CN111116704B - 一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法 - Google Patents

一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于生物工程技术领域，公开了一种方便、快捷、可大批量纯化力学功能蛋白的方法。该方法为表达ELP融合力学功能蛋白的发酵菌液预处理后经过镍亲和层析柱、除盐柱、SP离子交换层析柱纯化。本发明确定了一套针对力学功能蛋白的精细纯化方法，经过预处理、镍柱、除盐柱、离子交换柱分步处理后，并进行中试放大，最终得到纯度大于95％的力学功能蛋白，且每次获得量均达到克级水平。本发明可基于全自动蛋白纯化系统，操作简便。同时可实现蛋白样品的自动上样、自动洗涤、实时监控、在线检测等，能够根据样品状态及后续纯化要求来精细具体地调节纯化过程。

Description

一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及发明一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法。
背景技术
力学功能蛋白指一类具有一定力学强度的功能蛋白，包括丝心蛋白、蛛丝蛋白、节肢弹性蛋白、鱿鱼环齿蛋白等，主要为纤维状蛋白质，外形呈纤维状或细棒状，多数具有大量的β片层结构，此结构也是其具有较好的力学强度的关键。然而，过多的β片层会导致溶解性的降低，进而影响其在原核生物中的表达。
类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides,ELPs)是一种具有弹性功能且对环境温度非常敏感的人造基因工程蛋白质聚合物。其结构主要由五肽重复序列单元构成，即(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly,VPGXG)，源自于弹性蛋白的疏水区域，其中Xaa可以是除Pro以外任意氨基酸。申请人将ELPs可重复序列中的四号氨基酸选取为赖氨酸，使其带有高电荷密度的正电荷，并将其与不同的力学功能蛋白进行融合表达，增加了力学功能蛋白溶解度的同时赋予了其一定的类弹性蛋白多肽的性质，从而研究其在生物医学材料如蛋白纤维，蛋白胶水，药物载体等方面的应用。
ELPs可随着温度的升高发生可逆的相变，即从可溶状态变成不溶的集合体，该温度即为相变温度(Tt)。ELP融合蛋白又称为ELPylation，即在目标蛋白的羧基端或氨基端连接ELPs，ELP融合蛋白继承了ELP的特性，即也能从可溶状态变成不溶的集合体。通过改变温度和离子强度等环境因素，从而引起ELP融合蛋白发生可逆性溶解，这一过程称为可逆相变循环(inverse transition-cycling，ITC)。通过ITC循环处理，ELP融合蛋白集合体能通过简单的离心或者超滤收集，并在低于相变温度或者改变其他环境条件时能重溶于缓冲液中。然而，对于带有大量正电荷的ELPs且融合了力学功能蛋白的融合蛋白，其可逆相变条件较难控制，目前还没有利用大体积纯化柱对此类蛋白进行亲和及离子交换层析的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法，其特征在于，表达ELP融合力学功能蛋白的发酵菌液预处理后经过镍亲和层析柱、除盐柱、SP离子交换层析柱纯化。
在本发明中，所述发酵菌液为ELP融合力学功能蛋白构建pET25b原核表达载体，转化E.coli BLR(DE3)大肠杆菌，经过诱导表达筛选获得的稳定表达菌株发酵获得的菌液。所述与ELP融合的力学功能蛋白包括但不限于丝心蛋白、蛛丝蛋白、节肢弹性蛋白、鱿鱼环齿蛋白。
本发明所述ELP融合力学功能蛋白在构建时候引入了6×His标签，本发明采用用亲和及离子交换的方法对此类蛋白进行纯化，纯化步骤较少，蛋白纯度较高，并进行了等比例放大，且进行等比例放大无需额外设备，得到克级纯度为95％以上的大批量ELP融合力学功能蛋白，解决了力学功能蛋白其纯化产量低且溶解性不好的问题。
在本发明中，所述预处理为发酵菌液离心收集沉淀，洗涤后重悬，用高压破碎仪进行破碎，破碎后离心收集上清。
其中，所述发酵菌液离心和破碎后离心均为高速离心。进一步的，在一些实施方案中所述发酵菌液离心为8000rpm离心20min；所述破碎后离心为8000rpm离心20min。
