CN112812969A - 一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法 - Google Patents

一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：重组表达菌体的裂解、镍离子柱纯化方法、重组表达菌体的裂解的自裂解过程、疏水层析纯化步骤、反相色谱纯化步骤和切向流超滤浓缩。通过该基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，可获得重组多肽的纯度高达97％以上。获得重组多肽的纯度高，非常适合工业化规模的量产。

Description

一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法。
背景技术
生物制药是利用生物活体来生产药物的方法。随着生物技术的发展，人工制备的生物原料成为当前生物制药原料的主要来源。生物制药技术作为战略性新兴产业技术，发展迅猛，在制药工艺中广泛应用。现代生物制药特点是以基因工程为主导，包括细胞工程、发酵工程、酶工程和组织工程等技术的应用。多肽药物是指通过化学合成、基因重组或动植物中提取的具有特定治疗作用的多肽。多肽药物是国内外新药研发的重要方向。融合蛋白是指通过基因重组技术，将两种或多种蛋白质(或其结构域)的编码区连接起来，进行表达产生的一种新蛋白质。
随着生物制药的发展，基因工程重组蛋白的分离纯化技术显得尤为重要，快速特异地将目标蛋白从复杂的宿主菌中分离纯化出来，要求选择合适的蛋白纯化技术与方法。因为若要研究蛋白质的性质和功能，必须获得纯度较高的蛋白质，如果重组蛋白作为药物使用则需极高的蛋白质纯度，融合标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快捷，得到广泛应用。常用的蛋白纯化标签包括6X组氨酸(六聚组氨酸)等，即通过基因重组技术把6X组氨酸连接到目标蛋白质的N端融合表达，亲和标签在蛋白质纯化过程中有重要的作用，可以帮助稳定蛋白质和提高蛋白溶解性。纯化系统的选择取决于蛋白质性和下游应用。不同融合标签系统有其共性，也有其各自优点和缺点。融合标签的选择受到多因素制约，比如融合标签系统的纯化条件、融合蛋白自身的性质、纯化基质和缓冲液成本、融合标签的可去除性等，亲和标签被广泛应用于重组蛋白的分离纯化，但后续需要额外的方法去除标签，这极大限制其在工业规模的使用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，包括利用内含肽自身高效的剪切反应，把目标蛋白和亲和标签断裂分离。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，包括以下步骤：
S110：重组表达菌体的裂解：先用菌体裂解缓冲液A将湿重的菌体进行重悬，以叶片式搅拌器搅拌均匀，实验在冰浴中操作，然后使用均质机，将搅拌均匀的菌体重悬液进行高压均质，完成高压均质后，将菌体裂解液离心，收集上清，最后用深层滤膜过滤。
S120：镍离子柱纯化步骤：采用镍离子纯化胶体填充层析柱，以五倍于柱体积平衡缓冲液B平衡柱子，菌体裂解液上样量为八倍于柱体积，然后以七倍于柱体积平衡缓冲液B洗涤，最后用八倍于柱体积洗脱缓冲液C洗脱柱进行目的产物的收集。
S130：重组表达菌体的裂解的自裂解过程；将镍离子柱洗脱下来的样本称重定量，然后用蠕动泵缓慢泵入缓冲液D中，进行稀释并调节pH至10.0，放置于25℃恒温箱中自裂解反应，然后离心收集上清，最后用滤膜过滤。
S140：疏水层析纯化步骤：采用疏水层析胶体填充层析柱，以五倍于柱体积的平衡缓冲液E平衡柱子，裂解过滤液上样体积十倍于柱体积，然后以五倍于柱体积平衡缓冲液E洗涤纯化柱，最后以四倍于柱体积的纯化水洗脱收集目的产物，并加入浓度20mM的碳酸氢铵，调节pH至9.0。
S150：反相色谱纯化步骤：采用反相色谱介质填充层析柱，以二倍于柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，向疏水层析纯化步骤收集的洗脱液中加入终浓度为10％的乙醇，并上样体积1300mL，然后以二倍于柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子，最后以缓冲液F与缓冲液G拉线性梯度洗脱。
S160：切向流超滤浓缩：将反相色谱纯化收集到的样本进行切向流系统超滤，以一进一出的方式，使用相当于渗过流率的流速加入缓冲液H进行连续式稀释，共置换十倍的反相色谱纯化步骤所洗脱的体积。
