JP2020141558A - ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法 - Google Patents
ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020141558A JP2020141558A JP2017102993A JP2017102993A JP2020141558A JP 2020141558 A JP2020141558 A JP 2020141558A JP 2017102993 A JP2017102993 A JP 2017102993A JP 2017102993 A JP2017102993 A JP 2017102993A JP 2020141558 A JP2020141558 A JP 2020141558A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- solution
- solvent
- aqueous solution
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
Abstract
【課題】天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を、ポリペプチドの分解を抑制しながら、宿主細胞からの抽出によって得ること。【解決手段】天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、水性液及びこれに溶解したポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備える、ポリペプチド溶液を製造する方法が開示される。所定の温度が90℃以上130℃以下である。【選択図】図1
Description
本発明は天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法に関する。
非特許文献1は、単離された組換えクモ糸タンパク質を高温及び高圧条件で溶解する方法を開示している。ここでは、熱及び圧力の最適な組合せが135℃及び140psi(約0.97MPa)であることが示されている。
International Journal of Molecular Sciences, "Importance of Heat andPressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in AqueousSolution", Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(11)
宿主細胞から天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを抽出する際に、ポリペプチドの分解が生じることがあった。生産効率の観点の他、特に成形体のような機械的特性を要求される用途への応用を考慮しても、ポリペプチドの分解はできるだけ抑制されることが望ましい。
そこで、本発明の一側面の目的は、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を、ポリペプチドの分解を抑制しながら、宿主細胞からの抽出によって得ることにある。
本発明者らは、鋭意検討の結果、意外にも、特定の温度に加熱された水を抽出溶媒として用いることによって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを、その分解を抑制しながら宿主細胞から抽出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明のいくつかの側面は、以下に関する。
[1]
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、前記ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、前記水性液及びこれに溶解した前記ポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備え、
前記所定の温度が90℃以上130℃以下である、
ポリペプチド溶液を製造する方法。
[2]
前記所定の温度が90℃以上120℃未満である、[1]に記載の方法。
[3]
前記抽出溶媒がアルコールを更に含有する、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
当該方法が、前記宿主細胞及び水を含有する培養液中で前記宿主細胞に前記ポリペプチドを発現させる工程を更に備え、
前記培養液を前記所定の温度に加熱することによって、前記ポリペプチドが、前記培養液に含まれていた水を含む前記抽出溶媒を含有する前記水性液中に抽出され、加熱される前記培養液に、前記抽出溶媒に含まれる溶媒として親水性溶媒が更に加えられてもよい、[1]又は[2]に記載の方法。
[5]
前記親水性溶媒がアルコールである、[4]に記載の方法。
[6]
前記アルコールがエタノールを含む、[3]又は[5]に記載の方法。
[7]
前記抽出溶媒における前記アルコールの割合が、水及び前記アルコールの合計量に対して30質量%以下である、[3]、[5]又は[6]に記載の方法。
[8]
前記水性液が界面活性剤を更に含有する、[1]〜[7]のいずれか1項に記載の方法。
[9]
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、前記ポリペプチドが溶解している溶媒と、を含有し、前記溶媒が水及びアルコールを含み、成形体を得るための成形用原液である、ポリペプチド溶液。
[10]
[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法によって得られたポリペプチド溶液を成形用原液として用いた成形によって、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を形成する工程を備える、成形体を製造する方法。
[11]
前記ポリペプチド成形体が繊維又はフィルムである、[10]に記載の方法。
[1]
