CN103502516B - 人造多肽纤维及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的人造多肽纤维为以多肽为主成分的人造纤维，其应力为350MPa以上、韧性为138MJ/m3以上。本发明的人造多肽纤维的制造方法中，所述人造多肽纤维是通过将含有天然型蛛丝蛋白来源的多肽的纺丝液（6）纺丝，进行至少两阶段的拉伸而得到的，其中，所述至少两阶段的拉伸包括湿热下的第一阶段拉伸（3）和干热下的第二阶段拉伸（4）。由此，本发明提供应力和断裂伸长率适度、韧性高的人造多肽纤维及其制造方法。
Description
技术领域
本发明涉及合成蛋白纤维的一种即人造多肽纤维及其制造方法。
背景技术
蛛丝纤维已知是具有高强度和韧性的纤维，其比高强度钢、尼龙6纤维、芳纶纤维、碳纤维等具有更高的强度和韧性。而且，还具有不以石油为原料、可将原料生物质化的优点。关于人工蛛丝纤维，也提出了一些技术方案。例如，专利文献1中提出了将合成蛋白纺丝溶液以5～10μl/min的速度从纺丝头挤出到由90%甲醇构成的凝固浴中制成纤维的方案。专利文献2中提出了具有1μm以上的直径和5mm以上的长度、且具有200MPa或200MPa以上的抗拉强度的纤维。非专利文献1中公开了在甲醇浴和水浴中以5倍的拉伸倍率进行拉伸而得到的强度为1.91～2.26g/d、伸长率为43.4～59.6%的拉伸丝。非专利文献2中公开了通过将拉伸倍率设定为5倍而得到的应力为600MPa、伸长率为25%的拉伸丝。非专利文献3中公开了使其在蒸汽中滞留5分钟、拉伸至5倍而得到的应力为280～350MPa、伸长率为30～40%的拉伸丝。
但是，以往的人造多肽纤维的韧性还不充分，期望有具有更高应力的强韧的纤维。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2004-503204号公报
专利文献2：日本特表2009-521921号公报
非专利文献
非专利文献1：Anthoula Lazaris，et.al.，“Spider Silk Fiber Spun fromSoluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells”，Science，295，p472，2002年1月18日
非专利文献2：Xiao-XiaXia，et.al.，”Native-sized recombinant spider silkprotein produced in metabolically engineered Escherichia coil results in a strongfiber”，PNAS，vol.107，No.32，p14059-14063，2010年8月10日
非专利文献3：M.Elice，et.al.，“Bioinspired Fibers Follow the Track ofNatural Spider Silk”，Macromolecules，Vol.44，No.5，p1166-1176，2011年4月2日
发明内容
发明所要解决的课题
为了解决上述以往的问题，本发明提供应力和韧性高的人造多肽纤维及其制造方法。
用于解决课题的手段
本发明的人造多肽纤维的特征在于，其为以多肽为主成分的人造纤维，其应力为350MPa以上、韧性为138MJ/m3以上。
本发明的人造多肽纤维的制造方法的特征在于，所述人造多肽纤维是通过将含有天然型蛛丝蛋白（spider silk proteins）来源的多肽的纺丝液纺丝、并至少进行两阶段的拉伸而得到的，其中，所述至少两阶段的拉伸包括湿热下的第一阶段拉伸和干热下的第二阶段拉伸。
发明效果
本发明通过将由人造多肽构成的未拉伸纤维在湿热和干式加热的至少两阶段下进行拉伸，从而能够提供应力和韧性高的人造多肽纤维及其制造方法。即，能够实现应力为350MPa以上、韧性为138MJ/m3以上的人造多肽纤维。当应力高、韧性高时，对于与金属、树脂、橡胶等的复合材料来说是有利的。
附图说明
图1是表示本发明的一个实施例的制造工序的说明图。
图2A-B是表示本发明的另一实施例的制造工序的说明图，图2A表示纺丝工序-第一阶段拉伸工序、图2B表示第二阶段拉伸工序。
图3是本发明的实施例1中得到的纤维的应力-变位（变形）曲线。
