CN113265396B - 大型质粒dna的连续化生产的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种大型质粒DNA的连续化生产的工艺方法，包括以下步骤：S1：对含大型质粒DNA的细菌进行碱液裂解、酸性中和、对中和后的悬浮混合物进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液；所述大型质粒DNA是指大于20KB的质粒DNA；S2：将所述含大型质粒DNA的滤液在12h内上样到阴离子交换层析柱进行洗脱，收集含大型质粒DNA的洗脱液。本发明的方法能够减少生产过程中大型质粒DNA的超螺旋态向松弛态的转化，并获得稳定性高的大型质粒DNA。
Description
技术领域
本发明属于于生物技术领域中，特别是涉及一种用于大型质粒DNA(大于20KB)的中小规模和大规模的连续化生产的方法，所获得的大型质粒DNA具有较好的稳定性。
背景技术
实验室小规模的质粒DNA的制备与提纯已经有成熟的方法，是以大肠杆菌摇瓶、碱液裂解、异丙醇沉淀和AEX阴离子层析为主要步骤，可以表达和纯化出高纯度的超螺旋态的质粒DNA。
在2000-2010年间，基于当时对DNA疫苗和基因疗法开发的兴起，大规模的质粒DNA的生产受到了生物制药业的关注与研究。其中，最具挑战性的部分就是在使用碱液裂解大肠杆菌时，如何控制碱液混合时的接触时间，以提高超螺旋态的质粒DNA的产量，并避免混合时对染色体DNA的剪切，造成后期纯化的困难。针对这个问题，好几家生物制药公司都对此进行了比较深入的研发，以下面两份参考文献为代表：
参考文献1.Plasmid DNA Manufacturing Technology,Aaron E.Carnes,etc.Recent patents on Biotechnology 2007,Vol.I,151-166；
参考文献2.A continuous process to extract plasmid DNA based onalkaline lysis,Xiaolin Li,etc.2008,Nature Protocol 2008,Vol.3,176-180；
文献中，主要的技术要点就是使用了低剪切力的在线混合装置，来控制混合时间和剪切力，或者更进一步，引入连续性工艺的概念，将大肠杆菌悬浮、碱液裂解、酸性中和、以及对中和后的悬浮混合物进行过滤的步骤连接在一起。
然而，上述研究主要是针对小型质粒DNA(如2～20KB)。由于劳动时间的管理和人力资源的分配，在上述的大肠杆菌悬浮、碱液裂解、酸性中和、以及对中和后的悬浮混合物进行过滤的各个步骤中，试验人员可以根据需要随时暂停各个操作节点或者在各个步骤之间穿插其他的额外的步骤(如CN111304193A)，经验证明这样的操作属于常规操作，对小型质粒DNA(如2～20KB)而言并未发现存在对稳定性不利的影响。
在2015年之后的几年间，由于DNA疫苗和基因疗法的进展较大，大规模质粒DNA的生产工艺受到了进一步的关注。本案的技术人员在研究大肠杆菌悬浮、碱液裂解、酸性中和的生产工艺进行质粒DNA的生产时，发现现有工艺操作对大型质粒DNA，例如超过20KB的质粒，进行碱液裂解和酸性中和以及过滤后，大型质粒DNA的最佳稳定期很短，只有几到十几个小时，一旦超过24小时后，大量的质粒DNA将不能保持超螺旋态，超螺旋态的质粒DNA的浓度和纯度都明显降低，就不再适合用于AEX阴离子层析纯化。
因此，本案期望能够解决大型质粒DNA的生产工艺所遇到的超螺旋态的质粒DNA的稳定性差的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种大型质粒DNA的连续化生产的工艺方法，该方法能够减少生产过程中大型质粒DNA的超螺旋态向松弛态的转化，并获得稳定性高的大型质粒DNA。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一种大型质粒DNA的连续化生产的工艺方法，包括以下步骤：
