WO2017030197A1 - フィブロイン様構造を有するポリペプチド組成物の製造方法 - Google Patents

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WO2017030197A1
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polypeptide
fibroin
fiber
silk
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圭司 沼田
康佑 土屋
潤一 菅原
孝興 石井
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国立研究開発法人理化学研究所
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a polypeptide fiber having a fibroin-like structure and a polypeptide fiber produced by the production method.
  • Natural spider silk made of fibroin has excellent properties against physical changes such as tensile strength, toughness and extensibility, for example, toughness is better than iron of the same weight Polypeptide fibers having about 5 times. Moreover, it is excellent in heat resistance, and furthermore, since it is formed of a polypeptide, it has high biocompatibility and biodegradability.
  • silkworms that use natural yarns industrially, spiders are difficult to cultivate in large quantities, so they produce artificial synthetic fibers that mimic spider silks, and have characteristics for physical changes and biocompatibility. Attempts have been made to apply them to materials and materials such as yarns and bedclothes that have the property and biodegradability (Patent Documents 1-5). However, the production of artificial fibers comparable to natural spider silks for the above properties has not been successful.
  • the natural spider silk is composed of a polyalanine that forms a ⁇ -sheet structure in the structure and a polar region rich in glycine that becomes a core part, and a highly conserved non-repeated amino terminal and carboxyl group on both sides. Due to the arrangement of the terminal domain, it has a random coil-like structure, ⁇ sheet structure and helix structure, and the mixture of these structures is considered to be the reason for the excellent characteristics of natural spider silk, and its structural characteristics are It has been studied (Non-Patent Documents 1 to 3). Also, when spinning in the spider's body, unlike ordinary proteins, spider proteins are highly soluble when stored at high concentrations, but change to very strong fibers as needed. (Non-Patent Document 2). However, the structural characteristics and spider silk production mechanism are not necessarily clarified.
  • Non-Patent Literature The natural spider silk is classified into seven types according to its role, and among these, it is reported that the pulling thread formed by the large jar-like gland has the highest physical properties (Non-Patent Literature). 3). However, the reason for the high characteristics of the spider silk with respect to the above-mentioned physical change is not clarified.
  • Fibroin-like polypeptide composition with characteristics such as high strength and toughness by clarifying the production mechanism of natural spider dragline in spiders and the cause of high characteristics, and applying this mechanism to the production of artificial fibers Product, a method for producing the composition, and a polypeptide product produced by the production method, a polypeptide product such as a resin and a film, and a method for improving physical properties of the peptide product.
  • the present invention is a method for producing a fibroin-derived polypeptide fiber, (i) preparing a dope solution in which a polypeptide derived from fibroin protein is dissolved; (ii) forming fibrils having a granular structure having a high aspect ratio in the dope solution; (iii) a nano-granular structure having a higher aspect ratio than the fibrils closely forms a nano fibril, and the nano fibrils gather together in the fiber axis direction to form a microfiber that is bonded; and (iv) A production method comprising the step of obtaining the polypeptide fiber by isolating the microfiber.
  • the step (ii) of the method for producing a fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention may include a step of changing the composition, pH and / or ionic strength of the solvent.
  • step (ii) of the method for producing fibroin-derived polypeptide fiber The change in the composition of the dope solution is that the solvent of the dope solution is water, a polar organic solvent or a mixed solvent thereof, and / or a coagulant is added,
  • the change in pH of the solvent should be adjusted to pH 6-10, preferably pH 6-8,
  • the change in ionic strength should be adjusted to be high ionic strength, May be included.
  • the high ionic strength may be an ionic strength that is equal to or higher than the ionic strength corresponding to a 300 mM NaCl aqueous solution.
  • the step of changing the solvent composition, pH, salt type and / or salt concentration, and shear stress are applied to the fiber axis. Load in the direction,
  • the method includes a step of forming microfibers in which the nano fibrils are assembled and bonded in the fiber axis direction.
  • step (iii) of the method for producing a fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention Changing the composition of the solvent can be achieved by adding more coagulant, pH change should be adjusted to pH 3 to pH 6, Changes in ionic strength can reduce ionic strength, May be included.
  • the change in the ionic strength may be adjusted by a chaotropic agent and / or a kosmotropic agent.
  • the polypeptide fiber contains 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, most preferably 70% or more or 80% or more of the total of glycine residues and alanine residues in the amino acid sequence There is.
  • the polypeptide fiber may be a recombinant polypeptide.
  • the granular structure having a high aspect ratio in the step (ii) has a height of 110 nm or less and a width of 30 to 1900 nm
  • the nanogranular structure having a high aspect ratio in the step (iii) may have a height of 50 nm or less and a width of 50 to 200 nm.
  • the method for producing a fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention may be a method for producing a polypeptide fiber in which the polypeptide fiber contains 15-30% ⁇ sheet structure.
  • the method for producing a fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention may be a method for producing a polypeptide fiber in which the ⁇ sheet structure is formed of polyalanine.
  • the present invention also provides a polypeptide fiber produced by the production method.
  • the present invention is a fibroin-derived polypeptide fiber
  • a polypeptide fiber which is a microfiber in which nano-granular structures having a high aspect ratio closely form a nano fibril, and the nano fibril aggregates and binds in the fiber axis direction.
  • the nanogranular structure may have a height of 50 nm or less and a width of 50 to 200 nm.
  • the polypeptide fiber of the present invention contains 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, most preferably 70% or more or 80% or more of the total of glycine residues and alanine residues in the amino acid sequence There is.
  • the polypeptide fiber may contain 15-30% ⁇ sheet structure.
  • the fibroin-derived polypeptide fiber may be a spider silk-derived polypeptide fiber.
  • the present invention provides a dope comprising nanofibrils in which nanogranular structures having a high aspect ratio are intimately composed of nanofibrils, or nanogranular structures having a high aspect ratio are intimately configured.
  • a polypeptide product produced from the liquid is provided.
  • the polypeptide product may be a polypeptide product in which the nanofibrils contain 15-30% ⁇ sheet structure.
  • the ⁇ sheet structure may be a polypeptide fiber formed by polyalanine.
  • the present invention also provides a composition comprising fibroin and a polypeptide and / or polyamino acid forming a ⁇ sheet structure.
  • composition may be a polypeptide product selected from fibers, resins and films.
  • composition may be a composition formed by blending fibroin with a polypeptide and / or a polyamino acid forming a ⁇ sheet structure.
  • the polypeptide forming the ⁇ sheet structure may be a polypeptide containing a polyamino acid forming the ⁇ sheet structure.
  • the amino acid sequence of the polypeptide that forms the ⁇ sheet structure may include the amino acid sequence of the polyamino acid that forms the ⁇ sheet structure.
  • the polyamino acid forming the ⁇ sheet structure is an amino acid homopolyamino acid selected from the group consisting of alanine, phenylalanine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, tryptophan, glutamine and methionine. There is a case.
  • the polyamino acid forming the ⁇ sheet structure is at least two amino acids selected from the group consisting of alanine, phenylalanine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, tryptophan, glutamine and methionine. It may be a copolymer.
  • the present invention provides a method for producing the above composition, which comprises blending fibroin with a polypeptide and / or polyamino acid that forms a ⁇ sheet structure.
  • the polypeptide forming the ⁇ sheet structure may be a polypeptide containing a polyamino acid forming the ⁇ sheet structure.
  • the amino acid sequence of the polypeptide that forms the ⁇ sheet structure may include the amino acid sequence of the polyamino acid that forms the ⁇ sheet structure.
  • the polyamino acid forming the ⁇ sheet structure is an amino acid homopolyamino acid selected from the group consisting of alanine, phenylalanine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, tryptophan, glutamine and methionine.
  • amino acid homopolyamino acid selected from the group consisting of alanine, phenylalanine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, tryptophan, glutamine and methionine.
  • the polyamino acid forming the ⁇ sheet structure is at least two amino acids selected from the group consisting of alanine, phenylalanine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, tryptophan, glutamine and methionine. It may be a copolymer.
  • the present invention also provides a method for improving the physical properties of a polypeptide product by blending fibroin with a polypeptide and / or polyamino acid that forms a ⁇ -sheet structure.
  • the method of the present invention may be a method in which the improvement of the physical properties is an increase in tensile strength and / or an increase in toughness.
  • the polypeptide forming the ⁇ sheet structure may be a polypeptide containing a polyamino acid forming the ⁇ sheet structure.
  • the amino acid sequence of the polypeptide that forms the ⁇ sheet structure may include the amino acid sequence of the polyamino acid that forms the ⁇ sheet structure.
  • the polyamino acid forming the ⁇ sheet structure is selected from the group consisting of alanine, phenylalanine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, tryptophan, glutamine, and methionine. It may be a homopolyamino acid of the amino acid selected.
  • the polyamino acid forming the ⁇ sheet structure is selected from the group consisting of alanine, phenylalanine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, tryptophan, glutamine, and methionine. It may be a copolymer of at least two amino acids selected.
  • the fibroin may be a spider silk-derived polypeptide or a silk thread-derived polypeptide.
  • the polyamino acid forming the ⁇ sheet structure may be polyalanine.
  • a method for producing a fibroin-like polypeptide fiber having physical properties such as high toughness and tensile strength, and a polypeptide product such as a resin, a film, and a fiber produced by the production method are provided.
  • FIG. 2 represents a scanning electron micrograph of storage sac silk (upper) and tapered tube silk (lower).
  • the figure of the atomic force micrograph of a storage sac silk (upper stage) and a taper tube silk (lower stage) is represented.
  • variety of the granular structure body of a storage sac silk measured by the atomic force micrograph, and a tapering tube silk granular structure body is represented.
  • the upper right figure shows the distribution in the range of 0 to 1900 nm, and the lower figure shows the distribution in the range of 0 to 200 nm.
  • the distribution of the height of the granular structure of the storage sac silk and the granular structure of the tapered tube silk, as measured by the atomic force micrograph, and the distribution of the width and height of the fibers are shown.
  • the upper middle figure shows the distribution of the granular structure of the storage sac silk and the granular structure of the tapered silk in the range of 0 to 110 nm
  • the upper right figure shows the granular structure of the storage sac silk and the granular structure of the tapered silk.
  • the lower left diagram shows the width distribution of the fiber in the range of 0 to 200 nm
  • the lower right diagram shows the height distribution of the fiber in the range of 0 to 11 nm.
  • the measurement spectra of wide-angle X-ray scattering (WAXS, left figure) and small-angle X-ray scattering (SAXS, right figure) at the synchrotron are shown.
  • the figure of the birefringence image in a storage bag (upper stage) and a tapering tube (lower stage) is represented.
  • 1 represents a schematic diagram of a method for preparing and analyzing a sample of N. clavata dragline.
  • the figure shows an image (180 °) of the internal structure of N. clavata silk fiber observed with an atomic force microscope.
  • the figure (enlarged view) of the image observed with the atomic force microscope of the cross section of N. clavata silk fiber is shown.
  • a method for producing the fibroin-derived polypeptide fiber is a method for producing a fibroin-derived polypeptide fiber.
  • a method for producing the fibroin-derived polypeptide fiber (i) preparing a dope solution in which a polypeptide derived from fibroin protein is dissolved; (ii) forming fibrils having a granular structure having a high aspect ratio in the dope solution; (iii) a nano-granular structure having a higher aspect ratio than the fibrils closely forms a nano fibril, and the nano fibrils gather together in the fiber axis direction to form a microfiber that is bonded; and (iv) obtaining the polypeptide fiber by isolating the microfiber.
  • Fibroin is known as a generic term for fibrous proteins that make up 70% of insects and spider silks.
  • fibroin includes natural silk of insects and arachnids and artificial silks that are artificially produced that mimic or direct the composition and properties of these natural silks.
  • fibroin includes spidroin proteins such as the following spidroin I and II as well as “fibroin”, but not only fibroin derived from these spider silks but also fibroin derived from silkworm silk included.
  • fibroin is prepared by a recombinant method, for example, by producing a nucleic acid sequence encoding a desired amino acid sequence, incorporating this into an expression vector, and producing a recombinant expression vector by a known method,
  • a transformant can be prepared by introducing it into an appropriate host such as a bacterium, yeast, mammalian cell, plant, or insect cell, and these can be isolated and purified for use. (International Publication WO2012 / 165476 etc.).
  • Some of fibroin is commercially available, and for example, they can be obtained and used.
  • fibroin-derived protein refers to proteins that constitute naturally-occurring fibroin such as insects and arachnids, artificially produced by genetic recombination methods other than these natural proteins, for example. Proteins that are similar in structure and properties to the fibroin produced are included.
  • the fibroin structure is similar to a protein having the identity of the amino acid sequence of natural fibroin with 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more. And protein fragments having a partial sequence of these proteins, or fusion proteins of these proteins or protein fragments with other proteins or peptides, and the like.
  • fibroin-derived protein may be described as “fibroin-derived polypeptide” based on its structural characteristics.