图4是本发明的实施例2中得到的纤维的应力-变位（变形）曲线。
图5是本发明的实施例3中得到的纤维的应力-变位（变形）曲线。
图6是本发明的实施例4中得到的纤维的应力-变位（变形）曲线。
图7是本发明的实施例5中得到的纤维的应力-变位（变形）曲线。
图8是比较例1中得到的纤维的应力-变位（变形）曲线。
图9是比较例2中得到的纤维的应力-变位（变形）曲线。
具体实施方式
（1）多肽
本发明的人造多肽纤维以多肽为主成分。本发明中，主成分是指含有80质量%以上，更优选含有90质量%以上，进一步优选含有95质量%以上。需要说明的是，本发明的人造多肽纤维在不损害本发明效果的范围内还可以含有除多肽以外的其它成分。本发明中，作为原料，优选使用天然型蛛丝蛋白来源的多肽。天然型蛛丝蛋白来源的多肽包括天然型蛛丝蛋白的突变体、类似物或衍生物等。所述多肽只要是天然型蛛丝蛋白来源的即可，没有特殊限定。所述多肽从强韧性优异的观点出发，优选为由蜘蛛的大壶状腺产生的大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽。作为所述大吐丝管拖丝蛋白，可列举出Nephila clavipes来源的大壶状腺丝蛋白（spidroin）MaSp1、MaSp2、Araneus diadematus来源的ADF3、ADF4等。所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽包括大吐丝管拖丝蛋白的突变体、类似物或衍生物等。
作为所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽，可列举出包含2个以上、优选5个以上、更优选10个以上的式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单元的多肽。或者，所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽也可以为下述多肽：包含式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单元、且C末端序列为序列编号1～3中的任一个所示的氨基酸序列或与序列编号1～3中任一个所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。需要说明的是，所述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽中，式（1）：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单元可以相同也可以不同。这里，[REP1-REP2（1）]所示的氨基酸序列的单元不同包括REP1不同的情况、REP2不同的情况、REP1和REP2的任一个均不同的情况。上述大吐丝管拖丝蛋白来源的多肽在以大肠杆菌等微生物为宿主进行重组蛋白生产时，从生产率的观点出发，分子量优选为300kDa以下、更优选为200kDa以下、进一步优选为150kDa以下。
所述式（1）中，REP1为选自丙氨酸和甘氨酸中的至少一种氨基酸连续地排列2～20个残基、更优选3～16个残基、进一步优选4～12个残基、最优选5～8个残基的氨基酸序列。所述式（1）中，REP2为由2～200个残基、更优选10～150个残基、进一步优选20～100个残基、最优选20～75个残基的氨基酸构成的氨基酸序列，且所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸的总残基数相对于氨基酸残基数整体为40%以上、优选为60%以上、更优选为70%以上。
大吐丝管拖丝中，上述REP1相当于纤维内形成结晶β折叠的结晶区域，上述REP2相当于纤维内更具有柔软性且大部分缺乏整齐排列结构的无定型区域。并且，上述[REP1-REP2]相当于由结晶区域和无定型区域构成的重复区域（反复序列），该[REP1-REP2]为拖丝蛋白的特征性序列。
序列编号1所示的氨基酸序列与由ADF3（GI：1263287、NCBI）的氨基酸序列的C末端的50个残基的氨基酸构成的氨基酸序列相同，序列编号2所示的氨基酸序列与从序列编号1所示的氨基酸序列的C末端去除了20个残基后的氨基酸序列相同，序列编号3所示的氨基酸序列与从序列编号1所示的氨基酸序列的C末端去除了29个残基后的氨基酸序列相同。
