WO2018216779A1 - ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法 - Google Patents

ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法 Download PDF

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良太 佐藤
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide solution containing a polypeptide derived from a natural spider silk protein, a method for producing the same, and a method for producing a polypeptide molded product.
  • Non-Patent Document 1 discloses a method of dissolving an isolated recombinant spider silk protein under high temperature and high pressure conditions. Here, the optimal combination of heat and pressure is shown to be 135 ° C. and 140 psi (about 0.97 MPa).
  • an object of one aspect of the present invention is to obtain a polypeptide solution containing a polypeptide derived from a natural spider silk protein by extraction from a host cell while suppressing degradation of the polypeptide.
  • the present inventors surprisingly used a water heated to a specific temperature as an extraction solvent, thereby allowing a polypeptide derived from a natural spider silk protein to be separated from a host cell while suppressing its degradation.
  • the inventors have found that it can be extracted and have completed the present invention.
  • some aspects of the present invention relate to the following.
  • a method for producing a polypeptide solution [2] The method according to [1], wherein the predetermined temperature is 90 ° C or higher and lower than 120 ° C. [3] The method according to [1] or [2], wherein the extraction solvent further contains an alcohol.
  • the method further comprises the step of expressing the polypeptide in the host cell in a culture medium containing the host cell and water, By heating the culture solution to the predetermined temperature, the polypeptide is extracted into the aqueous solution containing the extraction solvent containing water contained in the culture solution and heated.
  • a hydrophilic solvent may be further added as a solvent contained in the extraction solvent.
  • the hydrophilic solvent is an alcohol.
  • the alcohol comprises ethanol.
  • a molding comprising a step of forming a polypeptide molded body containing a polypeptide by molding using the polypeptide solution obtained by the method according to any one of [1] to [8] as a stock solution for molding.
  • a method of manufacturing a body [11] The method according to [10], wherein the polypeptide molded body is a fiber or a film.
  • a polypeptide solution containing a polypeptide derived from a natural spider silk protein can be obtained by extraction from a host cell while suppressing degradation of the polypeptide. Furthermore, one aspect of the present invention is advantageous compared to conventional methods in that a special high-pressure vessel is not necessarily required.
  • One embodiment of a method for obtaining a polypeptide solution comprises a step of expressing a polypeptide derived from a natural spider silk protein in a host cell and a culture solution containing water, A polypeptide is extracted from an expressed host cell or a disrupted product thereof into an aqueous liquid containing an extraction solvent containing water and heated to a predetermined temperature, and contains the aqueous liquid and the polypeptide dissolved therein. Obtaining a polypeptide solution.
  • Expression of the polypeptide by the host cell in the culture medium can be performed by a usual method understood by those skilled in the art.
  • the host cell from which the polypeptide is extracted can be a dry cell or a wet cell after being recovered from the culture solution. Furthermore, the host cell may be alive in a cultured state or may be crushed by some technique.
  • the host cell or a crushed product thereof may be washed with an anionic surfactant (for example, sodium dodecyl sulfate (SDS)) before extraction. Washing in this case is performed, for example, by crushing host cells expressing the polypeptide, and collecting an insoluble polypeptide fraction containing the polypeptide out of the crushed product, and using an anionic surfactant. Including washing.
  • an anionic surfactant for example, sodium dodecyl sulfate (SDS)
  • the process can be further simplified by extracting the polypeptide from the host cell in the culture solution without recovering the host cell or its crushed material from the culture solution.
  • the polypeptide may be extracted into an aqueous solution containing an extraction solvent containing water contained in the culture solution by heating the culture solution to a predetermined temperature.
  • a hydrophilic solvent such as alcohol may be further added to the heated culture medium as a solvent contained in the extraction solvent.
  • Extraction of the polypeptide into an aqueous liquid may be performed, for example, by mixing a host cell or a crushed product thereof with an aqueous liquid, and then heating the dispersion in which the host cell or the crushed material is dispersed in the aqueous liquid. Stirring can be included.
  • the culture solution can be used as it is or after a hydrophilic solvent such as alcohol is added if necessary, as a dispersion for extraction.
  • the amount of the aqueous liquid mixed with the host cell or the crushed product thereof may be an amount that can dissolve the polypeptide, but it is 10 to 20 times the mass ratio of the dried cell or the dried crushed product. May be.
  • the amount of the aqueous liquid may be 4 to 5 times the mass ratio of wet cells.
  • the heating temperature of the aqueous liquid for extraction may be 90 ° C. or higher, 100 ° C. or higher, or 105 ° C. or higher, and is 130 ° C. or lower, less than 120 ° C., or 110 ° C. or lower. Also good.
  • Extraction of the polypeptide with an aqueous liquid can be performed under low pressure.
  • the extraction may be performed under atmospheric pressure, a saturated vapor pressure of an extraction solvent, or an atmosphere having a pressure of 0.070 to 0.27 MPa.
  • the degradation of the polypeptide can be more significantly suppressed.
