JP5739992B2 - タンパク質繊維及びその製造方法 - Google Patents
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- D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
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Description
本発明は絹フィブロイン成分を含むタンパク質繊維及びその製造方法に関する。
フィブロイン繊維は再生絹繊維とも言われ、強度と伸びがある生分解性繊維として知られている。例えば特許文献１には絹フィブロインの溶媒としてヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を用いてドープ液を作製し、紡糸後、冷延伸して再生絹繊維を得ることが提案されている。特許文献２にはヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）溶媒中に絹フィブロインとヘマチンを加えてメタノール凝固液に押し出して紡糸し、冷延伸することが提案されている。
しかし、従来のフィブロイン繊維の応力はいまだ不足であり、さらに高い強度と適度な伸度を有する強靭な繊維が望まれていた。さらにクモ糸タンパク質に由来するポリペプチドと混合したタンパク質繊維も要望されていた。
本発明は、前記従来の問題を解決するため、応力が高く、適度な破断伸度があるタンパク質繊維及びその製造方法を提供する。
本発明のタンパク質繊維は、絹フィブロイン単独系又は前記絹フィブロインにクモ糸タンパク質との２成分系のタンパク質繊維であって、前記タンパク質繊維を１００質量％としたとき、絹フィブロインは１０〜１００質量％、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは０〜９０質量％であり、前記タンパク質繊維は応力４５０ＭＰａ以上８５９ＭＰａ以下であることを特徴とする。
本発明の別のタンパク質繊維は、絹フィブロイン単独系又は前記絹フィブロインにクモ糸タンパク質との２成分系のタンパク質繊維であって、前記タンパク質を１００質量％としたとき、絹フィブロインは１０〜１００質量％、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは０〜９０質量％であり、前記タンパク質を溶媒に溶解して紡糸液とし、前記紡糸液を凝固液に押し出して未延伸糸とする工程と、前記未延伸糸を温度３０〜９０℃、延伸倍率１．０５〜６倍で湯浴延伸する工程と、温度１７０℃以上、延伸倍率１．０５〜４倍で乾熱加熱延伸する工程を含み、前記タンパク質繊維は応力４５０ＭＰａ以上であることを特徴とする。
本発明の別のタンパク質繊維は、絹フィブロイン単独系又は前記絹フィブロインにクモ糸タンパク質との２成分系のタンパク質繊維であって、前記タンパク質を１００質量％としたとき、絹フィブロインは１０〜１００質量％、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは０〜９０質量％であり、前記タンパク質を溶媒に溶解して紡糸液とし、前記紡糸液を凝固液に押し出して未延伸糸とする工程と、前記未延伸糸を温度３０〜９０℃、延伸倍率１．０５〜６倍で湯浴延伸する工程と、温度１７０℃以上、延伸倍率１．０５〜４倍で乾熱加熱延伸する工程を含み、前記タンパク質繊維は応力４５０ＭＰａ以上であることを特徴とする。
本発明のタンパク質繊維の製造方法は、前記のタンパク質繊維を得るための製造方法であって、絹フィブロインを含むドープ液を湿式紡糸して未延伸糸とし、前記未延伸糸を少なくとも乾熱で加熱延伸することを特徴とする。
本発明は、応力が高く適度な破断伸度があるタンパク質繊維及びその製造方法を提供できる。すなわち、本発明によると、応力４５０ＭＰａ以上、破断伸度５％以上のタンパク質繊維を実現できる。応力が高く、適度な破断伸度があり、金属、樹脂、ゴムなどとの複合材料（強化繊維）にとって有利である。
（１）絹の説明
絹はカイコガ(Bombyx mori)の幼虫である蚕の作る繭から得られる繊維であり、図７Ａの家蚕繭糸の模式的断面図に示すように繭糸４０は２本のフィブロイン４１が外側のニカワ質（セリシン）４２で覆われる形で１本になっている。さらに詳しくは図７Ｂに示す家蚕繭糸の構造のように、フィブロイン４１は多数のフィブリル４３で構成され、フィブロイン４１の外側は４層のセリシン４２で覆われ、１本の繭糸４４が構成されている。実用的には精錬により外側のセリシン４２を溶解して取り除き、絹フィラメントとして衣料用途に使用されている。絹の比重は１．３３である。また、繊度は平均３．３ｄｅｃｉ ｔｅｘ、繊維長は１３００〜１５００ｍ程度が一般的である。繊度を平均としているのは、繭の外層部は太く、内側に行くほど細くなっており、全体としては不均一な繊度となっていることによる。
絹はカイコガ(Bombyx mori)の幼虫である蚕の作る繭から得られる繊維であり、図７Ａの家蚕繭糸の模式的断面図に示すように繭糸４０は２本のフィブロイン４１が外側のニカワ質（セリシン）４２で覆われる形で１本になっている。さらに詳しくは図７Ｂに示す家蚕繭糸の構造のように、フィブロイン４１は多数のフィブリル４３で構成され、フィブロイン４１の外側は４層のセリシン４２で覆われ、１本の繭糸４４が構成されている。実用的には精錬により外側のセリシン４２を溶解して取り除き、絹フィラメントとして衣料用途に使用されている。絹の比重は１．３３である。また、繊度は平均３．３ｄｅｃｉ ｔｅｘ、繊維長は１３００〜１５００ｍ程度が一般的である。繊度を平均としているのは、繭の外層部は太く、内側に行くほど細くなっており、全体としては不均一な繊度となっていることによる。
（２）絹フィブロイン
本発明で使用する絹フィブロインは、天然もしくは家蚕の繭または中古や廃棄のシルク生地を原料とし、絹フィブロインを覆うセリシンや、その他の脂肪分などを除去した絹フィブロインを精製し、絹フィブロイン凍結乾燥粉末としたものが好ましい。