在本发明中，所述预处理中所述洗涤和重悬均采用后续层析柱的平衡缓冲液。在一些实施例中，所述洗涤和重悬均采用镍亲和层析柱平衡缓冲液A。在一些具体实施例中，采用平衡缓冲液A洗涤三次，并用平衡缓冲液A重悬。
在本发明中，所述高压破碎仪压力为39psi。
进一步的，在一些实施方案中，预处理后所得上清液用0.45μm滤膜进行过滤，除菌。
在本发明中，所述纯化克级力学功能蛋白的方法在预处理后依次经过镍亲和层析柱、除盐柱、SP离子交换层析柱纯化进行精细纯化。所述镍亲和层析柱柱体积为500ml的Ni柱、所述除盐柱柱体积≥600ml、所述SP柱柱体积为85ml。
在本发明中，所述镍亲和层析柱纯化包括以下步骤：
(1)柱平衡：用20％乙醇洗涤Ni柱，之后用平衡缓冲液A进行平衡；
(2)上样：将预处理蛋白样品加载到平衡后的Ni柱中，流速控制在60cm/h；
(3)平衡：用10CV的平衡缓冲液A继续冲洗Ni柱，使未结合的组分从柱子上分离；
(4)洗脱：用总计10-15CV体积的含有0-100％洗脱缓冲液A的平衡缓冲液A进行洗脱，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，收集洗脱液并保存。
其中，所述平衡缓冲液A为pH8.0的含有0.5M NaCl、0.02M咪唑的0.05M磷酸钠缓冲液，洗脱缓冲液A为pH8.0的含有0.5M NaCl、0.5M咪唑的0.05M磷酸钠缓冲液。
在本发明中，所述除盐柱纯化包括以下步骤：
(1)柱平衡：用20％乙醇洗涤除盐柱，之后用平衡缓冲液B对除盐柱进行平衡；
(2)上样：取等于除盐柱体积20％-30％的经Ni亲和层析处理过的洗脱液，加载到除盐柱中，流速控制在60cm/h
(3)洗涤：用1.5-2CV的平衡缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液；
(4)除盐：再用3CV的平衡缓冲液B进行洗脱，去除除盐柱中残留的盐离子，弃置洗脱液；
(5)用从步骤(3)中得到的洗脱液重复步骤(2)-(4)直至样品全部脱盐，其电导值应等于平衡缓冲液B。
在本发明中，所述SP离子交换层析柱纯化包括以下步骤：
(1)柱平衡：用20％乙醇洗涤SP柱，之后用平衡缓冲液B对SP柱进行平衡；
(2)上样：将除盐后的样品用平衡缓冲液B稀释到适当的浓度，调整pH到8.0；
(3)平衡：用10CV的平衡缓冲液B继续冲洗SP柱，使未结合的组分从柱子上分离；
(4)洗杂：用5CV洗杂缓冲液B冲洗SP柱，使结合不紧密的非目的蛋白尽可能被洗脱下来；
(5)洗脱：用2CV的洗脱缓冲液B洗涤SP柱，使目的蛋白被充分洗脱下来，收集洗脱液并保存。
其中，所述平衡缓冲液B为pH8.0的含有0.05M NaCl的0.05M磷酸钠缓冲液，洗杂缓冲液B为pH8.0的含有0.05M NaCl的0.05M磷酸钠缓冲液，洗脱缓冲液B为pH8.0的含有2MNaCl的0.05M磷酸钠缓冲液。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种方便、快捷、可大批量纯化力学功能蛋白的方法。本发明确定了一套针对力学功能蛋白的精细纯化方法，经过预处理，镍柱，除盐柱，离子交换柱分步处理后，并进行中试放大，最终得到纯度大于95％的力学功能蛋白，且每次获得量均达到克级水平。本发明可基于全自动蛋白纯化系统，操作简便。同时可实现蛋白样品的自动上样、自动洗涤、实时监控、在线检测等，能够根据样品状态及后续纯化要求来精细具体地调节纯化过程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示大批量纯化目的蛋白流程图；
图2示SRT蛋白纯化效果图，蛋白纯度>95％；
图3示Resilin蛋白纯化效果图(非还原电泳)，蛋白纯度>92％；
图4示蛛丝蛋白纯化效果图，蛋白纯度>95％；
图5示类弹性蛋白纯化效果图，蛋白纯度>97％。
具体实施方式
本发明公开了一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的在于提供一种大批量纯化力学功能蛋白的方法，所需纯化步骤较少，蛋白纯度较高，且进行等比例放大无需额外设备，得到克级的产物，且总回收率高于小试生产水平。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种大批量纯化力学功能蛋白的方法，将力学功能蛋白预处理后依次经过镍亲和柱及离子交换层析得到纯度为95％以上的大批量力学功能蛋白，且两次处理之间使用脱盐柱进行处理。
