WO2018235958A1 - タンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法、及びタンパク質成形体の製造方法 - Google Patents

タンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法、及びタンパク質成形体の製造方法 Download PDF

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WO2018235958A1
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protein
inorganic salt
purifying
target protein
aqueous solution
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祐哉 佐藤
利昭 大澤
森田　啓介
俊将 本間
良太 佐藤
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin

Definitions

  • the present invention relates to a method of purifying a protein, a method of producing a protein solution, and a method of producing a protein compact.
  • Production of proteins such as spider silk proteins and silk proteins may be performed by expressing them in a host cell as recombinant proteins, extracting and purifying them.
  • polar solvents such as dimethylsulfoxide (DMSO) are used as solvents for proteins such as spider silk proteins and silk proteins.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • an inorganic salt as a dissolution promoter to these polar solvents (for example, Patent Documents 1 to 3).
  • a calcium chloride / ethanol aqueous solution dissolves silk fibroin (silk fibroin) (Non-patent Document 1).
  • a solvent obtained by adding an inorganic salt (eg, lithium chloride) to DMSO is extremely excellent as a solvent for dissolving a protein.
  • an inorganic salt eg, lithium chloride
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying a protein without using a polar solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO), a method for producing a protein solution, and a method for producing a protein molded body.
  • a polar solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the present inventors bring the contaminating substance in which the target protein and the contaminants are mixed into contact with the inorganic salt and water to dissolve the target protein and obtain an inorganic salt solution containing a contaminant as a non-soluble substance.
  • the target protein By separating the target protein into inorganic salt aqueous solution and contaminants, it was found that protein can be extracted and purified without using an organic solvent, and the present invention has been accomplished.
  • the present invention relates to, for example, the following inventions.
  • a target protein extraction process for obtaining an inorganic salt water suspension containing the target protein dissolved by bringing the target protein into contact with an inorganic salt and water by contacting a mixture of the target protein and the contaminant with the inorganic salt and water. And a separation step of separating an inorganic salt solution into an inorganic salt aqueous solution in which the target protein is dissolved and contaminants.
  • the method for purifying a protein of [1] wherein the inorganic salt solution further contains an alcohol.
  • [4] The method for purifying a protein according to any one of [1] to [3], wherein the target protein extraction step further comprises heating.
  • [5] The method for purifying a protein according to any one of [1] to [4], wherein the inorganic salt is at least one selected from alkali metal halides, alkaline earth metal halides, alkaline earth metal nitrates and thiocyanates. .
  • [6] The method for purifying a protein of any one of [1] to [5], wherein the inorganic salt is at least one selected from inorganic chloride and nitrate.
  • [7] The method for purifying a protein according to any one of [1] to [6], wherein the concentration of the inorganic salt is 2 mol / L to 6 mol / L.
  • [8] The method for purifying a protein of any one of [1] to [7], wherein the target protein is a structural protein.
  • a method for producing a protein solution comprising the step of bringing a host cell expressing a protein into contact with a mineral salt and water to obtain an inorganic salt aqueous solution in which the protein is dissolved.
  • the method for producing a protein solution of [12] wherein the inorganic salt aqueous solution in which the protein is dissolved is subjected to a step of separating and removing contaminants derived from host cells.
  • a method for producing a protein molded article, wherein an inorganic salt aqueous solution in which the protein of [12] or [13] is dissolved is used as a raw material for forming a molded article containing a protein.
  • a method for purifying a protein it is possible to provide a method for purifying a protein, a method for producing a protein solution, and a method for producing a protein molded body, wherein no polar solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO) is used or the amount used can be reduced.
  • no polar solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a target protein can be selectively extracted and purified from contaminants (for example, cells) without using an organic solvent.
  • FIG. 2 shows the results of SDS-PAGE of purification of the proteins of Examples 1 and 2.
  • FIG. 7 shows the results of SDS-PAGE of protein purification by adjusting the mineral salt concentration in Example 3.
  • FIG. 6 shows the results of SDS-PAGE of purification of protein by pH adjustment of Example 4.
  • FIG. 6 shows the results of SDS-PAGE of purification of protein by pH adjustment of Example 5. It is a figure which shows the result of SDS-PAGE of refinement
  • FIG. 16 shows the results of SDS-PAGE of protein purification by adjusting the mineral salt concentration of Example 7.
  • FIG. 16 shows the results of SDS-PAGE of protein purification by adjusting the mineral salt concentration of Example 8.
  • an inorganic salt solution containing the target protein dissolved in a mixture of the target protein and the contaminants by contacting the contaminants with the mixture of the target protein and the contaminants with the inorganic salt and water.
  • the method includes a target protein extraction step of obtaining a turbid solution, and a separation step of separating the inorganic salt water turbid solution into an inorganic salt aqueous solution in which the target protein is dissolved and contaminants.
  • target protein examples include any protein whose production on an industrial scale is preferable.
  • examples of the target protein include proteins that can be used for industrial use, proteins that can be used for medical use, structural proteins, and the like.
  • proteins that can be used for industrial or medical use include enzymes, regulatory proteins, receptors, peptide hormones, cytokines, membrane or transport proteins, antigens used for vaccination, vaccines, antigen binding proteins, immunostimulatory proteins, Mention may be made of allergens, full-length antibodies or antibody fragments or derivatives.
  • Specific examples of structural proteins include fibroin such as spider silk protein (spider silk fibroin) and silk protein (silk fibroin), collagen, resilin, elastin, keratin, and proteins derived therefrom, and the like.
  • fibroin-like proteins such as spider silk protein and silk protein, and proteins derived therefrom, include proteins containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • (A) n motif indicates an amino acid sequence mainly comprising an alanine residue
  • n is 2 to 20, preferably 4 to 20, more preferably 8 to 20, and still more preferably 10 to It may be an integer of 20, still more preferably 4 to 16, still more preferably 8 to 16, particularly preferably 10 to 16.
  • the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in (A) n motif may be 40% or more, preferably 60% or more, and more preferably 70% or more.
  • REP represents an amino acid sequence composed of 2 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 2 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may be identical to each other or different from each other.
  • the plurality of REPs may be identical amino acid sequences to each other or different amino acid sequences.
  • Specific examples of spider silk proteins and silk proteins, and proteins derived therefrom can include proteins including the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 (PRT410) and SEQ ID NO: 2 (PRT799).
  • a weft protein which is a kind of spider silk protein, and a protein derived therefrom for example, a protein comprising a domain sequence represented by the formula 2: [REP2] o can be mentioned.
  • REP2 represents an amino acid sequence composed of Gly-Pro-Gly-Gly-X
  • X is composed of alanine (Ala), serine (Ser), tyrosine (Tyr) and valine (Val) It shows one amino acid selected from the group.
  • o represents an integer of 8 to 300.
  • Specific examples of the weft protein and the protein derived therefrom include a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (Recombinant spider silk protein Flag _ 92 — short 2).
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3 is from the N-terminus corresponding to the repeat portion and motif of the partial sequence (NCBI accession number: AAF36090, GI: 7106224) of the flagellar silk protein of American jergent spider obtained from the NCBI database
  • the amino acid sequence from residues 1220 to 1659 (referred to as the PR1 sequence) and a partial sequence of the flagella-like silk protein of the American spider spider obtained from the NCBI database (NCBI accession numbers: AAC38847, GI: 2833649)
  • a C-terminal amino acid sequence from the C-terminus to the 816th to 907th residues is joined, and the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 8 is added to the N terminus of the joined sequence is there.