本発明で使用する絹フィブロインは、天然もしくは家蚕の繭または中古や廃棄のシルク生地を原料とし、絹フィブロインを覆うセリシンや、その他の脂肪分などを除去した絹フィブロインを精製し、絹フィブロイン凍結乾燥粉末としたものが好ましい。
（３）クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド
本発明のタンパク質繊維は、絹フィブロインに加えてクモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含んでいてもよい。クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドとは、天然型クモ糸タンパク質に由来又は類似するものであればよく、特に限定されない。前記ポリペプチドは、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであることが好ましい。前記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ(Araneus diadematus)に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大吐糸管しおり糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。
本発明のタンパク質繊維は、絹フィブロインに加えてクモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含んでいてもよい。クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドとは、天然型クモ糸タンパク質に由来又は類似するものであればよく、特に限定されない。前記ポリペプチドは、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであることが好ましい。前記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ(Araneus diadematus)に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大吐糸管しおり糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。
（４）絹フィブロインとクモ糸タンパク質に由来するポリペプチドの混合割合
本発明のタンパク質繊維は、絹フィブロインが１０〜１００質量％、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドが０〜９０質量％であることが好ましい。さらに好ましくは、絹フィブロインが３０〜１００質量％、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドが０〜７０質量％である。前記の範囲であれば好ましい可紡性があり、両成分は剥離することなく親和性が良好であり、ハイブリッド繊維となり、応力が高く適度な破断伸度があるタンパク質繊維となる。
本発明のタンパク質繊維は、絹フィブロインが１０〜１００質量％、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドが０〜９０質量％であることが好ましい。さらに好ましくは、絹フィブロインが３０〜１００質量％、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドが０〜７０質量％である。前記の範囲であれば好ましい可紡性があり、両成分は剥離することなく親和性が良好であり、ハイブリッド繊維となり、応力が高く適度な破断伸度があるタンパク質繊維となる。
（５）紡糸液（ドープ液）
前記絹フィブロイン（凍結乾燥粉末）及びクモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（凍結乾燥粉末）の溶媒としては、ポリペプチドを溶解できるものであればどのようなものでも良い。例えばヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、尿素、グアニジン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化リチウム、塩化カルシウム、チオシアン酸リチウムなどを含む水溶液などを適切な濃度になるように加える。絹フィブロイン凍結粉末及びクモ糸タンパク質に由来するポリペプチド凍結乾燥粉末の合計濃度は４．２〜１５．８質量％が好ましい。ゴミと泡を取り除き、溶液粘度２，５００〜１５，０００ｃＰ（センチポイズ）の紡糸液（ドープ液）とする。
前記絹フィブロイン（凍結乾燥粉末）及びクモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（凍結乾燥粉末）の溶媒としては、ポリペプチドを溶解できるものであればどのようなものでも良い。例えばヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、尿素、グアニジン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化リチウム、塩化カルシウム、チオシアン酸リチウムなどを含む水溶液などを適切な濃度になるように加える。絹フィブロイン凍結粉末及びクモ糸タンパク質に由来するポリペプチド凍結乾燥粉末の合計濃度は４．２〜１５．８質量％が好ましい。ゴミと泡を取り除き、溶液粘度２，５００〜１５，０００ｃＰ（センチポイズ）の紡糸液（ドープ液）とする。
（６）紡糸工程