在本发明中，所述放大过程层析柱床体积计算，按照线性放大原则，采用反推计算方式获得数据。按照最终一批获得1500mg目的蛋白计算：
(1)除盐柱：结合凝胶过滤层析柱纯化得率大概90％，按照最终获得1500mg蛋白计算，层析柱处理蛋白量为1500mg/0.9＝1666mg；按照蛋白溶液浓度1.6mg/ml计算，凝胶过滤层析柱最终处理的样品为1000ml，分5批次进行处理则每批次处理量为200ml，按照处理量≤1/5-1/3柱床体积，其柱床体积不小于600ml。
(2)阳离子交换柱：阳离子交换柱SP柱纯化后需得到目的蛋白1666mg，按照75％纯化得率，Q柱需结合1666mg/0.75＝2221mg目的蛋白，此时蛋白纯度一般为90％左右，因此增加约222mg杂蛋白，按照其结合量30mg/ml，其柱床体积约为85ml。
(3)镍亲和层析柱：按照75％纯化得率大概需要3257mg纯目的蛋白，按照50％饱和上样量，即14mg/ml；柱床体积约为500ml。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。所得到的相关蛋白纯度检测依据《中国药典2015版》通则0541第五法所提供的检测方式。将待测样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色后用凝胶扫描仪进行扫描，对条带对应峰面积进行归一化处理并得到相应纯度。
实施例1
1.样品预处理
将2L含有SRT蛋白的大肠杆菌发酵液放入离心机中，分批次进行离心，8000rpm离心20min，收集沉淀，用平衡缓冲液A洗涤并用同样方式离心，重复三次。共收菌体100g，之后加入400ml平衡缓冲液A，经高压破碎仪破碎后，8000rpm离心20min，所得上清液用0.45μm滤膜进行过滤，除菌同时去除掉大分子，并用平衡缓冲液A稀释到200m L，最终得到200m L的预处理蛋白样品。
2.镍柱纯化SRT蛋白
将步骤1得到的预处理蛋白通过镍亲和层析柱进行纯化，所用柱子为HisTrap6XFF 5ml，具体纯化步骤为：
2.1缓冲液配制
(1)平衡缓冲液A：
Figure BDA0002390220680000061
加HCl调整pH＝8.0
(2)洗脱缓冲液A：
用平衡缓冲液A配制成咪唑终浓度为0.5M的缓冲液作为洗脱缓冲液，pH调整为8.0。
(3)清洁：
20％乙醇用于镍柱的清洁及保存，但在必要情况下，需要对镍柱进行脱镍再生处理。
2.2 SRT蛋白镍柱纯化步骤：
(1)柱平衡：
用20％乙醇洗涤Ni柱，之后用平衡缓冲液A进行平衡，使用的是AKTA avant系统，应冲洗到A280、A254基线平衡，电导及pH稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出镍柱。
(2)上样：
将预处理蛋白样品加载到平衡后的Ni柱中，流速控制在60cm/h。
(3)平衡：
用10CV的平衡缓冲液A继续冲洗Ni柱，使未结合的组分从柱子上分离，冲洗至AKTAavant系统A280、A254基线平衡，电导及pH稳定。
(4)洗脱：
用总计10-15CV体积的含有0-100％洗脱缓冲液A的平衡缓冲液A进行洗脱，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，当AKTA avant系统显示A280、A254基线开始上升时收集洗脱液并保存。
(5)镍柱的清洁及保存：
用20％的乙醇对镍柱进行彻底的清洁，保证系统中所显示的电导值为零且A280及A254平衡为止，将清洗并用乙醇填充好的柱子放入4℃保存。
(6)纯化后蛋白保存：
将纯化后的蛋白进行浓度测定，放入到-80℃冰箱中保存以便进行下一步实验。
3.SP柱纯化SRT蛋白
3.1缓冲液配制
(1)平衡缓冲液B:
pH＝8.0的磷酸钠缓冲液，添加氯化钠 5L
磷酸钠(M＝163.94) 81.97g
氯化钠(M＝58.44) 14.62g
加HCl调整pH＝8.0
(2)洗脱缓冲液B：