  • collagen and proteins derived therefrom include proteins containing a domain sequence represented by Formula 3: [REP3] p.
  • p represents an integer of 5 to 300.
  • REP3 shows the amino acid sequence comprised from Gly-X1-Y, and X and Y show arbitrary amino acid residues other than Gly.
  • the plurality of REP3 may be identical to each other or different from each other.
  • Specific examples of collagen and a protein derived therefrom can include a protein comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 (Collagen-type 4-Kai).
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 corresponds to the repeat portion and motif of a partial sequence of human collagen type 4 (NCBI GenBank accession numbers: CAA56335.1, GI: 3702452) obtained from the NCBI database.
  • the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 8 is added to the N-terminus of the amino acid sequence from residue 301 to residue 540.
  • REP4 proteins containing a domain sequence represented by Formula 4: [REP4] q.
  • q represents an integer of 4 to 300.
  • REP4 shows the amino acid sequence comprised from Ser 1 J 1 J 1 Tyr 1 Gly 1 U-Pro.
  • J represents any amino acid residue, and is particularly preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Ser and Thr.
  • U is any amino acid residue, and is particularly preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Ala, Thr and Ser.
  • the plurality of REP4 may be identical to each other or different from each other.
  • resilin and a protein derived therefrom can include a protein comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 5 (Resilin-Kai).
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 5 is such that in the amino acid sequence of resilin (NCBI GenBank accession numbers NP 611157, Gl: 24654243), Thr at position 87 is substituted with Ser, and Asn at position 95
  • the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 8 is added to the N-terminal of the amino acid sequence from the 19th residue to the 321st residue of the sequence in which
  • elastin and proteins derived therefrom include proteins having amino acid sequences such as NCBI GenBank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), NP786966 (bovine) and the like.
  • Specific examples of elastin and proteins derived therefrom can include a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (elastin short).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 at the N-terminus of the amino acid sequence from residue 121 to residue 390 of the amino acid sequence of NCBI GenBank accession number AAC 98 395 (tag sequence And hinge arrangement) are added.
  • a recombinant polypeptide of keratin for example, type I keratin of Capra hircus etc. can be mentioned.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (the amino acid sequence of accession number ACY30466 of Genbank of NCBI) can be mentioned.
  • the target protein is preferably spider silk protein and silk protein, and fibroin-like proteins such as proteins derived therefrom, and spider silk protein and a protein derived therefrom are more preferred.
  • the target protein can be obtained, for example, by a general method using genetic engineering techniques. Specifically, for example, a target protein (eg, recombinant spider silk protein) is produced using a host transformed with an expression vector containing a gene encoding a natural spider silk protein to be recombinantly be able to.
  • the gene production method is not particularly limited, but, for example, a method of cloning a gene encoding a natural spider silk protein from cells derived from spider by polymerase chain reaction (PCR) or the like, and chemically synthesizing it Methods are included.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the chemical synthesis method of the gene is not particularly limited, but, for example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare) based on the amino acid sequence information of natural spider protein obtained from the NCBI web database etc. There is a method of linking and synthesizing oligonucleotides automatically synthesized by Japan Co., Ltd. etc. by PCR etc.
  • an amino acid sequence consisting of an initiation codon and a His10 tag may be added to the N-terminus of the amino acid sequence to facilitate purification and confirmation of the protein.
  • an expression vector such as a plasmid, phage or virus capable of expressing a protein from a DNA sequence can be used.
  • the plasmid-type expression vector is not particularly limited as long as it can express a target gene in a host cell and can amplify itself. Specifically, for example, when E. coli Rosetta (DE3) is used as a host, pET22b (+) plasmid vector, pCold plasmid vector, etc. can be used. From the viewpoint of excellent protein productivity, it is preferable to use a pET22b (+) plasmid vector as the plasmid type expression vector.
  • a host for example, animal cells, plant cells, microorganisms and the like can be used.
  • the addition amount of the inorganic salt and water according to the present invention added to dissolve the target protein from the host cell expressing the target protein is not particularly limited, for example, from the viewpoint of enhancing the solubility of the target protein,
  • the ratio (volume (mL) / weight (g)) of the volume (mL) of the solvent for protein solubilization to the weight (g) of the host cell is preferably 5 or more, more preferably 7 or more Preferably, it is more preferably 10 times or more.
  • the host cells at the time of addition of the protein dissolving solvent may be in a dry state or in a wet state.
  • the contaminants in which the target protein and contaminants coexist are, for example, a host cell expressing the target protein or a fragment of the disrupted product of the host cell expressing the target protein and the target protein and the like.
  • Contaminants are not particularly limited and are substances other than the target protein, and refer to, for example, a protein derived from a host cell which has expressed the target protein.
  • the non-soluble matter is not particularly limited, and refers to a protein or the like derived from a host cell which expresses a target protein which is not dissolved in the inorganic salt aqueous solution.
  • Inorganic salts include, for example, alkali metal halides, alkaline earth metal halides, alkaline earth metal nitrates, and thiocyanates. More specifically, the inorganic salt is, for example, aluminum phosphate, lithium carbonate, aluminum carbonate, aluminum sulfate, aluminum fluoride, ferric acetate, aluminum acetate, zinc acetate, zinc hydroxide, magnesium hydroxide, ferrous hydroxide , Manganese hydroxide, chromium hydroxide, ferric hydroxide, aluminum hydroxide, nickel chloride, cobalt chloride, zinc chloride, ferrous chloride, manganese chloride, chromium chloride, ferric chloride, aluminum chloride, lithium nitrate, Strontium nitrate, nickel nitrate, calcium nitrate, cobalt nitrate, zinc nitrate, magnesium nitrate, ferrous nitrate, manganese nitrate, chromium
  • the inorganic salt is preferably at least one selected from inorganic chlorides and nitrates.
  • inorganic chloride sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, or magnesium chloride etc. are mentioned, for example.
  • nitrate examples include sodium nitrate, potassium nitrate, calcium nitrate, and magnesium nitrate.
  • the inorganic salt is at least one selected from calcium chloride, magnesium chloride, magnesium nitrate, or calcium nitrate, from the viewpoint of improving the extractability of the target protein and the solubility of the powder.
  • the concentration of the inorganic salt is not particularly limited, but may be 1 mol / L or more from the viewpoint of solubility improvement, and is 2 mol / L or more It may also be 3 mol / L or more, 4 mol / L or more, or 5 mol / L or more.
  • the inorganic salt may be 10 mol / L or less, 9 mol / L or less, 8 mol / L or less, or 7 mol / L or less. It may be 6 mol / L or less.
  • the concentration of the inorganic salt is within the above range, for example, 1 mol / L to 10 mol / L, 2 mol / L to 8 mol / L, 2 mol / L to 6 mol / L, 3 mol / L to 8 mol / L, or 3 mol / L to 7 mol
  • the concentration of the inorganic salt is within the above range, for example, 1 mol / L to 10 mol / L, 2 mol / L to 8 mol / L, 2 mol / L to 6 / L, 3 mol / L to 8 mol / L, or 3 mol / L to 7 mol
  • the upper limit of the calcium chloride concentration is preferably 6 mol / L or less from the viewpoint of cost reduction in addition to the solubility of the protein.
  • Water is not particularly limited, but may be, for example, pure water, distilled water, or ultrapure water from the viewpoint of reducing contaminants in the protein solution.