紡糸は湿式紡糸を採用する。これにより、ポリマーを溶解させた溶媒を除去し（脱溶媒ともいう）、未延伸糸を得る。湿式紡糸に使用する凝固液は、脱溶媒できる溶液であればどのようなものでも良い。溶媒がＨＦＩＰの場合、凝固液はメタノール、エタノール、２−プロパノールなどの炭素数１〜５の低級アルコールを使用するのが好ましい。凝固液の温度は０〜３０℃が好ましい。前記の範囲であれば紡糸は安定する。前記紡糸液を凝固液に押し出すことにより、未延伸糸が得られる。直径０．１〜０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプの場合、押し出し速度は１ホール当たり、０．２〜２．４ｍｌ／ｈが好ましい。この範囲であれば紡糸は安定する。さらに好ましい押し出し速度は１ホール当たり、０．２５〜１ｍｌ／ｈである。凝固液槽の長さは２００〜５００ｍｍ、未延伸糸の引き取り速度は１〜２０ｍ／ｍｉｎ、滞留時間は０．０５〜０．１５ｍｉｎが好ましい。この範囲であれば脱溶媒が効率よくできる。凝固液において延伸（前延伸）をしても良いが、低級アルコールの蒸発を考えると凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で引き取るのが好ましい。
紡糸は湿式紡糸を採用する。これにより、ポリマーを溶解させた溶媒を除去し（脱溶媒ともいう）、未延伸糸を得る。湿式紡糸に使用する凝固液は、脱溶媒できる溶液であればどのようなものでも良い。溶媒がＨＦＩＰの場合、凝固液はメタノール、エタノール、２−プロパノールなどの炭素数１〜５の低級アルコールを使用するのが好ましい。凝固液の温度は０〜３０℃が好ましい。前記の範囲であれば紡糸は安定する。前記紡糸液を凝固液に押し出すことにより、未延伸糸が得られる。直径０．１〜０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプの場合、押し出し速度は１ホール当たり、０．２〜２．４ｍｌ／ｈが好ましい。この範囲であれば紡糸は安定する。さらに好ましい押し出し速度は１ホール当たり、０．２５〜１ｍｌ／ｈである。凝固液槽の長さは２００〜５００ｍｍ、未延伸糸の引き取り速度は１〜２０ｍ／ｍｉｎ、滞留時間は０．０５〜０．１５ｍｉｎが好ましい。この範囲であれば脱溶媒が効率よくできる。凝固液において延伸（前延伸）をしても良いが、低級アルコールの蒸発を考えると凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で引き取るのが好ましい。
（７）延伸工程
延伸工程は、未延伸糸を延伸温度１７０℃〜２３０℃の乾熱で１．０５〜４倍延伸することが好ましい。本発明は前記のような高温乾熱加熱することにより、分子は高度に配向され、高強度の延伸糸が得られる。好ましい延伸温度は１８０℃〜２２５℃であり、さらに好ましくは１９０℃〜２２０℃である。また好ましい延伸倍率は２．７〜３．９倍であり、さらに好ましくは２．９〜３．５倍である。乾熱は一例として電気管状炉または熱板を使用する。
延伸工程は、未延伸糸を延伸温度１７０℃〜２３０℃の乾熱で１．０５〜４倍延伸することが好ましい。本発明は前記のような高温乾熱加熱することにより、分子は高度に配向され、高強度の延伸糸が得られる。好ましい延伸温度は１８０℃〜２２５℃であり、さらに好ましくは１９０℃〜２２０℃である。また好ましい延伸倍率は２．７〜３．９倍であり、さらに好ましくは２．９〜３．５倍である。乾熱は一例として電気管状炉または熱板を使用する。
（ａ）連続工程
紡糸から延伸までは連続工程としても良いし、任意の工程に分けて実施しても良い。図１は本発明の一実施例における製造工程を示す説明図である。図１は連続工程を示している。紡糸延伸装置１０は、押し出し工程１と、未延伸糸製造工程２と、乾熱延伸工程３を含む。紡糸液６は貯槽７に貯蔵され、ギアポンプ８から口金９に押し出す。ラボスケールにおいては、紡糸液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出しても良い。押し出された紡糸液は、エアギャップ１３を有するか又は直接、凝固液槽１２の凝固液１１内に供給し、溶媒を除去する。次いで乾熱延伸装置１７に供給し、糸道１８内で延伸し、巻糸体４とする。延伸は供給ニップローラ１５と引き取りニップローラ１６との速度比によって決まる。１４ａ〜１４ｆは糸ガイドである。
紡糸から延伸までは連続工程としても良いし、任意の工程に分けて実施しても良い。図１は本発明の一実施例における製造工程を示す説明図である。図１は連続工程を示している。紡糸延伸装置１０は、押し出し工程１と、未延伸糸製造工程２と、乾熱延伸工程３を含む。紡糸液６は貯槽７に貯蔵され、ギアポンプ８から口金９に押し出す。ラボスケールにおいては、紡糸液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出しても良い。押し出された紡糸液は、エアギャップ１３を有するか又は直接、凝固液槽１２の凝固液１１内に供給し、溶媒を除去する。次いで乾熱延伸装置１７に供給し、糸道１８内で延伸し、巻糸体４とする。延伸は供給ニップローラ１５と引き取りニップローラ１６との速度比によって決まる。１４ａ〜１４ｆは糸ガイドである。
（ｂ）分離工程
図２Ａ−Ｂは本発明の別の実施例における製造工程を分離した例の説明図である。図２Ａは紡糸工程２０、図２Ｂは延伸工程３０を示す。それぞれの工程ごとに糸を巻き取るかまたは巻き取らずに容器に溜めてもよい。紡糸工程２０においては、マイクロシリンジ２１内に紡糸液２２を入れておき、シリンジポンプを用いて矢印Ｐ方向に移動させ、ノズル２３から紡糸液２２を押し出し、凝固液槽２４内の凝固液２５に供給し、未延伸糸の巻糸体２６とする。次に延伸工程３０においては、巻糸体２６から未延伸糸を引き出し、乾熱延伸装置２９に供給し、糸道３１内で延伸する。延伸は供給ニップローラ２７と引き取りニップローラ２８との速度比によって決まる。次いで延伸糸を巻糸体３２に巻き取る。これにより本発明のフィブロイン繊維延伸糸を得る。
図２Ａ−Ｂは本発明の別の実施例における製造工程を分離した例の説明図である。図２Ａは紡糸工程２０、図２Ｂは延伸工程３０を示す。それぞれの工程ごとに糸を巻き取るかまたは巻き取らずに容器に溜めてもよい。紡糸工程２０においては、マイクロシリンジ２１内に紡糸液２２を入れておき、シリンジポンプを用いて矢印Ｐ方向に移動させ、ノズル２３から紡糸液２２を押し出し、凝固液槽２４内の凝固液２５に供給し、未延伸糸の巻糸体２６とする。次に延伸工程３０においては、巻糸体２６から未延伸糸を引き出し、乾熱延伸装置２９に供給し、糸道３１内で延伸する。延伸は供給ニップローラ２７と引き取りニップローラ２８との速度比によって決まる。次いで延伸糸を巻糸体３２に巻き取る。これにより本発明のフィブロイン繊維延伸糸を得る。