  • the extraction time of the polypeptide may be set so that the polypeptide is sufficiently extracted. From the viewpoint of inhibiting the degradation of the polypeptide, for example, it may be within 180 minutes, within 60 minutes, or within 30 minutes. Good.
  • Aqueous Liquid Aqueous liquid contains an extraction solvent including water and can itself be a single phase homogeneous medium that is compatible with water in any proportion.
  • the extraction solvent may be substantially only water, or may be a mixed solvent consisting essentially of water and a hydrophilic solvent (especially alcohol).
  • the aqueous liquid may be a phosphate buffer or a Tris buffer, and the pH may be adjusted by the addition of sodium hydroxide or the like.
  • substantially only water means that the proportion of water in the total amount of the extraction solvent is, for example, 98% by mass or more, or 99% by mass or more. The same applies to “substantially only water and a hydrophilic solvent (or alcohol)”.
  • the water is not particularly limited, but may be, for example, pure water, distilled water, or ultrapure water from the viewpoint of reducing impurities in the polypeptide solution.
  • the hydrophilic solvent to be combined with water is usually a solvent that is compatible with water and can form a single phase with water.
  • a polar protic solvent may be used. It can be alcohol.
  • the alcohol may be a lower alcohol having 1 to 6 carbon atoms, particularly ethanol.
  • An aqueous liquid containing an extraction solvent containing water and alcohol can extract the polypeptide from the host cell at a lower temperature. Polypeptide degradation can be further suppressed by extraction at a low temperature. Therefore, when the extraction solvent contains water and alcohol, the heating temperature of the aqueous liquid for polypeptide extraction may be 100 ° C. or lower, or 95 ° C. or lower. On the other hand, when the extraction solvent is substantially only water, the heating temperature of the aqueous liquid for polypeptide extraction may be 100 ° C. or higher, or 105 ° C. or higher.
  • the ratio of the hydrophilic solvent (for example, alcohol) other than water in the extraction solvent including water and the hydrophilic solvent may be set within a range in which water and the hydrophilic solvent do not undergo phase separation. Based on the mass of the peptide solution, it may be 10 mass% or more, or 20 mass% or more, or 50 mass% or less, 40 mass% or less, or 30 mass% or less.
  • anionic surfactant examples include fatty acid salts, ⁇ -sulfo fatty acid ertel salts, alkylbenzene sulfonates, alkyl sulfates, alkyl ether sulfate esters, alkyl ether sulfate esters, and alkyl sulfate triethanolamine.
  • Examples of the cationic surfactant include alkyltrimethylammonium salt, dialkyldimethylammonium chloride, and alkylpyridinium chloride.
  • nonionic activator examples include fatty acid diethanolamide, polyoxyethylene alkyl ether, and polyoxyethylene alkyl phenyl ether.
  • polyoxyethylene alkyl phenyl ether examples include octylphenol ethoxylate (CAS number: 9002-93-1, “Triton X-100”, or “Pentex 1226” (manufactured by Miyoshi Oil & Fat Co., Ltd.)).
  • the ratio of the surfactant in the aqueous liquid is not particularly limited, but may be 0.1% by mass or more, 0.5% by mass or more, or 1% by mass or more based on the mass of the aqueous liquid.
  • the upper limit of the ratio of the surfactant is not particularly limited, but may be 10% by mass or less, 7% by mass or less, or 5% by mass or less. When the ratio of the surfactant is within these ranges, the target protein can be effectively dissolved in the aqueous liquid, and gelation after the protein is dissolved can be suppressed.
  • polypeptide derived from natural spider silk protein is a spider silk polypeptide selected from the group consisting of natural spider silk proteins and polypeptides derived from natural spider silk proteins (artificial spider silk proteins). You may contain.
  • spider silk proteins examples include large sphincter bookmark protein, weft protein, and small bottle-like gland protein. Since the large splint bookmarker has a repeating region composed of a crystalline region and an amorphous region (also referred to as an amorphous region), it has both high stress and stretchability.
  • the weft of spider silk has a feature that it does not have a crystalline region but has a repeating region consisting of an amorphous region. The weft thread is less stressed than the large spout bookmarker thread, but has high stretchability.
  • Large splint bookmark protein is produced with spider large bottle-like wire and has excellent toughness.
  • Examples of the large sphincter bookmark thread protein include large bottle-shaped gland spiders MaSp1 and MaSp2 derived from Nephila clavipes, and ADF3 and ADF4 derived from two spider spiders (Araneus diadematus).
  • ADF3 is one of the two main dragline proteins of the elder spider.
  • Polypeptides derived from natural spider silk proteins may be polypeptides derived from these bookmark silk proteins.
  • a polypeptide derived from ADF3 is relatively easy to synthesize and has excellent properties in terms of strength and toughness.
  • weft protein is produced in the flagellate gland of spiders.
  • flagellum silk protein derived from the American spider (Nephila clavipes) can be mentioned.