  • a protein having properties similar to fibroin means that at least one property selected from the Young's modulus, tensile strength, toughness and stretchability of natural fibroin is at least 70%, preferably compared to natural fibroin. It means having excellent properties of 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 100% or more.
  • fibroin-like polypeptide or “fibroin-like protein”.
  • the “spider silk” or “spider silk” described in the present specification is also commonly referred to as a spider silk thread, and is produced by a silk gland in the spider body, and is produced by a yarn projection (yarn) at the back of the abdomen. It is spun from the tube.
  • the silk glands in the spider's body are divided into piriform, grape-like, bottle-like, tubular, glandular, and flagellate glands.
  • “Spider silk” is generally classified into pulling yarn (also known as bookmark yarn, pulling yarn), bobbin yarn, warp yarn, weft yarn, and retaining yarn, etc., according to its function and components. Refers to the “traction thread” formed by the large bottle-like gland.
  • the secretory gland produces and secretes the dope solution in which the protein that forms the spider silk is dissolved, and then stores the dope solution in the storage sac.
  • the spider silk thread is formed by passing through the taper pipe and spinning with the output pipe (see FIG. 1).
  • the detailed production mechanism has not been elucidated.
  • the “dope solution” refers to a solution in which a polypeptide, which is a raw material for producing a polypeptide composition, is dissolved.
  • polypeptide composition refers to polypeptide products such as fibers, resins, and films made of a polypeptide.
  • sik refers to a fiber in which a large amount of alanine is present and a polypeptide or protein in which a repeating sequence that induces a ⁇ -sheet structure is present.
  • polypeptide fiber refers to a fiber composed of a polypeptide, and particularly refers to a microfiber in which nano fibrils are gathered and bound in a bundle along the fiber axis.
  • spinning means, in principle, a biological process in which a spider produces spider silk in the body and then spouts from the output process.
  • spinning method in terms of “wet spinning method”, “dry spinning method”, “melt spinning method” and the like is, in principle, a “polymer” generally used in the production of synthetic fibers. It is used in the sense of “a step in a method of forming a fiber more”.
  • nanofiber refers to a fibril having a height and width of several hundred nm or less and a width of about 100 nm, which is formed by combining and binding fibroin-derived polypeptides such as spider silk.
  • microfiber refers to a fiber having a width of 1 ⁇ m or more formed by combining and binding nano-small fibers in a bundle shape in the fiber axis direction.
  • Nanoofibrils are nanogranular structures having a width of several hundred nm or less that are closely assembled and bonded.
  • the height of the nanofibril is several hundred nm or less, for example, 500 nm or less, 300 nm or less, 100 nm or less, 70 nm or less, 50 nm or less, 30 nm or less, 20 nm or less, 10 nm or less, 9 nm or less, or 7 nm. Or less, preferably 10 nm or less.
  • the granular structure is one of the structures constituting the spider-derived silk, and in particular, a small granular structure constituting the nanofibril is described as a nano-granular structure.
  • “Granular structure” has a granular form with a high aspect ratio, is rich in glycine and alanine, which are characteristic of silk, and is based on a peptide or polypeptide containing a ⁇ -sheet structure A structure.
  • Nephila edulis spider silk has been reported to have a 17% ⁇ 4% ⁇ -sheet structure (Ling S et al., Biomacromolecules, 2011, 12, 3344-3349). The strongest spider dragline is reported to be 45-65% ⁇ -sheet domain (Vollrath F et al., Polymer, 2009, 50, 5623-5632).
  • bonds of polypeptides, fibrils, and nanofibrils in the formation of these fibers include non-covalent bonds such as hydrogen bonds, ionic bonds, flood bonds, and van der Waals forces, and covalent bonds. It is mainly non-covalent.
  • the production method of the present invention may include a step of chemically cross-linking each fiber molecule by a covalent bond.
  • Examples of functional groups that can be used for cross-linking of polypeptides include amino groups, carboxyl groups, thiol groups, and hydroxy groups.
  • the amino group of the lysine side chain contained in the polypeptide can be crosslinked by forming an amide bond with dehydration condensation with the carboxyl group of the side chain of glutamic acid or aspartic acid.
  • polypeptide fiber of the present invention may affect properties such as tensile strength when the fiber is intertwined.
  • the assembly and bonding of nano fibrils in the formation of microfibers can be achieved by changing the composition of the solvent using a flocculant and / or changing the inorganic salt and pH in the solvent that forms the nano fibril environment. By making it, it can form by the aggregate
  • An aspect of the method for producing a polypeptide fiber of the present invention is a method for producing a polypeptide fiber that is similar to or improved in the characteristics of a pulling thread in a silk gland in a spider body.
  • the method includes the steps of forming nanofibrils from a state in which a polypeptide, which is a raw material for peptide fibers, is dissolved in a solvent, and forming microfibers in which the nanofibrils are assembled and bonded.
  • the step of reducing the width and height of the granular structure having a high aspect ratio in the steps from the formation of nano-fibrils to the formation of micro-fibers and closely assembling are included.
  • the polypeptide derived from the spider silk protein is a polypeptide having the amino acid sequence of a natural spider silk protein, or 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably Is a polypeptide having 95% or more amino acid sequence homology, and a polypeptide fragment having a partial sequence of these polypeptides, or a fusion of these polypeptides or polypeptide fragments with other polypeptides or peptides Protein etc. are included.
  • the fibroin protein-derived polypeptide such as the spider silk according to the present invention has an alanine residue and a glycine residue of 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, based on all amino acid residues. Most preferably, it is 80% or more.
  • spider silk protein is typically spidroin protein.
  • Spidroin protein is also called fibroin, and is spun in a large spider gland of natural spiders.
  • Spidroin I (MaSp1) and Spidroin II (MaSp2) are mainly known.
  • the molecular weight is 250-350 kDa, and 100% repeat structure of 30-40 amino acid units occupies 90% of the total length, and its amino acid composition has a characteristic structure consisting of repeat structure of consensus sequence rich in glycine and alanine .
  • Alanine forms a short polyalanine structure, has a repeating structure in the spidroin protein, and participates in the formation of a ⁇ sheet structure as a crystalline structure in the spider silk fiber.
  • Amino acid sequences such as spidroin-related proteins and polypeptides include, for example, peptides or polypeptides described by accession numbers in the following Table 1-1 and Table 1-2 in the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Peptides are recorded. Thus, for example, by using these amino acid sequences, a polypeptide for producing a fibroin-derived polypeptide fiber such as a spider silk of the present invention can be produced.
  • the spider silk-derived polypeptide is prepared by, for example, producing a nucleic acid sequence encoding a desired amino acid sequence, incorporating this into an expression vector, and producing a recombinant expression vector by a known method, such as bacteria, yeast, and mammalian cells. Then, a transformant can be prepared by introducing it into a suitable host such as a plant or insect cell. Since the recombinant peptide or polypeptide is produced by culturing the obtained transformant in an appropriate medium, the recombinant peptide chain produced from the culture is recovered and used in the present invention. A recombinant peptide chain can be prepared. In addition, a spider silk-derived peptide or polypeptide can be obtained by introducing a recombinant gene into an insect, bird or mammal and purifying and isolating the recombinant polypeptide produced in the body.
  • the ⁇ sheet structure is formed in a non-stretched state where no tension is applied, and when expressed as the amount of electrons present in the crystal out of the total amount of electrons in the material, the fibroin-derived polypeptide such as spider silk Polypeptides comprising 15-30% of the total are preferred, but the fibroin-derived polypeptide fibers such as spider silk produced by the production method of the present invention have a ⁇ -sheet structure of 10-50% or 5-80%. May have.
  • the granular structure having a high aspect ratio in the step (ii) is at least 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • the height is 100 nm or less, 110 nm or less or 120 nm or less, preferably 110 nm or less, and the width is 20 to 2500 nm, 30 to 1900 nm or 50 to 1500 nm, preferably 30 to 1900 nm.
  • the nano-granular structure having a high aspect ratio in the step (iii) is at least 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • the height is 50 nm or less, 30 nm or less, 20 nm or less, 10 nm or less, 9 nm or less or 7 nm or less, preferably 10 nm or less, and the width is in the range of 20 to 300 nm, 50 to 200 nm or 70 to 300 nm, Preferably, it is 50 to 200 nm.
  • the aspect ratio of the granular structure having a high aspect ratio in the step (ii) is at least 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • the structure has a width / height ratio of 5 or more, 10 or more, or 20 or more, preferably 10 or more, and the upper limit is not particularly limited.
  • the aspect ratio of the granular structure having a high aspect ratio in the step (iii) is at least 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • the structure has a width / height ratio of 3 or more, 5 or more, or 10 or more, preferably 5 or more, and the upper limit is not particularly limited.
  • a dope solution in which a fibroin-derived protein such as a spidron protein is dissolved is produced using a known method (using a fibroin-derived polypeptide such as a natural or recombinant spider silk as described above ( It can be produced by Patent Documents 1 to 5).
  • a solvent for these dope solutions for example, an aqueous solution, a polar organic solvent, or a mixed solvent thereof can be used.
  • Examples of polar organic solvents used in the dope solution include dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, or 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP ), Or a mixture thereof, but is not limited thereto.
  • polar organic solvents used in the dope solution include dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, or 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP ), Or a mixture thereof, but is not limited thereto.
  • Non-Patent Document 2 The three-dimensional structure of fibroin-derived proteins such as spider silk is known to be affected by the pH, ionic strength (salt type and concentration), humidity, or moisture concentration in the environment, for example, in the case of an aqueous solvent.
  • fibroin-derived polypeptide can be produced by changing one or more of these elements, or by changing a combination of a plurality of elements.
  • Specific examples of the method for producing the fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention include a wet spinning method, a dry spinning method, and a melt spinning method.
  • Changes in elements related to the polypeptide environment may change rapidly or slowly depending on the selection of these elements.
  • the microfiber can be formed by changing the composition, pH and / or ionic strength of the solvent of the dope solution and / or adding a flocculant.
  • a coagulant is added to the dope solution while applying a shear stress in the fiber axis direction, or the dope solution is injected and extruded into a solvent containing the coagulant, or Fibroin-derived polypeptide fibers can be produced by soaking.
  • an aqueous solution containing an inorganic salt is preferable.
  • a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, 2-propanol or acetone may be added as appropriate, but is not limited thereto.
  • the aqueous solution containing the inorganic salt is preferably a weakly acidic to acidic solvent.
  • a salt in a solvent may be prepared respectively.
  • This change in salt is due to the change from step (ii) to step (iii), and the nanogranular structure having the high aspect ratio closely forms a nanofibril, and the nanofibril is in the fiber axis direction. Prepared to form microfibers assembled and bound together.
  • step (ii) a solvent having a high ionic strength is prepared, and in step (iii), a salt is prepared so as to reduce the ionic strength.
  • step (ii) an ionic strength higher than that of a sodium chloride (NaCl) aqueous solution of 150 mM or higher, preferably 300 mM or higher, more preferably 350 mM or higher, and most preferably 400 mM or higher is given.
  • the salt in the solvent is prepared so as to give an ionic strength lower than the ionic strength of the aqueous sodium chloride (NaCl) solution in step (ii), but is not limited thereto.
  • the ionic strength I is a physical quantity that represents the degree of influence of ions in a solution, and is used herein with a definition generally understood by those skilled in the art. That is, the ionic strength is half of the sum of all ions in the solution multiplied by the molar concentration and the square of the charge, and can be expressed by the following formula 1.
  • Formula 1 m i represents the i-th ion concentration
  • Z i represents the number of charges.
  • a 300 mM NaCl aqueous solution and a 100 mM Na 3 PO 4 aqueous solution give the same ionic strength.
  • a NaCl aqueous solution of 300 mM or more may be prepared, and in step (iii), it may be adjusted to a Na 3 PO 4 aqueous solution of less than 100 mM.
  • the fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention can be produced by adjusting the type and / or concentration of the salt in steps (ii) and (iii).
  • Chaotropic ions are ions that reduce the interaction between water molecules and thereby destabilize the structure, exposing fibroin-derived polypeptides to an environment with solutes that increase the entropy of water. However, there are also those that destabilize the molecular structure by affecting hydrogen bonds, van der Waals forces, hydrophobic bonds, etc. between polypeptides. Kosmotropic ions have the opposite effect to this chaotropic ion. Following exposure to chaotropic ions, exposure to an environment rich in kosmotropic ions and / or removal or reduction of chaotropic ions can produce the polypeptide fibers of the invention.
  • Chaotropic agents for preparing the environment containing chaotropic ions are urea, guanidinium isothiocyanate, sodium thiocyanate (NaSCN), guanidine HCl, guanidinium chloride, guanidinium thiocyanate, lithium tetrachloroacetate, sodium perchlorate, tetrachloro Examples include, but are not limited to, rubidium acetate, potassium iodide, cesium trifluoroacetate, arginine, citrulline, sodium chloride, derivatives thereof or salts with different counter cations.