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、前記ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、前記水性液及びこれに溶解した前記ポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備え、
前記所定の温度が90℃以上130℃以下である、
ポリペプチド溶液を製造する方法。
[2]
前記所定の温度が90℃以上120℃未満である、[1]に記載の方法。
[3]
前記抽出溶媒がアルコールを更に含有する、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
当該方法が、前記宿主細胞及び水を含有する培養液中で前記宿主細胞に前記ポリペプチドを発現させる工程を更に備え、
前記培養液を前記所定の温度に加熱することによって、前記ポリペプチドが、前記培養液に含まれていた水を含む前記抽出溶媒を含有する前記水性液中に抽出され、加熱される前記培養液に、前記抽出溶媒に含まれる溶媒として親水性溶媒が更に加えられてもよい、[1]又は[2]に記載の方法。
[5]
前記親水性溶媒がアルコールである、[4]に記載の方法。
[6]
前記アルコールがエタノールを含む、[3]又は[5]に記載の方法。
[7]
前記抽出溶媒における前記アルコールの割合が、水及び前記アルコールの合計量に対して30質量%以下である、[3]、[5]又は[6]に記載の方法。
[8]
前記水性液が界面活性剤を更に含有する、[1]〜[7]のいずれか1項に記載の方法。
[9]
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、前記ポリペプチドが溶解している溶媒と、を含有し、前記溶媒が水及びアルコールを含み、成形体を得るための成形用原液である、ポリペプチド溶液。
[10]
[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法によって得られたポリペプチド溶液を成形用原液として用いた成形によって、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を形成する工程を備える、成形体を製造する方法。
[11]
前記ポリペプチド成形体が繊維又はフィルムである、[10]に記載の方法。
本発明の一側面の目的によれば、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を、ポリペプチドの分解を抑制しながら、宿主細胞からの抽出によって得ることができる。さらに、本発明の一側面は、特殊な高圧容器を必ずしも必要としない点でも、従来の方法と比較して有利である。
以下、本発明のいくつかの実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
1.ポリペプチド溶液を製造する方法
ポリペプチド溶液を得る方法の一実施形態は、宿主細胞及び水を含有する培養液中で宿主細胞に天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現させる工程と、ポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、水性液及びこれに溶解したポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程とを有する。
ポリペプチド溶液を得る方法の一実施形態は、宿主細胞及び水を含有する培養液中で宿主細胞に天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現させる工程と、ポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、水性液及びこれに溶解したポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程とを有する。
培養液中での宿主細胞によるポリペプチドの発現は、当業者に理解される通常の方法で行うことができる。
ポリペプチドが抽出される宿主細胞は、培養液から回収された後の、乾燥細胞、又は湿細胞であることができる。さらに、宿主細胞は、生存し宿主細胞を培養したままの状態であってもよいし、何らかの手法で破砕されていてもよい。
より高い精製度の観点から、抽出の前に、宿主細胞又はその破砕物を、陰イオン界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS))で洗浄してもよい。この場合の洗浄は、例えば、ポリペプチドを発現している宿主細胞を破砕すること、及び、破砕物のうちポリペプチドを含む不溶性のポリペプチド画分を回収し、これを陰イオン界面活性剤で洗浄することを含む。
あるいは、培養液から宿主細胞又はその破砕物を回収することなく、培養液中で宿主細胞からポリペプチドを抽出することで、工程のより一層の簡略化を図ることもできる。この場合、例えば、培養液を所定の温度に加熱することによって、ポリペプチドを、培養液に含まれていた水を含む抽出溶媒を含有する水性液中に抽出してもよい。この場合、加熱される培養液に、アルコール等の親水性溶媒が抽出溶媒に含まれる溶媒として更に加えられてもよい。
ポリペプチドの水性液中への抽出は、例えば、宿主細胞又はその破砕物を水性液と混合し、その後、宿主細胞又はその破砕物が水性液中に分散している分散液を、加熱しながら攪拌することを含むことができる。抽出が培養液中で行われる場合、培養液がそのまま、又は必要によってアルコール等の親水性溶媒が添加されてから、抽出のための分散液として用いられ得る。
宿主細胞又はその破砕物と混合される水性液の量は、ポリペプチドを溶解できる量であればよいが、乾燥細胞又は乾燥した破砕物に対しては、質量比で10〜20倍量であってもよい。水性液の量は、湿細胞に対しては質量比で4〜5倍量であってもよい。
抽出のための水性液の加熱温度(前記所定の温度)は、90℃以上、100℃以上、又は105℃以上であってもよく、130℃以下、120℃未満、又は110℃以下であってもよい。これら範囲内の温度に加熱された水性液を用いることによって、特に天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドの分解を抑制しながら、ポリペプチド溶液を得ることができる。
水性液によるポリペプチドの抽出は、低圧下で行うことができる。例えば、大気圧下、抽出溶媒の飽和蒸気圧下、又は圧力0.070〜0.27MPaの雰囲気下で、抽出を行ってもよい。低圧下で抽出を行うことによって、ポリペプチドの分解がより一層顕著に抑制され得る。