  • the protein derived from the large splint bookmark thread which is a polypeptide derived from the natural spider silk protein, may be a recombinant spider silk protein.
  • recombinant spider silk proteins include mutants, analogs or derivatives of natural spider silk proteins.
  • a suitable example of such a polypeptide is a recombinant spider silk protein (also referred to as “polypeptide derived from a large sputum bookmarker protein”).
  • Examples of a protein derived from a large splint bookmark thread that is a polypeptide derived from a natural spider silk protein include a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • a of the n motif represents an alanine residue.
  • n may be an integer of 2 to 20, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, 10 to 16.
  • the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif is 40% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100% (consisting of only alanine residues) May mean).
  • SEQ ID NO: 1 PRT410
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 5 PRT204
  • SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: 7 PRT202
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 PRT207
  • Examples of a protein derived from a natural spider silk protein and derived from a weft protein include, for example, a protein containing a domain sequence represented by Formula 2: [REP2] o (wherein REP2 is Gly ⁇ An amino acid sequence composed of Pro-Gly-Gly-X, wherein X represents one amino acid selected from the group consisting of alanine (Ala), serine (Ser), tyrosine (Tyr), and valine (Val). Represents an integer of 8 to 300). Specific examples thereof include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is from the N-terminal corresponding to the repeat part and the motif of the partial sequence of the flagellar silk protein of American spider spider obtained from the NCBI database (NCBI accession numbers: AAF36090, GI: 7106224). It is an amino acid sequence from the 1220th residue to the 1659th residue (referred to as PR1 sequence).
  • the recombinant spider silk protein can be produced using a host transformed with an expression vector containing a gene encoding a natural spider silk protein to be recombined.
  • the gene production method is not particularly limited, and a gene encoding a natural spider silk protein is cloned from a spider-derived cell by amplifying by polymerase chain reaction (PCR) or the like, or chemically synthesized. Obtainable.
  • the method of chemical synthesis of the gene is not particularly limited. For example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) based on the amino acid sequence information of the natural spider silk protein obtained from the NCBI web database.
  • a gene can be synthesized by linking oligonucleotides automatically synthesized by a company) by PCR or the like.
  • a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N-terminus of the amino acid sequence may be synthesized.
  • the expression vector a plasmid, phage, virus or the like capable of expressing a protein from a DNA sequence can be used.
  • the plasmid type expression vector is not particularly limited as long as it can express a target gene in a host cell and can amplify the gene itself.
  • a pET22b (+) plasmid vector when Escherichia coli Rosetta (DE3) is used as a host, a pET22b (+) plasmid vector, a pCold plasmid vector, or the like can be used. Among these, from the viewpoint of protein productivity, a pET22b (+) plasmid vector may be used.
  • the host for example, animal cells, plant cells, microorganisms and the like can be used.
  • Polypeptide solution By extracting a polypeptide from a host cell, a polypeptide solution containing a polypeptide derived from a natural spider silk protein and a solvent in which the polypeptide is dissolved is obtained.
  • the extraction solvent used for extraction may be part or all of the solvent in the polypeptide solution.
  • the polypeptide solution may contain unavoidable components, such as contaminants contained in the polypeptide.
  • the polypeptide solution can be used, for example, as a forming stock solution (dope solution) for obtaining a polypeptide molded product containing the polypeptide.
  • the forming stock solution (dope solution) is useful as, for example, a spinning stock solution for fiber spinning or a casting solution for film formation.
  • the viscosity of the polypeptide solution may be adjusted to a viscosity suitable for a molding process such as spinning.
  • the viscosity of the polypeptide solution may be 100 to 10,000 cP (centipoise) at the temperature during the molding process.
  • the viscosity of the polypeptide solution can be adjusted by, for example, the concentration of the polypeptide.
  • the viscosity of the polypeptide solution is measured, for example, using a trade name “EMS viscometer” manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.
  • a polypeptide can be purified through a step of removing unnecessary components (mainly solid content) from a polypeptide solution.
  • the precipitate may be separated by collecting the supernatant containing the polypeptide.
  • the sediment may be removed by separation by filtration or centrifugation. Separation by filtration can be performed using, for example, a filter paper, a filtration membrane, or the like. Centrifugation conditions are not particularly limited, and can be performed, for example, at 11000 ⁇ g for 5 minutes.
  • the polypeptide solution containing the purified polypeptide does not need to collect the powdered polypeptide by lyophilization and can be used as it is as a forming stock solution (dope solution).
  • polypeptide modified fibroin
  • modified fibroin expression strain Spider silk fibroin derived from Nephila clavipes (GenBank accession number: P46804.1, GI: 1174415), SEQ ID NO: 1
  • a modified fibroin which is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4
  • a spider silk fibroin derived from Araneus diadematsu (GenBank accession number: AAC470010.1) GI: 1263287)
  • a modified fibroin which is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 8 was designed.