S1：对含大型质粒DNA的细菌进行碱液裂解、酸性中和、对中和后的悬浮混合物进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液(或称为上清液)；所述大型质粒DNA是指大于20KB的质粒DNA；
S2：将所述含大型质粒DNA的滤液在12h内上样到阴离子交换层析柱进行洗脱，收集含大型质粒DNA的洗脱液。
具体地，所述步骤S1和步骤S2之间连续进行，中间不穿插其他步骤。其中，所述12h内是指从所述步骤S1得到含大型质粒DNA的滤液到所述步骤S2将含大型质粒DNA的滤液上样到阴离子交换层析柱，所述含大型质粒DNA的滤液的等待时长小于12h。所述含大型质粒DNA的滤液在等待时长内的保存温度优选为2℃～8℃。
优选地，所述步骤S2中，将所述含大型质粒DNA的滤液在12h内、10h内、8h内、6h内、5h内、4h内、3h内、2h内、1h内、或立即上样到阴离子交换层析柱进行洗脱，收集含大型质粒DNA的洗脱液。
优选地，所述步骤S2在12h内执行完毕，获得含大型质粒DNA的洗脱液。
优选地，所述步骤S1和步骤S2在24h内执行完毕。更优选地，所述步骤S1和步骤S2在12h内执行完毕
具体地，所述步骤S1中，对含大型质粒DNA的细菌进行碱液裂解、酸性中和，是通过在线缓冲液配液系统进行；所述步骤S1中，对中和后的悬浮混合物进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液，是通过深层过滤装置进行；所述步骤S2，是通过连续式层析系统进行。
具体地，所述线缓冲液配液系统包括至少三个容器和至少两个在线混合装置；所述三个容器分别用于容纳悬浮的菌体、碱性裂解液和酸性中和溶液，所述三个容器分别连接三条配液管路，其中，容纳悬浮的菌体的容器与第一配液管路连接，容纳碱性裂解液的容器与第二配液管路连接，容纳酸性中和溶液的容器与第三配液管路连接；所述第一配液管路、第二配液管路都连接于第一在线混合装置的前端；所述第一在线混合装置的后端通过第四配液管路连接于第二在线混合装置的前端，同时第三配液管路也连接于第二在线混合装置的前端。
具体地，所述第一配液管路负责将悬浮的菌体输送至第一在线混合装置，所述第二配液管路负责将碱性裂解液输送至第一在线混合装置，所述第一在线混合装置负责将输送来的悬浮的菌体与碱性裂解液进行混合，完成碱液裂解操作。
具体地，所述第四配液管路负责将第一在线混合装置内完成碱液裂解操作的溶液输送至第二在线混合装置，所述第三配液管路负责将酸性中和溶液输送至第二在线混合装置，所述第二在线混合装置负责将输送来的完成碱液裂解操作的溶液与酸性中和溶液进行混合，完成酸性中和操作。
具体地，各配液管路中分别设置有至少一个泵。所述泵为低剪切力泵。例如优选为隔膜泵。
具体地，各容器、各配液管路、各泵以及各在线混合装置均统一通过在线缓冲液配制系统的中控系统进行在线调节和监控。
具体地，第二在线混合装置的后端通过管路连接深层过滤装置，将完成酸性中和操作后的混合物直接输送至深层过滤装置；所述深层过滤装置负责对从第二在线混合装置输送来的完成酸性中和操作后的混合物进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液。
优选地，所述深层过滤装置包括至少一个深层过滤器和一个孔径0.2～0.5微米过滤器，各过滤器以串联方式连接。
优选地，深层过滤器的数目为两个，分别为深层过滤器1、深层过滤器2；深层过滤器1、深层过滤器2和孔径0.2～0.5微米过滤器以串联方式依次连接，组成所述深层过滤装置；第二在线混合装置的后端通过管路连接深层过滤器1的入口。
优选地，深层过滤器1的孔径范围为8～60微米，深层过滤器2的孔径范围为0.2～2微米，最后再经过孔径0.2微米过滤器。
具体地，所述深层过滤装置的后端通过管路连接中转容器；所述中转容器负责收集由深层过滤装置过滤得到的含大型质粒DNA的滤液。优选地，所述中转容器具有2～8℃冷藏控温的功能。