  • the alcohol to be combined with water may be a lower alcohol having 1 to 6 carbon atoms, particularly ethanol.
  • the proportion of alcohol may be set in a range where water and alcohol do not separate, but for example, it is 10% by mass or more or 20% by mass or more based on the weight of the extraction solvent or the protein solution to be obtained It may be 50% by mass or less, 40% by mass or less, or 30% by mass or less.
  • the inorganic salts and water may be added to the contaminates, and the inorganic salts and the contaminates in water. It may be added, and the order of addition does not matter.
  • the method of lowering the pH of the aqueous solution is not particularly limited.
  • the pH can be lowered by adding an acidic compound, water, a pH buffer, or other pH adjuster to the aqueous solution.
  • the width of lowering the pH of the aqueous solution is adjusted so that the target protein is extracted from an aqueous solution in which inorganic salt and water are brought into contact with a mixture in which the target protein and contaminants are mixed.
  • the decrease width of the pH of the aqueous solution is not particularly limited, and may be 3.0 or less, 2.7 or less, 2.5 or less, 2.0 or less, 1.5 or less, and 1.0 or less.
  • the type of acidic compound that can be added to the aqueous protein solution to lower the pH is not particularly limited.
  • the acidic compound may be, for example, at least one selected from the group consisting of nitric acid and EDTA.
  • Contaminants in which the target protein and contaminants coexist may be brought into contact with the inorganic salt and water, and then heated.
  • the heating method is not particularly limited, as long as a predetermined temperature can be maintained at the time of extraction of the target protein. Stirring may also be included.
  • the heating temperature is not particularly limited, and the heating temperature is, for example, 60 ° C. or higher, preferably 70 ° C. or higher, and more preferably 80 ° C. or higher, depending on the type of the target protein. Further, from the viewpoint of suppressing the degradation of the target protein and improving the purity of the target protein, the temperature is, for example, 130 ° C. or less, preferably 110 ° C. or less, more preferably 90 ° C. or less according to the type of the target protein.
  • the time for lysing the target protein is not particularly limited, and from the viewpoint of efficiently obtaining the target protein and from the viewpoint of cell death, for example, 0.5 hours or more, preferably according to the type of the target recombinant protein. It is 1 hour or more, more preferably 2 hours or more. Further, from the viewpoint of suppressing the degradation of the target protein and improving the working efficiency, it is, for example, 15 hours or less, preferably 10 hours or less, and more preferably 5 hours or less according to the type of the target protein.
  • the method for separating an inorganic salt solution containing the target protein obtained in the target protein extraction step and containing impurities as non-soluble substances into an inorganic salt aqueous solution in which the target protein is dissolved and impurities is particularly limited.
  • aggregates can be separated using any suitable separation means, such as spontaneous sedimentation, centrifugation or filtration.
  • the conditions for centrifugation are not particularly limited. For example, it can be carried out at (80 ⁇ 5 ° C.), 1000 ⁇ g to 15,000 ⁇ g for 5 to 30 minutes.
  • the insolubles may be separated twice or more.
  • the purity of the target protein can be improved by adding the poor solvent to the inorganic salt aqueous solution.
  • the poor solvent is not particularly limited, and is adjusted so as to precipitate the target protein. Examples of poor solvents include potassium acetate, sodium acetate, alcohol (ethanol) and the like.
  • the method for producing a protein solution according to the present embodiment is characterized by including the step of bringing a host cell expressing a protein into contact with an inorganic salt and water to obtain an inorganic salt aqueous solution in which the protein is dissolved.
  • the protein here is the same as the target protein described above.
  • host cells expressing proteins, inorganic salts and water are [1.
  • Target protein extraction step Inorganic salt aqueous solution, [2. As described in the separation step].
  • the inorganic salt aqueous solution is [2. It is preferable that the process passes through the step of separating and removing the host cell-derived contaminants by the separation method described in the separation step.
  • the method for producing a protein molded product according to the present embodiment is characterized in that an inorganic salt aqueous solution (protein solution) in which the target protein is dissolved is used as a raw material for a molded product.
  • protein solution inorganic salt aqueous solution
  • the protein solution according to the present embodiment can be used, for example, as a raw material for molded bodies.
  • the formed material raw material according to the present embodiment can be used for spinning, and is useful as a cast film liquid or the like.
  • the raw material for molded bodies according to this embodiment is manufactured, for example, by adjusting the viscosity of a protein solution to a viscosity at which it can be spun.
  • the viscosity of the protein solution is, for example, 100 to 10,000 cP (centipoise). Adjustment of the viscosity of the protein solution can be performed, for example, by adjusting the concentration of protein in the solution. The viscosity of the protein solution can be measured, for example, using a trade name "EMS viscometer” manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.
  • the protein molded body of the present embodiment is a fiber or a film.
  • the method for producing a protein fiber according to the present embodiment includes the step of obtaining the undrawn yarn by using the protein solution according to the present invention as a raw material for a shaped body and extruding into a coagulating solution (hereinafter also referred to as “spinning step”).
  • the manufacturing method according to the present embodiment may further include the step of drawing the undrawn yarn (hereinafter, also referred to as “drawing step”).
  • ⁇ Material> [(1) Preparation of modified fibroin expression strain] (Preparation of plasmid type expression strain) Based on the nucleotide sequence and amino acid sequence of fibroin (GenBank accession number: P46804.1, GI: 1174415) derived from Nephila clavipes, a modified fibroin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter “PRT410” "I also designed.”
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence obtained by substituting, inserting and deleting amino acid residues for the purpose of improving productivity with respect to the amino acid sequence of fibroin derived from Nephila clavipes.
  • the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 8 is added to the N-terminus.
  • nucleic acid encoding PRT410 was synthesized.
  • the NdeI site at the 5 'end and the EcoRI site downstream of the stop codon were added to the nucleic acid.
  • the nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the same nucleic acid was digested with NdeI and EcoRI, cut out, and then recombined into a protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • the modified fibroin having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 (hereinafter also referred to as "PRT 799") was similarly recombined into the protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • E. coli BLR (DE3) was transformed with the pET22b (+) expression vector containing a nucleic acid encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 1 and 2.
  • the transformed E. coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours.
  • the culture solution was added to 100 mL of seed culture medium (Table 1) containing ampicillin so that the OD 600 was 0.005.
  • the culture solution temperature was maintained at 30 ° C., and flask culture was performed until the OD 600 reached 5 (about 15 hours) to obtain a seed culture solution.
  • the seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of production medium (Table 2) was added such that the OD600 was 0.05.
  • the temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Also, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • the feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 ml / min.
  • the temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Further, the culture was carried out for 20 hours while maintaining the dissolved oxygen concentration in the culture solution at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration. Thereafter, 1 M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the target protein. Twenty hours after the addition of IPTG, the culture solution was centrifuged to recover the cells. SDS-PAGE was performed using cells prepared from the culture solution before IPTG addition and after IPTG addition, and expression of a target protein was confirmed by appearance of a band of the target protein size depending on IPTG addition.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • Example 1 Purification of Protein (1) (Purification of protein by inorganic salt) Two hours after IPTG was added, the collected cells were washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) to obtain the cells. 10 g of wet cells of the recombinant E. coli expressing the target protein (modified fibroin PRT799) obtained as described above was weighed out, and a solvent was added. As a solvent, an aqueous solution containing water (100 mL) and 3 M calcium chloride (CaCl 2 ) was used.