  • sequence number 1 PRT410 SEQ ID NO: 2: PRT787 Sequence number 3: PRT799 SEQ ID NO: 4: PRT414 SEQ ID NO: 5: PRT204 SEQ ID NO: 6: PRT363 SEQ ID NO: 7: PRT202 SEQ ID NO: 8: PRT207
  • a nucleic acid encoding each modified fibroin was synthesized. Each nucleic acid was added with an NdeI site at the 5 'end and an EcoRI site downstream of the stop codon. The nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). The synthesized nucleic acid was digested with NdeI and EcoRI and cut out, and then recombined with the protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • the seed culture was added to a jar fermenter to which 500 ml of production medium (Table 2) was added so that the OD 600 was 0.05.
  • the transformed Escherichia coli was cultured while maintaining the culture solution temperature at 37 ° C. and maintaining it at a constant pH of 6.9. During the culture, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • a feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 ml / min.
  • the culture temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was continued for 20 hours under constant control at pH 6.9.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • 1M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the target modified fibroin.
  • the culture solution was centrifuged to recover the cells. SDS-PAGE was performed using the cells prepared from the culture solution before and after IPTG addition, and the expression of the target modified fibroin was confirmed by the appearance of a band of the target protein size depending on the addition of IPTG. .
  • the washed precipitate was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL, and 60 ° C.
  • the precipitate was dissolved in the buffer by stirring with a stirrer for 30 minutes.
  • dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.).
  • the white aggregated polypeptide obtained after dialysis was recovered by centrifugation. Water was removed from the collected aggregated polypeptide with a freeze dryer to obtain freeze-dried powder of each modified fibroin.
  • Dissolution test 2-1 Temperature 50 mg of dry powder of PRT410, PRT414, PRT204, PRT363, PRT202, or PRT207 was weighed into a 10 mL vial and 5 mL of pure water was added thereto. The obtained dispersion was stirred under a water vapor pressure at each temperature while increasing the temperature stepwise using an aluminum block thermostatic tank with a stirrer (RCH-20L, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.). The temperature at which dissolution of the powder was confirmed visually was recorded as “dissolution temperature”. The confirmed dissolution temperature of each modified fibroin is shown in Table 3.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of PRT410 dissolved by heating at each temperature of 110 to 150 ° C. In particular, it was confirmed that a protein solution was obtained in the range of 110 to 130 ° C. while suppressing protein degradation. In the figure, the remaining degree of the polypeptide when the unheated polypeptide (R) is defined as 100, which is simply obtained from the comparison of the luminescence intensity, is shown.
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • Solvent type / additive 50 mg of dry powder of PRT799 was weighed into a 10 mL vial and 5 mL of various solvents shown in Table 4 were added thereto. The obtained dispersion was stirred under a saturated vapor pressure at each temperature while gradually raising the temperature to 115 ° C. using an aluminum block thermostatic tank with a stirrer (RCH-20L, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.). The temperature at which the dissolution of the dry powder was confirmed visually was recorded as the “dissolution temperature”. The presence or absence of gelation of the dispersion was also confirmed visually.
  • the ratio of the mixed solvent shown in the table is a volume ratio.
  • the pH was adjusted by the addition of sodium hydroxide and hydrochloric acid. Details of the components abbreviated in the table are as follows.
  • Triton X-100 Octylphenol ethoxylate (CAS number: 9002-93-1)
  • Pentex 1226 Octylphenol ethoxylate (Miyoshi Oil Co., Ltd., CAS number: 9002-93-1)
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of PRT410 extracted from wet cells.
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of PRT787 extracted from wet cells.
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • the polypeptide can be recovered from the host cell expressing the polypeptide derived from the natural spider silk protein while suppressing degradation.