ポリペプチドの抽出時間は、ポリペプチドが十分に抽出されるように設定すればよいが、ポリペプチドの分解抑制の観点から、例えば、180分以内、60分以内、又は30分以内であってもよい。
2.水性液
水性液は、水を含む抽出溶媒を含有し、それ自体が水と任意の割合で相溶し得る単一相の均一媒体であることができる。抽出溶媒は、実質的に水のみであってもよいし、実質的に水及び親水性溶媒(特にアルコール)のみからなる混合溶媒であってもよい。水性液は、リン酸系緩衝液、又はトリス系緩衝液であってもよいし、水酸化ナトリウム等の添加によってそのpHが調整されていてもよい。ここで、「実質的に水のみ」とは、抽出溶媒全量のうち水の割合が例えば98質量%以上、又は99質量%以上であることを意味する。「実質的に水及び親水性溶媒(又はアルコール)のみ」も同様である。
水性液は、水を含む抽出溶媒を含有し、それ自体が水と任意の割合で相溶し得る単一相の均一媒体であることができる。抽出溶媒は、実質的に水のみであってもよいし、実質的に水及び親水性溶媒(特にアルコール)のみからなる混合溶媒であってもよい。水性液は、リン酸系緩衝液、又はトリス系緩衝液であってもよいし、水酸化ナトリウム等の添加によってそのpHが調整されていてもよい。ここで、「実質的に水のみ」とは、抽出溶媒全量のうち水の割合が例えば98質量%以上、又は99質量%以上であることを意味する。「実質的に水及び親水性溶媒(又はアルコール)のみ」も同様である。
水は、特に限定されないが、ポリペプチド溶液中の夾雑物を低減するという観点から、例えば純水、蒸留水、又は超純水であってもよい。
水と組み合わせる親水性溶媒は、通常、水と相溶し、水とともに単一相を形成し得る溶媒であればよいが、ポリペプチドの溶解性向上の観点から、極性プロトン性溶媒であってもよく、アルコールであってもよい。アルコールは炭素数1〜6の低級アルコール、特にエタノールであってもよい。水及びアルコールを含む抽出溶媒を含有する水性液は、より低温で宿主細胞からポリペプチドを抽出することができる。低温での抽出によって、ポリペプチドの分解を更に抑制することができる。したがって、抽出溶媒が水及びアルコールを含む場合、ポリペプチドの抽出のための水性液の加熱温度は、100℃以下、又は95℃以下であってもよい。一方、抽出溶媒が実質的に水のみである場合、ポリペプチドの抽出のための水性液の加熱温度は、100℃以上、又は105℃以上であってもよい。
水及び親水性溶媒を含む抽出溶媒における水以外の親水性溶媒(例えばアルコール)の割合は、水と親水性溶媒が相分離しない範囲で設定すればよいが、例えば、抽出溶媒、又は得られるポリペプチド溶液の質量を基準として、10質量%以上、又は20質量%以上であってもよく、50質量%以下、40質量%以下又は30質量%以下であってもよい。
水性液は、界面活性剤を更に含有していてもよい。界面活性剤は特に限定されず、その例としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン活性剤、両性界面活性剤、及び非イオン活性剤が挙げられる。
陰イオン界面活性剤としては、脂肪酸塩、α―スルホ脂肪酸エルテル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、及びアルキル硫酸トリエタノールアミン等が挙げられる。
陽イオン界面活性剤としては、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウムクロリド、及びアルキルピリジニウムクロリド等が挙げられる。
両性界面活性剤としては、アルキルカルボキシベタイン、アルキルジエチレントリアミノカルボン酸、及びアルキルアミンオキシド等が挙げられる。
非イオン活性剤としては、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例としては、オクチルフェノールエトキシレート(CAS番号:9002-93-1、「Triton X−100」、又は「Pentex 1226」(ミヨシ油脂株式会社製))が挙げられる。
水性液における界面活性剤の割合は特に限定されないが、水性液の質量を基準として0.1質量%以上、0.5質量部以上、又は1質量%以上であってもよい。界面活性剤の割合の上限は特に制限されないが、10質量%以下、7質量%以下、又は5質量%以下であってもよい。界面活性剤の割合がこれら範囲内にあることで、目的タンパク質を効果的に水性液に溶解することができるとともに、タンパク質が溶解した後のゲル化を抑制することができる。
3.天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチド
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドは、天然クモ糸タンパク質、及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド(人造クモ糸タンパク質)からなる群より選ばれるクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドは、天然クモ糸タンパク質、及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド(人造クモ糸タンパク質)からなる群より選ばれるクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。
天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域(無定形領域とも言う。)からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。
大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状線で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)に由来する大瓶状腺スピドロインMaSp1及びMaSp2、並びに二ワオニグモ(Araneus diadematus)に由来するADF3及びADF4が挙げられる。ADF3は、ニワオニグモの2つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、これらのしおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであってもよい。ADF3に由来するポリペプチドは、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。