  • Cosmotropic agents for preparing the kosmotropic environment include ammonium sulfate, potassium phosphate and sodium citrate, sodium formate, taurine, D-trehalose, inositol, betaine, derivatives thereof or salts with different counter cations. However, it is not limited to these. Also, the preparation from chaotropic salts to cosmotropic salts may follow the Hofmeister series of salts. For example, in the step (iii), when the solvent is an aqueous solution, a salt (for example, ammonium sulfate or potassium phosphate) in which the salt ion has a remarkable kosmotropic property than sodium ion and chloride ion is selected as a kosmotropic salt. Can be used as
  • an alkali metal halide for example, LiCl, LiBr, etc.
  • an alkaline earth metal halide for example, CaCl 2
  • Alkaline earth metal nitrates such as Ca (NO 3 ) 2
  • thiocyanates such as NaSCN
  • the step of producing the fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention when changing the pH, for example, by forming a granular structure by making a weak alkaline dope near neutral, By changing to weak acidity, while applying a shear stress to the polypeptide fibrils, the nano fibrils closely composed of the nanogranular structures having a high aspect ratio are assembled and bonded in the axial direction. Constructed microfibers can be formed.
  • the weakly alkaline dope solution has a pH of 6.0 to 10.0, preferably pH 6.5 to 8.0, and a pH in the vicinity of neutrality for forming a granular structure includes pH 6 to 7.5.
  • examples of weakly acidic pH for forming nanogranular structures include pH 4-6.
  • the fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention can be produced by sequentially lowering the pH in step (iii) from pH 6.7 to pH 5.7.
  • each of the pHs of step (ii) and step (iii) may be adjusted to pH 6.4 or more and step (iii) to pH 6.4 or less with pH 6.4 as a boundary. .
  • the pH adjusting agent a commonly used pH adjusting agent can be used. Specifically, it is selected from hydrochloric acid, dilute hydrochloric acid, sulfuric acid, dilute sulfuric acid, nitric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, an aqueous ammonia solution, and the like, but is not limited thereto.
  • organic salts such as acetates, oxalates, and succinates that are not limited to these can be used.
  • a shear stress in the step of the method for producing the fibroin-derived polypeptide for example, by applying tension to the produced microfiber, or by applying a high speed to the produced microfiber. It is possible to apply a shear stress by carrying out by winding or passing a narrow tube having a diameter of 500 nm to several ⁇ m in contact with the tube wall in the manufacturing process, but is not limited thereto.
  • the temperature is not particularly limited, but the fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention can be produced by appropriately selecting a specific temperature.
  • the fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention can be produced by isolating the microfiber produced by the steps (i) to (iii).
  • isolated the microfiber means that in the wet spinning method, after forming the microfiber in a solvent, the microfiber is separated from the solvent, and the fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention is separated.
  • dry spinning method it refers to obtaining the fibroin-derived polypeptide fiber of the present invention by evaporating the solvent after forming the microfiber in the solvent.
  • artificial silk can be produced by bundling polypeptide fibers produced by the method for producing the fibroin-derived polypeptide.
  • this polypeptide fiber By using silk produced from this polypeptide fiber, for example, yarns, mattresses, non-silent fabrics, meshes, nets, etc. can be produced. Taking advantage of the heat resistance, high tensile strength, toughness, and extensibility of this polypeptide fiber, it is necessary to have high impact resistance such as bulletproof garments, parachutes, and car bodies. Can be used for the production of various materials. Moreover, it can be used as a medical material such as a wound closure material, suture thread, adhesive bandage, and scaffold material for regenerative medicine utilizing high strength, high extensibility, high toughness, biodegradability and biocompatibility.
  • a wound closure material such as a wound closure material, suture thread, adhesive bandage, and scaffold material for regenerative medicine utilizing high strength, high extensibility, high toughness, biodegradability and biocompatibility.
  • composition comprising fibroin and polypeptide and / or polyamino acid forming ⁇ sheet structure
  • composition comprising fibroin and polypeptide and / or polyamino acid forming ⁇ sheet structure. It is a thing.
  • polypeptide forming a ⁇ sheet structure includes any polypeptide as long as it forms a ⁇ sheet structure in its two-dimensional structure, and is a natural polypeptide or artificially produced.
  • it refers to an artificially produced polypeptide, more preferably a polypeptide comprising the following polyamino acid sequence:
  • polyamino acid refers to a high molecular weight amino acid polymer obtained by a one-stage polymerization reaction using an amino acid or a derivative thereof as a monomer.
  • the polyamino acid forming the ⁇ -sheet structure is an artificially produced polymer of L- or D-amino acid, and refers to any polyamino acid that forms the ⁇ -sheet structure in its secondary structure, preferably , Polyalanine, polyphenylalanine, polycysteine, polyvaline, polyleucine, polyisoleucine, polytyrosine, polytryptophan, polyglutamine, polymethionine and their derivatives, and their homopoly Not only amino acids and derivatives thereof, but also amino acids such as alanine, phenylalanine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, tryptophan, glutamine, methionine, and the like, as well as a plurality of types, preferably 2 to 5, More preferably 2-4 types Most preferably comprises a polyamino acid comprising a copolymer of two or three amino acids.
  • polyamino acids can be produced, for example, by known methods such as chemical enzyme polymerization (NumataNumK. Et al., Polymer Journal, 2015; 47: 537-545, and BakerBaJ. P. et al., Biomacromoleculesma2012, 13). , 947-951 etc.).
  • the degree of polymerization of the polyamino acid is in the range of 2 to 100, preferably in the range of 5 to 50, more preferably in the range of 10 to 30, and most preferably in the range of 10 to 20.
  • polyamino acids In the present specification, the structures of polyamino acids, polypeptides, and proteins are described in a three-letter or one-letter notation well-known to those skilled in the art. In the specification, amino acids are in L form unless otherwise specified.
  • composition comprising the fibroin of the present invention and a polypeptide and / or polyamino acid forming a ⁇ -sheet structure is, for example, an aqueous solution of a polypeptide and / or polyamino acid forming a ⁇ -sheet structure in a dope solution in which fibroin is dissolved.
  • it can be produced by adding a water suspension, mixing and drying.
  • the blending ratio of the polypeptide and / or polyamino acid forming the ⁇ sheet structure is in the range of 0.1 to 50.0%, preferably in the range of 0.5 to 30.0%, and more preferably in the range of 1 to 10.0%. Most preferably, it is in the range of 1 to 5%.
  • the polymerization degree of polyalanine is in the range of 2 to 100, preferably in the range of 3 to 50, more preferably in the range of 10 to 30. Range, most preferably in the range of 10-20.
  • the blending ratio of polyalanine is in the range of 0.1 to 30.0%, preferably in the range of 0.5 to 20.0%, more preferably in the range of 1.0 to 10.0%, and most preferably in the range of 3.0 to 5.0%. It is.
  • composition of the present invention examples include a polypeptide product produced by the above method.
  • polypeptide product examples include films, fibers, and resins described below.
  • a dope solution prepared by dissolving or suspending the above-described composition of the present invention in a solvent is prepared, and the protein in this dope solution is insolubilized by a conventional method well known to those skilled in the art.
  • the resin of the present invention can be produced.
  • the solvent include water, a polar organic solvent, or a mixed solvent thereof.
  • the method for insolubilizing the protein of the present invention include distillation of the solvent of the dope solution, change in the type and / or concentration of salt in the solvent, change in ionic strength or salt concentration, and / or change in pH.
  • a dope solution prepared by dissolving or suspending the above-described composition of the present invention in a solvent is prepared, and a wet spinning method or a dry spinning method well known to those skilled in the art, or the above-mentioned embodiment “ 1.
  • the fiber of the present invention can be produced from the dope solution by insolubilizing the protein of the present invention using the method described in “1. Polypeptide fiber”.
  • the solvent include water, a polar organic solvent, or a mixed solvent thereof.
  • a dope solution prepared by dissolving or suspending the above-described composition of the present invention in a solvent is prepared, and spin coating method, dipping method, spray coating method, brush coating method is prepared from this dope solution.
  • the film of the present invention can be produced using a known method such as a blade coating method, a roller coating method, and a roll-to-roll method.
  • the solvent include water, a polar organic solvent, or a mixed solvent thereof.
  • Examples of the polar organic solvent used in the dope liquid include dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide or 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. (HFIP) or a mixture thereof can be selected, but is not limited thereto.
  • polypeptide products of the present invention for example, yarns, bedding, non-clothes, meshes, nets, and the like using the same can be produced.
  • these polypeptide products such as heat resistance, high tensile strength, toughness and / or extensibility, for example, production of materials that require high impact resistance such as bulletproof garments, parachutes, automobile bodies, etc.
  • it can be used as a medical material such as a wound closure material, suture thread, adhesive bandage, and scaffold material for regenerative medicine utilizing high strength, high extensibility, high toughness, biodegradability and biocompatibility.
  • fibroin can be used by being produced by a microorganism into which DNA prepared by a genetic recombination method as described above is introduced, and by isolating and purifying it, or commercially available It is. By these methods, fibroin is obtained, and separately known methods such as a chemical enzyme polymerization method (Numata K.
  • the insolubilization method in addition to the drying method, for example, the same method as described in the method for producing a polypeptide fiber, specifically, the type and / or concentration change of the salt in the solvent, ion Methods such as changes in strength or salt concentration and / or changes in pH can be used.
  • Another preferred embodiment of the present invention is at least one selected from the tensile strength, toughness, extensibility, etc. of a polypeptide product comprising a polypeptide such as fibroin. Is a way to improve one physical property.
  • polypeptide products include resins, films and fibers made of polypeptides.
  • a method for improving the physical properties of a polypeptide product is, for example, by blending a polyamino acid that forms a ⁇ sheet such as polyalanine into a polypeptide product such as a resin, a film, and a fiber. More specifically, for example, a polypeptide and / or a polyamino acid that forms a ⁇ sheet structure is added to a dope solution in which a raw material such as fibroin, for example, for producing a polypeptide product such as a resin, a film, and a fiber is dissolved. After addition and mixing, for example, by distilling off the solvent and insolubilizing the polypeptide, a polypeptide product with improved physical properties can be obtained compared to a polypeptide product to which no polyamino acid is added.
  • improvement of physical properties of a polypeptide product refers to, for example, obtaining a commercially available tensile tester, conducting a tensile strength test, and determining a critical stress when the test sample breaks, When the value of this critical stress is higher than that of the sample to be compared, it means that the tensile strength is improved.
  • toughness is improved when the test sample is measured with a tensile tester and the area of the curve in the stress-strain curve diagram is higher than the area value of the sample to be compared. Means improved.
  • the extensibility is improved.
  • the tensile test of the test sample is performed with a tensile tester, and the limit strain rate (stretch rate) when the test sample breaks is obtained.
  • stretch rate is improved when the stretch rate at break of the test sample shows a higher value than the critical strain rate at break obtained as described above.
  • the polyamino acid used in the method of the present invention includes a polyamino acid that easily forms a ⁇ sheet structure, and more specifically, polyalanine, polycysteine, and the like.
  • These polyamino acids can be produced by known methods such as chemical enzyme synthesis (NumataNumK. Et al., Polymer Journal, 2015; 47: 537-545 and Baker J. P. et al., Biomacromolecules 2012, 13, 947 -951 etc.).
  • the degree of polymerization is in the range of 2 to 100, preferably 5
  • the dope solution is preferably blended at a blending ratio of preferably 1.0 to 10.0%, most preferably 3.0 to 5.0%.
  • this polypeptide product such as heat resistance, high tensile strength, toughness and / or extensibility, for example, for the production of materials requiring high impact resistance such as bulletproof garments, parachutes, and car bodies. Available. It can also be used for the production of medical materials such as wound closure materials, sutures, adhesive bandages, and scaffold materials for regenerative medicine using high strength, high extensibility and high toughness, biodegradability and biocompatibility.
  • Nephila clavata Extraction of Nephila clavata's large bottle-like gland silk
  • the large bottle-like gland was extracted from female Nephila clavata (Japanese name: joro spider, hereinafter referred to as “N. clavata”) having a body length of 20 mm or more.
  • the large bottle-shaped gland silk was collected with tweezers and used for the subsequent experiments.
  • Birefringence Birefringence was expressed as a phase difference divided by the target thickness. Since spider fibers are cylindrical, the thickness is the fiber diameter.
  • the phase difference was acquired with a 50 ⁇ objective lens using a light polarization microscope (BX53, Olympus, Tokyo). Images were analyzed with WPA-view software (ver. 2.4.2.5, Photonic Lattice, Inc.).
  • a single fiber is mounted directly on the sample stage or mounted in a super glue (Loctite 460, Henkel, Germany), and the cross section of the sample is microtome (RM2265, Leica Mikryosysteme GmbH, Austria).