具体地，所述中转容器通过输液管路连接连续式层析系统，所述中转容器内收集的含大型质粒DNA的滤液上样至连续式层析系统，采用阴离子交换层析柱进行纯化，得到含大型质粒DNA的洗脱液。优选地，所述中转容器内收集的含大型质粒DNA的滤液每间隔不超过3h即上样至连续式层析系统。更有选地，每间隔不超过1h内或2h即上样至连续式层析系统。
本申请针对20KB以上的大型质粒DNA在大肠杆菌的菌体离心收获、常规碱液裂解、酸性中和过程以及过滤后生成上清液中稳定性差的问题，提出了在生成上清液后的几个小时内完成阴离子层析纯化操作的方案，并意外地发现纯化后的洗脱液中大型质粒DNA超螺旋态的稳定性很好，能够长久保存。在这种情况下，无论是实验室中的小试，还是中试或大规模生产时，基于前面几步工艺的操作(菌体离心收获，碱液裂解、酸性中和以及过滤后)都需要立即完成，且已经耗费了相当长的时间，实验人员立刻进行下一步工艺的可行性，在劳动时间的管理和人力资源的分配上存在着很大的现实难度。在这种情况下，如何在维持现有工艺的基础上，提高效率，节省时间，尽快进行AEX纯化步骤，从而提高从发酵到粗纯工艺的整体产量并获得更高纯度的大型质粒DNA，就是本申请进一步所解决的问题。
为了进一步解决上述问题，本申请在现有工艺的基础上，创造性地使用连续性的在线缓冲配液系统和连续式层析系统的相结合的工艺设备，将表达20KB以上大型质粒DNA的大肠杆菌的悬浮处理菌体、碱液裂解菌体、酸性中和形成絮状沉淀物、深层过滤、和AEX阴离子层析纯化的所有步骤，变为一个连续流的自动化的工艺方法，使得大型质粒DNA的发酵批次，从菌体离心收获悬浮、常规碱液裂解、酸性中和、深层过滤、到完成AEX阴离子层析纯化的全部时间，都在几小时到一天内完成，极大地提高了效率，节省了人力和时间，并获得了高产率、高纯度、高稳定性的大型质粒DNA。由于大肠杆菌的菌体离心收获必须在当天完成，连续流工艺也应在一天内完成，从而将离心收获的质粒DNA，在当天就完成AEX阴离子层析的纯化，可存放在2-8C下，用于下一步的纯化。
本申请的有益效果还包括，1.发现了大型质粒DNA稳定性差的原因，对于特定的大型质粒DNA无需进行工艺开发，通过使用连续性的工艺设备和工艺规程，将超大质粒DNA(>20KB)从大肠杆菌的菌体离心收获后，菌体悬浮、常规碱液裂解、酸性中和以及过滤后的质粒DNA的上清液，在最短的时间内，通过AEX层析纯化；2.有效提高20KB以上的大型质粒DNA纯化的产率和纯度；3.使纯化后的大型质粒DNA达到一个较为稳定的状态，可长久保存；4.同时，连续式工艺的在线监控和调节功能，还能提高工艺的稳定性，减少超时工作的人力需求。
附图说明
图1为实施例2中琼脂凝胶电泳试验结果图。
图2为实施例3中琼脂凝胶电泳试验结果图。
图3为实施例4中步骤1的新鲜的上清液的琼脂凝胶电泳试验结果图。
图4为实施例4中步骤2的AEX色谱图。
图5为实施例4中步骤2的每个收集的组分所对应AEX洗脱峰的琼脂凝胶电泳试验结果图。
图6为实施例4中步骤2的AEX洗脱液放置3天和3个月后的琼脂凝胶电泳试验结果图。
图7为实施例4的对比例的AEX色谱结果图。
图8为实施例4的对比例的AEX洗脱峰的的琼脂凝胶电泳试验结果图。
图9为大型质粒DNA的连续式工艺的工艺设备和步骤流程图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规方法和条件，例如按照分子克隆指南所述方法进行操作，或者按照商品说明书选择。实施例中所用试剂盒原料均市售可得。
实施例1制备大型质粒DNA裂解上清液
大型质粒DNA裂解上清液可按照分子克隆指南所述方法，依次进行细菌悬浮、碱液裂解、酸性中和、以及对中和后的悬浮混合物进行过滤的操作来得到。一种具体的操作方法如下：
1)质粒DNA是22KB质粒。使用大肠杆菌菌株BL21以10L规模扩增质粒。将细胞糊在4℃下以15.2K g离心15分钟；