横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺(flagelliform gland)で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)に由来する鞭毛状絹タンパク質(flagelliform silk protein)が挙げられる。
天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドである大吐糸管しおり糸由来のタンパク質は、組換えクモ糸タンパク質であってよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このようなポリペプチドの好適な一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質(「大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチド」ともいう。)である。
天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドである大吐糸管しおり糸由来のタンパク質として、例えば、式1:[(A)nモチーフ−REP]mで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式1中、(A)nモチーフの、Aはアラニン残基を示す。nは2〜20、4〜20、8〜20、10〜20、4〜16、8〜16、10〜16の整数であってもよい。(A)nモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は40%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、又は100%(アラニン残基のみで構成されることを意味する)であってもよい。その具体例として配列番号1(PRT410)、配列番号2(PRT787)、配列番号3(PRT799)、配列番号4(PRT414)、配列番号5(PRT204)、配列番号6(PRT363)、配列番号7(PRT202)、又は配列番号8(PRT207)で示されるアミノ酸配列を挙げることができる。
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドであって横糸タンパク質に由来のタンパク質としては、例えば、式2:[REP2]oで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式2中、REP2はGly−Pro−Gly−Gly−Xから構成されるアミノ酸配列を示し、Xはアラニン(Ala)、セリン(Ser)、チロシン(Tyr)及びバリン(Val)からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。oは8〜300の整数を示す。)を挙げることができる。その具体例としては配列番号9で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号9で示されるアミノ酸配列は、NCBIデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列(NCBIアクセッション番号:AAF36090、GI:7106224)のリピート部分及びモチーフに該当するN末端から1220残基目から1659残基目までのアミノ酸配列(PR1配列と記す。)である。
前記組換えクモ糸タンパク質(ポリペプチド)は、組換えの対象となる天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などで増幅してクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、NCBIのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、AKTA oligopilot plus 10/100(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)などで自動合成したオリゴヌクレオチドをPCRなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、前記のアミノ酸配列のN末端に開始コドン及びHis10タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。前記発現ベクターとしては、DNA配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。前記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Rosetta(DE3)を用いる場合は、pET22b(+)プラスミドベクター、pColdプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、pET22b(+)プラスミドベクターを用いることが好ましい。宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。
4.ポリペプチド溶液
宿主細胞からのポリペプチドの抽出によって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、ポリペプチドが溶解している溶媒とを含有するポリペプチド溶液が得られる。ポリペプチド溶液中の溶媒の一部又は全部が、抽出のために用いられた抽出溶媒であってもよい。ポリペプチド溶液は、不可避的な成分、例えばポリペプチドに含まれていた夾雑物を含み得る。
宿主細胞からのポリペプチドの抽出によって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、ポリペプチドが溶解している溶媒とを含有するポリペプチド溶液が得られる。ポリペプチド溶液中の溶媒の一部又は全部が、抽出のために用いられた抽出溶媒であってもよい。ポリペプチド溶液は、不可避的な成分、例えばポリペプチドに含まれていた夾雑物を含み得る。