  • a solvent an aqueous solution containing water (100 mL) and 3 M calcium chloride (CaCl 2 ) was used.
  • the solvent After addition of the solvent, it was thermally dissolved at 80 ° C. with stirring for 2 hours. After completion of the thermal dissolution, the mixture was centrifuged at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge to separate contaminants and the inorganic salt aqueous solution (1) (modified fibroin extract) in which the target protein was dissolved.
  • a 1/5 volume of 3 M aqueous solution of calcium chloride (CaCl 2 ) was added to the separated contaminants, and the contaminants (filtration residue) and the target protein were dissolved by centrifuging at 11000 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge.
  • the inorganic salt aqueous solution (2) (modified fibroin extract) was separated.
  • ⁇ SDS-PAGE> For the modified fibroin extract (Extraction solution), a sample for SDS-PAGE was prepared so that the protein concentration was 10 mg / mL, based on the result obtained from the measurement by the BCA method.
  • Mini-PROTEAN (R) Tetra System Mini-PROTEAN (R)
  • FIG. 1 The photograph on the left of FIG. 1 shows the result of staining of all proteins after staining with OrioleTM fluorescent gel stain (manufactured by Bio-Rad) after electrophoresis, and the photograph on the right of FIG. 1 shows that after electrophoresis. It is stained with InVision (trademark) His-tagged in-gel staining reagent (manufactured by Thermo Fisher Scientific) that reacts to the His tag region of PRT799. PRT 799 (theoretical molecular weight: 211.4 kDa) was detected as a band around the 250 kDa molecular weight marker.
  • Example 2 Purification of Protein (2) (Purification of protein with inorganic salt and ethanol) 10 g of wet cells of recombinant E. coli expressing the target protein PRT799 (modified fibroin) obtained as described above were weighed out, and a solvent was added. As a solvent, an aqueous solution containing water (80 mL), 1 M calcium chloride (CaCl 2 ) and ethanol (20 mL) was used.
  • a solvent an aqueous solution containing water (80 mL), 1 M calcium chloride (CaCl 2 ) and ethanol (20 mL) was used.
  • the solvent After addition of the solvent, it was thermally dissolved at 80 ° C. with stirring for 2 hours. After completion of the thermal dissolution, the mixture was centrifuged at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge to separate contaminants and an inorganic salt aqueous solution (1) (modified fibroin extract) in which the target protein was dissolved.
  • inorganic salt aqueous solution (1) modified fibroin extract
  • Example 3 Purification of Protein by Adjustment of Inorganic Salt Concentration (1) 10 g of wet cells of recombinant E. coli expressing the target protein (modified fibroin) obtained as described above were weighed out, and a solvent was added. As a solvent, an aqueous solution containing water (100 mL), 0 M, 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, or 6 M calcium chloride (CaCl 2 ) was used.
  • a solvent an aqueous solution containing water (100 mL), 0 M, 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, or 6 M calcium chloride (CaCl 2 ) was used.
  • the solvent After addition of the solvent, it was thermally dissolved at 80 ° C. with stirring for 2 hours. After completion of the thermal dissolution, the mixture was centrifuged at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge to separate contaminants and the inorganic salt aqueous solution (1) in which the target protein was dissolved (modified fibroin extract).
  • the inorganic salt aqueous solution (1) and (2) in which the target protein was dissolved were integrated, and 1/2 volume of 7 M potassium acetate was mixed with the inorganic salt aqueous solution in which the target protein was dissolved, and then allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, the solid content was obtained as a target protein by centrifuging at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge, and powdered.
  • Example 4 Purification of Protein by pH Adjustment (1) (Purification of protein by inorganic salt solution of different pH) 10 g of the dry cells of recombinant E. coli expressing the target protein PRT410 (modified fibroin) obtained as described above were weighed out, and a solvent was added.
  • the solvent After addition of the solvent, it was thermally dissolved at 80 ° C. with stirring for 2 hours. After completion of the thermal dissolution, the mixture was centrifuged at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge to separate contaminants and an inorganic salt aqueous solution (1) (modified fibroin extract) in which the target protein was dissolved.
  • inorganic salt aqueous solution (1) modified fibroin extract
  • the inorganic salt aqueous solution (1) and (2) in which the target protein was dissolved were integrated, and 1/2 volume of 7 M potassium acetate was mixed with the inorganic salt aqueous solution in which the target protein was dissolved, and then allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, the solid content was obtained as a target protein by centrifuging at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge, and powdered.
  • Example 5 Purification of Protein by pH Adjustment (2) 10 g of wet cells of recombinant E. coli expressing the target protein PRT410 (modified fibroin) obtained as described above were weighed out, and a solvent was added.
  • a solvent (1) An aqueous solution (pH 5.4) containing water (100 mL) and 2 M magnesium nitrate (Mg (NO 3 ) 2 ), (2) Aqueous solution (pH 3.8) containing water (100 mL), 2 M magnesium nitrate, nitric acid (1 mL), (3) Aqueous solution (pH 3.5) containing water (100 mL), 2 M magnesium nitrate, nitric acid (2 mL), or (4) aqueous solution containing water (100 mL), 2 M magnesium nitrate, nitric acid (3 mL) 7) It was used.
  • the solvent After addition of the solvent, it was thermally dissolved at 80 ° C. with stirring for 2 hours. After completion of the thermal dissolution, the mixture was centrifuged at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge to separate contaminants and an inorganic salt aqueous solution (1) (modified fibroin extract) in which the target protein was dissolved.
  • inorganic salt aqueous solution (1) modified fibroin extract
  • the inorganic salt aqueous solution (1) and (2) in which the target protein was dissolved were integrated, and 1/2 volume of 7 M potassium acetate was mixed with the inorganic salt aqueous solution in which the target protein was dissolved, and then allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, the solid content was obtained as a target protein by centrifuging at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge, and powdered.
  • Example 6 Purification of protein by adjusting mineral salt concentration and liquid volume 10 g of wet cells of recombinant E. coli expressing the target protein PRT410 (modified fibroin) obtained as described above was weighed out, and the solvent was Added.
  • a solvent An aqueous solution containing water (100 mL), 2.0 M magnesium nitrate (Mg (NO 3 ) 2 ), (2) Water (100 mL), an aqueous solution containing 2.5 M magnesium nitrate, (3) Water (100 mL), an aqueous solution containing 3.0 M magnesium nitrate, (4) An aqueous solution containing water (200 mL), 2.0 M magnesium nitrate (Mg (NO 3 ) 2 ), (5) Water (200 mL), an aqueous solution containing 2.5 M magnesium nitrate, or (6) water (200 mL), an aqueous solution containing 3.0 M magnesium nitrate, It was used.
  • the solvent After addition of the solvent, it was thermally dissolved at 80 ° C. with stirring for 2 hours. After completion of the thermal dissolution, the mixture was centrifuged at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge to separate contaminants and an inorganic salt aqueous solution (1) (modified fibroin extract) in which the target protein was dissolved.
  • inorganic salt aqueous solution (1) modified fibroin extract
  • the inorganic salt aqueous solution (1) and (2) in which the target protein was dissolved were integrated, and 1/2 volume of 7 M potassium acetate was mixed with the inorganic salt aqueous solution in which the target protein was dissolved, and then allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, the solid content was obtained as a target protein by centrifuging at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge, and powdered.