用平衡缓冲液B配制成氯化钠终浓度为2M的缓冲液作为洗脱缓冲液B，pH调整为8.0
(3)清洁：
20％乙醇用于SP的清洁及保存。
3.2 Ni纯化后蛋白除盐柱处理
(1)柱平衡：
所用除盐柱为HiPrep Desalting 53ml，用超纯水洗涤除盐柱，之后用平衡缓冲液进行平衡，使用的是AKTA avant系统，应冲洗到A280、A254基线平衡，电导及pH稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出除盐柱，冲洗体积至少应到265ml。
(2)上样：
将预处理好的蛋白样品加载到平衡后的除盐柱中，流速控制在9ml/min，每次最多上样15ml。
(3)除盐：
用3CV的平衡缓冲液B冲洗除盐柱，收集UV280起峰时蛋白样品，约为上样量的两倍体积，即为除盐后样品。
(4)重复步骤3，直至所有样品除盐完毕。
(5)除盐柱保存：
使用后的除盐柱用20％乙醇处理后放入4℃冰箱保存。
(6)纯化后蛋白保存：
将纯化后的蛋白进行浓度测定，放入到-80℃冰箱中保存以便进行下一步实验。
3.3除盐后蛋白SP柱纯化
将除盐后得到的预处理蛋白通过SP柱进行纯化，所用柱子为SP HP 5ml，具体纯化步骤为：
(1)柱平衡：
用20％乙醇洗涤SP柱，之后用平衡缓冲液B进行平衡，使用的是AKTA avant系统，应冲洗到A280、A254基线平衡，电导及pH稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出镍柱。
(2)上样：
将除盐后得到的蛋白加载到平衡后的SP柱中，流速控制在60cm/h。
(3)平衡：
用10cv的平衡缓冲液B继续冲洗SP柱，使未结合的组分从柱子上分离，冲洗至AKTAavant系统A280，A254基线平衡，电导及pH稳定。
(4)洗脱：
用总计10-15CV体积的含有0-100％洗脱缓冲液B的平衡缓冲液B进行洗脱，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，当AKTA avant系统显示A280、A254基线开始上升时收集洗脱液并保存。
(5)SP柱的清洁及保存：
用20％的乙醇对镍柱进行彻底的清洁，保证系统中所显示的电导值为零且A280及A254平衡为止，将清洗并用乙醇填充好的柱子放入4℃保存。
(6)纯化后蛋白保存：
将纯化后的蛋白进行浓度测定，放入到-80℃冰箱中保存以便进行下一步实验。
4.蛋白纯度检测
纯度检测依据《中国药典2015版》通则0541第五法所提供的检测方式。将待测样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色后用凝胶扫描仪进行扫描，对SRT重组蛋白条带对应峰面积进行归一化处理并与其他杂蛋白条带进行比较，得到相应纯度，为95％。实验结果见图2。
实施例2
1.样品预处理
将20L含有重组Resilin蛋白的大肠杆菌发酵液放入连续流离心机中，不停收集沉淀，用平衡缓冲液A洗涤并用同样方式离心，重复三次。共收菌体1kg，之后加入5L平衡缓冲液A，经高压破碎仪破碎后，8000rpm离心20min，所得上清液用0.45μm滤膜进行过滤，除菌同时去除掉大分子，最终得到5L的预处理蛋白样品。
2.大体积镍柱纯化Resilin蛋白
将步骤1得到的预处理蛋白通过大体积镍亲和层析柱进行纯化，所用填料为NiSepharoseTM6Fast Flow高流速镍亲和层析填料，填料总镍离子结合量不低于15μmol/ml，线性流速不得高于400cm/h，颗粒尺寸为45-165μm，柱管为XK 50/30，填充体积为500ml，具体纯化步骤为：
2.1缓冲液配制
(1)平衡缓冲液A：
Figure BDA0002390220680000101
加Hcl调整pH＝8.0
(2)洗脱缓冲液：
用平衡缓冲液A配制成咪唑终浓度为0.5M的缓冲液作为洗脱缓冲液A，pH调整为8.0
(3)清洁：
20％乙醇用于镍柱的清洁及保存，但在必要情况下，需要对镍柱进行脱镍再生处理。2.2Resilin蛋白大体积镍柱纯化步骤：
(1)柱平衡：
用20％乙醇洗涤Ni柱，之后用平衡缓冲液A进行平衡，本发明使用的是AKTA avant系统，应冲洗到A280、A254基线平衡，电导及pH稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出镍柱。