作为包含上述式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单元、且C末端序列由序列编号1～3中的任一个所示的氨基酸序列或与序列编号1～3中的任一个所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的多肽，可以使用例如由序列编号4所示的氨基酸序列构成的多肽。由序列编号4所示的氨基酸序列构成的多肽是在N末端添加有由起始密码子、His10tag和HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列（序列编号为7）的ADF3的氨基酸序列中发生了下述变异的多肽：第1～13号的反复区域增加至约2倍，并且翻译在第1154号氨基酸残基处终止。由序列编号4所示的氨基酸序列构成的多肽中，C末端序列与序列编号3所示的氨基酸序列相同。
另外，作为包含所述式1：REP1-REP2（1）所示的氨基酸序列的单元、且C末端序列由序列编号1～3中的任一个所示的氨基酸序列或与序列编号1～3中的任一个所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的多肽，可以使用由序列编号4所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成，且具有由结晶区域和无定型区域构成的重复区域的蛋白。本发明中，“1个或多个”是指例如1～40个、1～35个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、或1个或数个。另外，本发明中，“1个或数个”是指1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个。
上述多肽可使用用含有编码多肽的基因的表达载体进行了转化的宿主来制造。基因的制造方法没有特别限制，将编码天然型蛛丝蛋白的基因从蜘蛛来源的细胞通过聚合酶链反应（PCR）等扩增进行克隆，或者化学地合成。基因的化学合成方法也没有特别限制，例如，可以以从NCBI的web数据库等获得的天然型蛛丝蛋白的氨基酸序列信息为基础，将利用AKTAoligopilot plus10/100（GE Healthcare Japan株式会社）等自动合成的寡核苷酸通过PCR等连接来合成。此时，由于容易进行蛋白的精制、确认，因此也可以合成编码由在上述氨基酸序列的N末端添加了由起始密码子和His10tag构成的氨基酸序列而成的氨基酸序列构成的蛋白的基因。作为上述表达载体，可以使用能够从DNA序列表达蛋白的质粒、噬菌体、病毒等。作为上述质粒型表达载体，只要在宿主细胞内能够表达目标基因、且自身能够进行扩增即可，没有特殊限定。例如作为宿主使用大肠杆菌Rosetta（DE3）时，可以使用pET22b（+）质粒载体、pCold质粒载体等。其中，从蛋白的生产率的观点出发，优选使用pET22b（+）质粒载体。作为上述宿主，例如可以使用动物细胞、植物细胞、微生物等。
（2）纺丝液
纺丝液（胶浆液）通过在上述多肽中加入溶剂并调节到可纺丝的粘度来制作。
溶剂只要能够将上述多肽溶解则可以是任何溶剂。例如当上述多肽为Araneus diadematus来源时，作为一个例子，将含有六氟异丙醇（HFIP）、六氟丙酮（HFA）、甲酸、尿素、胍、十二烷基硫酸钠（SDS）、溴化锂、氯化钙、硫氰酸锂等的水溶液等作为溶剂，适量加入，将溶液粘度调节至100～10000cP（厘泊）。将其作为纺丝液。
（3）纺丝
纺丝采用湿式纺丝。由此，将溶解有聚合物的溶剂除去（也称为脱溶剂），得到未拉伸丝。湿式纺丝中使用的凝固液只要是能够脱溶剂的溶液则可以是任何凝固液。当溶剂为HFIP时，凝固液优选使用甲醇、乙醇、2-丙醇等碳原子数为1～5的低级醇或丙酮。凝固液的温度优选为0～30℃。当在上述范围内时，纺丝稳定。将上述纺丝液挤出到凝固液中，由此得到未拉伸丝。在为具有直径为0.1～0.6mm的喷嘴的注射泵的情况下，挤出速度优选每孔为0.2～2.4ml/h。在该范围内时，纺丝稳定。进一步优选的挤出速度为每孔为0.6～2.2ml/h。凝固液槽的长度为200～500mm、未拉伸丝的牵引速度优选为1～3m/min、滞留时间优选为0.01～0.15min。在该范围内时，脱溶剂的效率高。凝固液中，可进行拉伸（前拉伸），但若考虑低级醇的蒸发，优选将凝固液维持在低温，以未拉伸丝的状态牵引。