2)将35克FID0025细胞糊状物完全重悬于700毫升重悬缓冲液(50mM Tris，10mMEDTA，pH 7.4)中；
3)使用5升的瓶子以及最宽的搅拌棒，在磁力搅拌器上以200-400rpm的速度混合，直到完全重悬；
4)将700ml裂解缓冲液(1.0％SDS,0.2N NaOH)加入搅拌的混合物中，以200-400rpm的转速混合5分钟；
5)五分钟后，立即添加700ml冷中和缓冲液(3.0M乙酸钾，2.0M乙酸)，在200-400rpm下混合五分钟；
6)在4℃下以15.2Kg的速度离心15分钟；
7)通过0.2um过滤器过滤，得到大型质粒DNA裂解上清液。
实施例2大型质粒DNA稳定性的验证
按照实施例1的方法制备得到新鲜的大型质粒DNA裂解上清液，取样，分为两份。一份作为对照组，采用新鲜的上清液直接用于琼脂凝胶电泳试验；另一份作为试验组，将新鲜的上清液在2～8℃下放置3～5天后，再取样用于琼脂凝胶电泳试验。
试验结果如图1所示。由图1可以得知，新鲜上清液中含有高浓度的超螺旋态的大型质粒DNA，而在2～8℃下放置3～5天后的样品中的大型质粒DNA主要呈松弛态。也就是说，放置前与放置后相比较，该大型质粒DNA在0.8％的DNA琼脂胶上的迁移条带从接近超螺旋态的位置，延缓至松弛态的位置。这充分显示了大型质粒DNA在该裂解上清液中和上述储存条件下处于不稳定的状态。20KB以上的超大质粒DNA，在碱液裂解和酸性中和后的溶液成分下，稳定性非常差。在操作完成后的1～2天内，即使是2-8℃的温度下，上清液和洗脱液中超螺旋态的质粒DNA的浓度和纯度都有明显降低。
实施例3在2～8℃下放置1天后的大型质粒DNA结合阴离子层析纯化效果的验证
按照实施例1的方法制备得到新鲜的大型质粒DNA裂解上清液，将该大型质粒DNA裂解上清液在2～8℃下放置1天后，取样，分为两份。一份作为上样液，立即进行AEX阴离子层析纯化，分别收集AEX流穿液、AEX洗脱液和AEX清洗液，进行琼脂凝胶电泳试验；另一份作为对照组，将其在室温下再放置6～8小时后，进行AEX阴离子层析纯化，再分别收集AEX流穿液、AEX洗脱液和AEX清洗液，进行琼脂凝胶电泳试验。
试验结果如图2所示。由图2可以得知，新鲜上清液在2～8℃下放置1天后得到的上样液中，大型质粒DNA在0.8％的DNA琼脂胶上的迁移条带已经从大部分为超螺旋态的位置，变成一半是松弛态一半是半松弛态的迁移条带位置(左图：AEX上样液)；而此时对应得到的AEX洗脱液中的大型质粒DNA(左图：AEX洗脱液)仍保持超螺旋态的迁移条带。相比较而言，室温下再放置6～8小时的对照组中，经过AEX纯化后的AEX洗脱液呈现半松弛态的迁移条带位置(右图：AEX洗脱液)，同时，洗脱液中大型质粒DNA的浓度也明显降低。
以上结果说明，大型质粒DNA在碱液裂解和酸性中和后的溶液成分下的稳定性非常差，在过滤操作完成后的1天之后，即使是一直存储在2～8℃下，上清液中超螺旋态的大型质粒DNA的浓度和纯度都有明显降低，但经AEX纯化后仍可以得到含超螺旋态的大型质粒DNA的洗脱液。而室温下放置6～8小时，会导致大型质粒DNA的浓度和纯度更加显著的降低，经AEX纯化后的洗脱液中也难以得到呈超螺旋态的大型质粒DNA。
实施例4当天(2～8℃下放置12小时)的大型质粒DNA结合阴离子层析纯化效果
步骤1.按照实施例1的方法制备得到新鲜的大型质粒DNA裂解上清液。新鲜的上清液立即取样进行琼脂凝胶电泳试验。琼脂凝胶电泳试验的运行条件为：在0.8％琼脂糖凝胶，120V上运行20uL裂解液1小时。
琼脂凝胶电泳试验的结果显示如图3所示。图3中，左图显示为裂解液在0.8％琼脂糖凝胶上的电泳条带，其中上方显著的亮白条带为22KB质粒DNA，下方条带为RNA杂质；右图为对应的ladder。图3的结果说明，新鲜的上清液中含有高浓度的超螺旋态的大型质粒DNA。
步骤2.将步骤1得到的新鲜的上清液取样，样品在当天2～8℃下放置12hr后进行AEX阴离子层析纯化。纯化条件和步骤具体为：