  • a cross section in the longitudinal direction of the fiber sample was observed with AFM. Images were acquired using a scanning probe microscope (type 5300E, Hitachi, Ltd., Tokyo) in tapping mode under 40% humidity conditions.
  • the cantilever was applied with a spring constant of 3 N / m and a scan wavelength: 0.8 Hz, and for a cross-section sample, a spring constant of 20 N / m and a scan wavelength of 0.5 Hz were used. .
  • Fig. 2 shows the observation results of both silks with a scanning electron microscope.
  • a bundle formed by a large number of nanofibrils was observed in the storage sac silk. This bundle was approximately 50 ⁇ m long and lined up along the storage sac silk. Even in the tapered tube, a bundle of nano-fibrils with less agglomeration was observed. At higher magnification, the findings indicating a spirally structured nanofibril were observed.
  • the width and height of the granular structure were measured for this granular structure.
  • 80% of the granular structure was distributed in the range of 500 nm to 1900 nm, while 15% was below 100 nm.
  • the width of the tapered tube silk granule structure was reduced to less than 200 nm and the peak was 100 nm.
  • Analysis for height also showed a decreasing trend, with taper tube silk from 1 nm to 9 nm versus 10 nm to 110 nm storage sac silk (FIGS. 4, 5).
  • the drag yarn fibers had a width in the range of 50 to 200 nm and a height in the range of 7 nm or less (FIG. 5).
  • the fiber containing granules with a high aspect ratio of about 500 nm to several ⁇ m in width and 50 nm in height in the storage sac becomes smaller as it moves through the tapering tube.
  • Small granules having a high aspect ratio of about 60-130 nm in width and a height of 10 nm or less are closely aligned in tandem, and the traction thread discharged from the emergence protrusion of N.clavata is tapered tube silk
  • the storage sac has granules with a high aspect ratio in the storage sac, and both the tapered tube and the silk spun from the yarn projection have a high aspect ratio. It was observed that the granules they had were arranged in tandem.
  • the silk fiber before spinning has a high aspect ratio before spinning, and is oriented by spinning, and the microfiber constituting the fiber is a granular structure of about 100 nm. It was shown that the micro-fibers were formed by the granular structures being oriented closely before spinning.
  • N.clavata dragline fiber The traction yarn as a product of the spinning process and its internal structure were analyzed (FIG. 8).
  • (1) Observation of N.clavata dragline fiber by atomic force microscope The atomic force microscope was used to examine the structure of N.clavata dragline fiber in the nanometer range (FIGS. 8 to 10).
  • An image showing nanofibrils was also observed in the pulling yarn, that is, silk after being spun out from the output tube. All nanofibrils were observed to be aligned in the direction of the dragline axis.
  • the observation of the helical structure was observed in the adjacent part of two nanofibrils. However, most nanofibrils were observed to be aligned parallel to each other.
  • the nanofibers of the drag yarn Compared to the nanofibers of tapered tube silk, the nanofibers of the drag yarn shared their properties and exhibited a granular image with a high aspect ratio along the fibers at 113 ⁇ 21 nm width. The height of the granular structure was about 7 nm.
  • nanofibrils are the main internal structure in the pulling yarn. Furthermore, changes in the nanofibrillar structure that change in response to mechanical pulling have been shown to contribute to the tensile strength and stretch properties of the dragline.
  • Temporary birefringence change due to external tension of N.clavata dragline fiber Birefringence is an index of molecular alignment and is expressed as a phase difference divided by the thickness of the object. Since the spider fiber has a cylindrical shape, the diameter of each fiber is used as the thickness. The diameter was obtained from a scanning electron microscope image, and the average thickness was 4.8 ⁇ 0.4 ⁇ m.
  • the birefringence of N.clavata dragline was about 0.03. This value increased when stretched by 5% and 10% over the total length of the fiber. This birefringence value decreased when relaxed from 10% stretch to 5% stretch. This value corresponds to the value for 5% stretching. When the fiber was stretched again to 10% and 15%, the birefringence value increased accordingly.
  • Silk fibroin powder obtained by freeze-drying an aqueous solution of silk fibroin (Bombyx mori silk cocoon)
  • an aggregate fiber of a granular structure having a width of 80 nm or less and a height of 10 nm produced by the method of Baker et al. (Baker JP et al., Biomacromolecules 2012, 13, 947-951) having a number average molecular weight of about 700 g / mol.
  • polyAla polyalanine
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • Table 3 shows the results of evaluating the physical properties of Young's modulus, tensile strength, tensile strain rate and toughness of non-stretched silk films produced with 100% fibroin and 5% polyAla / 95% fibroin.
  • Tables 4 and 5 show the results of evaluating the physical properties of the films obtained by 50% stretching and 100% stretching, followed by vacuum drying.

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Abstract

天然のクモの牽引糸のクモ体内での産生機構及び高い特性をもたらす原因を明らかにし、この機構を人工繊維の製造に応用することにより、高い強度及び靱性等の特性を有するフィブロイン様ポリペプチド組成物、該組成物を製造する方法、及び、該製造方法で製造されるポリペプチド繊維、樹脂及びフィルム等のポリペプチド製品、並びにペプチド製品の物理的特性を向上させる方法を提供する。

Description

フィブロイン様構造を有するポリペプチド組成物の製造方法
　本発明は、フィブロイン様構造を有するポリペプチド繊維の製造方法、及びその製造方法で製造されるポリペプチド繊維に関する。
　フィブロインからなる天然のクモの糸は、引張強度(tensile strength)、靱性（toughness)及び伸展性(extensibility)等の物理的な変化に対する特性に優れ、例えば、靱性は同一重量の鉄と比較して約５倍を有するポリペプチド繊維である。また、耐熱性にも優れ、さらに、ポリペプチドで形成されているところから、高い生体適合性(biocompatibility)及び生分解性(biodegradability)を有する。しかし、天然糸を産業上利用するカイコと相違し、クモは大量飼育が困難であるところから、クモの糸を模倣した人工合成繊維を製造し、前記物理的な変化に対する特性、並びに、生体適合性及び生分解性を有する糸、敷布等の素材や材料への応用が試みられている（特許文献１～５）。しかし、上記の特性について天然のクモ糸に匹敵する人工繊維の製造は、成功していない。
　天然のクモ糸は、その構造中にβシート構造を形成するポリアラニンとグリシンを多く含む極性領域とが繰り返されてコア部分となり、その両側に高度に保存された非反復型のアミノ末端とカルボキシル末端ドメインが配置されることにより、ランダムコイル状構造、βシート構造及びへリックス構造を有し、これらの構造の混在が天然のクモ糸の優れた特性の理由と考えられ、その構造的特性が検討されている（非特許文献１～３）。また、クモの体内で紡糸される際、通常のタンパク質の場合と相違し、クモタンパク質は高濃度で貯蔵されている際には高い可溶性を示すが、必要に応じて極めて丈夫な繊維へと変化する（非特許文献２）。しかし、構造的特性やクモ糸の産生機構が必ずしも明らかにされていない。
　上記天然のクモ糸は、その役割によって７種類に分類されるが、この中で、大瓶状腺で形成される牽引糸がもっとも上記の物理的特性が高いことが報告されている（非特許文献３）。しかし、クモ糸の上記の物理的な変化に対する高い特性の理由も明らかにされていない。
国際公開公報WO2007/078239 国際公開公報WO2010/123450 国際公開公報WO2011/112046 国際公開公報WO2012/165476 国際公開公報WO2013/065650
Numata Kら、Soft Matter 2015年6月30日、11、6335-6342 Hagn Fら、Nature. 2010; 465(7295): 239-242 Teule Fら、Nature Protocols 2009; 4: 341-355
　天然のクモの牽引糸のクモ体内での産生機構及び高い特性をもたらす原因を明らかにし、この機構を人工繊維の製造に応用することにより、高い強度及び靱性等の特性を有するフィブロイン様ポリペプチド組成物、該組成物を製造する方法、及び、該製造方法で製造されるポリペプチド繊維、樹脂及びフィルム等のポリペプチド製品、並びにペプチド製品の物理的特性を向上させる方法を提供する。
　具体的には、本発明は、フィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
(i)　フィブロインタンパク質由来のポリペプチドを溶解したドープ液を調整するステップ、
(ii)　高いアスペクト比を有する顆粒状構造体を有する小繊維を前記ドープ液中で形成させるステップ、
(iii)　前記小繊維より、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させるステップ、及び　
(iv) 前記マイクロ繊維を単離することにより前記ポリペプチド繊維を得るステップ
　を含む製造方法を提供する。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(ii)において、溶媒の組成、pH及び／又はイオン強度を変化させる工程を含む場合がある。
　フィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(ii)において、