(2)上样：
将预处理好的蛋白样品加载到平衡后的Ni柱中，流速控制在60cm/h。
(3)平衡：
用10CV的平衡缓冲液A继续冲洗Ni柱，使未结合的组分从柱子上分离，冲洗至AKTAavant系统A280、A254基线平衡，电导及pH稳定。
(4)洗脱：
用总计10-15CV体积的含有0-100％洗脱缓冲液A的平衡缓冲液A进行洗脱，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，当AKTA avant系统显示A280、A254基线开始上升时收集洗脱液并保存。
(5)镍柱的清洁及保存：
用20％的乙醇对镍柱进行彻底的清洁，保证系统中所显示的电导值为零且A280及A254平衡为止，将清洗并用乙醇填充好的柱子放入4℃保存。
(6)纯化后蛋白保存：
将纯化后的蛋白进行浓度测定，放入到-80℃冰箱中保存以便进行下一步实验。
3.大体积SP柱纯化Resilin蛋白。
3.1缓冲液配制
(1)平衡缓冲液B:
pH＝8.0的磷酸钠缓冲液，添加氯化钠 10L
磷酸钠(M＝163.94) 163.94g
氯化钠(M＝58.44) 29.24g
加HCl调整pH＝8.0
(2)洗脱缓冲液：
用平衡缓冲液B配制成氯化钠终浓度为2M的缓冲液作为洗脱缓冲液B，pH调整为8.0
(3)清洁：20％乙醇用于SP的清洁及保存。
3.2NI纯化后蛋白除盐柱处理
(1)柱平衡：
所用除盐柱为HiPrep Desalting 600ml，用超纯水洗涤除盐柱，之后用平衡缓冲液B进行平衡，使用的是AKTA avant系统，应冲洗到A280、A254基线平衡，电导及pH稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出除盐柱，冲洗体积至少应到265ml。
(2)上样：
将预处理好的蛋白样品加载到平衡后的除盐柱中，流速控制在100ml/min，每次最多上样180ml。
(3)除盐：
用3CV的平衡缓冲液B冲洗除盐柱，收集UV280起峰时蛋白样品，约为上样量的两倍体积，即为除盐后样品。
(4)重复步骤3，直至所有样品除盐完毕。
(5)除盐柱保存：
使用后的除盐柱用20％乙醇处理后放入4℃冰箱保存。
(6)纯化后蛋白保存：
将纯化后的蛋白进行浓度测定，放入到-80℃冰箱中保存以便进行下一步实验。
3.3除盐后蛋白大体积SP柱纯化
将除盐后得到的预处理蛋白通过大体积SP柱进行纯化，所用柱料为SP SepharoseHigh Performance高分辨率阳离子交换柱料，填料离子结合量不低于0.18-0.26mmol Na+/mL，线性流速不得高于200cm/h，颗粒尺寸为34μm，具体纯化步骤为：
(1)柱平衡：
用20％乙醇洗涤SP柱，之后用平衡缓冲液B进行平衡，使用的是AKTA avant系统，应冲洗到A280、A254基线平衡，电导及pH稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出镍柱。
(2)上样：
将除盐后得到的预处理蛋白加载到平衡后的SP柱中，流速控制在60cm/h。
(3)平衡：
用10CV的平衡缓冲液B继续冲洗SP柱，使未结合的组分从柱子上分离，冲洗至AKTAavant系统A280、A254基线平衡，电导及pH稳定。
(4)洗脱：
用总计10-15CV体积的含有0-100％洗脱缓冲液B的平衡缓冲液B进行洗脱，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，当AKTA avant系统显示A280、A254基线开始上升时收集洗脱液并保存。
(5)SP柱的清洁及保存：
用20％的乙醇对SP柱进行彻底的清洁，保证系统中所显示的电导值为零且A280及A254平衡为止，将清洗并用乙醇填充好的柱子放入4℃保存。
(6)纯化后蛋白保存：
将纯化后的蛋白进行浓度测定，放入到-80℃冰箱中保存以便进行下一步实验。
4.蛋白纯度检测
纯度检测依据《中国药典2015版》通则0541第五法所提供的检测方式。将待测样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色后用凝胶扫描仪进行扫描，对Resilin重组蛋白条带对应峰面积进行归一化处理并与其他杂蛋白条带进行比较，得到相应纯度，为95％。实验结果见图3。