质粒裂解物：PRID0302用150mM NaCl调节(加载约35mL)。
·AEX胶囊：Natrix Q Recon Mini(0.2毫升)。
·色谱缓冲液：
a)缓冲液A1：1M乙酸钾+0.15M NaCl，pH 5.0，74mS/cm；
b)缓冲液A2：100mM醋酸钠，pH 5.0；
c)洗脱缓冲液B：100mM乙酸钠，1M NaCl，pH 5.0；
d)清洁缓冲液C：2M NaCl/1M NaOH；
e)预平衡缓冲液D：2M NaCl，100mM Tris，pH 8.0。
·色谱步骤：缓冲液和流速
1)灌注：50MV Buffer A1，10mV/min；
2)平衡：5MV Buffer A1，10mV/min；
3)负载：裂解液为74mS/cm，10MV/min；
4)洗涤：20MV Buffer A2，10mV/min；
5)洗脱：30MV Buffer B，5MV/min；
6)CIP：40MV缓冲液C，10MV/min；
7)预平衡：10MV缓冲区D，10MV/min。
·执行AEX色谱运行并检查洗脱的组分。
·在0.8％琼脂糖凝胶，120V上运行1小时。每个收集的组分：每个5uL/lane。
·使用石英比色皿(A260)分析收集的组分。
AEX色谱结果如图4所示，每个收集的组分所对应AEX洗脱峰的条带信息如图5所示。图4中显示的洗脱峰非常显著。图5中，AEX洗脱液在0.8％琼脂胶上，呈献出高浓度的超螺旋态的迁移条带，说明样品在当天2～8℃下放置12hr内稳定性较好。收集得到的大型质粒DNA的产率达到80％，纯度达90％。同时，纯化后获得的此AEX洗脱液的稳定性非常好，在2～8℃下放置3天后，经琼脂凝胶电泳试验检测显示完全保持超螺旋态的迁移条带(参见图6中左图：AEX洗脱液)。此AEX洗脱液在3个月后经琼脂凝胶电泳试验检测，显示仍有约一半的大型质粒DNA保持超螺旋态的迁移条带，另一半大型质粒DNA的迁移条带虽有变化，仍然接近保持超螺旋态的迁移条带(参见图6中右图：AEX洗脱液2～8℃存放3个月)。
由此可见，新鲜的上清液在当天(12hr内)进行AEX阴离子层析纯化后能够得到高产率、高纯度的大型质粒DNA，且获得的大型质粒DNA在AEX洗脱液中的稳定性很好，能够长久保持超螺旋态，适合于样品的长久保存。这相比于大型质粒DNA在通过常规碱液裂解、酸性中和以及过滤后生成的上清液中的稳定性而言，表现出了显著的进步。
对比例：将步骤1得到的新鲜的上清液取样，样品在经过2～8℃12小时和室温5～6小时后,进行AEX阴离子层析纯化，纯化条件和步骤与前述的步骤2一致。AEX色谱结果如图7所示，收集的AEX洗脱峰的条带信息如图8所示。
对比例的结果显示，AEX洗脱峰的高度、以及上样液和洗脱液在琼脂胶上的纯度和浓度都明显降低；AEX上样液在0.8％琼脂胶上的迁移条带上移，AEX洗脱液的迁移条带虽呈现超螺旋态，但是浓度明显下降。这说明，步骤1得到的含大型质粒DNA的新鲜的上清液应当在短时间内完成AEX阴离子层析纯化，这对于大型质粒DNA的产率、纯度以及超螺旋态的稳定性有至关重要的影响；与2～8℃12小时的放置条件相比，室温下放置时间过长(比如5～6小时或更久)会明显导致大型质粒DNA的浓度下降。使用连续式工艺，来解决20KB以上大型质粒DNA的稳定性低的问题，在工艺上是完全可行的。
实施例5大型质粒DNA的连续式工艺
大型质粒DNA的连续式工艺采用市面上已有的在线缓冲液配制系统与连续式层析系统相结合的方案，利用在线缓冲液配制系统对悬浮的菌体、碱性裂解液、酸中和溶液分别进行调配控制，得到中和后的悬浮混合物，对中和后的悬浮混合物进行过滤，得到新鲜的上清液，再将新鲜的上清液直接通过连续式层析系统进行纯化，收集得到洗脱液。连续式工艺的工艺设备和步骤流程图可参考图9所示。
在线缓冲液配制系统包括至少三个容器，分别用于容纳悬浮的菌体、碱性裂解液和酸性中和溶液。三个容器分别连接三条配液管路，其中，容纳悬浮的菌体的容器与第一配液管路连接，容纳碱性裂解液的容器与第二配液管路连接，容纳酸性中和溶液的容器与第三配液管路连接。