ポリペプチド溶液は、例えば、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を得るための成形用原液(ドープ液)として用いることができる。成形用原液(ドープ液)は、例えば、繊維紡糸のための紡糸原液、又はフィルムの成膜のためのキャスト液として有用である。
ポリペプチド溶液の粘度を、紡糸等の成形プロセスに適した粘度に調整してもよい。例えばポリペプチド溶液の粘度は、成形プロセスでの温度において100〜10,000cP(センチポイズ)であってもよい。ポリペプチド溶液の粘度は、例えばポリペプチドの濃度によって調整することができる。ポリペプチド溶液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“EMS粘度計”を使用して測定される。
5.ポリペプチドの精製方法
ポリペプチド溶液から不要成分(主として固形分)を除去する工程を経て、ポリペプチドを精製することができる。例えば、ポリペプチドを含む上清の回収によって沈降物を分離してもよい。取扱いの簡便性から、濾過による分離又は遠心分離により沈降物を除去することが好ましい。濾過による分離は、例えば、ろ紙、ろ過膜などを用いて行うことができる。遠心分離の条件は、特に限定されず、例えば、11000×gで5分間行うことができる。
ポリペプチド溶液から不要成分(主として固形分)を除去する工程を経て、ポリペプチドを精製することができる。例えば、ポリペプチドを含む上清の回収によって沈降物を分離してもよい。取扱いの簡便性から、濾過による分離又は遠心分離により沈降物を除去することが好ましい。濾過による分離は、例えば、ろ紙、ろ過膜などを用いて行うことができる。遠心分離の条件は、特に限定されず、例えば、11000×gで5分間行うことができる。
精製されたポリペプチドを含むポリペプチドの溶液は、凍結乾燥により粉末のポリペプチドを回収することを必要とせず、そのまま成形用原液(ドープ液)として用いることができる。
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
1.ポリペプチド(改変フィブロイン)の準備
(1)改変フィブロイン発現株の作製
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のクモ糸フィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)に由来する、配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである改変フィブロイン、及び、アラネウス・ジアデマタス(Araneus diadematsu)由来のクモ糸フィブロイン(GenBankアクセッション番号:AAC47010.1、GI:1263287)に由来する、配列番号5、配列番号6、配列番号7、又は配列番号8で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである改変フィブロインを設計した。以下、各配列番号に対応する改変フィブロインを下記の名称でいうことがある。
配列番号1:PRT410
配列番号2:PRT787
配列番号3:PRT799
配列番号4:PRT414
配列番号5:PRT204
配列番号6:PRT363
配列番号7:PRT202
配列番号8:PRT207
(1)改変フィブロイン発現株の作製
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のクモ糸フィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)に由来する、配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである改変フィブロイン、及び、アラネウス・ジアデマタス(Araneus diadematsu)由来のクモ糸フィブロイン(GenBankアクセッション番号:AAC47010.1、GI:1263287)に由来する、配列番号5、配列番号6、配列番号7、又は配列番号8で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである改変フィブロインを設計した。以下、各配列番号に対応する改変フィブロインを下記の名称でいうことがある。
配列番号1:PRT410
配列番号2:PRT787
配列番号3:PRT799
配列番号4:PRT414
配列番号5:PRT204
配列番号6:PRT363
配列番号7:PRT202
配列番号8:PRT207
各改変フィブロインをコードする核酸を合成した。それぞれの核酸には、5’末端にNdeIサイト及び終止コドン下流にEcoRIサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター(pUC118)にクローニングした。合成された核酸をNdeI及びEcoRIで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターpET−22b(+)に組換えて発現ベクターを得た。
(2)ポリペプチドの発現
得られた発現ベクターによって、大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む100mLのシード培養用培地(表1)にOD600が0.005となるように添加した。培養液温度を30℃に保ち、OD600が5になるまで、約15時間のフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
得られた発現ベクターによって、大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む100mLのシード培養用培地(表1)にOD600が0.005となるように添加した。培養液温度を30℃に保ち、OD600が5になるまで、約15時間のフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