　ドープ液の組成の変化は、ドープ液の溶媒を水、極性有機溶媒若しくはそれらの混合溶媒とすること、及び／又は凝固剤を添加すること、
　溶媒のpHの変化は、pH6～10好ましくはpH6～8に調整すること、
　イオン強度の変化は、高いイオン強度となるように調整すること、
　を含む場合がある。
　フィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(ii)において、
　前記高いイオン強度は、300mMのNaCl水溶液に相当するイオン強度以上のイオン強度である場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(iii)において、溶媒の組成、pH、塩の種類及び／又は塩濃度を変化させる工程、及び
　剪断応力(shear stress)を繊維軸方向に負荷し、
　前記ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させる工程を含む場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法の前記ステップ(iii)において、
　溶媒の組成の変化は、凝固剤をさらに添加すること、
　pHの変化はpH3～pH6に調整すること、
　イオン強度の変化は、イオン強度を低下させること、
　を含む場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法において、
　前記イオン強度の変化は、カオトロピック(chaotropic）剤及び／又はコスモトロピック(kosmotropic)剤により調整される場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法において、
　前記ポリペプチド繊維は、アミノ酸配列中にグリシン残基及びアラニン残基の合計が40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、もっとも好ましくは70％以上又は80％以上含まれる場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法において、
　前記ポリペプチド繊維は、組換えポリペプチドである場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法において、
　前記ステップ(ii)における高いアスペクト比を有する顆粒状構造体は、高さが110nm以下及び幅が30～1900nmであり、
　前記ステップ(iii)における高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体は、高さが50nm以下及び幅が50～200nmである場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法は、前記ポリペプチド繊維が、βシート構造を15～30％含むポリペプチド繊維の製造方法である場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法は、前記βシート構造が、ポリアラニンによって形成されるポリペプチド繊維の製造方法である場合がある。
　また、本発明は前記製造方法で製造される、ポリペプチド繊維を提供する。
　さらに、本発明は、フィブロイン由来のポリペプチド繊維であって、
高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維であるポリペプチド繊維を提供する。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維において、
　前記ナノ顆粒状構造体は、高さが50nm以下及び幅が50～200nmである場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維において、
　前記ポリペプチド繊維は、アミノ酸配列中にグリシン残基及びアラニン残基の合計が40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、もっとも好ましくは70％以上又は80％以上含まれる場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維において、
　前記ポリペプチド繊維は、βシート構造を15～30％含む場合がある。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維において、前記フィブロイン由来のポリペプチド繊維が、クモ糸由来のポリペプチド繊維である場合がある。
　また、本発明は、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してナノ小繊維からなる、又は、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接して構成するナノ小繊維を含むドープ液より製造されるポリペプチド製品を提供する。
　前記ポリペプチド製品は、前記ナノ小繊維が、βシート構造を15～30％含むポリペプチド製品である場合がある。
　前記ポリペプチド繊維及び前記ポリペプチド製品の発明において、前記βシート構造が、ポリアラニンによって形成されるポリペプチド繊維の場合がある。
　また、本発明は、フィブロインと、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含む組成物を提供する。
　前記組成物が、繊維、樹脂及びフィルムから選択されるポリペプチド製品である場合がある。
　また、前記組成物は、フィブロインに、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を配合してなる組成物の場合がある。
　本発明の組成物において、前記βシート構造を形成するポリペプチドが、βシート構造を形成するポリアミノ酸を含むポリペプチドである場合がある。
　本発明の組成物において、前記βシート構造を形成するポリペプチドのアミノ酸配列が、βシート構造を形成するポリアミノ酸のアミノ酸配列を含む場合がある。
　本発明の組成物において、前記βシート構造を形成するポリアミノ酸が、アラニン、フェニルアラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン及びメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸のホモポリアミノ酸の場合がある。
　本発明の組成物において、前記βシート構造を形成するポリアミノ酸が、アラニン、フェニルアラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン及びメチオニンからなる群から選択される少なくとも2種のアミノ酸の共重合体の場合がある。
　さらに、本発明は、前記組成物を製造する方法であって、フィブロインに、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を配合する製造方法を提供する。
　本発明の製造方法において、前記βシート構造を形成するポリペプチドが、βシート構造を形成するポリアミノ酸を含むポリペプチドである場合がある。
　本発明の製造方法において、前記βシート構造を形成するポリペプチドのアミノ酸配列が、βシート構造を形成するポリアミノ酸のアミノ酸配列を含む場合がある。
　本発明の製造方法において、前記βシート構造を形成するポリアミノ酸が、アラニン、フェニルアラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン及びメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸のホモポリアミノ酸の場合がある。
　本発明の製造方法において、前記βシート構造を形成するポリアミノ酸が、アラニン、フェニルアラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン及びメチオニンからなる群から選択される少なくとも2種のアミノ酸の共重合体の場合がある。
　また、本発明は、フィブロインに、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を配合することにより、ポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法を提供する。
　本発明の方法は、前記物理的特性の向上が、引張強度の増加及び／又は靭性の増加である方法の場合がある。
　本発明のポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法において、前記βシート構造を形成するポリペプチドが、βシート構造を形成するポリアミノ酸を含むポリペプチドである場合がある。
　本発明のポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法において、前記βシート構造を形成するポリペプチドのアミノ酸配列が、βシート構造を形成するポリアミノ酸のアミノ酸配列を含む場合がある。
　本発明のポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法において、前記βシート構造を形成するポリアミノ酸が、アラニン、フェニルアラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン及びメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸のホモポリアミノ酸の場合がある。
　本発明のポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法において、前記βシート構造を形成するポリアミノ酸が、アラニン、フェニルアラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン及びメチオニンからなる群から選択される少なくとも2種のアミノ酸の共重合体の場合がある。
　前記組成物、組成物を製造する方法、及びポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法において、前記フィブロインが、クモ糸由来ポリペプチド又は絹糸由来ポリペプチドの場合がある。
　また、前記組成物、組成物を製造する方法、及びポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法において、βシート構造を形成するポリアミノ酸がポリアラニンの場合がある。
　高い靱性、及び引張強度等の物理的特性を有するフィブロイン様ポリペプチド繊維を製造する方法、及び、該製造方法で製造される樹脂、フィルム、繊維などのポリペプチド製品を提供する。
N.clavata（ジョロウグモ）の大瓶状腺の模式図を表す。 貯蔵嚢シルク（上段）及びテーパリング管シルク（下段）の走査型電子顕微鏡写真の図を表す。 貯蔵嚢シルク（上段）及びテーパリング管シルク（下段）の原子間力微鏡写真の図を表す。 原子間力微鏡写真で計測した貯蔵嚢シルクの顆粒状構造体及びテーパリング管シルク顆粒状構造体の幅の分布図を表す。上段右図は0～1900nmの範囲、下段図は0～200nmの範囲での分布を表す。 原子間力微鏡写真で計測した貯蔵嚢シルクの顆粒状構造体及びテーパリング管シルクの顆粒状構造体の高さ、並びに繊維の幅及び高さの分布図を表す。上段中央図は貯蔵嚢シルクの顆粒状構造体及びテーパリングシルクの顆粒状構造体の0～110nmの範囲の分布図、上段右図は貯蔵嚢シルクの顆粒状構造体及びテーパリングシルクの顆粒状構造体の0～11nmの範囲の分布図、下段左図は繊維の0～200nmの範囲での幅の分布図、下段右図は繊維の0～11nmの範囲での高さ分布図を表す。 シンクロトロンでの広角Ｘ線散乱(WAXS、左図）及び小角Ｘ線散乱（SAXS、右図）の測定スペクトルを表す。 貯蔵嚢（上段）及びテーパリング管（下段）における複屈折像の図を表す。 N.clavata牽引糸の試料の調製及び解析方法の概略図を表す。 N.clavataのシルク繊維の内部構造の原子間力顕微鏡での観察像の図(180°) を表す。 N. clavata シルク繊維の横断面の原子間力顕微鏡での観察像の図（拡大図）を表す。 張力負荷による延伸で変化したナノ小繊維のトポロジーを検討した原子間力顕微鏡像の図を表す。 張力負荷による延伸に伴うナノ小繊維の直径を計測した結果を表す。 外力により牽引糸を延伸した場合の一時的な複屈折の変化を表す。 外力により牽引糸を延伸後、弛緩し、その後再度延伸した場合の複屈折の変化を表す。 図１２Ｂの複屈折の値の変化を表す。
１．ポリペプチド繊維
　本発明の実施態様の一つは、フィブロイン由来のポリペプチド繊維の製造方法である。該フィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法は、
(i)　フィブロインタンパク質由来のポリペプチドを溶解したドープ液を調整するステップ、
(ii)　高いアスペクト比を有する顆粒状構造体を有する小繊維を前記ドープ液中で形成させるステップ、
(iii)　前記小繊維より、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させるステップ、及び
(iv)　前記マイクロ繊維を単離することにより前記ポリペプチド繊維を得るステップ
を含む。
　フィブロインは、昆虫とクモ類等のシルクを構成し、その70％を占める繊維状のタンパク質の総称として知られる。本明細書において、「フィブロイン」とは、昆虫とクモ類の天然のシルク、及び、これらの天然のシルクの組成及び特性を模倣又は指向した人工的に製造される人工的なシルクも含む。本明細書において、「フィブロイン」は、下記のスピドロインI及びII等のスピドロインタンパク質も「フィブロイン」に含まれるが、これらのクモ糸由来のフィブロインのみならず、カイコの絹糸に由来するフィブロイン等も含まれる。天然のフィブロイン以外でも、フィブロインは、遺伝子組換え法により、例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列を製造し、これを発現ベクターに組み込んで、組換え発現ベクターを公知の方法で作製し、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物、昆虫細胞等の適当な宿主に導入して形質転換体を作製し、これらを単離精製して利用することができる。（国際公開公報WO2012/165476等）。また、フィブロインの一部は、商業的に利用可能であり、例えば、これらを入手して使用できる。
　本明細書において、「フィブロイン由来のタンパク質」とは、前記の昆虫とクモ類等の天然由来のフィブロインを構成するタンパク質、これらの天然のタンパク質以外の、例えば、遺伝子組換え法により人工的に製造されるフィブロインと構造及び特性が類似するタンパク質が含まれる。
　フィブロインの構造が類似するとは、天然のフィブロインのアミノ酸配列と、そのアミノ酸配列が、80%以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、もっとも好ましくは95％以上の同一性を有するタンパク質、及び、これらのタンパク質の部分配列を有するタンパク質断片、又は、これらのタンパク質若しくはタンパク質断片と他のタンパク質若しくはペプチドとの融合タンパク質等が含まれる。また、本明細書において、「フィブロイン由来のタンパク質」を、その構造的特性に基づき「フィブロイン由来のポリペプチド」と記載する場合がある。
　また、フィブロインと特性が類似するタンパク質とは、天然のフィブロインが有するヤング率、引張強度、靭性及び伸縮性から選択される少なくとも1つの特性が天然のフィブロインと比較して、少なくとも70％、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、もっとも好ましくは100％以上の優れた特性を有することをいう。また、本明細書において、このようなフィブロインの構造及び物理的特性に関して記載する場合等に、「フィブロイン様ポリペプチド」又は「フィブロイン様タンパク質」と記載する場合がある。
　本明細書で記載される「クモの糸」又は「クモ糸」は、一般に、クモ絹糸ともいわれ、クモの体内の絹糸腺で産生され、腹部後部にある出糸突起（糸疣）の出糸管より吐糸される。クモの体内の絹糸腺はその形から梨状腺、ブドウ状腺、瓶状腺、管状腺、集合腺及び鞭状腺に分けられる。「クモ絹糸」は、一般に、その機能及び成分から、牽引糸（別名：しおり糸、ひき糸）、わく糸、縦糸、横糸及びけい留糸などに分けられるが、本明細書においては、代表的には大瓶状腺で形成される「牽引糸」をいう。
