JPWO2012165476A1

JPWO2012165476A1 - 人造ポリペプチド繊維

Info

Publication number: JPWO2012165476A1
Application number: JP2013518122A
Authority: JP
Inventors: 和秀関山; 香里関山; 瑞季石川; 涼太佐藤; 真也村田
Original assignee: Spiber Inc
Current assignee: Spiber Inc
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2015-02-23
Anticipated expiration: 2032-05-30
Also published as: US9617315B2; EP2716798B1; EP2716798A4; US20140058066A1; CN103502516A; WO2012165476A1; JP5540166B1; JP2014129639A; EP2716798A1; CN103502516B; JP5540154B2

Abstract

本発明の人造ポリペプチド繊維は、ポリペプチドを主成分とする人造繊維であって、応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ^３以上である。本発明の人造ポリペプチド繊維の製造方法は、天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含む紡糸液（６）を紡糸し、少なくとも２段延伸して得られる前記人造ポリペプチド繊維の製造方法であって、前記少なくとも２段の延伸は、湿熱における一段目延伸（３）と、乾熱における二段目延伸（４）を含む。これにより、応力と破断伸度が適度にあり、タフネスの高い人造ポリペプチド繊維及びその製造方法を提供する。

Description

本発明は合成タンパク質繊維の一種である人造ポリペプチド繊維及びその製造方法に関する。

クモ糸繊維は、高い強度とタフネスを有する繊維であり、高張力鋼、ナイロン６繊維、アラミド繊維、炭素繊維などよりも高い強度とタフネスを有することが知られている。加えて、石油を原料とせず、原料をバイオマス化できる利点もある。人工クモ糸繊維もいくつか提案されている。例えば、特許文献１には、合成タンパク質紡糸溶液を、５〜１０μｌ／ｍｉｎの速度で紡糸口金から９０％メタノールからなる凝固浴中に押し出して繊維とすることが提案されている。特許文献２には、１μｍ以上の直径および５ｍｍ以上の長さを有し、２００ＭＰａまたはそれ以上の引張強度を有する繊維が提案されている。非特許文献１には、メタノール浴と水浴で延伸倍率５倍で延伸することにより得られた強度１．９１〜２．２６ｇ／ｄ、伸度４３．４〜５９．６％の延伸糸が開示されている。非特許文献２には、延伸倍率を５倍とすることにより得られた応力６００ＭＰａ、伸度２５％の延伸糸が開示されている。非特許文献３には、スチーム中に５分間滞留させて５倍に延伸させることにより得られた応力２８０〜３５０ＭＰａ、伸度３０〜４０％の延伸糸が開示されている。

しかし、従来の人造ポリペプチド繊維のタフネスはいまだ不足であり、さらに高い応力を有する強靭な繊維が望まれていた。

特表２００４−５０３２０４号公報特表２００９−５２１９２１号公報

Anthoula Lazaris,et.al.,"Spider Silk Fiber Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells",Science,295,p472,2002年1月18日 Xiao-Xia Xia,et.al.,"Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coil results in a strong fiber",PNAS,vol.107,No.32,p14059-14063,2010年8月10日 M. Elice,et.al.,"Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk",Macromolecules,Vol. 44,No.5,p1166-1176,2011年4月2日

本発明は、前記従来の問題を解決するため、応力及びタフネスが高い人造ポリペプチド繊維及びその製造方法を提供する。

本発明の人造ポリペプチド繊維は、ポリペプチドを主成分とする人造繊維であって、応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ^３以上であることを特徴とする。

本発明の人造ポリペプチド繊維の製造方法は、天然型クモ糸タンパク質(spider silk proteins)に由来するポリペプチドを含む紡糸液を紡糸し、少なくとも２段延伸して得られる人造ポリペプチド繊維の製造方法であって、前記少なくとも２段の延伸は、湿熱における一段目延伸と、乾熱における二段目延伸を含むことを特徴とする。

本発明は人造ポリペプチドからなる未延伸繊維を湿熱と乾式加熱の少なくとも２段で延伸することにより、応力及びタフネスが高い人造ポリペプチド繊維及びその製造方法を提供できる。すなわち、応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ^３以上の人造ポリペプチド繊維を実現できる。応力が高く、タフネスが高いと、金属、樹脂、ゴムなどとの複合材料にとって有利である。