（ｃ）湯浴延伸
本発明方法においては、乾熱加熱延伸の前に予め湯浴延伸をしておくこともできる。湯浴延伸により、さらに分子配向を進めることができる。湯浴延伸は、絹フィブロインとクモ糸タンパク質との混合（ハイブリッド）にも有用である。湯浴延伸の条件は３０〜９０℃、延伸倍率１．０５〜６倍が好ましい。
本発明方法においては、乾熱加熱延伸の前に予め湯浴延伸をしておくこともできる。湯浴延伸により、さらに分子配向を進めることができる。湯浴延伸は、絹フィブロインとクモ糸タンパク質との混合（ハイブリッド）にも有用である。湯浴延伸の条件は３０〜９０℃、延伸倍率１．０５〜６倍が好ましい。
（８）繊維物性
以上のようにしてフィブロイン繊維を得る。得られたフィブロイン繊維は応力４５０ＭＰａ以上、破断伸度５％以上である。天然の絹繊維の応力は約４１０ＭＰａであり、前記特許文献２の図３に開示されている応力は約３９０ＭＰａであることから、本発明のフィブロイン糸の応力は高い。タフネスは繊維の強伸度を測定する際の応力−ひずみ曲線（Ｓ−Ｓカーブ）の積分値から算出される。図３は本発明の一実施例で得られた繊維のタフネスの説明図であり、応力−変位（ひずみ）曲線とタフネス（斜線部）を示す。応力と破断伸度の両方が高いとタフネスも高いことがわかる。
以上のようにしてフィブロイン繊維を得る。得られたフィブロイン繊維は応力４５０ＭＰａ以上、破断伸度５％以上である。天然の絹繊維の応力は約４１０ＭＰａであり、前記特許文献２の図３に開示されている応力は約３９０ＭＰａであることから、本発明のフィブロイン糸の応力は高い。タフネスは繊維の強伸度を測定する際の応力−ひずみ曲線（Ｓ−Ｓカーブ）の積分値から算出される。図３は本発明の一実施例で得られた繊維のタフネスの説明図であり、応力−変位（ひずみ）曲線とタフネス（斜線部）を示す。応力と破断伸度の両方が高いとタフネスも高いことがわかる。
本発明の架橋フィブロイン繊維は、好ましい応力は６００ＭＰａ以上であり、より好ましくは８００ＭＰａ以上である。架橋繊維の伸度は低くなるが応力は驚くほど高くなる。非架橋繊維の好ましい破断伸度は９％以上であり、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上である。
本発明のフィブロイン繊維は直径が５〜１００μｍの範囲であることが好ましい。前記の範囲であれば安定して延伸繊維を得ることができる。より好ましい繊維直径は７〜６０μｍの範囲、さらに好ましくは１０〜４０μｍの範囲である。繊度(単位：ｔｅｘまたはｄｅｃｉ ｔｅｘ）を算出する場合は、繊維断面が丸の場合は繊維直径から計算される断面積と比重と長さから算出する。なお、本発明の繊維は湿式紡糸により得られるため、断面が円形とは限らず様々な形状を含むため、繊維直径（平均直径）は断面を円形と想定した場合の平均径を言う。
（９）架橋処理
本発明のフィブロイン繊維（延伸糸）又はその原料の未延伸糸は、フィブロイン繊維内のポリペプチド分子間について化学的に架橋させてもよい。架橋方法は、プラスチックや繊維材料などの高分子材料や、コラーゲンなどのタンパク質材料を重合又は架橋させるための公知の方法が適用できる。例えば、加熱、紫外線、電子線などによる縮合反応、または、公知の縮合剤などを用いて行なっても良い。ポリペプチドにおいて架橋に使える官能基は例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシ基などがあるが、これに限定されるものではない。ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。架橋は真空加熱下で脱水縮合反応を行なっても良いし、カルボジイミドなどの脱水縮合剤により架橋させても良い。また、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いても良い。また、トランスグルタミナーゼなどの酵素により架橋することもできる。一例として、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどで架橋反応させても良い。カルボジイミドは一般式Ｒ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ２（但し、Ｒ１，Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。）で示され、具体的化合物は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドなどがある。この中でもＥＤＣ、ＤＩＣはペプチド鎖のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。架橋処理は、フィブロイン繊維に架橋剤を付与して真空加熱乾燥で架橋させても良い。カルボジイミドは１００％品を繊維に付与しても良いし、炭素数１〜５の低級アルコールや緩衝液などで希釈して０．００５〜１０質量％の濃度で繊維に付与しても良い。処理条件は、温度２０〜４５℃で３〜４８時間浸漬させておくのが好ましい。カルボジイミドによる架橋処理により、図３のＥｘ．２に示すとおり、フィブロイン延伸糸はさらに高い応力となる。架橋の方法は、延伸後の繊維を７０質量％エタノールもしくはリン酸バッファーにカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を加えた液中に浸漬させ、２０〜４５℃で６〜４８時間反応させる。反応後、１００質量％メタノールで１〜１０分程洗浄する。