  • Example 7 Purification of Protein by Adjustment of Inorganic Salt Concentration (2) 10 g of the dry cells of recombinant E. coli expressing the target protein PRT410 (modified fibroin) obtained as described above were weighed out, and a solvent was added.
  • the solvent After addition of the solvent, it was thermally dissolved at 80 ° C. with stirring for 2 hours. After completion of the thermal dissolution, the mixture was centrifuged at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge to separate contaminants and the inorganic salt aqueous solution (1) (modified fibroin extract) in which the target protein was dissolved.
  • the inorganic salt aqueous solution (1) and (2) in which the target protein was dissolved were integrated, and 1/2 volume of 7 M potassium acetate was mixed with the inorganic salt aqueous solution in which the target protein was dissolved, and then allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, the solid content was obtained as a target protein by centrifuging at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge, and powdered.
  • Example 8 Purification of Protein by Adjustment of Inorganic Salt Concentration (3) 10 g of the dry cells of recombinant E. coli expressing the target protein PRT410 (modified fibroin) obtained as described above were weighed out, and a solvent was added.
  • the solvent After addition of the solvent, it was thermally dissolved at 80 ° C. with stirring for 2 hours. After completion of the thermal dissolution, the mixture was centrifuged at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge to separate contaminants and the inorganic salt aqueous solution (1) (modified fibroin extract) in which the target protein was dissolved.
  • the inorganic salt aqueous solution (1) and (2) in which the target protein was dissolved were integrated, and 1/2 volume of 7 M potassium acetate was mixed with the inorganic salt aqueous solution in which the target protein was dissolved, and then allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, the solid content was obtained as a target protein by centrifuging at 2500 ⁇ g for 10 minutes with a centrifuge.

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Abstract

本発明は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しないタンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法、及びタンパク質成形体の製造方法の提供を目的とする。目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、かつ前記夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得る目的タンパク質抽出工程と、前記無機塩水混濁液を前記目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と前記夾雑物とに分離する分離工程と、を含むことを特徴とするタンパク質の精製方法。

Description

タンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法、及びタンパク質成形体の製造方法
　本発明は、タンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法、及びタンパク質成形体の製造方法に関する。
　クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質等のタンパク質の製造は、組換えタンパク質として宿主細胞に発現させ、抽出及び精製することによって行われることがある。抽出に際して、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒は、クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質等のタンパク質の溶媒として使用されている。また、これら極性溶媒に、溶解促進剤として無機塩を添加することが知られている（例えば、特許文献１～３）。また、塩化カルシウム／エタノール水溶液が絹フィブロイン（シルクフィブロイン）を溶解することが知られている（非特許文献１）。
特許第５４２７３２２号公報 特許第６０７７５６９号公報 特許第６０７７５７０号公報
AKIYOSHI AJISAW, "Dissolution of silk fibroin with calciumchloride/ethanol aqueous solution" The Journal of Sericultural Science of Japan Vol.67 No.2, 91-94(1998)
　ＤＭＳＯに無機塩（例えば、塩化リチウム）を添加した溶媒は、タンパク質を溶解させる溶媒として極めて優れている。一方、工業的な利用という観点からは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しない若しくは使用量の少ない溶媒が求められている。
　本発明は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しないタンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法、及びタンパク質成形体の製造方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得てから、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と夾雑物とに分離することによって、有機溶媒を使用せず、タンパク質を抽出及び精製できることを見出し、本発明の完成に至った。
　本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、かつ夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得る目的タンパク質抽出工程と、無機塩水混濁液を前記目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と夾雑物とに分離する分離工程と、を含むことを特徴とするタンパク質の精製方法。
［２］無機塩水混濁液がさらにアルコールを含む［１］のタンパク質の精製方法。
［３］前記無機塩混濁溶液のｐＨを下げる工程が含まれる［１］又は［２］のタンパク質の精製方法。
［４］目的タンパク質抽出工程が、加熱することをさらに含む［１］～［３］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［５］無機塩がアルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩及びチオシアン酸塩から選ばれる少なくともーつである［１］～［４］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［６］無機塩が無機塩化物、及び硝酸塩から選ばれる少なくともーつである［１］～［５］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［７］無機塩の濃度が２ｍｏｌ／Ｌ～６ｍｏｌ／Ｌである［１］～［６］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［８］目的タンパク質が、構造タンパク質である、［１］～［７］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［９］構造タンパク質が、フィブロインである、［８］のタンパク質の精製方法。
［１０］構造タンパク質が、クモ糸フィブロインである、［８］又は［９］のタンパク質の精製方法。
［１１］精製されたタンパク質水溶液に貧溶媒を添加し、タンパク質を自然沈降させる工程を含む［１］～［１０］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［１２］タンパク質を発現した宿主細胞と無機塩と水とを接触させて、該タンパク質が溶解した無機塩水溶液を得る工程を含むことを特徴とするタンパク質溶液の製造方法。
［１３］タンパク質が溶解した無機塩水溶液は、宿主細胞由来の夾雑物を分離除去する工程を経たものである［１２］のタンパク質溶液の製造方法。
［１４］タンパク質を含む成形体を製造するに際して、［１２］又は［１３］のタンパク質が溶解した無機塩水溶液を成形体原料として用いることを特徴とするタンパク質成形体の製造方法。
［１５］タンパク質成形体が繊維又はフィルムである［１４］のタンパク質成形体の製造方法。
　本発明によれば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しないこと若しくは、使用量の低減が可能なタンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法及びタンパク質成形体の製造方法の提供が可能となる。本発明の方法はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しないこと若しくは、使用量の低減が可能なため、工業的な利用を容易にすることができる。また、本発明のタンパク質の精製方法によれば、夾雑物（例えば菌体）から、有機溶媒を使用することなく目的タンパク質を選択的に抽出及び精製することができる。
実施例１及び２のタンパク質の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 実施例３の無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 実施例４のｐＨ調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 実施例５のｐＨ調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 実施例６の無機塩濃度及び液量の調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 実施例７の無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 実施例８の無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
｛タンパク質の精製方法｝
　本実施形態に係るタンパク質の精製方法は、目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、かつ夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得る目的タンパク質抽出工程と、無機塩水混濁液を目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と夾雑物とに分離する分離工程と、を含む。
〔１．目的タンパク質抽出工程〕
＜目的タンパク質＞