図１は本発明の一実施例における製造工程を示す説明図である。図２Ａ−Ｂは本発明の別の実施例における製造工程を示す説明図であり、図２Ａは紡糸工程−一段目延伸工程、図２Ｂは二段目延伸工程を示す。図３は本発明の実施例１で得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。図４は本発明の実施例２で得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。図５は本発明の実施例３で得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。図６は本発明の実施例４で得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。図７は本発明の実施例５で得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。図８は比較例１で得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。図９は比較例２で得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。

（１）ポリペプチド
本発明の人造ポリペプチド繊維は、ポリペプチドを主成分とする。本発明において、主成分とは、８０質量％以上含まれることを意味し、９０質量％以上含まれることがより好ましく、９５質量％以上含まれることがさらに好ましい。なお、本発明の人造ポリペプチド繊維は、本発明の効果を阻害しない範囲内において、ポリペプチド以外の他の成分を含んでもよい。本発明においては、原料として天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを用いることが望ましい。天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドとは、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。前記ポリペプチドは、天然型クモ糸タンパク質に由来するものであればよく、特に限定されない。前記ポリペプチドは、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであることが好ましい。前記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ(Araneus diadematus)に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大吐糸管しおり糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。

前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上含むポリペプチドが挙げられる。或いは、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。なお、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドにおいて、式（１）：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。ここで、［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）］で示されるアミノ酸配列の単位が異なるとは、ＲＥＰ１が異なる場合、ＲＥＰ２が異なる場合、ＲＥＰ１及びＲＥＰ２のいずれも異なる場合を含む。上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大腸菌などの微生物を宿主として組み換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が３００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは２００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは１５０ｋＤａ以下である。

前記式（１）において、ＲＥＰ１は、アラニン及びグリシンから選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が連続して２〜２０残基並んでおり、より好ましくは３〜１６残基、さらに好ましくは４〜１２残基、最も好ましくは５〜８残基並んでいるアミノ酸配列である。前記式（１）において、ＲＥＰ２は、２〜２００残基、より好ましくは１０〜１５０残基、さらに好ましくは２０〜１００残基、最も好ましくは２０〜７５残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、かつ前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上である。

大吐糸管しおり糸において、上記ＲＥＰ１は、繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、上記ＲＥＰ２は、繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、上記［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。

配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。

前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができる。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号７）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、Ｃ末端配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列と同一である。

また、前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するタンパク質を用いることができる。本発明において、「１若しくは複数個」とは、例えば、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、又は１若しくは数個を意味する。また、本発明において、「１若しくは数個」は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個を意味する。

前記ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅してクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔｐｌｕｓ１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。上記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。上記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつ自身が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。上記宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。

（２）紡糸液
紡糸液（ドープ液）は、前記ポリペプチドに溶媒を加え、紡糸できる粘度に調整して作製する。
溶媒は前記ポリペプチドを溶解することができるものであればどのようなものでも良い。例えば前記ポリペプチドがニワオニグモに由来する場合、一例としてヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、蟻酸、尿素、グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化リチウム、塩化カルシウム、チオシアン酸リチウムなどを含む水溶液などを溶媒とし、適量加えて溶液粘度を１００〜１０，０００ｃＰ（センチポイズ）とする。これを紡糸液とする。

（３）紡糸
紡糸は湿式紡糸を採用する。これにより、ポリマーを溶解させた溶媒を除去し（脱溶媒ともいう）、未延伸糸を得る。湿式紡糸に使用する凝固液は、脱溶媒できる溶液であればどのようなものでも良い。溶媒がＨＦＩＰの場合、凝固液はメタノール、エタノール、２−プロパノールなどの炭素数１〜５の低級アルコール又はアセトンを使用するのが好ましい。凝固液の温度は０〜３０℃が好ましい。前記の範囲であれば紡糸は安定する。前記紡糸液を凝固液に押し出すことにより、未延伸糸が得られる。直径０．１〜０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプの場合、押し出し速度は１ホール当たり、０．２〜２．４ｍｌ／ｈが好ましい。この範囲であれば紡糸は安定する。さらに好ましい押し出し速度は１ホール当たり、０．６〜２．２ｍｌ／ｈである。凝固液槽の長さは２００〜５００ｍｍ、未延伸糸の引き取り速度は１〜３ｍ／ｍｉｎ、滞留時間は０．０１〜０．１５ｍｉｎが好ましい。この範囲であれば脱溶媒が効率よくできる。凝固液において延伸（前延伸）をしても良いが、低級アルコールの蒸発を考えると凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で引き取るのが好ましい。