（4）拉伸
（a）多段拉伸的作用功能
拉伸分至少两阶段进行。当然也可采用3段以上的多段拉伸。本发明中，采用两阶段以上的多段拉伸的理由非要进行描述的话在于，天然型蛛丝蛋白来源的多肽的分子难以取向，通过多段地进行拉伸，使分子多段地取向，还能够提高总拉伸倍率，结果得到韧性高的纤维。
（b）多段拉伸的内容
所述至少两阶段的拉伸包括湿热下的第一阶段拉伸和其后的干热下的第二阶段拉伸。湿热下的第一阶段拉伸也可以在上述凝固液中进行。当采用3段以上的多段拉伸时，可以采用将湿热的第一阶段拉伸分为两阶段和/或将干热的第二阶段拉伸分为两阶段等的方法。第一阶段拉伸的湿热可以在温水中加热也可以用蒸汽加热。温水中还可以加入有机溶剂等。该多段拉伸也可以在拉伸工序的任意阶段追加除湿热或干热以外的拉伸方法。
（c）第一阶段和第二阶段的拉伸条件
第一阶段拉伸优选将未拉伸丝在50～90℃的温水下拉伸2～8倍。如此，能够进行稳定的拉伸。第二阶段拉伸优选在170℃～270℃的干热下拉伸1.25～3倍。由此得到高韧性的拉伸丝。上述中，第一阶段拉伸进一步优选将未拉伸丝在75～85℃的温水中拉伸。第一阶段拉伸的拉伸倍率进一步优选为2.3～7倍。第二阶段拉伸进一步优选180℃～230℃的干热。第二阶段拉伸的拉伸倍率进一步优选为1.35～3倍。为了提高拉伸丝的韧性并稳定地得到拉伸丝，总拉伸倍率优选为超过5倍且在20倍以下、进一步优选为6倍～11倍。关于干热，作为一个例子使用电管状炉或热板。
（d）连续工序
从纺丝到拉伸可以为连续工序，也可以分为任意的工序实施。图1为表示本发明的一个实施例的制造工序的说明图。图1表示连续工序。纺丝拉伸装置10包括挤出工序1、未拉伸丝制造工序2、湿热拉伸工序3、干热拉伸工序4。纺丝液6贮藏在贮存槽7、从齿轮泵8挤出到纺丝头9。在Labscale中，可以将纺丝液充填到滚筒中，用注射泵从喷嘴挤出。被挤出的纺丝液具有空隙19地或直接供给至凝固液槽20的凝固液11内，将溶剂除去。接着，供给至拉伸浴槽21内的温水12内，进行第一阶段拉伸。拉伸由供给夹持辊13与牵引夹持辊14的速度比决定。接着，供给至干热拉伸装置17。在丝道22内进行第二阶段拉伸，制成卷丝体5。拉伸由供给夹持辊15与牵引夹持辊16的速度比决定。18a～18f为导丝器。
（e）分离工序
图2A-B为将本发明的另一实施例的制造工序分离的例子的说明图。图2A表示纺丝工序30和第一阶段拉伸工序40、图2B表示第二阶段拉伸工序50。各工序中，还可以将丝卷取或不卷取地留存在容器中。纺丝工序30中，将纺丝液32预先加入微型注射器31内，用注射泵使其沿箭头P方向移动，将纺丝液32从喷嘴33挤出，供给至凝固液槽34内的凝固液35中，制成未拉伸丝36。然后，在第一阶段拉伸工序40中，将未拉伸丝36供给至拉伸浴槽37内的温水38内，进行第一阶段拉伸，制成第一阶段拉伸丝的卷丝体39。拉伸由供给夹持辊41与牵引夹持辊42的速度比决定。接着，从卷丝体39牵出第一阶段拉伸丝，供给至干热拉伸装置43，在丝道47内进行第二阶段拉伸。拉伸由供给夹持辊45与牵引夹持辊46的速度比决定。接着，将拉伸丝卷取成卷丝体44。
如此得到人造多肽纤维。得到的人造多肽纤维的应力为350MPa以上、韧性为138MJ/m3以上。韧性由测定纤维的强伸长率时的应力-变形曲线（SS曲线）的积分值算出。图3为本发明的一个实施例中得到的纤维的韧性的说明图，表示应力-变位（变形）曲线与韧性（斜线部）。可知应力与断裂伸长率这两者高，以及韧性也高。
本发明的人造多肽纤维优选的应力为400MPa以上、更优选为590MPa以上、特别优选为620MPa以上。优选的断裂伸长率为39%以上、更优选为45%以上、进一步优选为50%以上。优选的韧性为170MJ/m3以上、更优选为240MJ/m3以上、进一步优选为260MJ/m3以上。本发明的人造多肽纤维的优选的初始弹性模量为8GPa以上、更优选为14GPa以上、进一步优选为16GPa以上。
