JP5584932B2 - タンパク質繊維の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)極性溶媒の選択
本発明者らは、実施例で具体的に説明するように、絹フィブロインを含むタンパク質成分を溶媒に溶解させたタンパク質溶液として、どのような溶媒が適切かを検討した。実施例で説明するように、主として極性溶媒を選んで溶解実験をした。その結果、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N−ジメチルアセトアミド(DMA)及びN−メチル−2−ピロリドン(NMP)から選ばれる少なくとも一つの極性溶媒に無機塩を含む溶媒であれば、選択的に溶解度が高く、高温溶解が可能であることがわかった。タンパク質溶液を100質量%としたとき、媒質の濃度(溶解度)は3質量%以上であることが好ましく、より好ましくは5質量%以上であり、さらに好ましくは6質量%以上である。また、タンパク質溶液を100質量%としたとき、媒質の濃度(溶解度)は45質量%以下であることが好ましく、より好ましくは30質量%以下であり、さらに好ましくは25質量%以下である。DMSOは融点18.4℃、沸点189℃、DMFは融点−61℃、沸点153℃であり、従来法で使用されているヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)の沸点59℃、ヘキサフルオロアセトン(HFAc)の沸点−26.5℃に比べると、沸点ははるかに高い。また、前記極性溶媒は、一般産業分野においてもアクリル繊維の重合、紡糸液として使用され、ポリイミドの重合溶媒や希釈溶媒としても使用されていることから、コストも安く、安全性も確認されている物質である。
前記極性溶媒には溶解促進剤として無機塩を加える。無機塩としては、アルカリ金属ハロゲン化物(例えばLiCl,LiBrなど)、アルカリ土類金属ハロゲン化物(例えばCaCl2)、アルカリ土類金属硝酸塩(例えばCa(NO3)2など)、チオシアン酸塩(例えばNaSCNなど)から選ばれる少なくとも一つである。溶媒を100質量%としたとき、無機塩の割合は0.1〜20質量%の範囲が好ましい。
溶媒は、さらにアルコール及び/又は水を含んでも良い。溶媒を100質量%としたとき、前記極性溶媒と無機塩の割合が20質量%以上100質量%以下であり、残余はアルコールを含んでも良い。前記においてアルコールとは炭素数1〜6の低級アルコールが好ましい。さらに好ましくは、メタノール、エタノール又は2−プロパノールである。
タンパク質成分は絹フィブロイン100質量%でもよいし、絹フィブロインとその他のポリペプチドの混合物であっても良い。絹フィブロイン以外のポリペプチドとしては、応力や破断伸度等の特性に優れるクモ糸タンパク質に由来するポリペプチドが好ましい。すなわち、前記タンパク質成分を100質量%としたとき、質量比で絹フィブロイン:クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドが100:0〜10:90であるのが好ましい。前記の範囲であれば好ましい可紡性があり、両成分は剥離することなく親和性が良好であり、ハイブリッド繊維となり、応力が高く適度な破断伸度があるタンパク質繊維となる。
タンパク質を含む溶液は、ドープ液として用いることができる。ドープ液は例えば湿式紡糸、エレクトロンスピニング、キャストフィルム液などに有用である。ドープ液は、タンパク質成分に前記溶媒を加え、紡糸できる粘度に調整して作製する。溶媒は、前記極性溶媒と無機塩を含む。或いは、溶媒は、前記極性溶媒と無機塩に加え、前記アルコール及び/又は水を含んでも良い。例えば溶液粘度を100〜10,000cP(センチポイズ)とする。溶液粘度の測定方法は、例えば京都電子工業社製の商品名“EMS粘度計”を使用して測定する。なお、本発明のポリペプチドの溶液は、不可避的な含有成分、例えば絹フィブロインやクモ糸タンパク質に由来するポリペプチドに含まれている夾雑物などを含んでも良い。
(1)湿式紡糸