（４）延伸
（ａ）多段延伸の作用機能
延伸は少なくとも２段で行う。もちろん３段以上の多段延伸も採用できる。本発明において、２段以上の多段延伸を採用する理由は、天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、どちらかというと分子が配向し難いため、多段で延伸することにより分子を多段で配向させ、トータル延伸倍率も高くすることができるため、結果としてタフネスの高い繊維が得られるためである。

（ｂ）多段延伸の内容
前記少なくとも２段の延伸は、湿熱における一段目延伸と、次に乾熱における二段目延伸を含む。湿熱における一段目延伸は前記凝固液中で行ってもよい。３段以上の多段延伸を採用する場合は、湿熱の一段目延伸を２段に分ける及び／又は乾熱の二段目延伸を２段に分けるなどの方法を採用できる。一段目延伸の湿熱は、温水中でも良いし、スチーム加熱でも良い。温水には有機溶剤などを加えても良い。本多段延伸は湿熱又は乾熱以外の延伸方法を延伸工程の任意の段階に追加しても良い。

（ｃ）一段目と二段目の延伸条件
一段目延伸は未延伸糸を５０〜９０℃の温水で２〜８倍延伸することが好ましい。このようにすると安定した延伸ができる。二段目延伸は１７０℃〜２７０℃の乾熱で１．２５〜３倍延伸することが好ましい。これにより、高タフネスの延伸糸が得られる。前記において一段目延伸は未延伸糸を７５〜８５℃の温水で延伸するのがさらに好ましい。一段目延伸の延伸倍率は２．３〜７倍とすることがさらに好ましい。二段目延伸は１８０℃〜２３０℃の乾熱がさらに好ましい。二段目延伸の延伸倍率は１．３５〜３倍がさらに好ましい。延伸糸のタフネスを向上しかつ安定して延伸糸を得るためには、トータル延伸倍率は５倍を超え２０倍以下とするのが好ましく、さらに好ましくは６倍以上１１倍以下である。乾熱は一例として電気管状炉または熱板を使用する。

（ｄ）連続工程
紡糸から延伸までは連続工程としても良いし、任意の工程に分けて実施しても良い。図１は本発明の一実施例における製造工程を示す説明図である。図１は連続工程を示している。紡糸延伸装置１０は、押し出し工程１と、未延伸糸製造工程２と、湿熱延伸工程３と、乾熱延伸工程４を含む。紡糸液６は貯槽７に貯蔵され、ギアポンプ８から口金９に押し出す。ラボスケールにおいては、紡糸液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出しても良い。押し出された紡糸液は、エアギャップ１９を有するか又は直接、凝固液槽２０の凝固液１１内に供給し、溶媒を除去する。次いで延伸浴槽２１内の温水１２内に供給し、一段目延伸する。延伸は供給ニップローラ１３と引き取りニップローラ１４との速度比によって決まる。次いで乾熱延伸装置１７に供給し、糸道２２内で二段目延伸し、巻糸体５とする。延伸は供給ニップローラ１５と引き取りニップローラ１６との速度比によって決まる。１８ａ〜１８ｆは糸ガイドである。

（ｅ）分離工程
図２Ａ−Ｂは本発明の別の実施例における製造工程を分離した例の説明図である。図２Ａは紡糸工程３０及び一段目延伸工程４０、図２Ｂは二段目延伸工程５０を示す。それぞれの工程ごとに糸を巻き取るかまたは巻き取らずに容器に溜めてもよい。紡糸工程３０においては、マイクロシリンジ３１内に紡糸液３２を入れておき、シリンジポンプを用いて矢印Ｐ方向に移動させ、ノズル３３から紡糸液３２を押し出し、凝固液槽３４内の凝固液３５に供給し、未延伸糸３６とする。続いて一段目延伸工程４０においては、未延伸糸３６を延伸浴槽３７内の温水３８内に供給し、一段目延伸し、一段目延伸糸の巻糸体３９とする。延伸は供給ニップローラ４１と引き取りニップローラ４２との速度比によって決まる。次いで巻糸体３９から一段目延伸糸を引き出し、乾熱延伸装置４３に供給し、糸道４７内で二段目延伸する。延伸は供給ニップローラ４５と引き取りニップローラ４６との速度比によって決まる。次いで延伸糸を巻糸体４４に巻き取る。