在线缓冲液配制系统还包括至少两个在线混合装置。在线混合装置与各配液管路进行连接。通过在线混合装置将由各配液管路输送来的物料进行混合操作。
第一配液管路、第二配液管路都连接于第一在线混合装置的前端。第一配液管路负责将悬浮的菌体输送至第一在线混合装置，第二配液管路负责将碱性裂解液输送至第一在线混合装置，使悬浮的菌体与碱性裂解液在第一在线混合装置内得到混合，完成碱液裂解操作。
第一在线混合装置的后端通过第四配液管路连接于第二在线混合装置的前端，同时第三配液管路也连接于第二在线混合装置的前端。第四配液管路负责将第一在线混合装置内完成碱液裂解操作的溶液输送至第二在线混合装置，第三配液管路负责将酸性中和溶液输送至第二在线混合装置，使完成碱液裂解操作的溶液与酸性中和溶液在第二在线混合装置内得到混合，完成酸性中和操作。
各配液管路中可以分别设置有至少一个泵。泵负责为其所在的配液管路提供输送物料的驱动力。泵优选采用低剪切力的泵，例如隔膜泵。
在线缓冲液配制系统涉及的各容器、各配液管路、各泵以及各在线混合装置均统一通过计算机中控系统进行在线调节和监控，实现了全自动的的连续式工艺操作。
完成酸性中和操作后的混合物需要及时进行过滤操作。在小规模的试验中，完成酸性中和操作会后的混合物可以通过落地式离心机和孔径为0.2微米过滤器来实现的。用于中试或大规模生产时，一些常用的离心设备例如碟片式或管式离心机则不能适用，因为其剪切力过大。为了消除上述过滤设备的剪切力过大带来不利影响，我们开发出了一种深层过滤的工艺。
本申请涉及的深层过滤的工艺是指将完成酸性中和操作后的混合物直接采用深层过滤器进行过滤，所得到的滤液继续经过孔径0.2～0.5微米过滤器进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液。其中，深层过滤器和孔径0.2～0.5微米过滤器对DNA没有吸附性。
第二在线混合装置的后端通过管路连接深层过滤装置。深层过滤装置负责对从第二在线混合装置输送来的完成酸性中和操作后的混合物进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液。深层过滤装置包括至少一个深层过滤器和一个孔径0.2～0.5微米过滤器，各过滤器以串联方式连接。
深层过滤器的数量为一个或多个，多个深层过滤器可以串联起来使用，即将完成酸性中和操作后的混合物依次经过一个或多个深层过滤器进行过滤，最后再经孔径0.2～0.5微米过滤器进行过滤，以获得含大型质粒DNA的滤液。
一种具体的深层过滤的工艺为：将完成酸性中和操作后的混合物依次通过深层过滤器1、深层过滤器2和0.2微米的过滤器进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液。深层过滤的工艺的具体参数如下：
其中，深层过滤器1的孔径范围为8～60微米，深层过滤器2的孔径范围为0.2～2微米，最后再经过孔径0.2微米过滤器。
需要说明的是，本申请涉及的深层过滤的工艺不局限于表格中所提供的具体参数，任何供应商的相似规格，且滤器介质对DNA没有吸附性的过滤器，都可以起到类似的效果。
深层过滤装置的后端(即孔径0.2～0.5微米过滤器的后端)通过管路连接中转容器。经过深层过滤的工艺所得到的含大型质粒DNA的滤液，可收集于中转容器内。作为一种优化的方式，中转容器具有2～8℃冷藏控温的功能。
中转容器通过输液管路连接连续式层析系统。中转容器内收集的含大型质粒DNA的滤液上样至连续式层析系统，采用阴离子交换层析柱进行纯化，得到含大型质粒DNA的洗脱液。连续式层析系统及层析条件按照设备商推荐操作或本领域的常规实验手册操作即可。利用连续式层析系统切换不同的层析柱，每间隔一段时间(比如1h、2h或3h)将中转容器内收集的含大型质粒DNA的滤液上样至其中一个层析住进行纯化，以尽量缩短中转容器内收集的含大型质粒DNA的滤液的等待时间，将含大型质粒DNA的滤液尽快进行纯化，避免等待时间过长导致大型质粒DNA的浓度下降。