本发明的人造多肽纤维的直径优选为5～100μm的范围。当在上述范围内时，可稳定地得到拉伸纤维。更优选的纤维直径为7～30μm的范围、进一步优选为8～25μm的范围。另外，本发明的人造多肽纤维的纤维直径均匀，纤维直径的波动率优选为5%以下。当对纤度（单位：tex或deci tex）进行计算时，纤维截面为圆形时，由基于纤维直径计算的截面积、比重和长度算出。需要说明的是，本发明的人造多肽纤维由于通过湿式纺丝而得到，因此截面并不限于圆形，包括各种形状，因此纤维直径（平均直径）是指将截面假定为圆形时的平均直径。
所述多肽优选为十字园蛛（Araneus diadematus）的两种主要的拖丝蛋白之一即ADF3来源的多肽。作为该多肽的优点，可列举出强伸长率和韧性基本上都高，且易于合成。
所述人造多肽纤维的双折射率Δn（×1000）优选为15.6以上。需要说明的是，双折射率与双折射度相同。双折射率可以用Olympus公司制的偏光显微镜并使用称为塞纳蒙（Senarmont）的补偿器来测定。测定范围为0～546nm（0～1λ）、通过计算Δn=R/直径来求出。上文中，R为用塞纳蒙的补偿器测定的延迟量（nm）。双折射率Δn（×1000）为15.6以上表示分子的取向得以进行。
本发明的人造多肽纤维可以在拉伸后使丝蛋白纤维内的多肽分子间发生化学交联。多肽中，可用于交联的官能团有例如氨基、羧基、巯基、羟基等，但并不限定于这些。多肽中所含的赖氨酸侧链的氨基可通过与谷氨酸或天冬氨酸侧链的羧基脱水缩合而通过酰胺键交联。交联可以在真空加热下进行脱水缩合反应，也可以利用碳二亚胺等脱水缩合剂使其交联。另外，还可以使用戊二醛等交联剂。另外，还可以利用转谷氨酰胺酶等酶进行交联。作为一个例子，可以利用碳二亚胺、戊二醛等交联剂使其发生交联反应。碳二亚胺用通式R1N=C=NR2（其中，R1、R2表示包含碳原子数为1～6的烷基、环烷基的有机基团。）表示，具体的化合物有1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）、1-环己基-3-（2-吗啉代乙基）碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺（DIC）等。其中，EDC、DIC的肽链的酰胺键形成能力高、易于发生交联反应，因此优选。交联处理优选在对拉伸丝赋予交联剂后在真空加热干燥下进行交联。交联剂可以将100%的交联剂赋予纤维，也可以在用碳原子数为1～5的低级醇或缓冲液等稀释后以0.005～10质量%的浓度赋予纤维。处理条件优选温度为20～45℃、3～42小时。通过交联剂的交联处理，人造多肽拉伸纤维的应力（强度）进一步提高。
实施例
以下使用实施例对本发明进一步进行具体的说明。需要说明的是，本发明并不受下述的实施例的限定。
（实施例1～5、比较例1～2）
<基因合成>
（1）ADF3Kai基因的合成
从NCBI的web数据库获得作为十字园蛛的两种主要的拖丝蛋白之一的ADF3（GI：1263287）的部分氨基酸序列，委托GenScript公司合成编码在该序列的N末端添加了由起始密码子、His10tag和HRV3C蛋白酶（人鼻病毒3C蛋白酶）识别位点构成的氨基酸序列（序列编号7）的氨基酸序列（序列编号5）的基因。其结果，获得了由序列编号8所示的碱基序列构成的导入了ADF3Kai基因的pUC57载体（基因在5’末端紧接的上游具有NdeI位点、和在5’末端紧接的下游具有XbaI位点）。其后，用NdeI和EcoRI对该基因进行限制性酶处理，重组到pET22b（+）表达载体中。
（2）ADF3Kai-Large基因的合成
以ADF3Kai为模板，使用T7启动子引物（序列编号11）和RepXbaI引物（序列编号12）进行PCR反应，对ADF3Kai的基因序列中的5’侧一半的序列（以下记为序列A。）进行扩增，将该片段重组到预先使用MightyCloning Kit（Takara Bio株式会社制）用NdeI和XbaI进行了限制性酶处理的pUC118载体中。同样地，以ADF3Kai为模板，使用XbaIRep引物（序列编号13）和T7终止子引物（序列编号14）进行PCR反应，对ADF3Kai的基因序列中3’侧一半的序列（以下记为序列B。）进行扩增，将该片段重组到预先使用Mighty Cloning Kit（Takara Bio株式会社制）用XbaI、EcoRI进行了限制性酶处理的pUC118载体中。将导入了序列A的pUC118载体用NdeI、XbaI进行限制性酶处理，将导入了序列B的pUC118载体用XbaI、EcoRI进行限制性酶处理，利用凝胶的分离对序列A和序列B的目标DNA片段进行精制。使DNA片段A、B与预先用NdeI和EcoRI进行了限制性酶处理的pET22b（+）进行连接反应，转化到大肠杆菌DH5α中。利用使用了T7启动子引物和T7终止子引物的克隆PCR，在确认了目标DNA片段插入后，将目标大小（3.6kbp）的条带从得到的克隆提取质粒，通过使用了3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems）的序列反应对全碱基序列进行确认。其结果，确认构建了序列编号9所示的ADF3Kai-Large基因。需要说明的是，ADF3Kai-Large的氨基酸序列如序列编号6所示。