以上のようにして人造ポリペプチド繊維を得る。得られた人造ポリペプチド繊維は、応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ^３以上である。タフネスは繊維の強伸度を測定する際の応力−ひずみ曲線（ＳＳカーブ）の積分値から算出される。図３は本発明の一実施例で得られた繊維のタフネスの説明図であり、応力−変位（ひずみ）曲線とタフネス（斜線部）を示す。応力と破断伸度の両方が高いとタフネスも高いことがわかる。

本発明の人造ポリペプチド繊維の好ましい応力は４００ＭＰａ以上であり、より好ましくは５９０ＭＰａ以上、特に好ましくは６２０ＭＰａ以上である。好ましい破断伸度は３９％以上であり、より好ましくは４５％以上、さらに好ましくは５０％以上である。好ましいタフネスは１７０ＭＪ／ｍ^３以上であり、より好ましくは２４０ＭＪ／ｍ^３以上、さらに好ましくは２６０ＭＪ／ｍ^３以上である。本発明の人造ポリペプチド繊維の好ましい初期弾性率は８ＧＰａ以上、より好ましくは１４ＧＰａ以上，さらに好ましくは１６ＧＰａ以上である。

本発明の人造ポリペプチド繊維は直径が５〜１００μｍの範囲であることが好ましい。前記の範囲であれば安定して延伸繊維を得ることができる。より好ましい繊維直径は７〜３０μｍの範囲、さらに好ましくは８〜２５μｍの範囲である。また、本発明の人造ポリペプチド繊維は、繊維直径が均一であり、繊維直径の変動率が５％以下であることが好ましい。繊度（単位：ｔｅｘまたはｄｅｃｉｔｅｘ）を算出する場合は、繊維断面が丸の場合は繊維直径から計算される断面積と比重と長さから算出する。なお、本発明の人造ポリペプチド繊維は湿式紡糸により得られるため、断面が円形とは限らず様々な形状を含むため、繊維直径（平均直径）は断面を円形と想定した場合の平均径をいう。

前記ポリペプチドは、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３由来のポリペプチドであることが好ましい。このポリペプチドは強伸度及びタフネスが基本的に高く、合成し易いことも利点として上げられる。

前記人造ポリペプチド繊維の複屈折率Δｎ（×１０００）は１５．６以上であることが好ましい。なお複屈折率と複屈折度は同一である。複屈折率はオリンパス社製の偏光顕微鏡でセナルモンというコンペンセータを使用して測定できる。測定範囲は０〜５４６ｎｍ（０〜１λ）、Δｎ＝Ｒ／直径の計算で求める。前記において、Ｒはセナルモンのコンペンセータで測定したレタデーション量（ｎｍ）である。複屈折率Δｎ（×１０００）が１５．６以上であることは、分子の配向が進んでいることを示す。

本発明の人造ポリペプチド繊維は延伸後、フィブロイン繊維内のポリペプチド分子間について化学的に架橋させてもよい。ポリペプチドにおいて架橋に使える官能基は例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシ基などがあるが、これに限定されるものではない。ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。架橋は真空加熱下で脱水縮合反応を行なっても良いし、カルボジイミドなどの脱水縮合剤により架橋させても良い。また、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いても良い。また、トランスグルタミナーゼなどの酵素により架橋することもできる。一例として、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどの架橋剤で架橋反応させても良い。カルボジイミドは一般式Ｒ^１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ^２（但し、Ｒ^１，Ｒ^２は炭素数１〜６のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。）で示され、具体的化合物は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などがある。この中でもＥＤＣ、ＤＩＣはペプチド鎖のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。架橋処理は、延伸糸に架橋剤を付与して真空加熱乾燥で架橋するのが好ましい。架橋剤は１００％品を繊維に付与しても良いし、炭素数１〜５の低級アルコールや緩衝液などで希釈して０．００５〜１０質量％の濃度で繊維に付与しても良い。処理条件は、温度２０〜４５℃で３〜４２時間が好ましい。架橋剤による架橋処理により、人造ポリペプチド延伸繊維はさらに高い応力（強度）となる。

以下実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

（実施例１〜５、比較例１〜２）
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号７）を付加したアミノ酸配列（配列番号５）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成受託した。その結果、配列番号８で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅＩサイト、及び５’末端直下流にＸｂａＩサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。