本発明のフィブロイン繊維（延伸糸）又はその原料の未延伸糸は、フィブロイン繊維内のポリペプチド分子間について化学的に架橋させてもよい。架橋方法は、プラスチックや繊維材料などの高分子材料や、コラーゲンなどのタンパク質材料を重合又は架橋させるための公知の方法が適用できる。例えば、加熱、紫外線、電子線などによる縮合反応、または、公知の縮合剤などを用いて行なっても良い。ポリペプチドにおいて架橋に使える官能基は例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシ基などがあるが、これに限定されるものではない。ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。架橋は真空加熱下で脱水縮合反応を行なっても良いし、カルボジイミドなどの脱水縮合剤により架橋させても良い。また、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いても良い。また、トランスグルタミナーゼなどの酵素により架橋することもできる。一例として、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどで架橋反応させても良い。カルボジイミドは一般式Ｒ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ２（但し、Ｒ１，Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。）で示され、具体的化合物は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドなどがある。この中でもＥＤＣ、ＤＩＣはペプチド鎖のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。架橋処理は、フィブロイン繊維に架橋剤を付与して真空加熱乾燥で架橋させても良い。カルボジイミドは１００％品を繊維に付与しても良いし、炭素数１〜５の低級アルコールや緩衝液などで希釈して０．００５〜１０質量％の濃度で繊維に付与しても良い。処理条件は、温度２０〜４５℃で３〜４８時間浸漬させておくのが好ましい。カルボジイミドによる架橋処理により、図３のＥｘ．２に示すとおり、フィブロイン延伸糸はさらに高い応力となる。架橋の方法は、延伸後の繊維を７０質量％エタノールもしくはリン酸バッファーにカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を加えた液中に浸漬させ、２０〜４５℃で６〜４８時間反応させる。反応後、１００質量％メタノールで１〜１０分程洗浄する。
以下実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
１．絹フィブロイン原料の準備
（１）シルク生地を約２ｍｍ×１０ｍｍ程度に裁断し、沸騰した０．５質量％マルセル石鹸水（マルセル石鹸はおろし金で細かくしたものを使用）で約３０分間煮た。
（２）その後、沸騰したお湯で３０分間煮た。
（３）手順１と２をさらに２回繰り返した（計３回）。
（４）最後に沸騰したお湯で３０分間煮た。この操作で絹フィブロインを覆うセリシンやその他の添加剤などを完全に除去した。
（５）湿った絹フィブロインを３７℃環境で一晩乾燥させた。
（６）乾燥後の絹の重さを測り、１０w/v％となるように、ＬｉＢｒ水溶液（９ｍｏｌ／Ｌ）を加え、４０℃環境で２時間溶解させた。
（７）その水溶液をセルロース透析膜(VISKASESELES COAP製のSeamless Cellulose Tubing、36/32)に入れ、蒸留水を用いて３〜４日間透析した。
（８）透析後の回収溶液を、２０℃、１５，０００ｒｐｍ、１時間で遠心し、解け残りやゴミなどを除去した。
（９）更に濃度が２質量％以下になるようにＭｉｌｌｉＱで希釈した。
（１０）希釈後、ADVANTEC社の１５０μｍフィルターに通し、細かなゴミを完全に除去した。
（１１）絹フィブロイン水溶液を−８０℃環境で凍結させ、一晩かけて凍結乾燥した。十分に水分が抜けたことを確認し、絹フィブロイン粉末として保存した。このようにして絹フィブロイン凍結乾燥粉末を得た。
１．絹フィブロイン原料の準備
（１）シルク生地を約２ｍｍ×１０ｍｍ程度に裁断し、沸騰した０．５質量％マルセル石鹸水（マルセル石鹸はおろし金で細かくしたものを使用）で約３０分間煮た。
（２）その後、沸騰したお湯で３０分間煮た。
（３）手順１と２をさらに２回繰り返した（計３回）。
（４）最後に沸騰したお湯で３０分間煮た。この操作で絹フィブロインを覆うセリシンやその他の添加剤などを完全に除去した。
（５）湿った絹フィブロインを３７℃環境で一晩乾燥させた。
（６）乾燥後の絹の重さを測り、１０w/v％となるように、ＬｉＢｒ水溶液（９ｍｏｌ／Ｌ）を加え、４０℃環境で２時間溶解させた。
（７）その水溶液をセルロース透析膜(VISKASESELES COAP製のSeamless Cellulose Tubing、36/32)に入れ、蒸留水を用いて３〜４日間透析した。
（８）透析後の回収溶液を、２０℃、１５，０００ｒｐｍ、１時間で遠心し、解け残りやゴミなどを除去した。
（９）更に濃度が２質量％以下になるようにＭｉｌｌｉＱで希釈した。
（１０）希釈後、ADVANTEC社の１５０μｍフィルターに通し、細かなゴミを完全に除去した。
（１１）絹フィブロイン水溶液を−８０℃環境で凍結させ、一晩かけて凍結乾燥した。十分に水分が抜けたことを確認し、絹フィブロイン粉末として保存した。このようにして絹フィブロイン凍結乾燥粉末を得た。
２．紡糸液（ドープ液）の調整
上記で得られた絹フィブロイン凍結乾燥粉末を測り取り、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を適切な濃度になるように加えた。絹フィブロイン凍結乾燥粉末の濃度を５．９質量％とした。次いでローテーターで１６時間溶解した後、ゴミと泡を取り除き、紡糸液（ドープ液）とした。溶液粘度は４，５００ｃＰ（センチポイズ）であった。
上記で得られた絹フィブロイン凍結乾燥粉末を測り取り、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を適切な濃度になるように加えた。絹フィブロイン凍結乾燥粉末の濃度を５．９質量％とした。次いでローテーターで１６時間溶解した後、ゴミと泡を取り除き、紡糸液（ドープ液）とした。溶液粘度は４，５００ｃＰ（センチポイズ）であった。
３．紡糸工程