当該シード培養液を500mlの生産培地(表2)を添加したジャーファーメンターに、OD600が0.05となるように添加した。培養液温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して形質転換大腸菌を培養した。培養の間、培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液(グルコース455g/1L、Yeast Extract 120g/1L)を1ml/分の速度で添加した。培養液温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して培養を20時間継続した。培養の間、培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。その後、1Mのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養液に対して終濃度1mMになるよう添加し、目的の改変フィブロインを発現誘導させた。IPTG添加後、20時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。IPTG添加前とIPTG添加後の培養液から調製した菌体を用いてSDS−PAGEを行い、IPTG添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。
(3)ポリペプチド粉末
IPTGを添加してから20時間後に回収した菌体を20mM Tris−HCl buffer(pH7.4)で洗浄し湿菌体を得た。洗浄後の湿菌体を約1mMのPMSFを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8M グアニジン塩酸塩、10mM リン酸二水素ナトリウム、20mM NaCl、1mM Tris−HCl、pH7.0)で懸濁し、60℃で30分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集ポリペプチドを遠心分離により回収した。回収した凝集ポリペプチドから凍結乾燥機で水分を除き、各改変フィブロインの凍結乾燥粉末を得た。
IPTGを添加してから20時間後に回収した菌体を20mM Tris−HCl buffer(pH7.4)で洗浄し湿菌体を得た。洗浄後の湿菌体を約1mMのPMSFを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mM Tris−HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8M グアニジン塩酸塩、10mM リン酸二水素ナトリウム、20mM NaCl、1mM Tris−HCl、pH7.0)で懸濁し、60℃で30分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集ポリペプチドを遠心分離により回収した。回収した凝集ポリペプチドから凍結乾燥機で水分を除き、各改変フィブロインの凍結乾燥粉末を得た。
2.溶解試験
2−1.温度
PRT410、PRT414、PRT204、PRT363、PRT202、又はPRT207の乾燥粉末50mgを、10mLのバイヤル瓶に量り取り、そこに純水5mLを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽(RCH−20L、東京理化器械製)を用いて、温度を段階的に上昇させながら、各温度での水蒸気圧下で攪拌した。目視で粉末の溶解が確認された温度を、「溶解温度」として記録した。確認された各改変フィブロインの溶解温度を表3に示す。
2−1.温度
PRT410、PRT414、PRT204、PRT363、PRT202、又はPRT207の乾燥粉末50mgを、10mLのバイヤル瓶に量り取り、そこに純水5mLを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽(RCH−20L、東京理化器械製)を用いて、温度を段階的に上昇させながら、各温度での水蒸気圧下で攪拌した。目視で粉末の溶解が確認された温度を、「溶解温度」として記録した。確認された各改変フィブロインの溶解温度を表3に示す。
図1は、110〜150℃の各温度の加熱で溶解したPRT410のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による分析の結果を示す写真である。特に110〜130℃の範囲で、タンパク質の分解を抑制しながら、タンパク質の溶液が得られていることが確認された。図中に、発光強度の比較から簡易的に求めた、未加熱のポリペプチド(R)を100としたときのポリペプチドの残存度合いを示す。
2−2.溶媒の種類/添加剤
PRT799の乾燥粉末50mgを、10mLのバイヤル瓶に量り取り、そこに表4に示す各種溶媒5mLを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽(RCH−20L、東京理化器械製)を用いて、温度を115℃まで段階的に上昇させながら、各温度での飽和蒸気圧下で攪拌した。目視で乾燥粉末の溶解が確認された温度を、「溶解温度」として記録した。分散液のゲル化の有無も目視で確認した。
PRT799の乾燥粉末50mgを、10mLのバイヤル瓶に量り取り、そこに表4に示す各種溶媒5mLを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽(RCH−20L、東京理化器械製)を用いて、温度を115℃まで段階的に上昇させながら、各温度での飽和蒸気圧下で攪拌した。目視で乾燥粉末の溶解が確認された温度を、「溶解温度」として記録した。分散液のゲル化の有無も目視で確認した。
表中に示される混合溶媒の比率は、体積比である。一部の溶媒については、水酸化ナトリウム、及び塩酸の添加によってpHを調整した。表中で略記される成分の詳細は以下のとおりである。
Triton X−100:オクチルフェノールエトキシレート(CAS番号:9002-93-1)
Pentex 1226:オクチルフェノールエトキシレート(ミヨシ油脂株式会社、CAS番号:9002-93-1)
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
Triton X−100:オクチルフェノールエトキシレート(CAS番号:9002-93-1)
Pentex 1226:オクチルフェノールエトキシレート(ミヨシ油脂株式会社、CAS番号:9002-93-1)
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