（3）ADF3Kai-Large-NRSH1基因的合成
以导入了上述中得到的ADF3Kai-Large基因的pET22b（+）载体为模板，通过使用了Prime Star Mutagenesis Basal Kit（Takara Bio株式会社制）的部位特异性变异导入，使ADF3Kai-Large的氨基酸序列（序列编号6）中的与第1155号氨基酸残基甘氨酸（Gly）对应的密码子GGC变异为终止密码子TAA，在pET22b（+）上构建序列编号10所示的ADF3Kai-Large-NRSH1基因。关于变异导入的准确性，通过使用了3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems）的序列反应进行确认。需要说明的是，ADF3Kai-Large-NRSH1的氨基酸序列如序列编号4所示。
<蛋白的表达>
将包含上述得到的ADF3Kai-Large-NRSH1的基因序列的pET22b（+）表达载体转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）中。将得到的单克隆在含有氨苄青霉素的2mL的LB培养基中培养15小时后，将该培养液1.4ml添加到含有氨苄青霉素的140mL的LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下进行培养，直至培养液的OD600达到3.5。接着，将OD600为3.5的培养液与50%葡萄糖140mL一起加入到含有氨苄青霉素的7L的2×YT培养基中进一步进行培养，直至OD600达到4.0。其后，向得到的OD600为4.0的培养液中添加异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）使终浓度达到0.5mM，诱导蛋白表达。在IPTG添加后的2小时时，将培养液离心分离，回收菌体。将由IPTG添加前和IPTG添加后的培养液制备的蛋白溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果观察到依赖于IPTG添加的目标大小（约101.1kDa）的条带，从而确认了目标蛋白表达。
<精制>
将在IPTG添加2小时后回收的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液（pH为7.4）洗涤。将洗涤后的菌体悬浮于含有约1mM的PMSF的20mM Tris-HCl缓冲液（pH为7.4）中，用高压匀浆机（GEA Niro Soavi公司）使细胞破碎。将破碎的细胞离心分离，得到沉淀物。将得到的沉淀物用20mM Tris-HCl缓冲液（pH为7.4）洗涤直至达到高纯度。将洗涤后的沉淀物用7.5M UreaDB缓冲液（7.5M尿素、10mM磷酸二氢钠、20mMNaCl、1mM Tris-HCl、pH为7.0）溶解，用搅拌器搅拌，然后使用透析管（三光纯药株式会社制的纤维素管36/32）用水进行透析。将透析后得到的白色的凝集蛋白通过离心分离回收，用冻干机除去水分，回收冻干粉末。得到的冻干粉末中的目标蛋白（约101.1kDa）的精制度通过采用Totallab（nonlinear dynamics ltd.）对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果进行图像分析来确认。其结果，ADF3Kai-Large-NRSH1的精制度为约85%。
（4）纺丝液（胶浆液）
向冻干粉末中添加六氟异丙醇（HFIP），使冻干粉末的浓度达到8.1质量%。用旋转器溶解14小时，然后除去废物和泡。溶液粘度为1200cP（厘泊）。将其作为纺丝液（胶浆液）。