　クモの体内の絹糸腺におけるクモ絹糸の産生機構においては、分泌腺でクモ絹糸を形成するタンパク質が溶解されたドープ液が産生され、分泌され、その後、貯蔵嚢でドープ液が貯蔵され、必要に応じて、テーパリング管を通過して、出糸管で紡糸されてクモ絹糸が形成される（図１参照）。しかし、詳細な産生機構は解明されていない。
　本明細書において、「ドープ液」とは、ポリペプチド組成物を製造するための原料であるポリペプチドを溶解した溶液をいう。
　本明細書において、「ポリペプチド組成物」とは、ポリペプチドからなる繊維、樹脂及びフィルムなどのポリペプチド製品をいう。
　本明細書において、「シルク」とは、アラニンが多く存在し、βシート構造を誘起する繰り返し配列が存在するポリペプチド又はタンパク質が連続した繊維をいう。
　本明細書において、「貯蔵嚢シルク」とは、貯蔵嚢に貯蔵されているシルクをいい、「テーパリング管シルク」はテーパリング管を通過中のシルクをいう。また、本明細書において、「ポリペプチド繊維」は、ポリペプチドからなる繊維をいい、特に、ナノ小繊維が繊維軸に沿って束状に集合し結合したマイクロ繊維をいう。
　また、本明細書において、「紡糸」とは、原則として、クモが体内でクモ絹糸を産生後、出糸突起より吐糸する生物学的なプロセスをいう。
　一方、本明細書において、「湿式紡糸法」、「乾式紡糸法」及び「溶融紡糸法」等の用語における「紡糸法」は、原則として、一般に合成繊維を製造する際に用いられる「高分子より繊維を形成させる方法における工程」の意味で使用される。
　本明細書において、「ナノ小繊維」とは、クモ糸等のフィブロイン由来のポリペプチドが集合し結合して生成する高さ及び幅が数百nm以下で、幅が100nm程度の小繊維をいい、「マイクロ繊維」とは、ナノ小繊維が繊維軸方向に束状に集合し結合して生成する幅が１μm以上の繊維をいう。「ナノ小繊維」は、幅が数百nm以下のナノ顆粒状構造体が密接に集合し結合している。
　本明細書において、ナノ小繊維の高さは、数百nm以下であり、例えば、500nm以下、300nm以下、100nm以下、70nm以下、50nm以下、30nm以下、20nm以下、10nm以下、9nm以下又は7nm以下であり、好ましくは10nm以下である。
　本明細書において、顆粒状構造体とは、クモ由来のシルクを構成する構造体の一つであり、特に、ナノ小繊維を構成する小型の顆粒状構造体をナノ顆粒状構造体と記載する。「顆粒状(granular)構造体」は、高いアスペクト比を有する顆粒状の形態を有し、シルクに特徴的なグリシン及びアラニンを多く含み、βシート構造を含むペプチド又はポリペプチドを主成分とする構造体をいう。Nephila edulis のクモ絹糸の場合、17％±4％のβシート構造を有すると報告されている(Ling Sら、Biomacromolecules, 2011, 12, 3344-3349)。また、もっとも強いクモ牽引糸は、45～65%がβシートドメインと報告されている（Vollrath Fら、Polymer, 2009, 50, 5623-5632)。
　これらの繊維の形成におけるポリペプチド、小繊維及びナノ小繊維の結合は、水素結合、イオン結合、疏水結合及びファンデルワールス力等による非共有結合、並びに、共有結合が挙げられるが、好ましくは、主に非共有結合である。また、本発明の製造方法において、共有結合により各繊維の分子間に化学的に架橋形成させる工程を含む場合がある。
　ポリペプチドの架橋に使用可能な官能基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシ基等が挙げられる。ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸の側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合を形成し架橋できる。
　また、本発明のポリペプチド繊維は、その繊維が絡み合うことにより引張強度等の特性に影響する場合がある。
　また、マイクロ繊維の形成におけるナノ小繊維の集合と結合は、凝集剤を用い溶媒の組成を変化させることにより、及び／又は、ナノ小繊維の環境を形成する溶媒中の無機塩やpHを変化させることにより、ナノ小繊維の集合によって形成させることができる。
　本発明のポリペプチド繊維の製造方法の態様は、クモ体内における絹糸腺における牽引糸の特性に近似又は向上したポリペプチド繊維を製造するために、例えば、本発明のクモ糸等のフィブロイン由来のポリペプチド繊維の原料であるポリペプチドが溶媒に溶解した状態から、ナノ小繊維を形成し、そのナノ小繊維が集合し結合したマイクロ繊維を形成する工程を含む。特に、これらの工程の中でも、ナノ小繊維からマイクロ繊維を形成するまでの工程における、高いアスペクト比を有する顆粒状構造体の幅及び高さを減少させると共に、密接に集合させる工程を含む。
　本明細書において、前記クモ糸タンパク質由来のポリペプチドは、天然のクモ糸タンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチド、若しくは、それと80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、もっとも好ましくは95%以上のアミノ酸配列の相同性を有するポリペプチド、及び、これらのポリペプチドの部分配列を有するポリペプチド断片、又は、これらのポリペプチド若しくはポリペプチド断片と他のポリペプチド若しくはペプチドとの融合タンパク質等が含まれる。
　例えば、本発明における前記クモ糸等のフィブロインタンパク質由来のポリペプチドは、アラニン残基及びグリシン残基が全アミノ酸残基に対して40%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70％以上、もっとも好ましくは80%以上である。
　クモ糸タンパク質の例として、代表的には、スピドロインタンパク質が挙げられる。スピドロインタンパク質は、フィブロインともいわれ、天然のクモの大瓶状腺等で紡糸され、主にスピドロインＩ（MaSp1）とスピドロインII（MaSp2）とが知られる。分子量は250～350kDaであり、30～40アミノ酸単位の100回繰り返し構造で全長の90％を占め、そのアミノ酸組成は、グリシン及びアラニンを多く含むコンセンサス配列の繰り返し構造からなる特徴的な構造を有する。アラニンは短いポリアラニン構造を形成し、スピドロインタンパク質中で繰り返し構造を有し、クモ糸繊維中で結晶状構造としてβシート構造の形成に関与する。グリシンは、GGX, GPGXX (X=A, L, Q, Y)の配列を基本単位として、スピドロインタンパク質中で繰り返し構造を有し、クモ糸繊維中で非晶質のランダムコイル構造の形成に関与する。
　スピドロイン関連タンパク質及びポリペプチド等のアミノ酸配列は、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI: National Center for Biotechnology Information)に下記表１－１及び表１－２にアクセッション番号で記載のペプチド又はポリペプチドが収録されている。そこで、例えば、これらのアミノン酸配列を利用して、本発明のクモ糸等のフィブロイン由来ポリペプチド繊維を製造するためのポリペプチドを作製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記クモ糸由来ポリペプチドは、例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列を製造し、これを発現ベクターに組み込んで、組換え発現ベクターを公知の方法で作製し、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物、昆虫細胞等の適当な宿主に導入して形質転換体を作製することができる。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組換えペプチド又はポリペプチドが産生されるので、培養物から産生された遺伝子組換えペプチド鎖を回収することにより、本発明で用いる遺伝子組換えペプチド鎖を調製することができる。また、昆虫、鳥類又は哺乳動物に組換え遺伝子を導入し、これらの体内で製造された組換えポリペプチドを精製し単離することによりクモ糸由来のペプチド又はポリペプチドを得ることができる。
　また、βシート構造の形成は、張力を負荷しない非延伸状態で、材料全体の電子の量のうち、結晶に存在する電子の量として表した場合に、クモ糸等のフィブロイン由来のポリペプチドの全体中の15～30％を含むポリペプチドが好ましいが、本発明の製造方法で製造されるクモ糸等のフィブロイン由来のポリペプチド繊維は、10～50％又は5～80％のβシート構造を有する場合がある。
　前記ステップ(ii)における高いアスペクト比を有する顆粒状構造体は、その少なくとも50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、もっとも好ましくは80％以上の顆粒状構造体が、例えば、高さが100nm以下、110nm以下又は120nm以下であり、好ましくは110nm以下であり、幅が20～2500nm、30～1900nm又は50～1500nmであり、好ましくは30～1900nmである。また、前記ステップ(iii)における高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体は、その少なくとも50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、もっとも好ましくは80％以上の顆粒状構造体が、高さが50nm以下、30nm以下、20nm以下、10nm以下、9nm以下又は7nm以下であり、好ましくは10nm以下であり、幅が20～300nm、50～200nm又は70～300nmの範囲であり、好ましくは50～200nmである。
　また、前記ステップ(ii)における高いアスペクト比を有する顆粒状構造体のアスペクト比は、その少なくとも50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、もっとも好ましくは80％以上の顆粒状構造体が、幅/高さの比が5以上、10以上又は20以上であり、好ましくは10以上であり、上限は、特に限定されない。一方、前記ステップ(iii)における高いアスペクト比を有する顆粒状構造体のアスペクト比は、その少なくとも50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、もっとも好ましくは80％以上の顆粒状構造体が、幅/高さの比が3以上、5以上又は10以上であり、好ましくは5以上であり、上限は特に限定されない。
　本発明の製造方法のステップ(i)における、スピドロンタンパク質等のフィブロイン由来タンパク質を溶解したドープ液の製造は、前記の天然又は組換えクモ糸等のフィブロイン由来ポリペプチドを用い、公知の方法（特許文献１～５）で製造することができる。これらのドープ液の溶媒は、例えば、水溶液若しくは極性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を使用することができる。
　ドープ液に使用する極性有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド若しくは1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)、又は、これらの混合液から選択することができるが、これらに限定されない。
　クモ糸等のフィブロイン由来のタンパク質の三次元構造は、例えば、水溶媒の場合に、その環境中のpH、イオン強度（塩の種類及び濃度）、湿度又は水分濃度等の影響を受けることが知られている（非特許文献２)。
　したがって、剪断応力を負荷しながら、このドープ液のpH、塩の種類及び濃度、湿度又は水分濃度等のクモ糸等のフィブロイン由来のポリペプチドの環境に関連する要素を変化させることにより、フィブロイン由来ポリペプチドを製造することができる。これらの要素の１種以上を変化させることにより、又は、複数の要素を組み合わせて変化させることにより、フィブロイン由来のポリペプチドを製造することができる。本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維の製造方法として、具体的には、湿式紡糸法、乾式紡糸法及び溶融紡糸法を挙げることができる。
　ポリペプチドの環境に関連する要素の変化は、これらの要素の選択に応じて、急速に変化させる場合があり、又は、緩徐に変化させる場合がある。
　このドープ液の溶媒の組成、pH及び／又はイオン強度を変化させる、及び／又は、凝集剤を添加することにより、マイクロ繊維を形成させることができる。
　本発明の態様において、湿式紡糸法を用いる場合、繊維軸方向に剪断応力を負荷しながら、ドープ液に凝固剤を添加する、又は、凝固剤を含む溶媒中に前記ドープ液を射出、押し出す又は浸漬することにより、フィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造することができる。
　湿式防止法の凝固剤としては、無機塩を含む水溶液が好ましい。なお、メタノール、エタノール、2-プロパノールなどの炭素数1～5の低級アルコール又はアセトンを適宜加えてもよいが、これらに限定されない。前記無機塩を含む水溶液は、弱酸性～酸性の溶媒が好ましい。
　また、本発明のフィブロイン由来ポリペプチドを製造する方法の前記ステップ(ii)及び(iii)において、それぞれ、溶媒中の塩を調整する場合がある。この塩の変化は、ステップ(ii)からステップ(iii)への変化により、前記高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させるように調製される。
　例えば、ステップ(ii)では、高いイオン強度の溶媒に調製され、ステップ(iii)では、そのイオン強度を低下させるように塩が調製される。
　より具体的には、例えば、ステップ(ii)では、150mM以上、好ましくは300mM以上、より好ましくは350mM以上、もっとも好ましくは400mM以上の塩化ナトリウム(NaCl)水溶液のイオン強度以上のイオン強度を与えるように調製され、ステップ(iii)では、ステップ(ii)での塩化ナトリウム(NaCl)水溶液のイオン強度よりも低いイオン強度を与えるように溶媒中の塩が調製されるが、これに限定されない。
　イオン強度Ｉとは、溶液中のイオンの影響度を表す物理量であり、本明細書において、当業者により一般に理解される定義で使用される。すなわち、イオン強度は、溶液中の全てのイオンに対しモル濃度と電荷の２乗を掛けあわせたものの和の半分であり、下記式１で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　式１
miは、i番目のイオン濃度、Ziはその電荷数を表す。 
　すなわち、300mMのNaCl水溶液と100mMのNa3PO4水溶液とは、同一のイオン強度を与える。そこで、例えば、ステップ(ii)では、300mM以上のNaCl水溶液とし、ステップ(iii)では、100mM未満のNa3PO4水溶液に調整される場合がある。
　また、フィブロイン由来のポリペプチドをカオトロピック(chaotropic)イオンを多く含む環境に曝露し、続いて、繊維軸方向に剪断応力を負荷しながら、コスモトロピック（kosmotropic）イオンを多く含む環境に曝露することにより、ステップ(ii)と(iii)の塩の種類及び／又は濃度を調整することにより、本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造することができる。
　カオトロピックイオンは、水分子間の相互作用を減少させ、それによる構造を不安定化させるイオンのことであり、水のエントロピーを増大させるような溶質が存在する環境に、フィブロイン由来のポリペプチドを曝露し、ポリペプチド間の、水素結合、ファンデルワールス力や疎水結合などに影響を与えることにより、その分子構造を不安定化するものもある。コスモトロピックイオンは、このカオトロピックイオンと反対の効果を有する。カオトロピックイオンに曝露した後に、コスモトロピックイオンを多く含む環境への曝露、及び／又はカオトロピックイオンを除く又は減少させることにより、本発明のポリペプチド繊維を製造することができる。