表中、「ゲル化」に関しては、「A」はゲルの発生が実質的に認められなかったことを示し。「B」はゲルの発生がやや認められたことを示し、「C」はゲル化の発生がやや多く認められたことを示す。
PRT799、及びPRT787について上記と同様の溶解試験を行った。結果を表5に示す。
2−3.湿菌体からの抽出試験
「1.ポリペプチド(改変フィブロイン)の準備」の操作の中で得られた、PRT410、PRT787、又はPRT799及び水を含む洗浄後の湿菌体1gを、10mLのバイヤル瓶に量り取り、そこに、抽出用の水性液5mLを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽(RCH−20L、東京理化器械製)を用いて、110℃に加熱しながら、水蒸気圧下で10分間、攪拌した。その後、湿菌体から抽出された各タンパク質を含むタンパク質溶液を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分析した。
「1.ポリペプチド(改変フィブロイン)の準備」の操作の中で得られた、PRT410、PRT787、又はPRT799及び水を含む洗浄後の湿菌体1gを、10mLのバイヤル瓶に量り取り、そこに、抽出用の水性液5mLを加えた。得られた分散液を、スターラー付きアルミブロック恒温槽(RCH−20L、東京理化器械製)を用いて、110℃に加熱しながら、水蒸気圧下で10分間、攪拌した。その後、湿菌体から抽出された各タンパク質を含むタンパク質溶液を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分析した。
図2は、湿菌体から抽出されたPRT410のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による分析の結果を示す写真である。図中、各レーンの詳細は以下のとおりである。
1:市販の分子量マーカー
2:純水
3:水/エタノールの混合溶媒(水/エタノール=70/30(体積比))
1:市販の分子量マーカー
2:純水
3:水/エタノールの混合溶媒(水/エタノール=70/30(体積比))
図3は、湿菌体から抽出されたPRT787のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による分析の結果を示す写真である。図中、各レーンの水性液の詳細は以下のとおりである。
1:市販の分子量マーカー
2:水/エタノールの混合溶媒(水:エタノール=70:30(体積比))
3:水/エタノールの混合溶媒(水:エタノール=70:30(体積比)、pH10(NaOHによりpH調整))
4:水(pH10(NaOHによりpH調整))
1:市販の分子量マーカー
2:水/エタノールの混合溶媒(水:エタノール=70:30(体積比))
3:水/エタノールの混合溶媒(水:エタノール=70:30(体積比)、pH10(NaOHによりpH調整))
4:水(pH10(NaOHによりpH調整))
図4は、湿菌体から抽出されたPRT799のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による分析の結果を示す写真である。図中、各レーンの水性液の詳細は以下のとおりである。
1:市販の分子量マーカー
2:水/エタノールの混合溶媒(水:エタノール=70:30(体積比))
1:市販の分子量マーカー
2:水/エタノールの混合溶媒(水:エタノール=70:30(体積比))
いずれのタンパク質も、分解を抑制しながら、湿菌体から抽出されたことが確認された。
これらの実験結果から、水を抽出溶媒として用いることによって、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドが発現している宿主細胞から、分解を抑制しながらポリペプチドを回収できることが確認された。
Claims (11)
- 天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを発現している宿主細胞又はその破砕物から、前記ポリペプチドを、水を含む抽出溶媒を含有し所定の温度に加熱された水性液中に抽出して、前記水性液及びこれに溶解した前記ポリペプチドを含有するポリペプチド溶液を得る工程を備え、
前記所定の温度が90℃以上130℃以下である、
ポリペプチド溶液を製造する方法。 - 前記所定の温度が90℃以上120℃未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記抽出溶媒がアルコールを更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 当該方法が、前記宿主細胞及び水を含有する培養液中で前記宿主細胞に前記ポリペプチドを発現させる工程を更に備え、
前記培養液を前記所定の温度に加熱することによって、前記ポリペプチドが、前記培養液に含まれていた水を含む前記抽出溶媒を含有する前記水性液中に抽出され、加熱される前記培養液に、前記抽出溶媒に含まれる溶媒として親水性溶媒が更に加えられてもよい、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記親水性溶媒がアルコールである、請求項4に記載の方法。
- 前記アルコールがエタノールを含む、請求項3又は5に記載の方法。
- 前記抽出溶媒における前記アルコールの割合が、前記抽出溶媒の質量を基準として30質量%以下である、請求項3、5又は6に記載の方法。
- 前記水性液が界面活性剤を更に含有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドと、前記ポリペプチドが溶解している溶媒と、を含有し、前記溶媒が水及びアルコールを含み、成形体を得るための成形用原液である、ポリペプチド溶液。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法によって得られたポリペプチド溶液を成形用原液として用いた成形によって、ポリペプチドを含有するポリペプチド成形体を形成する工程を備える、成形体を製造する方法。
- 前記ポリペプチド成形体が繊維又はフィルムである、請求項10に記載の方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017102993A JP2020141558A (ja) | 2017-05-24 | 2017-05-24 | ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法 |
