドープ液中のＬｉＣｌ含有量や水分含有量を変えるだけで、ドープ液の粘度を容易に所望の値と為すことができる。
　＜実験４＞
　この実験は、ドープ液のＨ２Ｏ／ＣａＣｌ２のモル比と粘度の関係を温度別に調べた。ＬｉＣｌの代わりにＣａＣｌ２を無機塩として用いる以外は、前記実施例８、９、及び比較例５の３種類のドープ液を作製する際と同様な方法により３種類のドープ液（実施例１０、比較例６、比較例７）を作製し、その後、３．０質量％の水分と１．０ｗ/ｖ%のＣａＣｌ２を含むドープ液（比較例６）と、３．０質量％の水分と４．０ｗ/ｖ%のＣａＣｌ２を含むドープ液（比較例７）と、３．０質量％の水分と８．０ｗ/ｖ%のＣａＣｌ２を含むドープ液（実施例１０）の３種類のドープ液の粘度を２５℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃の温度でそれぞれ測定した。結果は図４に示すとおりである。比較例６、比較例７及び実施例１０のドープ液のＨ２Ｏ／ＣａＣｌ２のモル比を下記表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図４から明らかなように、Ｈ２Ｏ／ＣａＣｌ２のモル比が５．０以下となるように制御すれば、ドープ液中のＣａＣｌ２含有量や水分含有量の変化による粘度の変動量をより大きく為すことができ、それによって、単に、ドープ液中のＣａＣｌ２含有量や水分含有量を変えるだけで、ドープ液の粘度を容易に所望の値と為すことができる。
　本発明の極性溶媒溶液は湿式紡糸、フィルムキャスト、ゲル、パーティクル、メッシュ体、各種成形物に有用である。
　配列番号１～４、１２、１３　　アミノ酸配列
　配列番号５～７　　塩基配列
　配列番号８～１１　プライマーシーケンス

Claims (17)

  1. 　ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液であって、
    　前記溶液中に無機塩が添加され、かつ前記溶液中の水分と無機塩のモル比の値が２．５×ｍ×ｎ（ｍは無機塩を形成する陽イオンの数であり、ｎは該陽イオンの電荷数である。）以下であることを特徴とする極性溶媒溶液。
  2. 　前記ポリアミノ酸が、ポリペプチドである請求項１に記載の極性溶媒溶液。
  3. 　前記溶液を１００質量％としたときの前記溶液中の水分含有量が０．６質量％以上、９．１質量％以下である請求項１又は２に記載の極性溶媒溶液。
  4. 　前記極性溶媒は、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)及びＮ－メチル－２－ピロリドン(ＮＭＰ)からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むものである請求項１～３の何れか１項に記載の極性溶媒溶液。
  5. 　前記ポリペプチドは、構造タンパク質である請求項２～４の何れか１項に記載の極性溶媒溶液。
  6. 　前記構造タンパク質は、結晶領域を含むものである請求項５に記載の極性溶媒溶液。
  7. 　前記ポリペプチドは、クモ糸タンパク質である請求項２～６の何れか１項に記載の極性溶媒溶液。
  8. 　前記無機塩は、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩及びチオシアン酸塩から選ばれる少なくとも一つである請求項１～７の何れか１項に記載の極性溶媒溶液。
  9. 　前記溶液を１００体積％としたときの前記溶液中の前記無機塩含有量が１ｗ／ｖ％以上、１５ｗ／ｖ％以下である請求項１～８の何れか１項に記載の極性溶媒溶液。
  10. 　ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液の製造方法であって、
    　前記溶液中に無機塩を添加し、かつ前記溶液中の水分の含有量と前記無機塩の含有量のうちの少なくとも何れか一方を変えることにより、前記溶液の粘度を調節することを特徴とする極性溶媒溶液の製造方法。
  11. 　ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液の製造方法であって、
    　前記溶液中に無機塩を添加し、かつ前記溶液中の水分の含有量を減らすことにより、前記溶液の粘度を増加させることを特徴とする極性溶媒溶液の製造方法。
  12. 　前記ポリアミノ酸は、ポリペプチドである請求項１０又は１１に記載の極性溶媒の製造方法。
  13. 　前記溶液中の水分と無機塩のモル比の値が２．５×ｍ×ｎ（ｍは無機塩を形成する陽イオンの数であり、ｎは該陽イオンの電荷数である。）以下となるようにした請求項１０～１２の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  14. 　前記溶液を１００質量％としたときの前記溶液中の水分含有量を０．６質量％以上、９．１質量％以下とするようにした請求項１０～１３の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  15. 　前記ポリアミノ酸を含む溶質を乾燥させた後、前記極性溶媒に溶解させることによって、前記溶液中の水分含有量を変えるようにした請求項１０～１４の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  16. 　前記溶液の製造及び／又は貯蔵の際に雰囲気の相対湿度を調整することによって、前記溶液中の水分含有量を変えるようにした請求項１０～１５の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  17. 前記溶液の製造及び貯蔵の際に雰囲気の相対湿度を１．３％ＲＨ以下に調整する請求項１６に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
     
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