紡糸は湿式紡糸を採用する。これにより、ポリマーを溶解させた溶媒を除去し(脱溶媒又は凝固ともいう)、未延伸糸を得る。湿式紡糸に使用する凝固液は、脱溶媒できる溶液であればどのようなものでも良い。溶媒を除去し、繊維形成させるための凝固液はメタノール、エタノール、2−プロパノールなどの炭素数1〜5の低級アルコール又はアセトンを使用するのが好ましい。適宜水を加えても良い。凝固液の温度は3〜30℃が好ましい。前記の範囲であれば紡糸は安定する。前記紡糸液を凝固液に押し出すことにより、未延伸糸が得られる。直径0.1〜0.6mmのノズルを有するシリンジポンプの場合、押し出し速度は1ホール当たり、0.2〜2.4ml/hが好ましい。この範囲であれば紡糸は安定する。さらに好ましい押し出し速度は1ホール当たり、0.6〜2.2ml/hである。凝固液槽の長さは200〜500mm、未延伸糸の引き取り速度は1〜3m/min、滞留時間は0.01〜0.15minが好ましい。この範囲であれば脱溶媒が効率よくできる。凝固液において延伸(前延伸)をしても良いが、低級アルコールの蒸発を考えると凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で引き取るのが好ましい。
延伸は一段延伸でもよいし、2段以上の多段延伸でもよい。多段延伸は応力が高くなる利点がある。
本発明のタンパク質溶液はドープ溶液としてキャストフィルムにすることもできる。例えばガラス板のようなドープ液中の溶媒に耐性のある平板にドープ液を所定の厚さにキャストし、前記キャスト膜から溶媒を脱離させてタンパク質フィルムを得る。ドープ液を所定の厚さにキャストするには、ドクターコート、ナイフコーターなどの冶具を用いて数ミクロン以上の厚さにキャストし、その後減圧乾燥又は脱溶媒槽への浸漬により溶媒を脱離することにより得る。
本発明のタンパク質繊維又はフィルムは、ポリペプチド分子間を化学的に架橋させてもよい。ポリペプチドの架橋に使える官能基は、例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシ基等があるが、これに限定されるものではない。ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。架橋は真空加熱下で脱水縮合反応を行なっても良いし、カルボジイミド等の脱水縮合剤により架橋させても良い。また、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いても良い。また、トランスグルタミナーゼ等の酵素により架橋することもできる。一例として、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、多官能エポキシ樹脂(一例としてナガゼケムテック社製、商品名”デナコール”)等の架橋剤で架橋反応させても良い。カルボジイミドは一般式R1N=C=NR2(但し、R1,R2は炭素数1〜6のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。)で示され、具体的化合物は1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリノエチル)カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)などがある。この中でもEDC、DICはペプチド鎖のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。架橋処理は、ドープ液中に架橋剤を加えて架橋しても良いし、延伸糸に架橋剤を付与して真空熱乾燥で架橋しても良い。架橋剤は100%品を繊維に付与しても良いし、炭素数1〜5の低級アルコールや緩衝液などで希釈して0.005〜10質量%の濃度で繊維に付与しても良い。処理条件は、温度20〜45℃で3〜42時間が好ましい。架橋剤による架橋処理により、強度、タフネス、耐薬品性等を上げることができる。
(1)絹フィブロイン原料の準備
(a)繭を約2mm×10mm程度に裁断し、沸騰した0.5質量%マルセル石鹸水(マルセル石鹸はおろし金で細かくしたものを使用)で約30分間煮た。
(b)その後、沸騰したお湯で30分間煮た。
(c)手順1と2を後2回繰り返した(計3回)。
(d)最後に沸騰したお湯で30分間煮た。この操作で絹フィブロインを覆うセリシンやその他の添加剤などを完全に除去した。
(e)湿った絹フィブロインを37℃環境で一晩乾燥させた。
(f)乾燥後の絹の重さを測り、10w/v%となるように、LiBr水溶液(9mol/L)を加え、40℃環境で2時間溶解させた。
(g)その水溶液をセルロース透析膜((VISKASESELES COAP製 Seamless Cellulose Tubing,36/32))に入れ、蒸留水を用いて3〜4日間透析した。
(h)透析後の回収溶液を、20℃、15,000rpm、1時間で遠心し、解け残りやゴミ等を除去した。
(i)更に濃度が2質量%以下になるようにMilliQで希釈した。
(j)希釈後、ADVANTEC社の150μmフィルターに通し、細かなゴミを完全に除去した。