PCT/JP2018/020038 WO2018216779A1 (ja) | 2017-05-24 | 2018-05-24 | ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017102993A JP2020141558A (ja) | 2017-05-24 | 2017-05-24 | ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020141558A true JP2020141558A (ja) | 2020-09-10 |
Family
ID=64396513
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017102993A Pending JP2020141558A (ja) | 2017-05-24 | 2017-05-24 | ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2020141558A (ja) |
WO (1) | WO2018216779A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020110063A (ja) * | 2019-01-09 | 2020-07-27 | Spiber株式会社 | 改変フィブロイン |
JP7458619B2 (ja) | 2019-01-31 | 2024-04-01 | Spiber株式会社 | フィブロイン繊維の製造方法及びフィブロイン溶液 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103502516B (zh) * | 2011-06-01 | 2015-04-22 | 丝芭博株式会社 | 人造多肽纤维及其制造方法 |
JP5427322B2 (ja) * | 2011-11-02 | 2014-02-26 | スパイバー株式会社 | ポリペプチドの溶液とこれを用いた人造ポリペプチド繊維の製造方法及びポリペプチドの精製方法 |
CA2878656A1 (en) * | 2012-07-09 | 2014-01-16 | Trustees Of Tufts College | High molecular weight silk fibroin and uses thereof |
MY190347A (en) * | 2016-08-10 | 2022-04-15 | Spiber Inc | Production method for insoluble recombinant protein aggregate |
-
2017
- 2017-05-24 JP JP2017102993A patent/JP2020141558A/ja active Pending
-
2018
- 2018-05-24 WO PCT/JP2018/020038 patent/WO2018216779A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018216779A1 (ja) | 2018-11-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7088511B2 (ja) | フィブロイン様タンパク質を含むコンポジット成形組成物及びその製造方法 | |
WO2017094722A1 (ja) | タンパク質溶液を製造する方法 | |
EP2940032B1 (en) | Extraction method for hydrophilic recombinant protein | |
JP5796147B2 (ja) | ポリペプチド多孔質体及びその製造方法 | |
JP5782580B2 (ja) | ポリペプチドヒドロゲル及びその製造方法 | |
JP5823079B2 (ja) | ポリペプチドパーティクルの製造方法 | |
WO2018043698A1 (ja) | モールド成形体及びモールド成形体の製造方法 | |
JP7436065B2 (ja) | タンパク質の回収方法 | |
JP6077570B2 (ja) | 親水性組換えタンパク質の粗精製方法 | |
JP2013523665A (ja) | 不溶性の標的タンパク質の分離 | |
KR20120076346A (ko) | 실크 도프의 제조 방법 | |
WO2018216779A1 (ja) | ポリペプチド溶液及びこれを製造する方法、並びにポリペプチド成形体を製造する方法 | |
WO2019151435A1 (ja) | カーボンナノチューブ分散剤、カーボンナノチューブ分散液、及びカーボンナノチューブの分散方法 | |
Riley et al. | Bioproduction and characterization of a pH responsive self‐assembling peptide | |
WO2018164195A1 (ja) | 精製されたタンパク質を製造する方法 | |
JPWO2018207827A1 (ja) | ポリペプチド溶液、及びポリペプチド繊維の製造方法、並びに人造ポリペプチド | |
JP2019131923A (ja) | フィブロイン繊維の製造方法 | |
WO2019189802A1 (ja) | 組換え構造タンパク質の製造方法、組換え構造タンパク質、タンパク質成形体及びタンパク質成形体の製造方法 | |
WO2019194231A1 (ja) | タンパク質組成物及びその製造方法 | |
JP7308507B2 (ja) | 組換え構造タンパク質の製造方法及び分析方法、並びにタンパク質成形体の製造方法 | |
JP2018178296A (ja) | タンパク質溶解用溶媒、タンパク質溶液、タンパク質繊維の製造方法、及び目的タンパク質の精製方法 | |
WO2019131924A1 (ja) | モールド成形体及びモールド成形体の製造方法 | |
WO2019146765A1 (ja) | タンパク質成形体用素材、タンパク質成形体、及びタンパク質成形体の製造方法 | |
JP2020055762A (ja) | モールド成形体の製造方法 |