JP6450680B2 - 高靱性シルク繊維を作製する方法 - Google Patents
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Description
(a)少なくとも1つのシルクタンパク質と、シルクタンパク質変性濃度のタンパク質変性剤又はタンパク質変性剤の混合物とを含む水溶液を準備する工程であって、該溶液中の該シルクタンパク質の総濃度が20% w/v未満である、工程と、
(b)タンパク質変性剤の濃度を8分の1〜14分の1に低下させる工程と、
(c)タンパク質変性剤の濃度を1.5分の1〜3分の1に低下させる工程と、
(d)溶液中のシルクタンパク質を工程(a)における該シルクタンパク質の濃度に比べて少なくとも1.5倍濃縮して、少なくとも10% w/vの濃度にすることにより、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を作製する工程と、
を含む、方法に関する。
(a)本発明の方法により作製可能なシルク紡糸ドープ溶液を準備する工程と、
(b)シルクタンパク質紡糸ドープ溶液からの引き抜き又は該シルクタンパク質紡糸ドープ溶液の押し出し又はそれらの組合せにより繊維を作製する工程と、
を含む、方法に関する。
(a)少なくとも1つのシルクタンパク質と、シルクタンパク質変性濃度のタンパク質変性剤又はタンパク質変性剤の混合物とを含む水溶液を準備する工程であって、該溶液中の該シルクタンパク質の総濃度が20% w/v未満である、工程と、
(b)タンパク質変性剤の濃度を8分の1〜14分の1に低下させる工程と、
(c)タンパク質変性剤の濃度を1.5分の1〜3分の1に低下させる工程と、
(d)溶液中のシルクタンパク質を工程(a)における該シルクタンパク質の濃度に比べて少なくとも1.5倍濃縮して、少なくとも10% w/vの濃度にすることにより、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を作製する工程と、
を含む、方法を提供する。
(a)GPGXX(配列番号3)(ここで、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してA、S、G、Y、P及びQから選択される)、
(b)GGX(ここで、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してY、P、R、S、A、T、N及びQから選択される)、及び、
(c)Ax(ここで、xは5〜10の整数である)、
からなる群から選択される少なくとも1つのコンセンサス配列を含む少なくとも2つの反復単位を含むことが好ましい。
i)アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのGPGAS(配列番号5)、AAAAAA(配列番号13)、GGY、及びGPGSG(配列番号6)、
ii)アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのAAAAAAAA(配列番号15)、GPGGY(配列番号7)、GPGGY(配列番号7)、及びGPGGP(配列番号8)、
iii)アミノ酸配列としてのGPGQQ(配列番号4)、GPGQQ(配列番号4)、GPGQQ(配列番号4)、及びGPGQQ(配列番号4)、
iv)アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのGPGGA(配列番号9)、GGP、GPGGA(配列番号9)、GGP、GPGGA(配列番号9)、及びGGP、
v)アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのAAAAAAAA(配列番号15)、GPGQG(配列番号40)、及びGGR、
vi)アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのAAAAAAAA(配列番号15)、GPGGG(配列番号10)、GGR、GGN、及びGGR、
vii)アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのGGA、GGA、GGA、GGS、GGA、及びGGS、及び/又は、
viii)アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのGPGGA(配列番号9)、GPGGY(配列番号7)、GPGGS(配列番号11)、GPGGY(配列番号7)、GPGGS(配列番号11)、及びGPGGY(配列番号7)。
i)(C)m(ここでは、配列番号21によるアミノ酸配列により表される、「m」個のCモジュール、すなわち8個〜64個のCモジュールが互いに組み合わされている)、
ii)(C)mNRz(ここでは、配列番号21によるアミノ酸配列により表される、「m」個のCモジュール、すなわち8個〜48個のCモジュールが互いに組み合わされており、該Cモジュールは「z」個の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復(NR)単位と更に組み合わされている)、
iii)NRz(C)m(ここでは、「z」個の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復(NR)単位が存在するか(z=1)、又は互いに組み合わされており(z=2又は3)、該非反復(NR)単位(複数の場合もあり)は配列番号21によるアミノ酸配列により表される、「m」個のCモジュール、すなわち2個〜64個のCモジュールと更に組み合わされている)、