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Abstract

天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、水性液及びこれに溶解したポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備える、ポリペプチド溶液を製造する方法が開示される。所定の温度が９０℃以上１３０℃以下である。

Description

ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法
　本発明は天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法に関する。
　非特許文献１は、単離された組換えクモ糸タンパク質を高温及び高圧条件で溶解する方法を開示している。ここでは、熱及び圧力の最適な組合せが１３５℃及び１４０ｐｓｉ（約０．９７ＭＰａ）であることが示されている。
特開２００２－２４１２９０号公報
International Journal of Molecular Sciences, "Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in AqueousSolution", Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(11)
　宿主細胞から天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを抽出する際に、ポリペプチドの分解が生じることがあった。生産効率の観点の他、特に成形体のような機械的特性を要求される用途への応用を考慮すると、ポリペプチドの分解はできるだけ抑制されることが望ましい。
　そこで、本発明の一側面の目的は、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を、ポリペプチドの分解を抑制しながら、宿主細胞からの抽出によって得ることにある。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、意外にも、特定の温度に加熱された水を抽出溶媒として用いることによって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを、その分解を抑制しながら宿主細胞から抽出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明のいくつかの側面は、以下に関する。
［１］
　天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、前記ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、前記水性液及びこれに溶解した前記ポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備え、
　前記所定の温度が９０℃以上１３０℃以下である、
ポリペプチド溶液を製造する方法。
［２］
　前記所定の温度が９０℃以上１２０℃未満である、［１］に記載の方法。
［３］
　前記抽出溶媒がアルコールを更に含有する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　当該方法が、前記宿主細胞及び水を含有する培養液中で前記宿主細胞に前記ポリペプチドを発現させる工程を更に備え、
　前記培養液を前記所定の温度に加熱することによって、前記ポリペプチドが、前記培養液に含まれていた水を含む前記抽出溶媒を含有する前記水性液中に抽出され、加熱される前記培養液に、前記抽出溶媒に含まれる溶媒として親水性溶媒が更に加えられてもよい、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］
　前記親水性溶媒がアルコールである、［４］に記載の方法。
［６］
　前記アルコールがエタノールを含む、［３］又は［５］に記載の方法。
［７］
　前記抽出溶媒における前記アルコールの割合が、水及び前記アルコールの合計量に対して３０質量％以下である、［３］、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］
　前記水性液が界面活性剤を更に含有する、［１］～［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］
　天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、前記ポリペプチドが溶解している溶媒と、を含有し、前記溶媒が水及びアルコールを含み、成形体を得るための成形用原液である、ポリペプチド溶液。
［１０］
　［１］～［８］のいずれか１項に記載の方法によって得られたポリペプチド溶液を成形用原液として用いた成形によって、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を形成する工程を備える、成形体を製造する方法。
［１１］
　前記ポリペプチド成形体が繊維又はフィルムである、［１０］に記載の方法。
　本発明の一側面によれば、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を、ポリペプチドの分解を抑制しながら、宿主細胞からの抽出によって得ることができる。さらに、本発明の一側面は、特殊な高圧容器を必ずしも必要としない点でも、従来の方法と比較して有利である。
実施例で得られたポリペプチド溶液中のポリペプチド（改変フィブロイン）のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果を示す写真である。 実施例で得られたポリペプチド溶液中のポリペプチド（改変フィブロイン）のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果を示す写真である。 実施例で得られたポリペプチド溶液中のポリペプチド（改変フィブロイン）のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果を示す写真である。 実施例で得られたポリペプチド溶液中のポリペプチド（改変フィブロイン）のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析の結果を示す写真である。
　以下、本発明のいくつかの実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
１．ポリペプチド溶液を製造する方法
　ポリペプチド溶液を得る方法の一実施形態は、宿主細胞及び水を含有する培養液中で宿主細胞に天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現させる工程と、ポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、水性液及びこれに溶解したポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程とを有する。
　培養液中での宿主細胞によるポリペプチドの発現は、当業者に理解される通常の方法で行うことができる。
　ポリペプチドが抽出される宿主細胞は、培養液から回収された後の、乾燥細胞、又は湿細胞であることができる。さらに、宿主細胞は、培養されたままの状態で生存していてもよいし、何らかの手法で破砕されていてもよい。
　より高い精製度の観点から、抽出の前に、宿主細胞又はその破砕物を、陰イオン界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で洗浄してもよい。この場合の洗浄は、例えば、ポリペプチドを発現している宿主細胞を破砕すること、及び、破砕物のうちポリペプチドを含む不溶性のポリペプチド画分を回収し、これを陰イオン界面活性剤で洗浄することを含む。