本实施例提供的大型质粒DNA的连续式工艺通过采用在线缓冲液配制系统、深层过滤装置与连续式层析系统相结合的方案，形成完整的连续的管路输送系统，通过在线缓冲液配制系统进行碱液裂解、酸性中和得到混合物，混合物直接输送至深层过滤装置进行过滤，收集滤液直接进入连续式层析系统进行纯化，得到含大型质粒DNA的洗脱液。整个工艺过程连续进行，并且实现了连续式工艺的在线监控和调节功能，还能提高工艺的稳定性，减少超时工作的人力需求。
本实施例提供的大型质粒DNA的连续式工艺从菌体离心收获悬浮、常规碱液裂解、酸性中和、深层过滤、到完成AEX阴离子层析纯化的全部时间，都在几小时到一天内完成，并且解决了滤液中大型质粒DNA稳定性差的缺陷，能够高产率、高纯度的得到大型质粒DNA，且其超螺旋态长久地保持稳定，利于存放。
本实施例提供的大型质粒DNA的连续式工艺可快速应用于20KB以上的大型质粒DNA在小试、中试、到大规模生产时的工艺研发的需求，该方案具有适用性广、研发成本低和研发周期短的优点，对加快生物技术行业中20KB以上的大型质粒DNA的研发和生产会有极大的促进作用。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (19)
1.一种大型质粒DNA的连续化生产的工艺方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：通过在线缓冲液配液系统对含大型质粒DNA的细菌进行碱液裂解、酸性中和，通过深层过滤装置对中和后的悬浮混合物进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液，并保持滤液处于2℃～8℃的温度条件下；所述大型质粒DNA是指大于20KB的质粒DNA；
S2：将所述含大型质粒DNA的滤液在12h内上样到阴离子交换层析柱进行洗脱，通过连续式层析系统收集含大型质粒DNA的洗脱液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1和步骤S2之间连续进行，中间不穿插其他步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，从所述步骤S1得到含大型质粒DNA的滤液到所述步骤S2将含大型质粒DNA的滤液上样到阴离子交换层析柱，所述含大型质粒DNA的滤液的等待时长小于12h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，将所述含大型质粒DNA的滤液在12h内、10h内、8h内、6h内、5h内、4h内、3h内、2h内、1h内、或立即上样到阴离子交换层析柱进行洗脱，收集含大型质粒DNA的洗脱液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2在12h内执行完毕，获得含大型质粒DNA的洗脱液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1和步骤S2在24h内执行完毕。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述线缓冲液配液系统包括至少三个容器和至少两个在线混合装置；所述三个容器分别用于容纳悬浮的菌体、碱性裂解液和酸性中和溶液，所述三个容器分别连接三条配液管路，其中，容纳悬浮的菌体的容器与第一配液管路连接，容纳碱性裂解液的容器与第二配液管路连接，容纳酸性中和溶液的容器与第三配液管路连接；所述第一配液管路、第二配液管路都连接于第一在线混合装置的前端；所述第一在线混合装置的后端通过第四配液管路连接于第二在线混合装置的前端，同时第三配液管路也连接于第二在线混合装置的前端。