紡糸工程から延伸工程は図２に示す方法を用いた。まず、紡糸液（ドープ液）をシリンダーに充填し、０．５７ｍｍ径のノズルからシリンジポンプを用い１００質量％メタノール凝固液中で未延伸糸を作製した。押し出しスピードは０．２〜２．４ｍｌ／ｈがよかった。本実施例では押し出し速度を０．６ｍｌ／ｈ、凝固液槽の長さは４００ｍｍ、巻き取り速度を２ｍ／ｍｉｎとした。
紡糸工程から延伸工程は図２に示す方法を用いた。まず、紡糸液（ドープ液）をシリンダーに充填し、０．５７ｍｍ径のノズルからシリンジポンプを用い１００質量％メタノール凝固液中で未延伸糸を作製した。押し出しスピードは０．２〜２．４ｍｌ／ｈがよかった。本実施例では押し出し速度を０．６ｍｌ／ｈ、凝固液槽の長さは４００ｍｍ、巻き取り速度を２ｍ／ｍｉｎとした。
４．延伸工程
前記で得られた未延伸糸を、供給速度０．６ｍ／ｍｉｎ、２２０℃の電気管状炉内で３．０５倍に延伸し、巻き取り速度は１.８３ｍ／ｍｉｎとした。電気管状炉の長さは３００ｍｍとした。
前記で得られた未延伸糸を、供給速度０．６ｍ／ｍｉｎ、２２０℃の電気管状炉内で３．０５倍に延伸し、巻き取り速度は１.８３ｍ／ｍｉｎとした。電気管状炉の長さは３００ｍｍとした。
５．物性測定
（ａ）走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で表面構造を観察した。繊維の長さ方向に沿って筋が見えた。図５にＳＥＭの表面観察写真、図６に同断面観察写真を示した。
（ｂ）光学顕微鏡を用いて繊維の直径を求めた。
（ｃ）温度２５℃、相対湿度６０％の雰囲気温度で引張り試験機（島津社製小型卓上試験機ＥＺ−Ｓ）を用いて繊維の強度（応力）、初期弾性率（２０点の最大傾きで測定した。具体的には、５０ｍｓｅｃ間隔で測定し、傾きの計算を２０点間隔で行ったときの最大傾きを初期弾性率とした。）、伸度（破断点変位、変位）を測定し、下記式によりタフネスを算出した。サンプルは厚紙で作製した型枠に貼り付け、つかみ具間距離は２０ｍｍ、引張り速度は１０ｍｍ／ｍｉｎで行った。ロードセル容量１Ｎ、つかみ冶具はクリップ式とした。測定値はサンプル数ｎ＝５の平均値とした。タフネスの算出式は次のとおりとした。
タフネス＝［Ｅ／（ｒ２×π×Ｌ）×１０００］（単位：ＭＪ／ｍ３）
但し、
Ｅ 破壊エネルギー（単位：Ｊ）
ｒ 繊維の半径（単位：ｍｍ）
π 円周率
Ｌ 引張り試験測定時のつかみ具間距離：２０ｍｍ
（ｄ）繊維の比重測定は一般財団法人カケンテストセンターに外注分析を依頼し、JIS L 1015 浮沈法に準じて測定した。実施例１品の比重は１．３６であった。
（ａ）走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で表面構造を観察した。繊維の長さ方向に沿って筋が見えた。図５にＳＥＭの表面観察写真、図６に同断面観察写真を示した。
（ｂ）光学顕微鏡を用いて繊維の直径を求めた。
（ｃ）温度２５℃、相対湿度６０％の雰囲気温度で引張り試験機（島津社製小型卓上試験機ＥＺ−Ｓ）を用いて繊維の強度（応力）、初期弾性率（２０点の最大傾きで測定した。具体的には、５０ｍｓｅｃ間隔で測定し、傾きの計算を２０点間隔で行ったときの最大傾きを初期弾性率とした。）、伸度（破断点変位、変位）を測定し、下記式によりタフネスを算出した。サンプルは厚紙で作製した型枠に貼り付け、つかみ具間距離は２０ｍｍ、引張り速度は１０ｍｍ／ｍｉｎで行った。ロードセル容量１Ｎ、つかみ冶具はクリップ式とした。測定値はサンプル数ｎ＝５の平均値とした。タフネスの算出式は次のとおりとした。
タフネス＝［Ｅ／（ｒ２×π×Ｌ）×１０００］（単位：ＭＪ／ｍ３）
但し、
Ｅ 破壊エネルギー（単位：Ｊ）
ｒ 繊維の半径（単位：ｍｍ）
π 円周率
Ｌ 引張り試験測定時のつかみ具間距離：２０ｍｍ
（ｄ）繊維の比重測定は一般財団法人カケンテストセンターに外注分析を依頼し、JIS L 1015 浮沈法に準じて測定した。実施例１品の比重は１．３６であった。
実施例１で得られた延伸繊維の応力−変位（ひずみ）曲線を図３のＥｘ．１に示す。各種物性値を下記にまとめて示す。
応力：４７４．２ＭＰａ
伸び：２１．３％
繊維直径：３５．１μｍ
破壊エネルギー：０．００１６４Ｊ
タフネス：８４．８ＭＪ／ｍ３
初期弾性率：１１．９ＧＰａ
応力：４７４．２ＭＰａ
伸び：２１．３％
繊維直径：３５．１μｍ
破壊エネルギー：０．００１６４Ｊ
タフネス：８４．８ＭＪ／ｍ３
初期弾性率：１１．９ＧＰａ
（実施例２）
本実施例は、延伸後の繊維を後架橋させた例である。カルボジイミドはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を使用した。実施例１で得られた延伸後繊維を２０ｍｌの７０質量％エタノールと、２００μｌのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（液体カルボジイミド）と、４ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を混和した溶液内に浸漬させ、２５℃で６時間反応させた。その後１００質量％メタノールで１０秒間洗浄し、８時間以上乾燥させた。得られた延伸繊維の応力−変位（ひずみ）曲線を図３のＥｘ．２に示す。各種物性値を下記にまとめて示す。
応力：８５８．９ＭＰａ
伸び：９．４％
繊維直径：２８．７μｍ
破壊エネルギー：０．０００７０Ｊ
タフネス：５４．１ＭＪ／ｍ３
初期弾性率：１８．３ＧＰａ
本実施例は、延伸後の繊維を後架橋させた例である。カルボジイミドはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を使用した。実施例１で得られた延伸後繊維を２０ｍｌの７０質量％エタノールと、２００μｌのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（液体カルボジイミド）と、４ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を混和した溶液内に浸漬させ、２５℃で６時間反応させた。その後１００質量％メタノールで１０秒間洗浄し、８時間以上乾燥させた。得られた延伸繊維の応力−変位（ひずみ）曲線を図３のＥｘ．２に示す。各種物性値を下記にまとめて示す。
応力：８５８．９ＭＰａ
伸び：９．４％
繊維直径：２８．７μｍ