　あるいは、培養液から宿主細胞又はその破砕物を回収することなく、培養液中で宿主細胞からポリペプチドを抽出することで、工程のより一層の簡略化を図ることもできる。この場合、例えば、培養液を所定の温度に加熱することによって、ポリペプチドを、培養液に含まれていた水を含む抽出溶媒を含有する水性液中に抽出してもよい。この場合、加熱される培養液に、アルコール等の親水性溶媒が抽出溶媒に含まれる溶媒として更に加えられてもよい。
　ポリペプチドの水性液中への抽出は、例えば、宿主細胞又はその破砕物を水性液と混合し、その後、宿主細胞又はその破砕物が水性液中に分散している分散液を、加熱しながら攪拌することを含むことができる。抽出が培養液中で行われる場合、培養液がそのまま、又は必要によってアルコール等の親水性溶媒が添加されてから、抽出のための分散液として用いられ得る。
　宿主細胞又はその破砕物と混合される水性液の量は、ポリペプチドを溶解できる量であればよいが、乾燥細胞又は乾燥した破砕物に対しては、質量比で１０～２０倍量であってもよい。水性液の量は、湿細胞に対しては質量比で４～５倍量であってもよい。
　抽出のための水性液の加熱温度（前記所定の温度）は、９０℃以上、１００℃以上、又は１０５℃以上であってもよく、１３０℃以下、１２０℃未満、又は１１０℃以下であってもよい。これら範囲内の温度に加熱された水性液を用いることによって、特に天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドの分解を抑制しながら、ポリペプチド溶液を得ることができる。
　水性液によるポリペプチドの抽出は、低圧下で行うことができる。例えば、大気圧下、抽出溶媒の飽和蒸気圧下、又は圧力０．０７０～０．２７ＭＰａの雰囲気下で、抽出を行ってもよい。低圧下で抽出を行うことによって、ポリペプチドの分解がより一層顕著に抑制され得る。
　ポリペプチドの抽出時間は、ポリペプチドが十分に抽出されるように設定すればよいが、ポリペプチドの分解抑制の観点から、例えば、１８０分以内、６０分以内、又は３０分以内であってもよい。
２．水性液
　水性液は、水を含む抽出溶媒を含有し、それ自体が水と任意の割合で相溶し得る単一相の均一媒体であることができる。抽出溶媒は、実質的に水のみであってもよいし、実質的に水及び親水性溶媒（特にアルコール）のみからなる混合溶媒であってもよい。水性液は、リン酸系緩衝液、又はトリス系緩衝液であってもよいし、水酸化ナトリウム等の添加によってそのｐＨが調整されていてもよい。ここで、「実質的に水のみ」とは、抽出溶媒全量のうち水の割合が例えば９８質量％以上、又は９９質量％以上であることを意味する。「実質的に水及び親水性溶媒（又はアルコール）のみ」も同様である。
　水は、特に限定されないが、ポリペプチド溶液中の夾雑物を低減するという観点から、例えば純水、蒸留水、又は超純水であってもよい。
　水と組み合わせる親水性溶媒は、通常、水と相溶し、水とともに単一相を形成し得る溶媒であればよいが、ポリペプチドの溶解性向上の観点から、極性プロトン性溶媒であってもよく、アルコールであってもよい。アルコールは炭素数１～６の低級アルコール、特にエタノールであってもよい。水及びアルコールを含む抽出溶媒を含有する水性液は、より低温で宿主細胞からポリペプチドを抽出することができる。低温での抽出によって、ポリペプチドの分解を更に抑制することができる。したがって、抽出溶媒が水及びアルコールを含む場合、ポリペプチドの抽出のための水性液の加熱温度は、１００℃以下、又は９５℃以下であってもよい。一方、抽出溶媒が実質的に水のみである場合、ポリペプチドの抽出のための水性液の加熱温度は、１００℃以上、又は１０５℃以上であってもよい。
　水及び親水性溶媒を含む抽出溶媒における水以外の親水性溶媒（例えばアルコール）の割合は、水と親水性溶媒が相分離しない範囲で設定すればよいが、例えば、抽出溶媒、又は得られるポリペプチド溶液の質量を基準として、１０質量％以上、又は２０質量％以上であってもよく、５０質量％以下、４０質量％以下又は３０質量％以下であってもよい。
　水性液は、界面活性剤を更に含有していてもよい。界面活性剤は特に限定されず、その例としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン活性剤、両性界面活性剤、及び非イオン活性剤が挙げられる。
　陰イオン界面活性剤としては、脂肪酸塩、α―スルホ脂肪酸エルテル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、及びアルキル硫酸トリエタノールアミン等が挙げられる。
　陽イオン界面活性剤としては、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウムクロリド、及びアルキルピリジニウムクロリド等が挙げられる。
　両性界面活性剤としては、アルキルカルボキシベタイン、アルキルジエチレントリアミノカルボン酸、及びアルキルアミンオキシド等が挙げられる。
　非イオン活性剤としては、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例としては、オクチルフェノールエトキシレート（CAS番号：9002-93-1、「Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００」、又は「Ｐｅｎｔｅｘ　１２２６」（ミヨシ油脂株式会社製））が挙げられる。
　水性液における界面活性剤の割合は特に限定されないが、水性液の質量を基準として０．１質量％以上、０．５質量部以上、又は１質量％以上であってもよい。界面活性剤の割合の上限は特に制限されないが、１０質量％以下、７質量％以下、又は５質量％以下であってもよい。界面活性剤の割合がこれら範囲内にあることで、目的タンパク質を効果的に水性液に溶解することができるとともに、タンパク質が溶解した後のゲル化を抑制することができる。
３．天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチド
　天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドは、天然クモ糸タンパク質、及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（人造クモ糸タンパク質）からなる群より選ばれるクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。
　天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域（無定形領域ともいう。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。
　大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状線で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びに二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、これらのしおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであってもよい。ＡＤＦ３に由来するポリペプチドは、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。
　横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ　ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
　天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドである大吐糸管しおり糸由来のタンパク質は、組換えクモ糸タンパク質であってよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このようなポリペプチドの好適な一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質（「大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチド」ともいう。）である。
