CN101310022A - 质粒dna的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

公开从生产过程，包括大规模发酵方案中，来分离临床级质粒DNA的方法，所述方法包括了两个可供选择的均为质粒DNA纯化工艺中的核心单元操作。在此公开的新型上游和下游纯化工艺可降低产品成本并提高工艺稳定性。在此公开的纯化工艺中，任何一种或两种全部都可以与另外的本领域已知的与DNA质粒纯化技术相关的纯化步骤结合使用。

Description

质粒DNA的纯化方法
相关申请的交叉参考
本申请要求提交于2005年1月31号的美国临时专利申请60/648,670的优先权，此处纳入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及分离临床级质粒DNA方法，从生产工艺包括大规模发酵方法，包括两种可选的纯化质粒DNA的核心单元操作。在这里公开的新型上游和下游纯化工艺用于降低产品成本和提高工艺稳定性。本发明中描述的新型上游纯化工艺部分包括了裂解/溶胞产物澄清两个步骤：首先产生含质粒DNA的宿主细胞溶胞产物，然后絮凝宿主细胞碎片进行澄清。作为本发明另一部分描述的，一种新型的下游纯化工艺包括从富含所述DNA的宿主细胞溶胞产物沉淀质粒DNA，并在切向流过滤模式下微孔过滤所述沉淀的DNA。此处公开的两种或两种之一的纯化工艺可以与在质粒DNA纯化技术领域所知的其它纯化步骤结合使用。
发明背景
多聚核苷酸疫苗是一种诱导保护性免疫来抵抗殊定疾病的新型方法，该方法既能产生中和性抗体又能激活更好的细胞介导的免疫反应(Montgomery，D.L.等.，1993，Cell Biol.169：244-247；Ulmer，J.B.等.，1993，Science 259：1745-1749)。将含有编码目的抗原基因以及哺乳动物细胞的有效启动子的质粒DNA送入体内并被转进肌肉细胞。抗原DNA被转录和翻译，其发表出的蛋白被转送至细胞表面用于T细胞呈递。在临床前的疾病模型实验中，许多传染性疾病的DNA疫苗的都表现出了免疫原性和疗效(综述见Gurunathan，S.等.，2000，Ann.Rev.Immunol.18：927-974)。质粒DNA也用于基因治疗，包括将功能基因带入体内，将所述基因导入目标细胞并表达治疗产物，以选择性地调节病情。这样，基因疗法代表着一种预防、治疗或治愈遗传疾病的可选方法。许多基于质粒DNA基因疗法的临床试验已经开始(综述见Mountain，A.，2000，TIBTECH 18：119-128；和Ferber，D.，2001，Science294：1638-1642)。
生产和纯化大量的药用级别质粒DNA是多聚核苷酸疫苗和基因疗法得以可行的关键。作为部分预防和治疗方案，使用多聚核苷酸疫苗或基因疗法来对抗疾病的潜在人群数量是十分庞大的，这将对临床级质粒产生很高的需求量。这样，高产量质粒DNA的生产方法和纯化工艺对全面发展和挖掘多聚核苷酸疫苗和基因疗法的优势是必需的(Shamlou，P.A.，2003，Biotechnol.Appl.Biochem.11：207-218)。虽然前期在小规模质粒DNA纯化的方法学上有很多研究成果，但是将其放大到生产和纯化临床级质粒DNA上则证明是有较多问题的(Prazeres，D.M.F.等人，1999，TIBTECH 17：169-174)。而且，革新大规模生产工艺必须平衡优质和成本问题以跟上市场要求和需求(Shamlou，2003，supra)。本发明公开一种质粒DNA纯化的高度生产性、可调控和重复性工艺，能降低成本，提高生产工艺的稳定性。本工艺展示了一种新的溶解细胞和溶胞产物澄清的程序，包括宿主细胞碎片的聚合物絮凝作用。这种新的溶解和絮凝作用过程可以与一种新型的下游提纯步骤，包括质粒DNA沉淀(用聚乙二醇或醇)和后续的切向流过滤模式下的微孔过滤，进行结合使用。