优选的，所述重组表达菌体裂解所采用的缓冲液A为2mM乙二胺四乙酸、25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且缓冲液A的酸碱度为pH7.0。
优选的，所述镍离子柱纯化步骤中所采用的平衡缓冲液B为25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且平衡缓冲液B的酸碱度为pH7.0。
优选的，所述镍离子柱纯化步骤中所采用的柱洗脱缓冲液C为400mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且柱洗脱缓冲液的酸碱度为pH7.0。
优选的，所述自裂解步骤中所采用的裂解缓冲液D为50mM磷酸钾缓冲液，且裂解缓冲液D的酸碱度为pH10.0。
优选的，所述疏水层析纯化步骤中所采用的平衡缓冲液E为50mM磷酸钾缓冲液和120Mm氯化钠的混合溶液，且平衡缓冲液E的酸碱度为pH10.0。
优选的，所述疏水层析纯化步骤中所采用的洗脱液为纯化水。
优选的，所述反相色谱纯化步骤中所采用的平衡缓冲液F为20mM碳酸氢铵溶液，且平衡缓冲液F的酸碱度为pH8.0。
优选的，所述反相色谱纯化步骤中所采用的洗脱缓冲液G为20mM碳酸氢铵溶液，且洗脱缓冲液G的酸碱度为pH8.0。
优选的，所述切向流超滤浓缩步骤中所采用的浓缩置换缓冲液H为10mM碳酸氢铵，且浓缩置换缓冲液H的酸碱度为pH9.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、通过重组表达菌体裂解方法中的均质破菌方法，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析结果表明重组表达菌体基本全部破菌裂解，按镍离子柱纯化步骤，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析结果表明经过镍离子柱纯化后，含有6X组氨酸标签的基因工程重组蛋白被分离纯化收集，按内含肽自裂解步骤，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析结果表明重组表达目的蛋白全部完成自裂解。
2、通过按实验步骤所述的疏水层析纯化方法，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析和高效液相色谱分析表明疏水层析纯化效果良好，按实验步骤所述的反相色谱纯化方法，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析和高效液相色谱分析表明反相色谱纯化方法效果良好，按实验步骤所述的切向流超滤浓缩方法，经过5次重复实验，高效液相色谱分析表明切向流超滤浓缩效果良好。
3、通过该基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，可获得重组多肽的纯度高达97％以上。获得重组多肽的纯度高，非常适合工业化规模的量产。
附图说明
图1为本发明的基因工程重组表达多肽的系统纯化方案步骤示意图；
图2为本发明的蛋白凝胶电泳分析重组表达菌体的裂解示意图；
图3为本发明的蛋白凝胶电泳分析镍离子柱纯化示意图；
图4为本发明的蛋白凝胶电泳分析内含肽的自裂解示意图；
图5为本发明的蛋白凝胶电泳分析分析疏水层析纯化效果示意图；
图6为本发明的高效液相色谱分析疏水层析纯化效果示意图；
图7为本发明的高效液相色谱分析反相色谱纯化的效果示意图；
图8为本发明的高效液相色谱分析切向流超滤浓缩置换效果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-8，本发明提供一种技术方案：一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，包括以下步骤：
S110：重组表达菌体的裂解：先用菌体裂解缓冲液A将湿重的菌体进行重悬，以叶片式搅拌器搅拌均匀，实验在冰浴中操作，然后使用均质机，将搅拌均匀的菌体重悬液进行高压均质，完成高压均质后，将菌体裂解液离心，收集上清，最后用深层滤膜过滤。
S120：镍离子柱纯化步骤：采用镍离子纯化胶体填充层析柱，以五倍于柱体积平衡缓冲液B平衡柱子，菌体裂解液上样量为八倍于柱体积，然后以七倍于柱体积平衡缓冲液B洗涤，最后用八倍于柱体积洗脱缓冲液C洗脱柱进行目的产物的收集。
S130：重组表达菌体的裂解的自裂解过程：将镍离子柱洗脱下来的样本称重定量，然后用蠕动泵缓慢泵入缓冲液D中，进行稀释并调节pH至10.0，放置于25℃恒温箱中自裂解反应，然后离心收集上清，最后用滤膜过滤。