（5）纺丝工序-第一阶段拉伸工序
从纺丝工序到拉伸工序使用图2A-B所示的方法。将纺丝液填充到滚筒中，使用注射泵从0.2mm直径的喷嘴挤出至100质量%甲醇凝固液中，制作未拉伸丝。使挤出速度为1.8ml/h、使凝固液槽的长度为400mm。接着，作为第一阶段拉伸，将未拉伸丝在80℃的温水中拉伸2.3～7倍，使卷取速度为2.3～3.6m/min。
（6）第二阶段拉伸工序
作为第二阶段拉伸，可知用180～220℃的干热板拉伸1.4～2.96倍时，得到了高韧性的拉伸丝。各实施例和各比较例采用下述表1的条件。
表1
（7）物性测定
（a）用扫描型电子显微镜观察观察表面结构。
（b）为了研究分子的取向，用偏光显微镜求出延迟、干扰色、双折射度。使用Olympus公司制的偏光显微镜，并使用称为塞纳蒙的补偿器。测定范围为0～546nm（0～1λ），通过计算Δn=R/直径求出。上文中，R为用塞纳蒙补偿器测定的延迟量（nm）。实施例1的纤维的双折射率Δn（×1000）为15.6。确认了实施例1的纤维的分子取向得以进行。
（c）使用光学显微镜求出纤维的直径。
（d）在温度为25℃、相对湿度为60%的气氛温度下使用拉伸试验机（岛津公司制小型台式试验机EZ-S）测定纤维的强度（应力）、初始弹性模量（20点的最大斜率。具体地，以50msec间隔进行测定，将以20点间隔进行斜率计算时的最大斜率作为初始弹性模量。）、伸长率（断裂点变位、变位），通过下式算出韧性。将样品贴到用厚纸制作的框架上，在夹具间距离为20mm、拉伸速度为10mm/min下进行。测力传感器容量为1N、夹具为clip式。测定值取样品数n=5的平均值。
韧性=[E/（r2×π×L）×1000]（单位：MJ/m3）
其中：
E：破坏能量（单位：J）
R：纤维的半径（单位：mm）
π：圆周率
L：拉伸试验测定时的夹具间距离：20mm
（e）纤维的比重测定向外委托一般财团法人Kaken Test Center进行分析，基于JISL1015浮沉法进行测定。该纤维的比重为1.34。
将各物性值汇总示于表2。各实施例和比较例中得到的纤维的应力-变位（变形）曲线如图3～图9所示。
表2
如由表2可知的，确认了本发明的实施例品为具有适当的应力、断裂伸长率且韧性高的人造多肽纤维。
表3中汇总了本发明的实施例1～5中得到的纤维和已知的天然蛛丝纤维、碳纤维、对位芳纶纤维的应力、伸长率、韧性。
表3
| 应力（MPa） | 伸长率（%） | 韧性（MJ/m3） | |
| 本发明实施例1的纤维 | 598.4 | 45.5 | 241.7 |
| 本发明实施例2的纤维 | 357.7 | 54.3 | 173.6 |
| 本发明实施例3的纤维 | 420.0 | 39.4 | 138.7 |
| 本发明实施例4的纤维 | 626.4 | 48.6 | 265.4 |
| 本发明实施例5的纤维 | 628.7 | 26.7 | 142.1 |
| 天然蛛丝纤维 | 1100.0 | 27.0 | 160.0 |
| 碳纤维 | 4000.0 | 1.3 | 25.0 |
| 芳纶纤维（对位系） | 3600.0 | 2.7 | 50.0 |
（备注）表2的“断裂点变位（变形）”与表3的“伸长率”相同。
如从表3可知的，确认了本发明的实施例中得到的纤维具有适当的应力、伸长率且韧性高。
产业上的可利用性
本发明的人造多肽纤维可适用于树脂、金属的强化纤维、复合材料、注塑成型等。其用途适用于汽车等的输送机器部件、轮胎的补强纤维等。此外，还适用于钓丝、网球或羽毛球的肠线、小提琴的弦、小提琴的弓、人造毛发等。作为形态，可以丝、棉、织物、编织物、线绳、无纺布等应用。
符号说明
1 挤出工序
2、30 未拉伸丝制造工序
3、40 湿热拉伸工序（第一阶段拉伸工序）
4、50 干热拉伸工序（第二阶段拉伸工序）
5、39、44 卷丝体
6、32 纺丝液
7 贮存槽
8 齿轮泵
9 纺丝头
10 纺丝拉伸装置
11、35 凝固液
12、38 温水
13、15、41、45 供给夹持辊
14、16、42、46 牵引夹持辊
17、43 干热拉伸装置
18a～18f 导丝器
19 空隙
20、34 凝固液槽
21、37 拉伸浴槽
22、47 丝道
31 注射器
33 喷嘴
36 未拉伸丝
序列表自由文本
序列编号1～7 氨基酸序列
序列编号8～10 碱基序列