　溶解させるタンパク質（以下、「目的タンパク質」ということもある。）としては、工業規模での製造が好ましい任意のタンパク質を挙げることができる。目的タンパク質としては、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、クモ糸タンパク質（クモ糸フィブロイン）及びシルクタンパク質（シルクフィブロイン）などのフィブロイン、コラ－ゲン、レシリン、エラスチン、及びケラチン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
　フィブロイン様タンパク質であるクモ糸タンパク質及びシルクタンパク質、並びにこれら由来のタンパク質として、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、ｎは２～２０、好ましくは４～２０、より好ましくは８～２０、更に好ましくは１０～２０、更により好ましくは４～１６、更によりまた好ましくは８～１６、特に好ましくは１０～１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることが更に好ましく、９０％以上であることが更により好ましく、１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは２～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質、並びにこれら由来のタンパク質の具体的としては、配列番号１（ＰＲＴ４１０）、配列番号２（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
　クモ糸タンパク質の一種である横糸タンパク質、及びこれに由来するタンパク質としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、式２中、ＲＥＰ２はＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８～３００の整数を示す。横糸タンパク質、及びこれに由来するタンパク質の具体的としては、配列番号３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｐｉｄｅｒ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｌａｇ＿９２＿ｓｈｏｒｔ２）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　コラーゲン、及びこれに由来するタンパク質として、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、式３中、ｐは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。コラーゲン、及びこれに由来するタンパク質の具体的としては、配列番号４（Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉ）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　レシリン、及びこれに由来するタンパク質として、例えば、式４：［ＲＥＰ４］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、式４中、ｑは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。レシリン、及びこれに由来するタンパク質の具体的としては、配列番号５（Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉ）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ　６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　エラスチン、及びこれに由来するタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。エラスチン、及びこれに由来するタンパク質の具体的としては、配列番号６（ｅｌａｓｔｉｎ　ｓｈｏｒｔ）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ　ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。ケラチンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号７で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
　目的タンパク質としては、溶解性がより優れるという観点から、クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質、並びにこれら由来のタンパク質等のフィブロイン様タンパク質が好ましく、クモ糸タンパク質、及びこれに由来するタンパク質がより好ましい。目的タンパク質は、例えば、遺伝子工学的手法を用いた一般的な方法により取得できる。具体的には、例えば、目的タンパク質（例えば、組換えクモ糸タンパク質）は、組換えの対象となる天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法としては、特に制限さないが、例えば、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で増幅してクローニングする方法、及び化学的に合成する方法が挙げられる。
　遺伝子の化学的な合成方法としては、特に制限されないが、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベース等より入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等で自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ等で連結して合成する方法が挙げられる。目的タンパク質には、タンパク質の精製及び確認を容易にするため、アミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加してもよい。発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ又はウイルス等の発現ベクターを用いることができる。プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。具体的には、例えば、宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクター等を用いることができる。プラスミド型発現ベクターとしては、タンパク質の生産性に優れるという観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。宿主としては、例えば、動物細胞、植物細胞、微生物等を用いることができる。
　目的タンパク質を発現した宿主細胞から当該目的タンパク質を溶解するために添加する本発明に係る無機塩及び水の添加量は特に制限されるものではないが、目的タンパク質の溶解性を高める観点から、例えば、宿主細胞の重量（ｇ）に対するタンパク質溶解用溶媒の体積（ｍＬ）の比（体積（ｍＬ）／重量（ｇ））として、５倍以上であることが好ましく、７倍以上であることがより好ましく、１０倍以上であることが更に好ましい。タンパク質溶解用溶媒を添加する際の宿主細胞は、乾燥した状態でもよく、湿った状態でもよい。
＜目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物＞
　目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物は、例えば目的タンパク質を発現した宿主細胞若しくは、目的タンパク質を発現した宿主細胞の破砕物と目的タンパク質が分散したもの等のことをいう。
　夾雑物は、特に限定されず目的タンパク質以外の物質であり、例えば、目的タンパク質を発現した宿主細胞由来のタンパク質等のことをいう。
　非溶物は、特に限定されず、前記無機塩水溶液に溶解していない目的タンパク質を発現した宿主細胞由来のタンパク質等のことをいう。
＜無機塩＞
　無機塩としては、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、及びチオシアン酸塩が挙げられる。より具体的には、無機塩は、例えば、リン酸アルミニウム、炭酸リチウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、フッ化アルミニウム、酢酸第二鉄、酢酸アルミニウム、水酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化マンガン、水酸化クロム、水酸化第二鉄、水酸化アルミニウム、塩化ニッケル、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化第一鉄、塩化マンガン、塩化クロム、塩化第二鉄、塩化アルミニウム、硝酸リチウム、硝酸ストロンチウム、硝酸ニッケル、硝酸カルシウム、硝酸コバルト、硝酸亜鉛、硝酸マグネシウム、硝酸第一鉄、硝酸マンガン、硝酸クロム、硝酸第二鉄、硝酸アルミニウム、臭化リチウム、臭化バリウム、臭化ストロンチウム、臭化ニッケル、臭化カルシウム、臭化コバルト、臭化亜鉛、臭化マグネシウム、臭化第一鉄、臭化マンガン、臭化クロム、臭化第二鉄、臭化アルミニウム、塩素酸バリウム、塩素酸ストロンチウム、塩素酸ニッケル、塩素酸カルシウム、塩素酸コバルト、塩素酸亜鉛、塩素酸マグネシウム、塩素酸第一鉄、塩素酸マンガン、塩素酸クロム、塩素酸第二鉄、塩素酸アルミニウム、ヨウ化ルビジウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化銅、ヨウ化リチウム、ヨウ化バリウム、ヨウ化ストロンチウム、ヨウ化ニッケル、ヨウ化カルシウム、ヨウ化コバルト、ヨウ化亜鉛、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化第一鉄、ヨウ化マンガン、ヨウ化クロム、ヨウ化第二鉄、ヨウ化アルミニウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸鉛、過塩素酸銅、過塩素酸リチウム、過塩素酸バリウム、過塩素酸ストロンチウム、過塩素酸ニッケル、過塩素酸カルシウム、過塩素酸コバルト、過塩素酸亜鉛、過塩素酸マグネシウム、過塩素酸第一鉄、過塩素酸マンガン、過塩素酸クロム、過塩素酸第二鉄、過塩素酸アルミニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸鉛、チオシアン酸銅、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸バリウム、チオシアン酸ストロンチウム、チオシアン酸ニッケル、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸コバルト、チオシアン酸亜鉛、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸第一鉄、チオシアン酸マンガン、チオシアン酸クロム、チオシアン酸第二鉄、チオシアン酸アルミニウム、シアン酸アンモニウム、シアン酸セシウム、シアン酸ルビジウム、シアン酸カリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸鉛、シアン酸銅、シアン酸リチウム、シアン酸バリウム、シアン酸ストロンチウム、シアン酸ニッケル、シアン酸カルシウム、シアン酸コバルト、シアン酸亜鉛、シアン酸マグネシウム、シアン酸第一鉄、シアン酸マンガン、シアン酸クロム、シアン酸第二鉄、及びシアン酸アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。
　無機塩としては、無機塩化物及び硝酸塩から選ばれる少なくともーつであることが好ましい。無機塩化物としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、又は塩化マグネシウム等が挙げられる。硝酸塩としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、又は硝酸マグネシウム等が挙げられる。
　目的タンパク質の抽出性向上の観点及び粉末の溶解性向上の観点から、さらに好ましくは、無機塩が塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、又は硝酸カルシウムから選ばれる少なくとも一つである。
　本実施形態に係る無機塩水溶液は、溶解性に優れているため、無機塩の濃度は特に限定されないが溶解性向上の観点から１ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよく、２ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよく、３ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよく、４ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよく、５ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよい。
　無機塩の添加によるコスト低減の観点から１０ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよく、９ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよく、８ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよく、７ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよく、６ｍｏｌ／Ｌ以下でであってもよい。