S140：疏水层析纯化步骤：采用疏水层析胶体填充层析柱，以五倍于柱体积的平衡缓冲液E平衡柱子，裂解过滤液上样体积十倍于柱体积，然后以五倍于柱体积平衡缓冲液E洗涤纯化柱，最后以四倍于柱体积的纯化水洗脱收集目的产物，并加入浓度20mM的碳酸氢铵，调节pH至9.0。
S150：反相色谱纯化步骤：采用反相色谱介质填充层析柱，以二倍于柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，向疏水层析纯化步骤收集的洗脱液中加入终浓度为10％的乙醇，并上样体积1300mL，然后以二倍于柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子，最后以缓冲液F与缓冲液G拉线性梯度洗脱。
S160：切向流超滤浓缩：将反相色谱纯化收集到的样本进行切向流系统超滤，以一进一出的方式，使用相当于渗过流率的流速加入缓冲液H进行连续式稀释，共置换十倍的反相色谱纯化步骤所洗脱的体积。
本实施方案中，通过上述步骤可获得重组多肽的纯度高达97％以上。获得重组多肽的纯度高，非常适合工业化规模的量产。
具体的，重组表达菌体裂解所采用的菌体裂解缓冲液A为2mM乙二胺四乙酸、25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且缓冲液A的酸碱度为pH7.0。
本实施例中，菌体裂解缓冲液A的配制方法为：秤取15.77gKH2PO4、30.61gK2HPO4·3H2O、87.66gNaCl、8.5g咪唑、3.72gEDTA-2Na·2H2O，加入约4750g的去离子水，搅拌溶解后，调pH至7.0，补水至5L，0.45μm滤膜过滤至5L血清瓶，保存于4℃冰箱。
具体的，镍离子柱纯化步骤中所采用的平衡缓冲液B为25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且平衡缓冲液B的酸碱度为pH7.0。
本实施例中，平衡缓冲液B的配制方法为：秤取15.77gKH2PO4、30.61gK2HPO4·3H2O、87.66gNaCl、8.5g咪唑，加入约4900g的去离子水，搅拌溶解后，调整pH值至7.0，补水至5L。0.45μm滤膜过滤至5L血清瓶，保存于4℃冰箱。
具体的，镍离子柱纯化步骤中所采用的柱洗脱缓冲液C为400mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且柱洗脱缓冲液的酸碱度为pH7.0。
本实施例中，柱洗脱缓冲液C的配制方法为：秤取27.2gKH2PO4、70.12gNaCl、108.93g咪唑，加入约3670g的去离子水，搅拌溶解后，补水至4L。0.45μm滤膜过滤至5L血清瓶，保存于RT。
具体的，自裂解步骤中所采用的裂解缓冲液D为50mM磷酸钾缓冲液，且裂解缓冲液D的酸碱度为pH10.0。
本实施例中，裂解缓冲液D的配制方法为：秤取57.1gK2HPO4，加入约4750g的去离子水，搅拌溶解后，调节pH至10.0，补水至5L。以0.45μm滤膜过滤至5L血清瓶，保存于RT。
具体的，疏水层析纯化步骤中所采用的平衡缓冲液E为50mM磷酸钾缓冲液和120Mm氯化钠的混合溶液，且平衡缓冲液E的酸碱度为pH10.0。
本实施例中，平衡缓冲液E的配制方法为：秤取13.6gKH2PO4、35.06gNaCl、34.26gK2HPO4·3H2O，加入约4800g的去离子水，搅拌溶解后，调节pH至10.0，补水至5L，以0.45μm滤膜过滤至5L血清瓶，保存于RT。
具体的，疏水层析纯化步骤中所采用的洗脱液为纯化水。
本实施例中，洗脱液为的成分为纯化水。
具体的，反相色谱纯化步骤中所采用的平衡缓冲液F为20mM碳酸氢铵溶液，且平衡缓冲液F的酸碱度为pH8.0。
本实施例中，平衡缓冲液F的配制方法为：秤取7.9g碳酸氢铵，加入约4900g的去离子水，搅拌溶解后，以30％氨水调节pH值至8.0，补水至5L。0.45μm滤膜过滤至5L血清瓶，保存于RT。
具体的，反相色谱纯化步骤中所采用的洗脱缓冲液G为20mM碳酸氢铵溶液，且洗脱缓冲液G的酸碱度为pH8.0。
本实施例中，洗脱缓冲液G的配制方法为：秤取4.74g碳酸氢铵，加入约63.2g的去离子水，搅拌溶解后，以30％氨水调节pH至8.0，再加入2202.6g的95％EtOH，均匀搅拌后，0.45μm滤膜过滤至3L血清瓶内，保存于RT。
具体的，切向流超滤浓缩步骤中所采用的浓缩置换缓冲液H为10mM碳酸氢铵，且浓缩置换缓冲液H的酸碱度为pH9.0。
本实施例中，浓缩置换缓冲液H的配制方法为：秤取3.95g碳酸氢铵，加入约4990g的去离子水，搅拌溶解后，以30％氨水调整pH值至9.0，补水至5L。以0.45μm滤膜过滤至5L血清瓶中，保存于RT。