序列编号11～14 引物序列
Claims (20)
1.一种人造多肽纤维，其特征在于，其是以多肽为主成分的人造纤维，并且是通过将含有所述多肽的纺丝液纺丝、并进行至少两阶段的拉伸而得到的；其中，所述至少两阶段的拉伸包括湿热下的第一阶段拉伸和干热下的第二阶段拉伸；
所述人造多肽纤维的应力为350MPa～628.7MPa、韧性为138MJ/m3～265.4MJ/m3。
2.根据权利要求1所述的人造多肽纤维，其中，所述多肽为天然型蛛丝蛋白来源的多肽，其包含式1：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单元，所述式(1)中，REP1为选自丙氨酸和甘氨酸中的至少一种氨基酸连续地排列2～20个残基的氨基酸序列；REP2为由2～200个残基的氨基酸构成的氨基酸序列，且所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸的总残基数相对于氨基酸残基数整体为40％以上。
3.根据权利要求2所述的人造多肽纤维，其中，所述多肽是C末端序列为序列编号1～3中的任一个所示的氨基酸序列或与序列编号1～3中的任一个所示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽。
4.根据权利要求1所述的人造多肽纤维，其中，所述纤维的韧性为170MJ/m3以上。
5.根据权利要求1所述的人造多肽纤维，其中，所述纤维的韧性为240MJ/m3以上。
6.根据权利要求1所述的人造多肽纤维，其中，所述纤维的应力为590MPa以上。
7.根据权利要求1所述的人造多肽纤维，其中，所述纤维的断裂伸长率为26％以上。
8.根据权利要求1所述的人造多肽纤维，其中，所述纤维的初始弹性模量为8GPa以上。
9.根据权利要求1所述的人造多肽纤维，其中，所述纤维直径的波动率为5％以下。
10.根据权利要求1所述的人造多肽纤维，其中，所述纤维的直径为5～100μm的范围。
11.一种人造多肽纤维的制造方法，其特征在于，所述人造多肽纤维是通过将含有天然型蛛丝蛋白来源的多肽的纺丝液纺丝、并进行至少两阶段的拉伸而得到的；
所述多肽为天然型蛛丝蛋白来源的多肽，其包含式1：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单元，所述式(1)中，REP1为选自丙氨酸和甘氨酸中的至少一种氨基酸连续地排列2～20个残基的氨基酸序列；REP2为由2～200个残基的氨基酸构成的氨基酸序列，且所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸的总残基数相对于氨基酸残基数整体为40％以上；
其中，所述至少两阶段的拉伸包括湿热下的第一阶段拉伸和干热下的第二阶段拉伸。
12.根据权利要求11所述的人造多肽纤维的制造方法，其中，所述第一阶段拉伸的拉伸条件为在70～90℃的温水中拉伸至2～8倍。
13.根据权利要求11所述的人造多肽纤维的制造方法，其中，所述第二阶段拉伸的拉伸条件为在170～230℃的气氛温度下拉伸至1.25～3倍。
14.根据权利要求11所述的人造多肽纤维的制造方法，其中，所述纺丝为将含有所述多肽的纺丝液挤出到凝固液中制成未拉伸丝，并在所述凝固液中进行第一阶段拉伸。
15.根据权利要求11所述的人造多肽纤维的制造方法，其中，所述纤维的总拉伸倍率超过5倍且在20倍以下。
16.根据权利要求11所述的人造多肽纤维的制造方法，其中，所述多肽纤维的应力为350MPa以上、韧性为138MJ/m3以上。
17.根据权利要求11所述的人造多肽纤维的制造方法，其中，所述多肽是C末端序列为序列编号1～3中的任一个所示的氨基酸序列或与序列编号1～3中的任一个所示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽。
18.根据权利要求11所述的人造多肽纤维的制造方法，其中，所述纤维的断裂伸长率为26％以上。
19.根据权利要求11所述的人造多肽纤维的制造方法，其中，所述纤维的初始弹性模量为8GPa以上。
20.根据权利要求11所述的人造多肽纤维的制造方法，其中，所述纤维直径的波动率为5％以下。
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