　前記カオトロピックイオンを含む環境を調製するためのカオトロピック剤は、尿素、イソチオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム(NaSCN)、グアニジンHCl、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、トリフルオロ酢酸セシウム、アルギニン、シトルリン、塩化ナトリウム、これらの誘導体又はカウンターカチオンが相違する塩が含まれるが、これらに限定されない。前記コスモトロピック環境を調製するためのコスモトロピック剤は、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム及びクエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、タウリン、Ｄ－トレハロース、イノシトール、ベタイン、これらの誘導体又はカウンターカチオンが相違する塩が含まれるが、これらに限定されない。また、カオトロピック塩からコスモトロピック塩への調製は、塩のホフマイスター系列にしたがってもよい。例えば、前記ステップ(iii)において、溶媒が水溶液の場合には、塩のイオンがナトリウムイオンおよび塩化物イオンよりも顕著なコスモトロピック特性を有する塩類（例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム）をコスモトロピック塩として用いることができる。
　また、前記カオトロピック塩及びコスモトロピィック塩に加えて、又は、これらの塩の添加を伴わずに、適宜、アルカリ金属ハロゲン化物（例えばLiCl,LiBrなど）、アルカリ土類金属ハロゲン化物(例えばCaCl2)、アルカリ土類金属硝酸塩(例えばCa(NO3)2など)、チオシアン酸塩(例えばNaSCNなど)から選ばれる少なくとも一種の塩を使用できる。
　本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する工程において、pHを変化させる場合は、例えば、弱アルカリ性のドープ液を中性付近にすることにより、顆粒状の構造体を形成させた後、さらに、弱酸性に変化させることにより、前記ポリペプチド小繊維に剪断応力を負荷しながら、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接して構成するナノ小繊維が軸方向に集合し結合して構成されるマイクロ繊維を形成させることができる。
　前記弱アルカリ性のドープ液はpH6.0～10.0であり、pH6.5～8.0が好ましく、顆粒状構造体を形成させるための中性付近のpHとしては、pH6～7.5が挙げられる。また、ナノ顆粒状構造体を形成させるための弱酸性のpHとしては、pH4～6が挙げられる。また、前記ステップ(iii)におけるpHはpH6.7よりpH5.7に順次低下させることにより、本発明のフィブロイン由来ポリペプチド繊維を製造することができる。また、前記ステップ(ii)とステップ(iii)の各々pHは、pH6.4を境界として、ステップ(ii)はpH6.4以上、ステップ(iii)はpH6.4未満に調整される場合がある。
　pH調整剤としては、一般に使用されるpH調整剤を使用できる。具体的には、塩酸、希塩酸、硫酸、希硫酸、硝酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム及びアンモニア水溶液等から選択されるが、これらに限定されない。また、これらに限定されない、酢酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩等の有機塩を使用することができる。
　前記フィブロイン由来のポリペプチドを製造する方法の前記工程において剪断応力(shear stress)を負荷する方法として、例えば、製造されるマイクロ繊維に張力を負荷することにより、又は、製造中のマイクロ繊維を高速で巻き取ることにより行うこと、又は製造工程でマイクロ繊維が直径500nm～数μmの狭い管を管壁と接触しながら通過させることにより、剪断応力を負荷できるが、これらに限定されない。
　前記フィブロイン由来のポリペプチドを製造する方法の前記工程において、温度は、特に限定されないが、適宜、特定の温度を選択して本発明のフィブロイン由来ポリペプチド繊維を製造することができる。
　前記ステップ(i)～(iii)の工程によって製造されるマイクロ繊維を単離することにより、本発明のフィブロイン由来ポリペプチド繊維を製造することができる。本明細書において、「マイクロ繊維を単離する」とは、湿式紡糸法においては、マイクロ繊維を溶媒中で形成後に、該溶媒より該マイクロ繊維を分離し本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を取得すること等をいい、乾式紡糸法においては、マイクロ繊維を溶媒中で形成後に該溶媒を気化させることにより本発明のフィブロイン由来のポリペプチド繊維を取得すること等をいう。
　また、前記フィブロイン由来のポリペプチドを製造する方法で製造されるポリペプチド繊維を束ねることにより、人工シルクを製造することができる。
　このポリペプチド繊維から製造されるシルクを用いることにより、例えば、これを使用する糸、敷布、不敷布、メッシュ及びネット等を製造することができる。本ポリペプチド繊維の、耐熱性、高い引張強度(tensile strength)、靱性(toughness)、伸展性(extensibility)の特性を活かし、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造に利用できる。また、高強度、高伸展性及び高靱性並びに生分解性及び生互換性を利用した創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料として使用できる。
２．フィブロインと、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含む組成物
　本発明のもう1つの実施態様は、フィブロインとβシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含む組成物である。
　本明細書において、「βシート構造を形成するポリペプチド」とは、その二次元構造中で、βシート構造を形成する限り任意のポリペプチドが含まれ、天然のポリペプチド及び人工的に製造されるポリペプチドが含まれ、好ましくは、人工的に製造されるポリペプチドをいい、より好ましくは下記のポリアミノ酸の配列を含むポリペプチドをいう。
　本明細書において、「ポリアミノ酸」とは、アミノ酸又はその誘導体を単量体として、1段の重合反応によって得られる高分子量のアミノ酸重合体をいう。
　また、βシート構造を形成するポリアミノ酸は、人工的に製造され、L-又はD-アミノ酸の重合体であり、その二次構造でβシート構造を形成する任意のポリアミノ酸をいい、好ましくは、ポリアラニン、ポリフェニルアラニン、ポリシステイン、ポリバリン、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリチロシン、ポリトリプトファン、ポリグルタミン、ポリメチオニン及びそれらの誘導体から選択されるホモポリアミノ酸及びその誘導体、さらに、これらのホモポリアミノ酸及びその誘導体のみならず、アラニン、フェニルアラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン、メチオニン等のアミノ酸、並びにそれらの誘導体から選択される複数種、好ましくは2～5種の、より好ましくは2～4種の、もっとも好ましくは2又は3種のアミノ酸の共重合体からなるポリアミノ酸を含む。これらのポリアミノ酸は、例えば、化学酵素重合法などの公知の方法によって製造できる（Numata K.ら、Polymer Journal, 2015; 47: 537-545、及び、Baker J. P.ら、Biomacromolecules 2012, 13, 947-951等）。ポリアミノ酸の重合度は、2～100の範囲であり、好ましくは5～50の範囲であり、より好ましくは10～30、もっとも好ましくは10～20の範囲である。
　本明細書において、ポリアミノ酸、ポリペプチド及びタンパク質の構造は、当業者に周知慣用のアミノ酸の3文字又は１文字による表記法で記述される。明細書においてアミノ酸は、特に記載のない限りL体である。
　本発明のフィブロインとβシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含む組成物は、例えば、フィブロインを溶解したドープ液に、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸の水溶液又は水懸濁液を添加し、混合後、乾燥させることによって製造できる。βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸の配合割合は、0.1～50.0％の範囲であり、好ましくは0.5～30.0％の範囲であり、より好ましくは、1～10.0％の範囲であり、もっとも好ましくは1～5％の範囲である。
　βシート構造を形成するポリアミノ酸としてポリアラニンを使用する場合には、ポリアラニンの重合度は、2～100の範囲であり、好ましくは3～50の範囲であり、より好ましくは10～30の範囲であり、もっとも好ましくは10～20の範囲である。また、ポリアラニンの配合率は、0.1～30.0％の範囲であり、好ましくは0.5～20.0％の範囲であり、より好ましくは1.0～10.0％の範囲であり、もっとも好ましくは3.0～5.0％の範囲である。
　本発明の組成物は、例えば、前記方法によって製造されるポリペプチド製品が挙げられる。
　前記ポリペプチド製品としては、例えば、下記に説明するフィルム、繊維又は樹脂などが挙げられる。
　例えば、樹脂を製造する場合には、前記の本発明の組成物を溶媒に溶解又は懸濁したドープ液を調製し、当業者に周知慣用の方法で、このドープ液のタンパク質を不溶化することにより、本発明の樹脂を製造できる。溶媒としては、例えば、水若しくは極性有機溶媒又はこれらの混合溶媒が挙げられる。本発明のタンパク質を不溶化する方法として、ドープ液の溶媒の留去、溶媒中の塩の種類及び／又は濃度の変化、イオン強度若しくは塩濃度の変化、及び／又はpHの変化等が挙げられる。
　繊維を製造する場合は、例えば、前記の本発明の組成物を溶媒に溶解又は懸濁したドープ液を調整し、当業者に周知の湿式紡糸法又は乾式紡糸法、又は、前記の実施態様「１．ポリペプチド繊維」に記載した方法を用い、本発明のタンパク質を不溶化することにより、前記ドープ液より本発明の繊維を製造できる。溶媒としては、例えば、水若しくは極性有機溶媒又はこれらの混合溶媒が挙げられる。
　例えば、フィルムを製造する場合は、前記の本発明の組成物を溶媒に溶解又は懸濁したドープ液を調整し、このドープ液よりスピン・コーティング法、ディッピング法、スプレー・コーティング法、ブラシコーティング法、ブレードコーティング法、ローラコーティング法及びロール・ツー・ロール法等の公知の方法を用いて、本発明のフィルムを製造できる。溶媒としては、例えば、水若しくは極性有機溶媒又はこれらの混合溶媒が挙げられる。
　前記のドープ液に使用する極性有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド若しくは1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)、又は、これらの混合液から選択することができるが、これらに限定されない。
　これらの本発明のポリペプチド製品より、例えば、これを使用する糸、敷布、不敷布、メッシュ及びネット等を製造することができる。これらのポリペプチド製品の、耐熱性、高い引張強度、靱性及び／又は伸展性等の優れた特性を活かし、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造に利用できる。また、高強度、高伸展性及び高靱性並びに生分解性及び生互換性を利用した創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料として使用できる。
３．本発明の組成物の製造方法
　本発明のもう１つの実施態様は、前記組成物の製造方法である。前記に記載のとおり、例えば、フィブロインは、前記に記載のとおり遺伝子組換え法によって作製したDNAを導入した微生物によって製造し、これを単離精製することにより利用でき、また、商業的に利用可能である。これらの方法によって、フィブロインを入手し、別途、例えば、化学酵素重合法等の公知の方法（Numata K.ら、Polymer Journal, 2015; 47: 537-545、及び、Baker J. P.ら、Biomacromolecules 2012, 13, 947-951等）で、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を製造し、フィブロインを含むドープ液にポリペプチド及び／又はポリアミノ酸の水懸濁液を混合後、乾燥等により不溶化させることによって、本発明の組成物を製造できる。
　この不溶化の方法としては、乾燥する方法以外にも、例えば、前記ポリペプチド繊維の製造方法で記載したと同様の方法、具体的には、溶媒中の塩の種類及び／又は濃度の変化、イオン強度若しくは塩濃度の変化、及び／又はpHの変化等方法を使用できる。
４．本発明のポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法
　本発明のもう1つの好ましい実施態様は、フィブロイン等のポリペプチドからなるポリペプチド製品の引張強度、靭性及び伸展性等から選択される少なくとも1つの物理的特性を向上させる方法である。ポリペプチド製品の例としては、ポリペプチドからなる樹脂、フィルム及び繊維が挙げられる。
　ポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法は、例えば、樹脂、フィルム及び繊維等のポリペプチド製品に、ポリアラニン等のβシートを形成するポリアミノ酸を配合させることによる。より具体的には、例えば、樹脂、フィルム及び繊維等のポリペプチド製品を製造するための例えば、フィブロイン等の原料を溶解したドープ液に、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を添加し、混合後、例えば、溶媒を留去し、ポリペプチドを不溶化することによって、ポリアミノ酸を添加しないポリペプチド製品と比較して、物理的特性が向上したポリペプチド製品を取得できる。
　本明細書において、ポリペプチド製品の物理的特性の向上とは、例えば、商業的に利用可能な引張試験機を入手し、引張強度試験を行い、被験試料が破断するときの限界応力を求め、この限界応力の値が比較対象の試料よりも高値を示すときに、引張強度が向上することを意味する。また、靭性が向上するとは、同様に、引張試験機で被験試料を測定し、応力-ひずみ曲線図における曲線の面積の値が、比較対象の試料の面積値よりも高値を示すときに、靭性が向上することを意味する。さらに、伸展性が向上するとは、同様に引張試験機で被験試料の引張試験を行い、被験試料が破断するときの限界歪率（延伸率）を求め、比較対象の試料で同様の条件で測定して得られた破断時の限界歪率よりも被験試料の破断時の延伸率の方が、高値を示すときに、伸展率が向上することを意味する。
　本発明の方法で、使用するポリアミノ酸としては、βシート構造を容易に形成するポリアミノ酸が挙げられ、より具体的には、ポリアラニン、ポリシステイン等が挙げられる。これらのポリアミノ酸は、化学酵素合成法等の公知の方法で製造できる（Numata K.ら、Polymer Journal, 2015; 47: 537-545、及び、Baker J. P.ら、Biomacromolecules 2012, 13, 947-951等）。
　例えば、フィブロイン由来ポリペプチドからなるポリペプチド製品に、ポリアラニンを配合させることによって、該ポリペプチド製品の物理的特性を向上させる場合には、重合度が、2～100の範囲、好ましくは、5～50の範囲の、より好ましくは10～30の範囲の、もっとも好ましくは10～20の範囲のポリアラニンを、配合率として、0.1～30.0％の範囲、好ましくは0.5～20.0％の範囲、より好ましくは1.0～10.0％の範囲、もっとも好ましくは3.0～5.0％の範囲の配合率でドープ液に配合させる。
　本発明の方法を使用することにより、よりその物理的特性が向上した糸、敷布、不敷布、メッシュ及びネット等を製造することができる。本ポリペプチド製品の、耐熱性、高い引張強度、靱性及び／又は伸展性等の優れた特性を活かし、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造に利用できる。また、高強度、高伸展性及び高靱性並びに生分解性及び生互換性を利用した創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料の製造にも使用できる。
　なお、本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
１．実験材料及び方法
(1)　Nephila clavataの大瓶状腺シルクの採取
　体長20mm以上のメスのNephila clavata（和名：ジョロウグモ、以下「N. clavata」と記載）より大瓶状腺を摘出した。ピンセットで大瓶状腺のシルクを採取し、以後の実験に使用した。