(k)絹フィブロイン水溶液を−80℃環境で凍結させ、一晩かけて凍結乾燥した。十分に水分が抜けたことを確認し、絹フィブロイン粉末として保存した。このようにして絹フィブロイン凍結乾燥粉末を得た。
(1)極性溶媒
極性溶媒は、アクリル繊維の重合、紡糸液用、ポリイミドの重合溶媒として使用されている極性溶媒を中心に検討した。
DMA:N,N−ジメチルアセトアミド
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
DMI:1,3−ジメチル−2−イミダゾリジノン
NMP:N−メチル−2−ピロリドン
HFIP:ヘキサフルオロイソプロパノール
DMSO:ジメチルスルホキシド
蟻酸
炭酸ブチレン
炭酸プロピレン
γ−ブチロラクトン
ヘキサメチルホスホルアミド
(2)溶解促進剤(無機塩)
溶解促進剤として下記の無機塩を検討した。
アルカリ金属ハロゲン化物:LiCl,LiBr
アルカリ土類金属ハロゲン化物:CaCl2
アルカリ土類金属硝酸塩:Ca(NO3)2
チオシアン酸ナトリウム:NaSCN
表1に示すように、極性溶媒とこれに無機塩を加えた系で溶解性試験をした。温度は100℃とした。絹フィブロインの濃度は4質量%とした。下記の表1以下の溶解性評価は次の基準に従った。なお、表1において、無機塩の質量%は、極性溶媒と無機塩の全体質量に対する無機塩の質量の割合である。
[溶解性評価基準]
A 溶解する。
B 大部分溶解するが一部不溶物が残る。
C 溶解しない。
紡糸液(ドープ液)を用いて湿式紡糸し延伸して繊維を作成した。
(1)紡糸液(ドープ液)の調整
タンパク質成分の濃度(ドープ濃度)を15質量%、溶媒はDMSO+10質量%LiClとした。
(2)湿式紡糸
図3に示す紡糸装置を用いた。湿式紡糸における各条件は次のとおりである。
押し出しノズル直径:0.3mm
押し出し速度:3.0ml/h
凝固液槽の湯温:10℃
(3)延伸
50℃の温水中での延伸倍率(一段延伸):3.0倍
巻取速度:6.6m/min(66rpm)で巻取った。
(4)得られた延伸糸の物性
得られた繊維の物性を下記のように測定した。その結果、単繊維の平均直径:37.0μm、最大点応力:135.1MPa、初期弾性率:5.8GPa、破断点変位(伸度):71.4%、タフネス:82.4MJ/m3であった。得られた単繊維の応力−変位(ひずみ)曲線は図5に示した。
(a)光学顕微鏡を用いて繊維の直径を求めた。
(b)引張り試験
温度:25℃、相対湿度60%の雰囲気温度で引張り試験機(島津社製小型卓上試験機EZ−S)を用いて繊維の強度、初期弾性率(20点の最大傾きで測定。50msec間隔で測定し、傾きの計算を20点間隔で行ったときの最大傾きを初期弾性率とした。)、伸度を測定し、タフネスを算出した。サンプルは厚紙で型枠を作製したものに貼り付け、つかみ具間距離は20mm、引張り速度は10mm/minで行った。ロードセル容量1N、つかみ冶具はクリップ式とした。測定値はサンプル数n=5の平均値とした。タフネスの算出式は次のとおりとした。
[E/(r2×π×L)×1000](単位:MJ/m3)
但し、
E 破壊エネルギー(単位:J)
r 繊維の半径(単位:mm)
π 円周率
L 引張り試験測定時のつかみ具間距離:20mm
本実施例は絹フィブロインとクモ糸タンパク質に由来するポリペプチドとを混合したハイブリッド繊維の例である。
1.クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドの準備
<遺伝子合成>
(1)ADF3Kaiの遺伝子の合成
ニワオニグモの2つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるADF3(NCBIアクセッション番号:AAC47010、GI:1263287)の部分的なアミノ酸配列をNCBIのウェブデータベースより取得し、同配列のN末端に開始コドン、His10タグ及びHRV3Cプロテアーゼ(Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ)認識サイトからなるアミノ酸配列(配列番号4)を付加したアミノ酸配列(配列番号2)をコードする遺伝子を、GenScript社に合成受託した。その結果、配列番号5で示す塩基配列からなるADF3Kaiの遺伝子が導入されたpUC57ベクター(遺伝子の5’末端直上流にNde Iサイト、及び5’末端直下流にXba Iサイト有り)を取得した。その後、同遺伝子をNde I及びEcoR Iで制限酵素処理し、pET22b(+)発現ベクターに組み換えた。