本发明的具体步骤包括：
S110重组表达菌体的裂解：先用3050mL菌体裂解缓冲液A将305g湿重的菌体以比例10：1w/w进行重悬，以叶片式搅拌器搅拌均匀，转速为700rpm，实验在冰浴中操作，然后使用均质机，将搅拌均匀的菌体重悬液进行高压均质，均质压力为850±50bar，重复3次，实验过程控温在8℃以下。完成高压均质后，将菌体裂解液离心，收集上清，最后用0.45μm深层滤膜过滤。
S120镍离子柱纯化步骤：采用镍离子纯化胶体填充层析柱，其中柱内径50mm、柱高20cm、柱体积392.5mL，线性流速为90cm/h，以五倍于柱体积平衡缓冲液B平衡柱子，在冰浴内操作，菌体裂解液上样量为八倍于柱体积，然后以七倍于柱体积平衡缓冲液B洗涤，最后用八倍于柱体积洗脱缓冲液C洗脱柱进行目的产物的收集。
S130重组表达菌体的裂解的自裂解过程：将镍离子柱洗脱下来的样本称重定量，然后用蠕动泵缓慢泵入2.5倍重量的缓冲液D中，进行稀释并调节pH至10.0，然后放置于25℃恒温箱中自裂解反应16小时，然后离心收集上清，最后用0.45μm滤膜过滤。
S140：疏水层析纯化步骤：采用疏水层析胶体填充层析柱，柱内径50mm、柱高16.2cm、柱体积317.9mL，线性流速为122cm/h，以五倍于柱体积的平衡缓冲液E平衡柱子，裂解过滤液上样体积十倍于柱体积，然后以五倍于柱体积平衡缓冲液E洗涤纯化柱，最后以四倍于柱体积的纯化水洗脱收集目的产物，并加入浓度20mM的碳酸氢铵，调节pH至9.0。
S150：反相色谱纯化步骤：采用反相色谱介质填充层析柱，柱内径50mm、柱高22cm、柱体积431.8mL，线性流速为244cm/h，以二倍于柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，其中平衡缓冲液的组成为90％缓冲液F和10％缓冲液G，向疏水层析纯化步骤收集的洗脱液中加入浓度为10％的乙醇，并上样体积1300mL，然后以二倍于柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子，其中平衡缓冲液的成分为90％缓冲液F和10％缓冲液G，最后以缓冲液F与缓冲液G拉线性梯度洗脱。
S160：切向流超滤浓缩：将反相色谱纯化收集到的样本进行切向流系统超滤，其中压力为0.9bar，渗过流率为15mL/min，以一进一出的方式，使用相当于渗过流率的流速加入缓冲液H进行连续式稀释，共置换十倍的反相色谱纯化步骤所洗脱的体积。
通过蛋白凝胶电泳分析、高效液相层析分析，结果显示本发明提供的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法在纯度和回收率方面均效果优异。
(一)重组表达菌体的裂解
重组表达菌体裂解方法按实验步骤所述均质破菌方法，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析结果表明重组表达菌体基本全部破菌裂解，详情可见图2。
(二)镍离子柱纯化步骤
按实验步骤所述镍离子柱纯化步骤，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析结果表明经过镍离子柱纯化后，含有6X组氨酸标签的基因工程重组蛋白被分离纯化收集，详情可见图3。
(三)重组表达菌体的裂解的自裂解过程
按实验步骤所述的内含肽自裂解步骤，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析结果表明重组表达目的蛋白全部完成自裂解，详情可见图4。
(四)疏水层析纯化步骤
按实验步骤所述的疏水层析纯化方法，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析和高效液相色谱分析表明疏水层析纯化效果良好，纯度：86.66％，回收率：96％，详情可见图5和图6。
(五)反相色谱纯化步骤
按实验步骤所述的反相色谱纯化方法，经过5次重复实验，蛋白凝胶电泳分析和高效液相色谱分析表明反相色谱纯化方法效果良好，纯度：98.56％，回收率：92.01％，详情可见图7。
(六)切向流超滤浓缩
按实验步骤所述的切向流超滤浓缩方法，经过5次重复实验，高效液相色谱分析表明切向流超滤浓缩效果良好，纯度：97.56％，回收率：95.63％，详情可见图8。