　天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドである大吐糸管しおり糸由来のタンパク質として、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフのＡはアラニン残基を示す。ｎは２～２０、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、１０～１６の整数であってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は４０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する）であってもよい。その具体例として配列番号１（ＰＲＴ４１０）、配列番号２（ＰＲＴ７８７）、配列番号３（ＰＲＴ７９９）、配列番号４（ＰＲＴ４１４）、配列番号５（ＰＲＴ２０４）、配列番号６（ＰＲＴ３６３）、配列番号７（ＰＲＴ２０２）、又は配列番号８（ＰＲＴ２０７）で示されるアミノ酸配列を挙げることができる。
　天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドであって横糸タンパク質に由来のタンパク質としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ＲＥＰ２はＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８～３００の整数を示す。）を挙げることができる。その具体例としては配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）である。
　前記組換えクモ糸タンパク質（ポリペプチド）は、組換えの対象となる天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅してクローニングするか、若しくは化学的に合成することにより遺伝子を得ることができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して遺伝子を合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、前記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。前記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。前記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いてもよい。宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。
４．ポリペプチド溶液
　宿主細胞からのポリペプチドの抽出によって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、ポリペプチドが溶解している溶媒とを含有するポリペプチド溶液が得られる。ポリペプチド溶液中の溶媒の一部又は全部が、抽出のために用いられた抽出溶媒であってもよい。ポリペプチド溶液は、不可避的な成分、例えばポリペプチドに含まれていた夾雑物を含み得る。
　ポリペプチド溶液は、例えば、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を得るための成形用原液（ドープ液）として用いることができる。成形用原液（ドープ液）は、例えば、繊維紡糸のための紡糸原液、又はフィルムの成膜のためのキャスト液として有用である。
　ポリペプチド溶液の粘度を、紡糸等の成形プロセスに適した粘度に調整してもよい。例えばポリペプチド溶液の粘度は、成形プロセスでの温度において１００～１０，０００ｃＰ（センチポイズ）であってもよい。ポリペプチド溶液の粘度は、例えばポリペプチドの濃度によって調整することができる。ポリペプチド溶液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定される。
５．ポリペプチドの精製方法
　ポリペプチド溶液から不要成分（主として固形分）を除去する工程を経て、ポリペプチドを精製することができる。例えば、ポリペプチドを含む上清の回収によって沈降物を分離してもよい。取扱いの簡便性から、濾過による分離又は遠心分離により沈降物を除去してもよい。濾過による分離は、例えば、ろ紙、ろ過膜などを用いて行うことができる。遠心分離の条件は、特に限定されず、例えば、１１０００×ｇで５分間行うことができる。
　精製されたポリペプチドを含むポリペプチドの溶液は、凍結乾燥により粉末のポリペプチドを回収することを必要とせず、そのまま成形用原液（ドープ液）として用いることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
１．ポリペプチド（改変フィブロイン）の準備
（１）改変フィブロイン発現株の作製
　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のクモ糸フィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）に由来する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである改変フィブロイン、及び、アラネウス・ジアデマタス（Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｓｕ）由来のクモ糸フィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０．１、ＧＩ：１２６３２８７）に由来する、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである改変フィブロインを設計した。以下、各配列番号に対応する改変フィブロインを下記の名称でいうことがある。
配列番号１：ＰＲＴ４１０
配列番号２：ＰＲＴ７８７
配列番号３：ＰＲＴ７９９
配列番号４：ＰＲＴ４１４
配列番号５：ＰＲＴ２０４
配列番号６：ＰＲＴ３６３
配列番号７：ＰＲＴ２０２
配列番号８：ＰＲＴ２０７
　各改変フィブロインをコードする核酸を合成した。それぞれの核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。合成された核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（２）ポリペプチドの発現
　得られた発現ベクターによって、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまで、約１５時間のフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターに、ＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して形質転換大腸菌を培養した。培養の間、培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍｌ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養を２０時間継続した。培養の間、培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的の改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後、２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。
（３）ポリペプチド粉末
　ＩＰＴＧを添加してから２０時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄し湿菌体を得た。洗浄後の湿菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍ　グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌することにより、沈殿物を緩衝液に溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集ポリペプチドを遠心分離により回収した。回収した凝集ポリペプチドから凍結乾燥機で水分を除き、各改変フィブロインの凍結乾燥粉末を得た。