ADF3Kaiを鋳型にT7プロモータープライマー(配列番号8)とRep Xba Iプライマー(配列番号9)を用いてPCR反応を行い、ADF3Kaiの遺伝子配列における5’側半分の配列(以下、配列Aと記す。)を増幅し、同断片をMighty Cloning Kit(タカラバイオ株式会社製)を使用して、予めNde I及びXba Iで制限酵素処理をしておいたpUC118ベクターに組み換えた。同様に、ADF3Kaiを鋳型にXba I Repプライマー(配列番号10)とT7ターミネータープライマー(配列番号11)を用いてPCR反応を行い、ADF3Kaiの遺伝子配列における3’側半分の配列(以下、配列Bと記す。)を増幅し、同断片をMighty Cloning Kit(タカラバイオ株式会社製)を使用して、予めXba I、EcoR Iで制限酵素処理をしておいたpUC118ベクターに組み換えた。配列Aの導入されたpUC118ベクターをNde I、Xba Iで、配列Bの導入されたpUC118ベクターをXba I、EcoR Iでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列A及び配列Bの目的DNA断片を精製した。DNA断片A、B及び予めNde I及びEcoR Iで制限酵素処理をしておいたpET22b(+)をライゲーション反応させ、大腸菌DH5αに形質転換した。T7プロモータープライマー及びT7ターミネータープライマーを用いたコロニーPCRにより、目的DNA断片の挿入を確認した後、目的サイズ(3.6 kbp)のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号6に示すADF3Kai−Largeの遺伝子の構築が確認された。なお、ADF3Kai−Largeのアミノ酸配列は配列番号3で示すとおりである。
上記で得られたADF3Kai−Largeの遺伝子が導入されたpET22b(+)ベクターを鋳型に、PrimeStar Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ株式会社製)を用いた部位特異的変異導入により、ADF3Kai−Largeのアミノ酸配列(配列番号3)における第1155番目のアミノ酸残基グリシン(Gly)に対応するコドンGGCを終止コドンTAAに変異させ、配列番号7に示すADF3Kai−Large−NRSH1の遺伝子をpET22b(+)上に構築した。変異の導入の正確性については、3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ADF3Kai−Large−NRSH1のアミノ酸配列は配列番号1で示すとおりである。
(I)遠沈管(50ml)にADF3KaiーLargeーNRSH1のタンパク質を発現している大腸菌の菌体約4.5gと、緩衝液AI(20mM Tris−HCl、pH7.4)30mlを添加し、ミキサー(GE社製「SI−0286」、レベル10)で菌体を分散させた後、遠心分離機(トミー精工製の「MX−305」)で遠心分離(10,000rpm、10分、室温)し、上清を捨てた。
(II)遠心分離で得られた沈殿物(菌体)に緩衝液AIを30mlと、0.1MのPMSF(イソプロパノールで溶解)を0.3ml添加し、上記GE社製のミキサー(レベル10)で3分間分散させた。その後、超音波破砕機(SONIC&MATERIALS INC製「VCX500」)を用いて菌体を破砕し、遠心分離(10,000rpm、10分、室温)した。
(III)遠心分離で得られた沈殿物に緩衝液AIを30mL加え、ミキサー(IKA社製「T18ベーシック ウルトラタラックス」、レベル2)で3分間分散させた後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離(10,000rpm、10分、室温)し、上清を除去した。
(IV)上清を捨てた遠沈管に7.5Mの尿素緩衝液I(7.5M 尿素、10mM リン酸二水素ナトリウム、20mM NaCl、1mM Tris−HCl、pH7.0)を加え、上記SMT社製の超音波破砕機(レベル7)で沈殿を良く分散させた。その後、上記タイテック社製のシェイカー(200rpm、60℃)で120分間溶解させた。溶解後のタンパク質溶液を上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離(11,000×g、10分、室温)し、上清を透析チューブ(三光純薬株式会社セルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ADF3KaiーLargeーNRSH1(約101.1kDa)の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動(CBB染色)の結果をTotallab(nonlinear dynamics ltd.)を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ADF3KaiーLargeーNRSH1の精製度は約85%であった。