实施例3、4
与实施例2操作方法相似，不同之处在于把蛋白换成了蛛丝蛋白及类弹性蛋白。结果见图4-5。
结果显示，图4中的蛛丝蛋白纯度达到90％，符合要求。图5中的单独ELPs纯度极高，经过分析其纯度达到了99％，说明了此标签的表达效果及纯化效果极好，作为融合表达标签极其有效。

Claims (7)

1.一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法，其特征在于，表达ELP融合力学功能蛋白的发酵菌液预处理后经过镍亲和层析柱、除盐柱、SP离子交换层析柱纯化；
所述镍亲和层析柱纯化包括以下步骤：
（1）柱平衡：用20%乙醇洗涤Ni柱，之后用平衡缓冲液A进行平衡；
（2）上样：将预处理蛋白样品加载到平衡后的Ni柱中，流速控制在60 cm/h；
（3）平衡：用10 CV的平衡缓冲液A继续冲洗Ni柱，使未结合的组分从柱子上分离；
（4）洗脱：用总计10-15 CV体积的含有0-100%洗脱缓冲液A的平衡缓冲液A进行洗脱，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，收集洗脱液并保存；
所述除盐柱纯化包括以下步骤：
（1）柱平衡：用20%乙醇洗涤除盐柱，之后用平衡缓冲液B对除盐柱进行平衡；
（2）上样：取等于除盐柱体积20%-30%的经Ni亲和层析处理过的洗脱液，加载到除盐柱中，流速控制在60cm/h
（3）洗涤：用1.5-2CV的平衡缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液；
（4）除盐：再用3CV的平衡缓冲液B进行洗脱，去除除盐柱中残留的盐离子，弃置洗脱液；
（5）用从步骤（3）中得到的洗脱液重复步骤（2）-（4）直至样品全部脱盐，其电导值应等于平衡缓冲液B；
所述SP离子交换层析柱纯化包括以下步骤：
（1）柱平衡：用20%乙醇洗涤SP柱，之后用平衡缓冲液B对SP柱进行平衡；
（2）上样：将除盐后的样品用平衡缓冲液B稀释到适当的浓度，调整pH到8.0；
（3）平衡：用10 CV的平衡缓冲液B继续冲洗SP柱；
（4）洗杂：用5 CV洗杂缓冲液B冲洗SP柱；
（5）洗脱：用2 CV的洗脱缓冲液B洗涤SP柱，收集洗脱液并保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵菌液为ELP融合力学功能蛋白构建pET25b原核表达载体，转化E.coli BLR(DE3)大肠杆菌，经过诱导表达筛选获得的稳定表达菌株发酵获得的菌液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理为发酵菌液离心收集沉淀，洗涤后重悬，用高压破碎仪进行破碎，破碎后离心收集上清。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵菌液离心为8000 rpm离心20min；所述洗涤和重悬均采用平衡缓冲液A；所述高压破碎仪压力为39psi；所述破碎后离心为8000 rpm离心20 min；
所得上清液用0.45 μm滤膜进行过滤，除菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述镍亲和层析柱柱体积为500ml的Ni柱、所述除盐柱柱体积≥600ml、所述SP柱柱体积为85 ml 。
6.根据权利要求1~5任意一项所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液A为pH8.0的含有0.5 M NaCl、0.02 M咪唑的0.05 M磷酸钠缓冲液，洗脱缓冲液A为pH8.0的含有0.5 MNaCl、0.5M咪唑的0.05M磷酸钠缓冲液。
7.根据权利要求1~5任意一项所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液B为pH8.0的含有0.05M NaCl的 0.05M磷酸钠缓冲液，洗脱缓冲液B为pH8.0的含有2M NaCl的 0.05M磷酸钠缓冲液。
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