(2)　牽引糸の回収と保存
　N. clavataより2m/分の巻き取り速度で牽引糸を回収した。繊維束は暗所、室温、40%湿度下の条件でボックス内に保存した。
(3)　走査電子顕微鏡による観察
　紡糸前後の糸の形態を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。試料を金でスパッタリングコーティングしたアルミニウムスタブ上にマウントし、走査型電子顕微鏡（JSM6330F, 日本電子株式会社、東京)を用い、加速電圧5kVで試験した。
(4)　シンクロトロン小角Ｘ線散乱（SAXS）及び広角Ｘ線散乱(WAXS）
　SPring-8のBL45XUビームライン（播磨、兵庫）でシンクロトロン小角Ｘ線散乱（SAXS）及び広角Ｘ線散乱(WAXS）の測定を、Ｘ線エネルギー：12.4keV（波長0.1nm)、ビーム直径：45μmで実施した。フラットパネルディテクター(FPD, C9728DK-10型、浜松ホトニクス株式会社、静岡）で全てのWAXSパターンが記録された。カメラ距離は、WAXS及びSAXS測定の間、各々50.2及び2036 mmであった。各散乱パターンの曝露時間は10秒であった。取得された二次元散乱パターンは、Fit2Dソフトウェア―を使用して、１次元プロフィールに変換された。バックグランド散乱及び検出器の配置に対する校正が行われた。
(5)　複屈折
　複屈折が目的とする厚さによって分割される位相差として表された。クモの繊維は、シリンダー状であるため、厚さは繊維直径である。位相差は、光偏光顕微鏡(BX53型、オリンパス株式会社、東京)を使用し、50倍の対物レンズで取得された。画像は、WPA-viewソフトウェア (ver. 2.4.2.5, Photonic Lattice,Inc.)で解析された。
　ステイン－複屈折測定のために、１本の糸繊維が1.5cmの長さに切断され、166μm/sの速度でLinkamの使用によって延伸された。緩んだ長さ、引張強度の５％増加又は減少で屈折率が測定された。情報が１試料の３画像より収集された（図８参照）。
(6)　原子間力顕微鏡(AFM)観察
　１本の繊維が、試料ステージに直接載置されるか、又はスーパーグルー（Loctite 460, Henkel, ドイツ）中にマウントされ、試料の横断面切片がミクロトーム（RM2265型, Leica Mikryosysteme GmbH、オーストリア）によって調製された。繊維試料の長軸方向の横断面切片がＡＦＭ観察された。画像が40％湿度条件下、タッピングモードで、走査型プローブ顕微鏡（5300E型、株式会社日立製作所、東京）を使用して取得された。試料表面の観察には、カンチレバーは3 N/mのスプリング定数及びスキャン波長：0.8Hzが適用され、横断面切片試料に対して、20 N/mのスプリング定数及びスキャン波長0.5 Hzが使用された。画像が取得され、AFM5000II（株式会社日立製作所、東京）で解析された。ナノ小繊維の幅（各ナノ小繊維間の距離）が、データが全結果において典型的であることを確認するために、１試料当たり５画像、１画像当たり少なくとも20～30領域で収集された。ナノ小繊維の幅（各ナノ小繊維間距離）及び顆粒状構造体の長さ（同一ナノ小繊維上の隣接する顆粒状構造体間距離）が、データが全結果において典型的であることを確認するために、１試料当たり５画像、１画像当たり20～30領域で収集された。
(7)　張力負荷試験
　個別の牽引糸繊維の延伸試験が小型卓上試験機（EZ -LX型、株式会社島津製作所、京都）で実施された。初期の試料長さは、10.0mmであり、一定の速度10mm/mmで延伸した。結果が記録され、TRAPEZIUM （ver. 1.3.0, 株式会社島津製作所、京都）で解析された。測定は40%湿度、室温下で実施された。さらに、隣接する繊維断片が回収され、直径を求めるために電子顕微鏡で観察された。シリンダー形状のため、繊維の横断面切片領域が直径より計算された。
N.clavataの大瓶状腺より採取した繊維の観察及び解析
　N.clavataの大瓶状腺を摘出し、貯蔵嚢及びテーパリング管の内部の特徴を走査型顕微鏡(SEM)及び原子間力顕微鏡(AFM)で解析し、比較した（図１参照）。
(1) 走査型電子顕微鏡による観察
　両シルクの走査型電子顕微鏡での観察結果を図２に示す。多数のナノ小繊維で形成される束が貯蔵嚢シルクで認められた。この束は、約50μmの長さであり、貯蔵嚢シルクに沿った方向に並んでいた。テーパリング管においても、より少ない凝集のナノ小繊維の束が観察された。より高い拡大率では、らせん状構造のナノ小繊維を示す所見が認められた。
(2)　原子間力顕微鏡による観察
　より詳細なナノスケールでの解析が原子間力顕微鏡で行われた。この貯蔵嚢シルクとテーパリング管シルクを原子間力顕微鏡で観察した結果を図３に示す。貯蔵嚢シルクでは数μmの高いアスペクト比を有する顆粒状構造体が主に観察された。一方、テーパリング管では、より幅及び高さが減少したナノ小繊維が主に観察された。ナノ小繊維は、テーパリング管の軸方向に配列した。すなわち、このナノ小繊維は、この軸方向に沿った高いアスペクト比を有するナノ顆粒構造体が密接してタンデム状に配向することを示した。
　そこで、この顆粒状構造体について顆粒状構造体の幅と高さを測定した。貯蔵嚢では、500nm～1900nmの範囲に80％の顆粒構造体が分布した一方、100nm未満は、15％であった。反対にテーパリング管シルクの顆粒構造体の幅は減少し、200nm未満であり、ピークは100nmであった。高さについての解析も、減少傾向を示し、10nm～110nmの貯蔵嚢シルクに対して、テーパリング管シルクでは1nm～9nmであった（図４、５）。
　また、牽引糸繊維では、幅は、50～200nmの範囲であり、高さは7nm以下の範囲であった（図５）。
　これらの結果は、剪断応力による紡糸過程で、遷移的な特徴が惹起されることを示している。したがって、遷移的な結果として、出糸管から押し出される前にテーパリング管シルクでナノ小繊維が形成されたことを示す。
　これらの結果は、N.clavataの大瓶状腺において、貯蔵嚢では約500nm～数μmの幅、高さ50nmと高いアスペクト比を有する顆粒を含む繊維が、テーパリング管での移動に伴い小型化し、幅は約60～130nm、高さが10nm以下の高いアスペクト比を有する小顆粒がタンデム状に密接して配向し、N.clavataの出糸突起より排出された牽引糸は、テーパリング管シルクよりも、より大きな幅及び高さを有すること、及び、貯蔵嚢では高いアスペクト比を有する顆粒を有し、テーパリング管、出糸突起より吐糸されたシルクのいずれもが、高いアスペクト比を有する顆粒がタンデム状に配列して形成されていることが観察された。
(3)　広角Ｘ線散乱(WAXS）及び小角Ｘ線散乱（SAXS）の測定
　貯蔵嚢シルク(n=2)、テーパリング管シルク(n=5)、大瓶状腺皮(n=1)及び牽引糸(n=1)の広角Ｘ線散乱(WAXS）及び小角Ｘ線散乱（SAXS）を測定した。広角Ｘ線散乱では、結晶性構造を示す特徴的な散乱が認められた。また、小角Ｘ線散乱では、貯蔵嚢シルクに4.18nmの、テーパリング管シルクで7.85nm及び5.28nmの特徴的なピークを認めた（図６）。
(4)　複屈折の測定
　貯蔵嚢シルク及びテーパリング管シルクの複屈折を測定した。貯蔵嚢シルクでは、複屈折率は、8ｘ10-6±1ｘ10-6、テーパリング管シルクでは3.8ｘ10-4±0.3ｘ10-4であった。このテーパリング管シルクにおける高い複屈折は、上記の配向構造の存在を示すＸ線の散乱結果と一致した。一方、牽引糸繊維においても、ラスク状態で、0.003の複屈折率を示した。したがって、分子構造の配向において、テーパリング管シルクと牽引糸とが、全体に均一な同一形を示した（図７）。
　牽引糸に張力が負荷された状態で、さらに複屈折が測定された。複屈折は引張強度が高くなるにつれて、増加した。これは、応力によって分子鎖又は構造が配向していることを示す。複屈折は、ランダムに惹起される代わりに、シルク全体に均一な増加が観察された。
(5)　小括
　以上の結果より、紡糸される前のシルク繊維は、高アスペクト比が紡糸前から存在し、紡糸により配向すること、繊維を構成するマイクロ繊維は、100nm程度の顆粒状構造体が集合することで形成されていること、紡糸前から、顆粒状構造体は密接に配向することで、マイクロ繊維を形成していることが示された。
N.clavata繊維の解析
　紡糸工程の製造物としての牽引糸及びその内部構造が分析された（図８）。
(1)　N.clavata牽引糸繊維の原子間力顕微鏡による観察
　原子間力顕微鏡を使用して、N.clavata牽引糸繊維のナノメーター範囲の構造が検討された（図８～１０）。牽引糸、すなわち、出糸管から吐糸された後のシルクにおいても、ナノ小繊維を示す像が観察された。全てのナノ小繊維の牽引糸軸方向での配列が観察された。また、２つのナノ小繊維の隣接部位でらせん構造の所見が観察された。しかし、大半のナノ小繊維は、相互に平行に配列するように観察された。テーパリング管シルクのナノ小繊維と比較して、牽引糸のナノ小繊維は、その特性を共有し、113±21nm幅で繊維に沿った高いアスペクト比を有する顆粒状像を示した。顆粒状構造体の高さは、約7nmであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
(2)　張力負荷時における原子間力顕微鏡による観察
　ナノ小繊維に張力を負荷した場合の変化を観察した。インタクトな牽引糸に対して、最初に全長に対して20％引き伸ばし、瞬間接着剤で固定し、内部構造を分析した。主に、２つの特徴が観察された。ナノ小繊維は繊維軸に沿っており、より圧縮されたパターンを示した一方、ナノ小繊維の幅は54±32nmに減少した。ナノ小繊維は、顆粒状構造体の特徴を示したが、高さは同様に減少した(～1nm）。繊維のいくつかの箇所でスキャンされ、全ての像は、同一の、良好に配列したナノ小繊維のパターンを示した。繊維を引き延ばした場合、らせん構造は観察されなかった（図１１Ａ、図１１Ｂ）。
　これらの結果は、ナノ小繊維が牽引糸での主要な内部構造であることを示した。さらに、機械的な引っ張りに応答して変化するナノ小繊維構造の変化は、牽引糸の引張強度と伸展特性に関与することが示された。
(3) 　N.clavata牽引糸繊維の外部張力による一時的な複屈折の変化
　複屈折は、分子の配列の指標であり、対象物の厚さによって分割される位相差として表される。クモ糸繊維は、シリンダー形状であるため、厚さとしてその各繊維の直径を用いた。直径は、走査型電子顕微鏡の画像より求め、平均の厚さは4.8±0.4μmであった。N.clavata牽引糸の複屈折率は約0.03を示した。この値は、繊維の全長さに対して5％及び10％引き伸ばした場合に、増加した。この複屈折値は、10%の延伸から5%の延伸に緩めた場合に、減少した。この値は、5％延伸の際の値に相当する。繊維を再び10％及び15％に引き伸ばした場合、複屈折値は、それに応じて増加した。これらの結果は、複屈折の変化は、外部張力に相関し、分子配列が可逆的な変化であることを示すものである（図１２Ａ～Ｃ）。
(4)　小括
　以上の結果より、牽引糸内部においても、同様の顆粒が観察され、紡糸直前の顆粒から構成されるマイクロ繊維が束状に紡糸されることで、牽引糸が形成されることが示された。これらの結果は、引き伸ばし過程において、顆粒が変形し、マイクロ繊維が再配向することで高い靱性を実現することを示すものである。
高いアスペクト比の顆粒状構造体を有する小繊維を使用したポリペプチドフィルムの製造とその物理学的特性の評価
　シルクフィブロイン（Bombyx moriシルク繭）の水溶液を凍結乾燥して得られたシルクフィブロイン粉末に対して、数平均分子量約700g/molのBakerらの方法(Baker J. P.ら、Biomacromolecules 2012, 13, 947-951)で製造した、幅80nm以下で高さ10nmの顆粒状構造体の集合体繊維（βシート構造（56％）：ランダムコイル構造(25％)：α-へリックス構造(19%)）を形成するポリアラニン（以下、「polyAla」と記載）をシルクフィブロイン粉末に対して5 wt%を懸濁液として加え、ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）へ溶解させて5 % 溶液を調整した。この溶液をテフロンＲシャーレへキャストした後、室温で自然乾燥させてシルクフィルムを得た（以下、各々を「polyAla： 5%群」と記載、n=5）。このフィルムをメタノールへ５分間含浸させた後、手動一軸延伸機（IMC-1A11型、井元製作所）を用いて0 ～100% 延伸した。真空乾燥した延伸フィルムを用いて引張試験機（小型卓上試験機　EZ Testシリーズ　EZ-LX HS、島津製作所）による機械測定を行った。polyAlaを添加しないシルクを対照として使用した（群n=5、以下「対照群」と記載)。
結果
　100%フィブロイン、及び5％polyAla/95％フィブロインで製造したシルクフィルムを非延伸時のヤング率、引張強度、引張歪率及び靭性の物理的特性を評価した結果を表３に、メタノール含浸で50％延伸及び100％延伸させた後に、真空乾燥させて得たフィルムの物理的特性を評価した結果をそれぞれ表４及び表５示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表３～５の結果において、非延伸又は延伸させたフィルムのいずれにおいても、ポリアラニンを5％配合させることにより引張強度の増加を示し、非延伸フィルムでは、13.6％の引張強度の増加を示した。また、50％及び100％延伸させて作製したフィルムでは、引張強度が、それぞれ23.6％及び34.1％増加し、さらに靭性も55.7％及び49.7％増加した。
　これらの結果は、ポリアラニンなどのβシート構造を形成するポリアミノ酸等のポリペプチドを配合させることにより、樹脂、フィルム及び繊維などのポリペプチド製品引張強度や靭性により優れた特性を取得できることを示すものである。

Claims (9)

  1. 　フィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
    (i)　フィブロインタンパク質由来のポリペプチドを溶解したドープ液を調整するステップ、
    (ii)　高いアスペクト比を有する顆粒状構造体を有する小繊維を前記ドープ液中で形成させるステップ、
    (iii)　前記小繊維より、高いアスペクト比を有するナノ顆粒状構造体が密接してナノ小繊維を構成し、該ナノ小繊維が繊維軸方向に集合し結合したマイクロ繊維を形成させるステップ、及び　
    (iv)　前記マイクロ繊維を単離することにより前記ポリペプチド繊維を得るステップ
    を含むことを特徴とする、製造方法。
  2. 　フィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造する方法であって、
    　前記ポリペプチド繊維が、βシート構造を15～30％含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド繊維の製造方法。
  3. 　前記βシート構造が、ポリアラニンによって形成されることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド繊維の製造方法。
  4. 　フィブロインと、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含むことを特徴とする、組成物。
  5. 　前記組成物が、繊維、樹脂及びフィルムから選択されるポリペプチド製品であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
  6. 　フィブロインに、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を配合してなることを特徴とする、請求項４又は５に記載の組成物。
  7. 　請求項４～６のいずかれ1項に記載の組成物を製造する方法であって、フィブロインに、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を配合することを特徴とする、製造方法。
  8. 　フィブロインに、βシート構造を形成するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を配合することを特徴とする、ポリペプチド製品の物理的特性を向上させる方法。
  9. 　前記物理的特性の向上が、引張強度の増加及び／又は靭性の増加であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
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