２．溶解試験
２－１．温度
　ＰＲＴ４１０、ＰＲＴ４１４、ＰＲＴ２０４、ＰＲＴ３６３、ＰＲＴ２０２、又はＰＲＴ２０７の乾燥粉末５０ｍｇを、１０ｍＬのバイヤル瓶に量り取り、そこに純水５ｍＬを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽（ＲＣＨ－２０Ｌ、東京理化器械製）を用いて、温度を段階的に上昇させながら、各温度での水蒸気圧下で攪拌した。目視で粉末の溶解が確認された温度を、「溶解温度」として記録した。確認された各改変フィブロインの溶解温度を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図１は、１１０～１５０℃の各温度の加熱で溶解したＰＲＴ４１０のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。特に１１０～１３０℃の範囲で、タンパク質の分解を抑制しながら、タンパク質の溶液が得られていることが確認された。図中に、発光強度の比較から簡易的に求めた、未加熱のポリペプチド（Ｒ）を１００としたときのポリペプチドの残存度合いを示す。
２－２．溶媒の種類／添加剤
　ＰＲＴ７９９の乾燥粉末５０ｍｇを、１０ｍＬのバイヤル瓶に量り取り、そこに表４に示す各種溶媒５ｍＬを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽（ＲＣＨ－２０Ｌ、東京理化器械製）を用いて、温度を１１５℃まで段階的に上昇させながら、各温度での飽和蒸気圧下で攪拌した。目視で乾燥粉末の溶解が確認された温度を、「溶解温度」として記録した。分散液のゲル化の有無も目視で確認した。
　表中に示される混合溶媒の比率は、体積比である。一部の溶媒については、水酸化ナトリウム、及び塩酸の添加によってｐＨを調整した。表中で略記される成分の詳細は以下のとおりである。
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００：オクチルフェノールエトキシレート（CAS番号：9002-93-1）
Ｐｅｎｔｅｘ　１２２６：オクチルフェノールエトキシレート（ミヨシ油脂株式会社、CAS番号：9002-93-1）
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
　表中、「ゲル化」に関しては、「Ａ」はゲルの発生が実質的に認められなかったことを示し。「Ｂ」はゲルの発生がやや認められたことを示し、「Ｃ」はゲル化の発生がやや多く認められたことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＰＲＴ７９９、及びＰＲＴ７８７について上記と同様の溶解試験を行った。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
２－３．湿菌体からの抽出試験
　「１．ポリペプチド（改変フィブロイン）の準備」の操作の中で得られた、ＰＲＴ４１０、ＰＲＴ７８７、又はＰＲＴ７９９及び水を含む洗浄後の湿菌体１ｇを、１０ｍＬのバイヤル瓶に量り取り、そこに、抽出用の水性液５ｍＬを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽（ＲＣＨ－２０Ｌ、東京理化器械製）を用いて、１１０℃に加熱しながら、水蒸気圧下で１０分間、攪拌した。その後、湿菌体から抽出された各タンパク質を含むタンパク質溶液を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分析した。
　図２は、湿菌体から抽出されたＰＲＴ４１０のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。図中、各レーンの詳細は以下のとおりである。
１：市販の分子量マーカー
２：純水
３：水／エタノールの混合溶媒（水／エタノール＝７０／３０（体積比））
　図３は、湿菌体から抽出されたＰＲＴ７８７のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。図中、各レーンの水性液の詳細は以下のとおりである。
１：市販の分子量マーカー
２：水／エタノールの混合溶媒（水：エタノール＝７０：３０（体積比））
３：水／エタノールの混合溶媒（水：エタノール＝７０：３０（体積比）、ｐＨ１０（ＮａＯＨによりｐＨ調整））
４：水（ｐＨ１０（ＮａＯＨによりｐＨ調整））
　図４は、湿菌体から抽出されたＰＲＴ７９９のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。図中、各レーンの水性液の詳細は以下のとおりである。
１：市販の分子量マーカー
２：水／エタノールの混合溶媒（水：エタノール＝７０：３０（体積比））
　いずれのタンパク質も、分解を抑制しながら、湿菌体から抽出されたことが確認された。
　これらの実験結果から、水を抽出溶媒として用いることによって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドが発現している宿主細胞から、分解を抑制しながらポリペプチドを回収できることが確認された。

Claims (11)

  1. 　天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、前記ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、前記水性液及びこれに溶解した前記ポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備え、
    　前記所定の温度が９０℃以上１３０℃以下である、
    ポリペプチド溶液を製造する方法。
  2. 　前記所定の温度が９０℃以上１２０℃未満である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記抽出溶媒がアルコールを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　当該方法が、前記宿主細胞及び水を含有する培養液中で前記宿主細胞に前記ポリペプチドを発現させる工程を更に備え、
    　前記培養液を前記所定の温度に加熱することによって、前記ポリペプチドが、前記培養液に含まれていた水を含む前記抽出溶媒を含有する前記水性液中に抽出され、加熱される前記培養液に、前記抽出溶媒に含まれる溶媒として親水性溶媒が更に加えられてもよい、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記親水性溶媒がアルコールである、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記アルコールがエタノールを含む、請求項３又は５に記載の方法。
  7. 　前記抽出溶媒における前記アルコールの割合が、前記抽出溶媒の質量を基準として３０質量％以下である、請求項３、５又は６に記載の方法。
  8. 　前記水性液が界面活性剤を更に含有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、前記ポリペプチドが溶解している溶媒と、を含有し、前記溶媒が水及びアルコールを含み、成形体を得るための成形用原液である、ポリペプチド溶液。
  10. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法によって得られたポリペプチド溶液を成形用原液として用いた成形によって、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を形成する工程を備える、成形体を製造する方法。
  11. 　前記ポリペプチド成形体が繊維又はフィルムである、請求項１０に記載の方法。
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