破壊エネルギー：０．０００７０Ｊ
タフネス：５４．１ＭＪ／ｍ３
初期弾性率：１８．３ＧＰａ
以上から明らかなとおり、本発明の架橋後の実施例品はさらに応力が高いフィブロイン繊維であることが確認できた。
（実施例３）
応力：６１３．２ＭＰａ
伸び：１２．３％
繊維直径：２６．６μｍ
破壊エネルギー：０．０００５０Ｊ
タフネス：４５．０ＭＪ／ｍ３
初期弾性率：１１．７ＧＰａ
応力：６１３．２ＭＰａ
伸び：１２．３％
繊維直径：２６．６μｍ
破壊エネルギー：０．０００５０Ｊ
タフネス：４５．０ＭＪ／ｍ３
初期弾性率：１１．７ＧＰａ
実施例１〜３の繊維の応力と、天然絹繊維の応力を比較して表１に示す。
表１から明らかなとおり、本発明の実施例で得られた繊維の応力は高いことが確認できた。
（実施例４〜７）
１．クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドの準備
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成受託した。その結果、配列番号５で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。
１．クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドの準備
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成受託した。その結果、配列番号５で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。
（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号８）とＲｅｐ Ｘｂａ Ｉプライマー（配列番号９）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａ Ｉ Ｒｅｐプライマー（配列番号１０）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１１）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅ Ｉ、Ｘｂａ Ｉで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６ ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号６に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号３で示すとおりである。
ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号８）とＲｅｐ Ｘｂａ Ｉプライマー（配列番号９）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａ Ｉ Ｒｅｐプライマー（配列番号１０）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１１）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅ Ｉ、Ｘｂａ Ｉで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅ Ｉ及びＥｃｏＲ Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６ ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号６に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号３で示すとおりである。
（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号３）における第１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号７に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号１で示すとおりである。
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号３）における第１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号７に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号１で示すとおりである。
＜タンパク質の発現＞
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約１０１．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約１０１．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。
＜精製＞
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を７．５ＭＵｒｅａ ＤＢ緩衝液（７．５Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で溶解し、スターラーで撹拌した後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質（約１０１．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を７．５ＭＵｒｅａ ＤＢ緩衝液（７．５Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で溶解し、スターラーで撹拌した後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質（約１０１．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。