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一配液管路负责将悬浮的菌体输送至第一在线混合装置，所述第二配液管路负责将碱性裂解液输送至第一在线混合装置，所述第一在线混合装置负责将输送来的悬浮的菌体与碱性裂解液进行混合，完成碱液裂解操作。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第四配液管路负责将第一在线混合装置内完成碱液裂解操作的溶液输送至第二在线混合装置，所述第三配液管路负责将酸性中和溶液输送至第二在线混合装置，所述第二在线混合装置负责将输送来的完成碱液裂解操作的溶液与酸性中和溶液进行混合，完成酸性中和操作。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，各配液管路中分别设置有至少一个泵。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述泵为低剪切力泵。
12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，第二在线混合装置的后端通过管路连接深层过滤装置，将完成酸性中和操作后的混合物直接输送至深层过滤装置；所述深层过滤装置负责对从第二在线混合装置输送来的完成酸性中和操作后的混合物进行过滤，得到含大型质粒DNA的滤液。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述深层过滤装置包括至少一个深层过滤器和一个孔径0.2～0.5微米过滤器，各过滤器以串联方式连接。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，深层过滤器的数目为两个，分别为深层过滤器1、深层过滤器2；深层过滤器1、深层过滤器2和孔径0.2～0.5微米过滤器以串联方式依连接，组成所述深层过滤装置；第二在线混合装置的后端通过管路连接深层过滤器1的入口。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，深层过滤器1的孔径范围为8～60微米，深层过滤器2的孔径范围为0.2～2微米，最后再经过孔径0.2微米过滤器。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述深层过滤装置的后端通过管路连接中转容器；所述中转容器负责收集由深层过滤装置过滤得到的含大型质粒DNA的滤液。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述中转容器具有2～8℃冷藏控温的功能。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述中转容器通过输液管路连接连续式层析系统，所述中转容器内收集的含大型质粒DNA的滤液上样至连续式层析系统，采用阴离子交换层析柱进行纯化，得到含大型质粒DNA的洗脱液。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述中转容器内收集的含大型质粒DNA的滤液每间隔不超过3h即上样至连续式层析系统。
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Non-Patent Citations (3)
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| 多表位HBV DNA疫苗的中试制备及质量研究;郭妍等;《南方医科大学学报》;20090120(第01期);第118-120页 * |
| 郭妍等.多表位HBV DNA疫苗的中试制备及质量研究.《南方医科大学学报》.2009,(第01期), * |
| 重组质粒pVAX1-PENK大规模制备研究;蔡珍珍等;《生物技术通讯》;20131130(第06期);第828-832页 * |
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