以上结果表明，本发明提供的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，对大肠杆菌表达的多肽分离纯化效果优异。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S110：重组表达菌体的裂解：先用菌体裂解缓冲液A将湿重的菌体进行重悬，以叶片式搅拌器搅拌均匀，实验在冰浴中操作，然后使用均质机，将搅拌均匀的菌体重悬液进行高压均质，完成高压均质后，将菌体裂解液离心，收集上清，最后用深层滤膜过滤；
S120：镍离子柱纯化步骤：采用镍离子纯化胶体填充层析柱，以五倍于柱体积平衡缓冲液B平衡柱子，菌体裂解液上样量为八倍于柱体积，然后以七倍于柱体积平衡缓冲液B洗涤，最后用八倍于柱体积洗脱缓冲液C洗脱柱进行目的产物的收集；
S130：重组表达菌体的裂解的自裂解过程：将镍离子柱洗脱下来的样本称重定量，然后用蠕动泵缓慢泵入缓冲液D中，进行稀释并调节pH至10.0，放置于25℃恒温箱中自裂解反应，然后离心收集上清，最后用滤膜过滤；
S140：疏水层析纯化步骤：采用疏水层析胶体填充层析柱，以五倍于柱体积的平衡缓冲液E平衡柱子，裂解过滤液上样体积十倍于柱体积，然后以五倍于柱体积平衡缓冲液E洗涤纯化柱，最后以四倍于柱体积的纯化水洗脱收集目的产物，并加入浓度20mM的碳酸氢铵，调节pH至9.0；
S150：反相色谱纯化步骤：采用反相色谱介质填充层析柱，以二倍于柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，向疏水层析纯化步骤收集的洗脱液中加入终浓度为10％的乙醇，并上样体积1300mL，然后以二倍于柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子，最后以缓冲液F与缓冲液G拉线性梯度洗脱；
S160：切向流超滤浓缩：将反相色谱纯化收集到的样本进行切向流系统超滤，以一进一出的方式，使用相当于渗过流率的流速加入缓冲液H进行连续式稀释，共置换十倍的反相色谱纯化步骤所洗脱的体积。
2.根据权利要求1所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述重组表达菌体裂解所采用的菌体裂解缓冲液A为2mM乙二胺四乙酸、25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且缓冲液A的酸碱度为pH7.0。
3.根据权利要求1所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述镍离子柱纯化步骤中所采用的平衡缓冲液B为25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且平衡缓冲液B的酸碱度为pH7.0。
4.根据权利要求3所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述镍离子柱纯化步骤中所采用的柱洗脱缓冲液C为400mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且柱洗脱缓冲液的酸碱度为pH7.0。
5.根据权利要求1所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述自裂解步骤中所采用的裂解缓冲液D为50mM磷酸钾缓冲液，且裂解缓冲液D的酸碱度为pH10.0。
6.根据权利要求1所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述疏水层析纯化步骤中所采用的平衡缓冲液E为50mM磷酸钾缓冲液和120Mm氯化钠的混合溶液，且平衡缓冲液E的酸碱度为pH10.0。
7.根据权利要求6所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述疏水层析纯化步骤中所采用的洗脱液为纯化水。
8.根据权利要求1所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述反相色谱纯化步骤中所采用的平衡缓冲液F为20mM碳酸氢铵溶液，且平衡缓冲液F的酸碱度为pH8.0。
9.根据权利要求8所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述反相色谱纯化步骤中所采用的洗脱缓冲液G为20mM碳酸氢铵溶液，且洗脱缓冲液G的酸碱度为pH8.0。
10.根据权利要求1所述的一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法，其特征在于：所述切向流超滤浓缩步骤中所采用的浓缩置换缓冲液H为10mM碳酸氢铵，且浓缩置换缓冲液H的酸碱度为pH9.0。
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