化学絮凝作用常用于从培养基分离细菌细胞，是一种可替代离心的低成本方法(见例Lee，J.和CV.Viswanathan，1974，Lab.Pract.23：297-298；Gumming，R.H.，等.，1996，Bioseparation 6：17-23)。絮凝作用的机理比较复杂，与很多可变因素有关，比如温度、离子环境、菌体生理年龄、絮凝剂、表面剪切力和要絮凝的物质(McGregor，W.C.和R.K.Finn，1969，Biotechnol.Bioeng.11：127-138)。只有少量研究分析了该机制用于细菌细胞碎片。Persson，I.-L.和B.Lindman(“Flocculationof Cell Debris for Improved Separation by Centrifugation，”Flocculationin Biotechnology and Separation Systems，Ed.Y.A.Attia，Amsterdam：Elsevier，1987，429-439)在实验室和中试工厂研究了使用阳离子多聚电解质、壳聚糖和聚乙烯亚胺来絮凝大肠杆菌细胞碎片。带正电荷的多聚颗粒也用于了大肠杆菌细胞碎片的絮凝(Kim，C.W.，等，“Removal ofCell and Cell Debris by Electrostatic Adsorption of Positively ChargedPolymeric Particles，”Flocculation in Biotechnology and SeparationSystems，Ed.Y.A.Attia，Amsterdam：Elsevier，1987，429-439)，但是，使用多聚絮凝剂澄清溶胞产物的方法来设计可调节工艺的可能性没被到认识到。
从微生物细胞发酵中纯化临床级质粒DNA的最后一步包括去除所有的残渣、宿主细胞来源的杂质和前期上游纯化步骤所引入的污染物，以及浓缩终产物和交换缓冲液。本发明使用常规的聚乙二醇(见例Us，J.T.和R.Schleif，1975，Nucleic Acids Res.2：383-389；Sadhu，C.和L.Gedamu，1988，Biotechniqms 6：20-21；Yeung，M.C.和A.S.Lau，1993，Biotechniques 15：381-382；以及Horn，N.A.等，1995，Hum.Gene Ther.6：565-573)或乙醇(见例Wallace，D.M.，“Precipitation of NucleicAcids，”Methods in Enzymology：Guide to Molecular CloningTechniques，Eds.S.L.Berger和A.R.Kimmel，1987，41-48；Serghini，M.A.等，1989，Nucleic Acids Res.17：3604)沉淀DNA的方法结合使用的切向流过滤模式下的微孔过滤进行最后精加工，完成DNA的纯化。本工艺避免了常规的最后精加工过程中使用超滤法而需要的较高循环次数和较大滤膜面积。
美国专利No.5,561,064，于1996年10月1日授权于Marquet，M.等，公布了一种纯化药用级质粒DNA时聚乙二醇(PEG)差级沉淀策略。重要的是，第一步PEG沉淀在生产澄清溶胞产物之后而在用离子交换色谱筛选大小之前。
美国专利No.5,707,812，于1998年1月13日授权于Horn，N.等，公布了使用PEG作为浓缩试剂增强质粒DNA在色谱基质上的结合力的方法，通过这种方法所述DNA随后在含PEG的盐缓冲液中被洗脱。
发明概述
本发明涉及从微生物细胞中提取药用级质粒DNA，其中所述方法代表纯化质粒DNA生产工艺上的可替代部分，包括大规模发酵方法，能降低生产成本和提高生产过程的稳定性。本发明还涉及两个同样为质粒DNA纯化工艺中的核心单元的操作，包括一种新型的上游纯化步聚(即宿主细胞溶胞产物的澄清及之前的处理)和一种新型的下游纯化步聚(即溶胞产物的后期澄清)。更具体的说，在此公布的上游纯化步骤包括一个裂解细胞/澄清溶胞产物两部分流程，其中首先由含目的超螺旋质粒DNA的宿主细胞产生溶胞产物，然后通过絮凝作用澄清该溶胞产物，以除去宿主细胞碎片。本发明所述的新型下游纯化工艺包括了一种最终浓缩/精加工过程，其中先将由上游纯化和下游纯化步骤所得到的富含超螺旋质粒DNA的细胞溶胞产物用沉淀的方法去除残留杂质，再用切向流过滤模式进行微孔过滤。这些步骤可能与本领域已知的其它纯化步骤结合或进一步结合使用，和/或其中至少省去上述步骤的其中之一，优选与本领域已知的与质粒DNA纯化技术相关的其他方法结合使用。