iv)(AQ)n(ここでは、「n」個のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち6個〜36個のAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここで、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される)が互いに組み合わされている)、
v)(AQ)nNRz(ここでは、「n」個のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち10個〜40個のAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここで、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される)が互いに組み合わされており、該AモジュールとQモジュールとの組合せは、「z」個の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復(NR)単位と更に組み合わされている)、
vi)NRz(AQ)n(ここでは、「z」個の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復(NR)単位が存在するか(z=1)、又は互いに組み合わされており(z=2又は3)、該非反復(NR)単位(複数の場合もあり)は、「n」個のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち10個〜40個のAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここで、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される)と更に組み合わされている)、
vii)(QAQ)o(ここでは、「o」個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち8個〜24個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここで、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表され、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表される)が互いに組み合わされている)、
viii)(QAQ)oNRz(ここでは、「o」個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち8個〜16個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここで、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表され、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表される)が互いに組み合わされており、該QモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せは、「z」個の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復(NR)単位と更に組み合わされている)、
ix)NRz(QAQ)o(ここでは、「z」個の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復(NR)単位が存在するか(z=1)、又は互いに組み合わされており(z=2又は3)、該非反復(NR)単位(複数の場合もあり)は、「o」個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち8個〜40個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここで、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表され、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表される)と更に組み合わされている)。
(i)本発明の第1の態様の方法により作製可能なシルク紡糸ドープ溶液を準備する工程と、
(ii)シルクタンパク質紡糸ドープ溶液からの引き抜き又は該シルクタンパク質紡糸ドープ溶液の押し出し又はそれらの組合せにより繊維を作製する工程と、
を含む、方法を提供する。
(a)GPGXX(配列番号3)(ここで、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してA、S、G、Y、P及びQから選択される)、
(b)GGX(ここで、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してY、P、R、S、A、T、N及びQから選択される)、及び、
(c)Ax(ここで、xは5〜10の整数である)、
からなる群から選択される少なくとも1つのコンセンサス配列を含む少なくとも2つの反復単位を含むことが特に好ましい。
1.紡糸ドープ液の準備
500 mgの組換えスパイダーシルクタンパク質(C16NR4、C32NR4、(AQ)12NR3、NR5(AQ)12NR3、又は(AQ)24NR3))を10 mLの6 MのGdmSCN(5%(w/v))に溶解した。タンパク質を溶解した後、不溶性部分を遠心分離(8500rpm、30分、18℃)により除去した。上清を、下記のバッファーを用いて毎回4時間透析した(MWCO:6 kDa〜8 kDa):