実施例2と同様にしてドープ液を作成した。具体的条件は表2に示す。ドープ液を調整する際に、絹フィブロインとクモ糸タンパク質を混合した。絹フィブロインは実施例1と同一物を使用した。
延伸は第1延伸として湯浴で行い、第2延伸は湯浴(実施例3〜5,7)と乾熱(実施例6)で行った。第1延伸の湯浴延伸は凝固工程の後に連続して行った。絹フィブロインとクモ糸タンパク質の質量混合割合、延伸工程の条件を表2に、上述のとおりに測定した物性の結果を表3に示す。
2,30,62,80 未延伸糸製造装置
3,40 湿熱延伸装置(1段目延伸装置)
4,50,63,90 乾熱延伸装置(2段目延伸装置)
5,39,44,64,86,92 巻糸体
6,32,66,82 紡糸液
7 貯槽
8 ギアポンプ
9,69,83 口金
10,60 紡糸延伸装置
11,35,71,85 凝固液
36 未延伸糸
12,38 温水
13,15,41,45 供給ニップローラ
14,16,42,46 引き取りニップローラ
17,43,77,89 乾熱延伸装置
18a〜18f 糸ガイド
19,73 エアギャップ
20,34,72,84 凝固液槽
21,37 延伸浴槽
22,47,78,91 糸道
配列番号5〜7 塩基配列
配列番号8〜11 プライマーシーケンス
Claims (9)
- 絹フィブロインを含むタンパク質成分をジメチルスルホキシド、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド及びN−メチル−2−ピロリドンから選ばれる少なくとも一つの極性溶媒及び無機塩を含む溶液に溶解させ、ドープ液とし、このドープ液を紡糸して得られるタンパク質繊維の製造方法であって、
前記ドープ液を口金から凝固液槽に押し出し、前記凝固液の温度を3〜30℃、前記凝固槽における滞留時間を0.01〜0.15minとし、前記極性溶媒を脱離させるとともに繊維形成して未延伸糸とし、
前記未延伸糸を温水温度30〜90℃の湯浴で第1段延伸し、延伸繊維を得ることを特徴とするタンパク質繊維の製造方法。 - 前記絹フィブロインを含むタンパク質成分は、前記タンパク質成分を100質量%としたとき、質量比で絹フィブロイン:クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドが100:0〜10:90である請求項1に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記タンパク質溶液を100質量%としたとき、前記タンパク質の割合が3〜45質量%の範囲である請求項1又は2に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記溶解成分を100質量%としたとき、無機塩の割合が0.1〜20質量%の範囲である請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記溶解成分を100質量%としたとき、前記極性溶媒の割合が20質量%以上100質量%以下であり、残余はアルコール及び/又は不可避的含有成分を含んでも良い請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記溶解成分を100質量%としたとき、前記極性溶媒の割合が10質量%以上100質量%以下であり、残余は水及び/又は不可避的含有成分を含んでも良い請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、チオシアン酸ナトリウム(NaSCN)から選ばれる少なくとも一つである請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記第1段延伸の延伸倍率は1.05〜6倍である請求項1〜7のいずれか1項に記載のタンパク質繊維の製造方法。
- 前記第1段延伸の後、第2延伸を湯浴又は乾熱で行う請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質繊維の製造方法。
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