（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号１１）とＲｅｐＸｂａＩプライマー（配列番号１２）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅＩ及びＸｂａＩで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａＩＲｅｐプライマー（配列番号１３）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１４）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号９に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号６で示すとおりであった。

（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＢａｓａｌＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号６）における第１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号１０に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号４で示すとおりであった。

＜タンパク質の発現＞
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ_６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ_６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ_６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ_６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約１０１．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。

＜精製＞
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡＮｉｒｏＳｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を７．５ＭＵｒｅａＤＢ緩衝液（７．５Ｍ尿素、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で溶解し、スターラーで撹拌した後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質（約１０１．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒｄｙｎａｍｉｃｓｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。

（４）紡糸液（ドープ液）
凍結乾燥粉末の濃度が８．１質量％になるように、凍結乾燥粉末にヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を添加した。ローテーターで１４時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いた。溶液粘度は１，２００ｃＰ（センチポイズ）であった。これを紡糸液（ドープ液）とした。

（５）紡糸工程−一段目延伸工程
紡糸工程から延伸工程は図２Ａ−Ｂに示す方法を用いた。紡糸液をシリンダーに充填し、０．２ｍｍ径のノズルからシリンジポンプを用い、１００質量％メタノール凝固液中に押し出して未延伸糸を作製した。押し出し速度を１．８ｍｌ／ｈ、凝固液槽の長さは４００ｍｍとした。続いて一段目延伸として、未延伸糸を８０℃の温水で２．３〜７倍延伸し、巻き取り速度を２．３〜３．６ｍ／ｍｉｎとした。

（６）二段目延伸工程
二段目延伸として、１８０〜２２０℃の乾熱板で１．４〜２．９６倍延伸すると高タフネスの延伸糸が得られることがわかった。各実施例及び各比較例では下記表１の条件を採用した。

（７）物性測定
（ａ）走査型電子顕微鏡観察で表面構造を観察した。
（ｂ）分子の配向を調べるため、偏光顕微鏡でレタデーション、干渉色、複屈折度を求めた。オリンパス社製の偏光顕微鏡でセナルモンというコンペンセータを使用した。測定範囲は０〜５４６ｎｍ（０〜１λ）、Δｎ＝Ｒ／直径の計算で求める。前記において、Ｒはセナルモンのコンペンセータで測定したレタデーション量（ｎｍ）である。実施例１の繊維の複屈折率Δｎ（×１０００）は１５．６であった。実施例１の繊維は分子の配向が進んでいることが確認できた。
（ｃ）光学顕微鏡を用いて繊維の直径を求めた。
（ｄ）温度２５℃、相対湿度６０％の雰囲気温度で引張り試験機（島津社製小型卓上試験機ＥＺ−Ｓ）を用いて繊維の強度（応力）、初期弾性率（２０点の最大傾きで測定した。具体的には、５０ｍｓｅｃ間隔で測定し、傾きの計算を２０点間隔で行ったときの最大傾きを初期弾性率とした。）、伸度（破断点変位、変位）を測定し、下記式によりタフネスを算出した。サンプルは厚紙で作製した型枠に貼り付け、つかみ具間距離は２０ｍｍ、引張り速度は１０ｍｍ／ｍｉｎで行った。ロードセル容量１Ｎ、つかみ冶具はクリップ式とした。測定値はサンプル数ｎ＝５の平均値とした。
タフネス＝［Ｅ／（ｒ^２×π×Ｌ）×１０００］（単位：ＭＪ／ｍ^３）
但し、
Ｅ破壊エネルギー（単位：Ｊ）
ｒ繊維の半径（単位：ｍｍ）
π 円周率
Ｌ引張り試験測定時のつかみ具間距離：２０ｍｍ
（ｅ）繊維の比重測定は一般財団法人カケンテストセンターに外注分析を依頼し、ＪＩＳＬ１０１５浮沈法に準じて測定した。本繊維の比重は１．３４であった。

各種物性値を表２にまとめて示した。各実施例及び比較例で得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線を図３〜図９に示した。