在本发明的一个实施方案中，其中描述的方法能够从微生物细胞纯化临床级DNA质粒，所述的微生物包括但不仅限于细菌细胞、植物细胞、酵母细胞和杆状病毒，大肠杆菌为优选微生物宿主。此处所述方法纯化的临床级质粒DNA在作为用于人体的疫苗或基因治疗载体极为有用。虽然本发明所述方法特别指出了是从微生物细胞中纯化临床级DNA质粒，但该方法的应用并不仅限于从微生物细胞的纯化。因此，本发明也涉及到用本处公开的一个或多个新步骤从哺乳动物细胞中分离纯化临床级质粒DNA，以及从不同的宿主细胞(如微生物或哺乳动物)中分离和纯化其它的生物分子(比如蛋白质)。
本发明涉及从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的一种方法，所述方法包括：(a)裂解含有超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；和(b)通过絮凝宿主细胞碎片来澄清步骤(a)中所述的溶胞产物。裂解微生物宿主细胞可以在溶菌酶存在下或者在没有溶菌酶存在的情况下进行。在本发明的一个实施方案中宿主细胞碎片用聚乙二醇(PEG)进行絮凝。用于澄清细胞溶胞产物的絮凝剂，包括但不仅限于聚乙二醇，可以作为溶解缓冲液(例如标准STET缓冲液)的一个组成成份包括在内，或者在裂解细胞后再加入溶胞产物中。絮凝的宿主细胞碎片能以如沉降、倾倒或离心的方法，包括但不限于连续离心，从宿主细胞溶胞产物中除去，最后得到澄清的溶胞产物。在去除絮凝的细胞碎片后，澄清后的细胞溶胞产物中的超螺旋质粒DNA用下游纯化工艺可进一步从残留污染物中纯化出来。因此，本发明的一个实施方案涉及使用此处描述的上游纯化工艺生产含超螺旋质粒DNA的澄清的宿主细胞溶胞产物的一种方法。
本发明还涉及从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的一种方法，所述方法包括：(a)裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；(b)调节步骤(a)中得到的宿主细胞溶胞产物至碱性pH，然后再中和；(c)通过絮凝宿主细胞碎片，来澄清步骤(b)所述的pH调节后的细胞溶胞产物。在此描述的调至碱性pH然后再中和的步骤有助于制备宿主细胞溶胞产物来用于絮凝过程；不过，所述的溶胞产物的pH调节既可在加入絮凝剂之前进行，也可以在加入之后进行。在本发明的一个实施方案中，用一定浓度的碱溶液将最初细胞溶胞产物的pH值调至碱性(比如，大概12-13)，使可溶的宿主细胞染色质DNA能够变性。然后将已调至碱性的细胞溶胞产物加入一定浓度的酸溶液中和至接近初始裂解缓冲液的pH值，优选使细胞溶胞产物的pH介于8-9之间。因此，本发明的一个实施方案涉及到一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)在生理缓冲液中裂解含有超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；(b)将步骤(a)的宿主细胞溶胞产物调节至碱性pH值，即向所述的溶胞产物中加入碱，升高其pH值至约12至约13之间；(c)中和步骤(b)中碱化的细胞溶胞产物，使其pH值大约为细胞裂解时的生理缓冲液的pH；(d)通过加入絮凝剂，包括但不仅限于PEG，絮凝宿主细胞碎片，澄清所述的碱化又中和后的溶胞产物。
应用本发明所述的上游裂解和溶胞产物澄清技术后，能进行多种下游的纯化过程，包括但不仅限于：(i)使用阳离子去垢剂，包括但不仅限于CTAB，来从澄清后的溶胞产物中沉淀质粒DNA；(ii)用盐溶液溶解质粒；(iii)用水合硅酸钙吸附残留杂质；(iv)在进行最后临床级质粒制备前，使用聚乙二醇或醇来沉淀纯化的质粒DNA。