1)バッファー1:50 mMのNH4HCO3(pH 7.8)、500 mMの尿素、500 mMのGdmSCN
2)バッファー2:50 mMのNH4HCO3(pH 7.8)、500 mMの尿素、250 mMのGdmSCN
3)バッファー3:50 mM NH4HCO3(pH 7.8)、500 mMの尿素
Cタンパク質:15%の濃度に達するまで20%(w/v)のPEG(35 kDa)、500 mMの尿素に対して透析する。ここでの紡糸ドープ液を紡糸に使用することができる。
AQタンパク質:15 mL容のグライナーチューブに移す。このチューブを4℃で一晩保ち、そこで相分離が起こる。濃縮した(下)相(9%(w/v)〜15%(w/v))を紡糸に使用した。
紡糸ドープ液を、22Gカニューレを用いて1 mL容のシリンジに移した。充填されたシリンジをシリンジポンプに取り付けた。カニューレをシリンジに対して直角に下方向へと曲げ、そのようにしてカニューレの先端を凝固浴槽に漬ける。
Cタンパク質:90%のイソプロパノール、10%のH2O
AQタンパク質:75%のイソプロパノール、25%のH2O
引張試験のために、乾燥した繊維を1 cm片に切断し、これを、プラスチック接着剤を用いてプラスチック枠(ゲージ長:2 mm)上に接着した。接着した繊維片を一晩風乾した。繊維片の直径を、繊維片に亘って均等に分布した三点にて光学顕微鏡(倍率100倍、200倍及び400倍)を用いて求めた。
Claims (5)
- 少なくとも1つのシルクタンパク質を含む繊維であって、該繊維の材料の少なくとも10重量%がシルクタンパク質(複数の場合もあり)であり、該シルクタンパク質のモノマー(複数の場合もあり)の分子量が20 kDa〜600 kDaの範囲であり、該繊維の靭性(MJ/m3)が、該シルクタンパク質の分子量が最大300 kDaである場合、該シルクタンパク質の分子量(kDa単位)と少なくとも1.0の因数との積であり、分子量が300 kDaを超えるタンパク質の場合、少なくとも300 MJ/m3であって、
ここで該少なくとも1つのシルクタンパク質は4個〜100個の反復単位を含み、ここで
(i)該反復単位は配列番号21(モジュールC)に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するそれらの変異体から独立して選択され、又は
(ii)該反復単位は一般構造XYを有し、ここで
Xは配列番号20(モジュールA)に記載のアミノ酸配列を有する反復単位若しくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するそれらの変異体から独立して選択され、及び
Yは配列番号22(モジュールQ)に記載のアミノ酸配列を有する反復単位若しくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するそれらの変異体から独立して選択される、
繊維。 - 前記シルクタンパク質が、少なくとも1つの非反復(NR)単位を更に含み、
前記NR単位が、配列番号41に記載のアミノ酸配列を有するNR3、配列番号42に記載のアミノ酸配列を有するNR4、配列番号45に記載のアミノ酸配列を有するNR5、配列番号46に記載のアミノ酸配列を有するNR6、及びそれらのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体からなる群から選択される、請求項1に記載の繊維。 - 合成ポリマー又は天然ポリマーを更に含み、
前記合成ポリマーが、ポリアミド、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、ポリアラミド、ポリ乳酸(PLA)、ポリプロピレン、ポリラクテート、ポリヒドロキシブチレート、ポリウレタン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、又は
前記天然ポリマーが、キサンタン、セルロース、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン、ケラチン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の繊維。 - 前記シルクタンパク質が(C) m NR z 、NR z (C) m 、NR z (C) m NR z 、(AQ) n NR z 、NR z (AQ) n 、及びNR z (AQ) n NR z からなる群から選択され、ここでmは10〜64の整数、nは10〜40の整数、及びzは1〜3の整数であり、NRはそれぞれ独立して非反復単位である、請求項2又は3に記載の繊維。
- 前記シルクタンパク質がC 8 NR4、C 16 NR4、C 32 NR4、(AQ) 12 NR3、(AQ) 24 NR3、NR4C 16 NR4、NR4C 32 NR4、NR3C 16 NR3、NR3C 32 NR3、NR4(AQ) 12 NR4、NR4(AQ) 24 NR4、NR3(AQ) 12 NR3、NR3(AQ) 24 NR3、NR5C 16 NR4、NR6C 16 NR4、NR5C 32 NR4、NR6C 32 NR4、NR5C 16 NR3、NR6C 16 NR3、NR5C 32 NR3、NR6C 16 NR3、NR5(AQ) 12 NR4、NR6(AQ) 12 NR4、NR5(AQ) 24 NR4、NR6(AQ) 24 NR4、NR5(AQ) 12 NR3、NR6(AQ) 12 NR3、NR5(AQ) 24 NR3、又はNR6(AQ) 24 NR3である、請求項4に記載の繊維。
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