表２から明らかなとおり、本発明の実施例品は応力、破断伸度は適度にあり、タフネスが高い人造ポリペプチド繊維であることが確認できた。

表３には本発明の実施例１〜５で得られた繊維と、既存の天然クモ糸繊維、炭素繊維、パラ系アラミド繊維との応力、伸度、タフネスをまとめた。

（備考）表２の「破断点変位（ひずみ）」と表３の「伸度」とは同一である。

表３から明らかなとおり、本発明の実施例で得られた繊維の応力、伸度は適度にあり、タフネスは高いことが確認できた。

本発明の人造ポリペプチド繊維は、樹脂や金属の強化繊維、複合材料、射出成形などに好適に使用できる。その用途は、自動車などの輸送機器部材、タイヤの補強繊維などに適用できる。さらに釣り糸、テニスやバドミントンのガット、バイオリンの絃、バイオリンの弓、人造毛髪などにも適用できる。形態としては糸、綿、織物、編物、組み物、不織布などに応用できる。

１押し出し工程
２，３０未延伸糸製造工程
３，４０湿熱延伸工程（一段目延伸工程）
４，５０乾熱延伸工程（二段目延伸工程）
５，３９，４４巻糸体
６，３２紡糸液
７貯槽
８ギアポンプ
９口金
１０紡糸延伸装置
１１，３５凝固液
１２，３８温水
１３，１５，４１，４５供給ニップローラ
１４，１６，４２，４６引き取りニップローラ
１７，４３乾熱延伸装置
１８ａ〜１８ｆ糸ガイド
１９エアギャップ
２０，３４凝固液槽
２１，３７延伸浴槽
２２，４７糸道
３１シリンジ
３３ノズル
３６未延伸糸

配列番号１〜７アミノ酸配列
配列番号８〜１０塩基配列
配列番号１１〜１４プライマーシーケンス

本発明は合成タンパク質繊維の一種である人造ポリペプチド繊維に関する。

本発明は、前記従来の問題を解決するため、応力及びタフネスが高い人造ポリペプチド繊維を提供する。

本発明の人造ポリペプチド繊維は、ポリペプチドを主成分として含む人造繊維であって、応力が３５０ＭＰａ以上６２８．７ＭＰａ以下、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ³以上２６５．４ＭＪ／ｍ ³ 以下であることを特徴とする。

Claims

ポリペプチドを主成分とする人造繊維であって、
応力が３５０ＭＰａ以上、タフネスが１３８ＭＪ／ｍ^３以上であることを特徴とする人造ポリペプチド繊維。
前記ポリペプチドは、天然型クモ糸タンパク質(spider silk proteins)に由来するポリペプチドであり、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、前記式（１）において、ＲＥＰ１は、アラニン及びグリシンから選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が連続して２〜２０残基並んでおり、ＲＥＰ２は、２〜２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、かつ前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上である請求項１に記載の人造ポリペプチド繊維。
前記ポリペプチドは、Ｃ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドである請求項２に記載の人造ポリペプチド繊維。
前記繊維のタフネスは１７０ＭＪ／ｍ^３以上である請求項１〜３のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
前記繊維のタフネスは２４０ＭＪ／ｍ^３以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
前記繊維の応力は５９０ＭＰａ以上である請求項１〜５のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
前記繊維の破断伸度は２６％以上である請求項１〜６のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
前記繊維の初期弾性率は８ＧＰａ以上である請求項１〜７のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
前記繊維直径の変動率が５％以下である請求項１〜８のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
前記繊維の直径が５〜１００μｍの範囲である請求項１〜９のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維。
天然型クモ糸タンパク質(spider silk proteins)に由来するポリペプチドを含む紡糸液を紡糸し、少なくとも２段延伸して得られる人造ポリペプチド繊維の製造方法であって、
前記少なくとも２段の延伸は、湿熱における一段目延伸と、乾熱における二段目延伸を含むことを特徴とする人造ポリペプチド繊維の製造方法。
前記一段目延伸の延伸条件が、７０〜９０℃の温水中で２〜８倍に延伸する請求項１１に記載の人造ポリペプチド繊維の製造方法。
前記二段目延伸の延伸条件が、１７０〜２３０℃の雰囲気温度で１．２５〜３倍に延伸する請求項１１又は１２に記載の人造ポリペプチド繊維の製造方法。
前記紡糸は、前記ポリペプチドを含む紡糸液を凝固液に押し出して未延伸糸とし、前記凝固液中で一段目延伸する請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維の製造方法。
前記繊維のトータル延伸倍率は５倍を超え２０倍以下である請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の人造ポリペプチド繊維の製造方法。