　無機塩の濃度を上記の範囲内、例えば、１ｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｏｌ／Ｌ、２ｍｏｌ／Ｌ～８ｍｏｌ／Ｌ、２ｍｏｌ／Ｌ～６ｍｏｌ／Ｌ、３ｍｏｌ／Ｌ～８ｍｏｌ／Ｌ、又は３ｍｏｌ／Ｌ～７ｍｏｌ／Ｌに調整することにより、上述したコスト低減の効果をより一層顕著に発揮することができる。無機塩濃度の下限は、２ｍｏｌ／Ｌ以上であれば、充分に優れたタンパク質の溶解性を示すことができる。塩化カルシウム濃度の上限は、タンパク質の溶解性に加えて、コスト低減の観点から、６ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。
　水は、特に限定されないが、タンパク質溶液中の夾雑物を低減するという観点から、例えば純水、蒸留水、又は超純水であってもよい。
　アルコールを使用することにより、抽出に必要な無機塩の添加量を低減することができる。水と組み合わせるアルコールは、炭素数１～６の低級アルコール、特にエタノールであってもよい。
　アルコールの割合は、水とアルコールが相分離しない範囲で設定すればよいが、例えば、抽出溶媒、又は得られるタンパク質溶液の質量を基準として、１０質量％以上、又は２０質量％以上であってもよく、５０質量％以下、４０質量％以下又は３０質量％以下であってもよい。
　目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させる方法に関しては、特に限定されず、混在物に無機塩及び水を添加してもよく、水に無機塩及び混在物を添加してもよく、また添加の順番を問わない。目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩と水とを接触させた水溶液のｐＨを低下さることによって、水溶液中に抽出される目的タンパク質量が増加する。
　水溶液のｐＨを低下させる方法は、特に限定されない。例えば、前記水溶液に酸性化合物、水、ｐＨ緩衝剤、又はその他のｐＨ調整剤を加える方法によって、ｐＨを低下させることができる。
　前記水溶液のｐＨを低下させる幅は、目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩と水とを接触させた水溶液から目的タンパク質が抽出されるように、調整される。水溶液のｐＨの低下幅は、特に限定されず、３．０以下、２．７以下、２．５以下、２．０以下、１．５以下、及び１．０以下であってもよい。
　ｐＨを低下させるためにタンパク質水溶液に添加され得る酸性化合物の種類は、特に限定されない。酸性化合物は、例えば、硝酸、ＥＤＴＡからなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。
　目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させてから、加熱してもよい。加熱方法は特に限定されず、目的タンパク質の抽出時に所定の温度を保持できればよい。また更に撹拌することが含まれていてもよい。
　加熱温度は特に限定されず、目的とするタンパク質の種類に応じて、たとえば加熱温度は６０℃以上、好ましくは７０℃以上、さらに好ましくは８０℃以上である。また目的タンパク質の分解を抑制し、目的タンパク質の純度向上の観点から、目的タンパク質の種類に応じて、たとえば１３０℃以下、好ましくは１１０℃以下、さらに好ましくは９０℃以下である。
　目的タンパク質を溶解させる時間は特に限定されず、効率よく目的タンパク質を得る観点及び菌体死菌化の観点から、目的とする組換えタンパク質の種類に応じて、たとえば０．５時間以上、好ましくは１時間以上、さらに好ましくは２時間以上である。また目的タンパク質の分解を抑制し、作業効率向上の観点から、目的タンパク質の種類に応じて、たとえば１５時間以下、好ましくは１０時間以下、さらに好ましくは５時間以下である。
〔２．分離工程〕
　目的タンパク質抽出工程で得られた目的タンパク質を溶解し、かつ夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と夾雑物とに分離する方法は、特に限定されず、適宜な分離手段、例えば、自然沈降（沈殿）、遠心分離又は濾過を用いて凝集体を分離することができる。遠心分離の条件は、特に限定されない。例えば、（８０±５℃）、１０００×ｇ～１５０００×ｇで５～３０分間行うことができる。不溶物の分離は２回以上行ってもよい。
＜貧溶媒＞
　貧溶媒を無機塩水溶液に添加することで目的タンパク質の純度を向上することができる、貧溶媒は特に限定されず、目的タンパク質を析出されるように、調整される。貧溶媒は、例えば、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、アルコール（エタノール）等が挙げられる。
｛タンパク質溶液の製造方法｝
　本実施形態に係るタンパク質溶液の製造方法は、タンパク質を発現した宿主細胞と無機塩と水とを接触させて、該タンパク質が溶解した無機塩水溶液を得る工程を含むことを特徴とする。ここのタンパク質は上記の目的タンパク質と同じである。また、タンパク質を発現した宿主細胞、無機塩及び水は、［１．目的タンパク質抽出工程］に記載されている通りである。
　無機塩水溶液、［２．分離工程］に記載されている通りである。無機塩水溶液は、［２．分離工程］に記載の分離方法によって、宿主細胞由来の夾雑物を分離除去する工程を経たものであることが好ましい。
｛タンパク質成形体の製造方法｝
　本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、上記目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（タンパク質溶液）を成形体原料として用いることを特徴とする。
＜タンパク質成形体＞
　本実施形態に係るタンパク質溶液は、例えば、成形体原料として用いることができる。本実施形態に係る成形体原料は、紡糸に用いることができ、またキャストフィルム液等として有用である。本実施形態に係る成形体原料は、例えば、タンパク質溶液の粘度を、紡糸できる粘度に調整して製造される。タンパク質溶液の粘度は、例えば、１００～１０，０００ｃＰ（センチポイズ）である。タンパク質溶液の粘度の調整は、例えば、溶液中のタンパク質の濃度を調整することで行うことができる。タンパク質溶液の粘度は、例えば、京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定することができる。
　本実施形態のタンパク質成形体が繊維又はフィルムであることが好ましい。本実施形態に係るタンパク質繊維の製造方法は、本発明に係るタンパク質溶液を成形体原料とし、凝固液に押し出し、未延伸糸を得る工程（以下、「紡糸工程」ともいう。）を含む。本実施形態に係る製造方法は、未延伸糸を延伸する工程（以下、「延伸工程」ともいう。）を更に含むものであってもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜材料＞〔（１）改変フィブロイン発現株の作製〕
（プラスミド型発現株の作製）
　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。
　次に、ＰＲＴ４１０をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）についても同様にタンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（タンパク質の発現）
　配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍｌ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。
実施例１　タンパク質の精製（１）
（無機塩によるタンパク質の精製）
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄し菌体を取得した。上記のようにして得られた、目的タンパク質（改変フィブロインＰＲＴ７９９）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、水（１００ｍＬ）、３Ｍ　塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含む水溶液を使用した。
　溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。
　分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ　塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物（ろ過残渣）と目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。
　目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、３倍量の８５％エタノール、又は１／２倍量の７Ｍ　酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。
（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析）
　得られた改変フィブロイン抽出液について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析を行った。解析結果は図１のレーンＮｏ．１（３倍量の８５％エタノール）及びレーンＮｏ．２（１／２倍量の７Ｍ　酢酸カリウム）に示す。
＜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ＞
　改変フィブロイン抽出液（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）について、ＢＣＡ法による測定から得られた結果を基に、タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるようにＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）　Ｔｅｔｒａ　ＳｙｓｔｅｍにＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）
　ＴＧＸ（登録商標）　Ｇｅｌｓをセットし、調製した各ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルをロードし、電気泳動を行った。電気泳動終了後、Ｇｅｌ　ＤＯＣ（登録商標）　ＥＺ　Ｉｍａｇｅｒで解析を行った。結果を図１に示す。
　図１の左の写真は、電気泳動後、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅ（商標）蛍光ゲルステイン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で染色したもの、図１の右の写真は、電気泳動後、ＰＲＴ７９９のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｓタグ付きゲル内染色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で染色したものである。ＰＲＴ７９９（理論分子量：２１１．４ｋＤａ）は、２５０ｋＤａの分子量マーカの付近にバンドとして検出された。
実施例２　タンパク質の精製（２）
（無機塩及びエタノールによるタンパク質の精製）
　上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ７９９（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、水（８０ｍＬ）、１Ｍ　塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、エタノール（２０ｍＬ）を含む水溶液を使用した。
　溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。
　分離した夾雑物に１／５倍量の１Ｍ　塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（８０ｍＬ）、エタノール（２０ｍＬ）を含む水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。
　目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、３倍量の８５％エタノール、又は１／２倍量の７Ｍ　酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。
（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析）
　得られた改変フィブロイン抽出液について、上記「ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図１レーンＮｏ．３（３倍量の８５％エタノール）及びレーンＮｏ．４（１／２倍量の７Ｍ　酢酸カリウム）に示す。エタノールの添加により、無機塩の添加量を低減できることが確認された。また、図１より抽出溶媒を１Ｍ　ＣａＣｌ２　２０％エタノールとし、析出用貧溶媒をエタノールとすることで純度向上が確認された。
実施例３　無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製（１）
　上記のようにして得られた、目的タンパク質（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、水（１００ｍＬ）、０Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、又は６Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含む水溶液を使用した。
　溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（改変フィブロイン抽出液）を分離した。
　分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。
　目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。
（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析）
　得られた改変フィブロイン抽出液について、上記「ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。レーンＮｏ．１～６はそれぞれ１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、又は６Ｍのサンプルに対応している。解析結果は図２に示す。無機塩の添加量により抽出効率が向上することが確認された。
実施例４　ｐＨ調整によるタンパク質の精製（１）
（異なるｐＨの無機塩水溶液によるタンパク質の精製）
　上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の乾燥菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム（Ｍｇ（ＮＯ３）２）を含む水溶液（ｐＨ４．２）、
（２）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む水溶液（ｐＨ４．０）、
（３）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、３０ｍＭのＥＤＴＡを含む水溶液（ｐＨ３．７）、又は
（４）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、０．３％の硝酸を含む水溶液（ｐＨ３．４）
を使用した。
　溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。
　分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ　塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。
　目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ　酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。
（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析）
　得られた改変フィブロイン抽出液について、上記「ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図３に示す。レーンＮｏ．１～４はそれぞれ水溶液（１）～（４）に対応している。ＰＲＴ４１０（理論分子量：５３．６ｋＤａ）は、５０～６０ｋＤａの分子量マーカの付近にバンドとして検出された。ｐＨの調整により抽出効率が向上することが確認された。
実施例５　ｐＨ調整によるタンパク質の精製（２）
　上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）、を含む水溶液（ｐＨ５．４）、
（２）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、硝酸（１ｍＬ）を含む水溶液（ｐＨ３．８）、
（３）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、硝酸（２ｍＬ）を含む水溶液（ｐＨ３．５）、又は
（４）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、硝酸（３ｍＬ）を含む水溶液（ｐＨ２．７）
を使用した。
　溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。
　分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。
　目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。
（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析）
　得られた改変フィブロイン抽出液、及びろ過残渣について、上記「ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図４に示す。レーンＮｏ．１～４はそれぞれ水溶液（１）～（４）に対応している。ｐＨの調整により抽出効率が向上することが確認された。
実施例６　無機塩濃度及び液量の調整によるタンパク質の精製
　上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、２．０Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）を含む水溶液、
（２）水（１００ｍＬ）、２．５Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
（３）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
（４）水（２００ｍＬ）、２．０Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）を含む水溶液、
（５）水（２００ｍＬ）、２．５Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、又は
（６）水（２００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
を使用した。
　溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液と）を分離した。
　分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液と）を分離した。
　目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。
（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析）
　得られた改変フィブロイン抽出液、及びろ過残渣について、上記「ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図５に示す。レーンＮｏ．１～６はそれぞれ水溶液（１）～（６）に対応している。無機塩の濃度、液量の違いにより抽出効率が向上することが確認された。
実施例７　無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製（２）
　上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の乾燥菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）を含む水溶液、
（２）水（１００ｍＬ）、１．０Ｍの塩化マグネシウム（MgCl2）を含む水溶液、
（３）水（１００ｍＬ）、２．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
（４）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、又は
（５）水（１００ｍＬ）、４．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
を使用した。
　溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。
　分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。
　目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。
（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析）
　得られた改変フィブロイン抽出液について、上記「ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図６に示す。レーンＮｏ．１～５はそれぞれ水溶液（１）～（５）に対応している。無機塩の種類、濃度の違いにより抽出効率が向上することが確認された。
実施例８　無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製（３）
　上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の乾燥菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）を含む水溶液、
（２）水（１００ｍＬ）、１．０Ｍの塩化マグネシウム（MgCl2）を含む水溶液、
（３）水（１００ｍＬ）、１．０Ｍの塩化カルシウム（CaCl2）を含む水溶液、
（４）水（１００ｍＬ）、２．０Ｍの塩化カルシウムを含む水溶液、
（５）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの塩化カルシウムを含む水溶液、又は
（６）水（１００ｍＬ）、４．０Ｍの塩化カルシウムを含む水溶液、
を使用した。
　溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。
　分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ　塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。
　目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得した。
（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析）
　得られた改変フィブロイン抽出液ついて、上記「ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図７に示す。レーンＮｏ．１～６はそれぞれ水溶液（１）～（６）に対応している。無機塩の種類、濃度の違いにより抽出効率が向上することが確認された。

Claims (15)

  1. 　目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、かつ前記夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得る目的タンパク質抽出工程と、前記無機塩水混濁液を前記目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と前記夾雑物とに分離する分離工程と、を含むことを特徴とするタンパク質の精製方法。
  2. 　前記無機塩水混濁液がさらにアルコールを含む請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
  3. 　前記無機塩水混濁液のｐＨを下げる工程をさらに含む請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
  4. 　目的タンパク質抽出工程が、加熱することをさらに含む請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
  5. 　前記無機塩がアルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩及びチオシアン酸塩から選ばれる少なくともーつである請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
  6. 　前記無機塩が無機塩化物、及び硝酸塩から選ばれる少なくともーつである請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
  7. 　前記無機塩水混濁液における無機塩の濃度が２ｍｏｌ／Ｌ～６ｍｏｌ／Ｌである請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
  8. 　前記目的タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
  9. 　前記構造タンパク質が、フィブロインである、請求項８に記載のタンパク質の精製方法。
  10. 　前記構造タンパク質が、クモ糸フィブロインである、請求項８又は９に記載のタンパク質の精製方法。
  11. 　分離工程で得られた前記無機塩水溶液に貧溶媒を添加し、タンパク質を自然沈降させる工程をさらに含む請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
  12. 　タンパク質を発現した宿主細胞と無機塩と水とを接触させて、該タンパク質が溶解した無機塩水溶液を得る工程を含むことを特徴とするタンパク質溶液の製造方法。
  13. 　前記タンパク質が溶解した無機塩水溶液が前記宿主細胞由来の夾雑物を分離除去する工程を経たものである請求項１２に記載のタンパク質溶液の製造方法。
  14. 　タンパク質を含む成形体を製造するに際して、請求項１２又は１３に記載のタンパク質が溶解した無機塩水溶液を成形体原料として用いることを特徴とするタンパク質成形体の製造方法。
  15. 　前記タンパク質成形体が繊維又はフィルムである請求項１４に記載のタンパク質成形体の製造方法。
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