２．紡糸液（ドープ液）の調整
実施例１と同様にしてドープ液を作成した。ドープ液を調整する際に、絹フィブロインとクモ糸タンパク質を混合した。
実施例１と同様にしてドープ液を作成した。ドープ液を調整する際に、絹フィブロインとクモ糸タンパク質を混合した。
３．延伸条件と結果
延伸は湯浴延伸と乾熱延伸をこの順番に行った。湯浴延伸は凝固工程の後に連続して行った。実施例４〜７における絹フィブロインとクモ糸タンパク質の質量混合割合（絹：クモ質量割合）、延伸工程の条件を表２（湯浴延伸）及び表３（乾熱延伸）に示す。参考のため、実施例１の条件も併記する。また、結果を表４に示す。参考のため、実施例１〜３の結果も併記する。
延伸は湯浴延伸と乾熱延伸をこの順番に行った。湯浴延伸は凝固工程の後に連続して行った。実施例４〜７における絹フィブロインとクモ糸タンパク質の質量混合割合（絹：クモ質量割合）、延伸工程の条件を表２（湯浴延伸）及び表３（乾熱延伸）に示す。参考のため、実施例１の条件も併記する。また、結果を表４に示す。参考のため、実施例１〜３の結果も併記する。
表２〜４の結果から、絹フィブロインとクモ糸タンパク質を混合しても応力が高い繊維が得られたことがわかる。
本発明のタンパク質繊維は、樹脂や金属の強化繊維、複合材料、射出成形などに好適に使用できる。また、その用途は、自動車などの輸送機器部材、タイヤの補強繊維などに適用できる。さらに、釣り糸、テニスやバドミントンのガット、バイオリンの絃、バイオリンの弓、人造毛髪などにも適用できる。形態としては、糸、綿、織物、編物、組み物、不織布などに応用できる。
１ 押し出し工程
２，２０ 未延伸糸製造工程
３，３０ 延伸工程
４，２６，３２ 巻糸体
６，２２ 紡糸液
７ 貯槽
８ ギアポンプ
９ 口金
１０ 紡糸延伸装置
１１，２５ 凝固液
１２，２４ 凝固液槽
１５，２７ 供給ニップローラ
１６，２８ 引き取りニップローラ
１７，２９ 乾熱延伸装置
１３ エアギャップ
１４ａ〜１４ｆ 糸ガイド
１８，３１ 糸道
２１ シリンジ
２３ ノズル
４０ ２本の繭糸
４１ フィブロイン
４２ セリシン
４３ フィブリル
４４ １本の繭糸
２，２０ 未延伸糸製造工程
３，３０ 延伸工程
４，２６，３２ 巻糸体
６，２２ 紡糸液
７ 貯槽
８ ギアポンプ
９ 口金
１０ 紡糸延伸装置
１１，２５ 凝固液
１２，２４ 凝固液槽
１５，２７ 供給ニップローラ
１６，２８ 引き取りニップローラ
１７，２９ 乾熱延伸装置
１３ エアギャップ
１４ａ〜１４ｆ 糸ガイド
１８，３１ 糸道
２１ シリンジ
２３ ノズル
４０ ２本の繭糸
４１ フィブロイン
４２ セリシン
４３ フィブリル
４４ １本の繭糸
配列番号１〜４ アミノ酸配列
配列番号５〜７ 塩基配列
配列番号８〜１１ プライマーシーケンス
配列番号５〜７ 塩基配列
配列番号８〜１１ プライマーシーケンス
Claims (11)
- 絹フィブロイン単独系又は前記絹フィブロインにクモ糸タンパク質との２成分系のタンパク質繊維であって、
前記タンパク質繊維を１００質量％としたとき、絹フィブロインは１０〜１００質量％、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは０〜９０質量％であり、
前記タンパク質繊維は応力４５０ＭＰａ以上８５９ＭＰａ以下であることを特徴とするタンパク質繊維。 - 絹フィブロイン単独系又は前記絹フィブロインにクモ糸タンパク質との２成分系のタンパク質繊維であって、
前記タンパク質を１００質量％としたとき、絹フィブロインは１０〜１００質量％、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは０〜９０質量％であり、
前記タンパク質を溶媒に溶解して紡糸液とし、前記紡糸液を凝固液に押し出して未延伸糸とする工程と、
前記未延伸糸を温度３０〜９０℃、延伸倍率１．０５〜６倍で湯浴延伸する工程と、
温度１７０℃〜２３０℃、延伸倍率１．０５〜４倍で乾熱加熱延伸する工程を含み、
前記タンパク質繊維は応力４５０ＭＰａ以上であることを特徴とするタンパク質繊維。 - 前記タンパク質繊維は、さらに前記繊維に含まれるポリペプチド分子間の一部において化学的に架橋されている請求項１又は２に記載のタンパク質繊維。
- 前記タンパク質繊維の応力は５００ＭＰａ以上である請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質繊維。
- 前記タンパク質繊維の直径が５〜１００μｍの範囲である請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質繊維。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質繊維を得るための製造方法であって、
絹フィブロインを含むドープ液を湿式紡糸して未延伸糸とし、前記未延伸糸を少なくとも乾熱で加熱延伸することを特徴とするタンパク質繊維の製造方法。 - 前記乾熱加熱延伸の条件が、１７０℃以上、延伸倍率１．０５〜４倍である請求項６に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記乾熱加熱延伸の前に、予め湯浴延伸をしておく請求項６又は７に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記湯浴延伸の条件が、３０〜９０℃、延伸倍率１．０５〜６倍である請求項８に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記加熱延伸後、さらにカルボジイミド及びグルタルアルデヒドから選ばれる少なくとも一つの架橋剤を反応させて架橋する請求項６〜９のいずれか１項に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記タンパク質繊維の未延伸糸をカルボジイミド及びグルタルアルデヒドから選ばれる少なくとも一つの架橋剤を反応させて架橋する請求項６〜９のいずれか１項に記載のタンパク質繊維の製造方法。
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