本发明还涉及一种从大规模发酵方案中提取临床级质粒DNA的新型下游纯化工艺，即使用最后的浓缩/精加工步骤得到粉状的质粒DNA产品。本发明的下游纯化工艺的作用是，从前期纯化所得到的富含超螺旋质粒DNA的溶胞产物中除去残留杂质。因此，本发明涉及一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)沉淀所述的超螺旋质粒DNA；(b)用切向流过滤模式的微孔过滤浓缩所述的沉淀后的超螺旋质粒DNA。在步骤(a)中沉淀超螺旋质粒DNA可用大家熟知的方法，使用聚乙二醇或醇类包括但不仅限于乙醇、甲醇和异丙醇。步骤(b)中的微孔过滤可直接替代在质粒DNA纯化工艺中最后浓缩/交换缓冲液过程中常用的超滤法，能减小循环率、滤膜面积以及整个批次的体积。
在本发明的一个实施方案中，作为在此公布的新型下游浓缩/精加工纯化工艺的第一步骤，使用PEG将超螺旋质粒DNA从富含它的澄清细胞溶胞产物(即通过上游工艺和前期的下游纯化工艺富集超螺旋质粒DNA的宿主细胞溶胞产物)中沉淀出来。然后将所述的沉淀质粒DNA进行切向流过滤模式下的微孔过滤。因此，本发明的一个实施方案涉及一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)使用PEG沉淀所述的超螺旋质粒DNA；(b)使用切向流过滤模式下的微孔过滤浓缩该沉淀后的超螺旋质粒DNA。本发明提涉的微孔过滤可能是一种分级过滤工艺的一部分。因此，在本发明的一个实施方案中，上述PEG沉淀的超螺旋质粒DNA通过一种分级过滤工艺得以浓缩，该分级过滤工艺包括：第一个过滤步骤，其中使用微孔过滤和后续的透析过滤浓缩沉淀的质粒DNA浆液，并清除残留的RNA和杂质。第二个过滤步骤用乙醇置换DNA沉淀中的聚乙二醇，并进一步浓缩质粒DNA，最后得到一种脱水质粒DNA的湿品，其可干燥后获得细粉状质粒DNA。该第二步过滤可以在一种过滤干燥设备中进行，在搅动细胞的操作下(如，单板Nutsche过滤干燥器)允许加压过滤和真空干燥。因此本发明涉及一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)使用PEG沉淀所述的超螺旋质粒DNA；和(b)用分级过滤工艺，包括切向流过滤模式下的微孔过滤，浓缩所述的沉淀后超螺旋质粒DNA。所述的分级过滤工艺包括：(a)第一个过滤浓缩步骤，包括切向流过滤模式下的微孔过滤；(b)第一个透析过滤步骤，使用含有PEG的透析过滤缓冲液进行透析过滤，该透析过滤缓冲液中含有足够浓度的PEG和任选盐以保持所述的超螺旋质粒DNA的沉淀状态；(c)脱水步骤，加入乙醇对沉淀的超螺旋质粒DNA进行部分脱水；(d)第二次的过滤浓缩步骤；和(e)第二次的透析过滤步骤，用100％(v/v)乙醇进行透析过滤。在其它实施方案中，第二次的过滤和透析过滤，步骤(d)和步骤(e)，是在一个过滤干燥器中，包括但不仅限于单板Nutsche过滤干燥器，以加压和搅动细胞模式进行的。
本发明涉及从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)使用醇类，包括但不仅限于乙醇、甲醇和异丙醇，沉淀超螺旋质粒DNA；(b)使用切向流过滤模式下的微孔过滤来浓缩所述沉淀的质粒DNA。在本发明该部分的一个实施方案中，所述微孔过滤浓缩步骤是一个分级过滤工艺的一部分，包括：(a)第一次过滤浓缩步骤，包括切向流过滤模式下的微孔过滤；(b)使用乙醇溶液进行第一次透析过滤步骤，其中该溶液的乙醇浓度足以保持所述超螺旋质粒DNA的沉淀状态；(c)第二次过滤浓缩步骤；和(d)使用100％(v/v)乙醇进行第二次透析过滤步骤。在另一个实施方案中，第二次过滤和透析过滤，步骤(c)和步骤(d)，是在一个过滤干燥器中，包括但不仅限于单板Nutsche过滤干燥器，以加压和搅动细胞模式进行的。
作为本处可交替使用的术语“临床级质粒DNA”和“药用级质粒DNA”指从宿主细胞中分离制备的质粒DNA，其纯度能够达于用于人体进行任何已知的预防和治疗的要求，包括但不仅限于基因治疗和/或多聚核苷酸疫苗的应用。
这里使用的“非超螺旋质粒DNA”指任何不是超螺旋质粒DNA的DNA，包括任何其它形式的，比如缺刻的、开环的、线性的质粒DNA，以及宿主基因组DNA。
这里使用“NTU”指标准化浊度单位。浊度定义为使用一种光学领域的液面下探头对液体中颗粒的“计数”。溶液浊度能用基于激光的光散射装置进行测定。
这里使用的“PEG”指聚乙二醇。
这里使用的“OD600”是600nm处的光密度值，由一种光散射分光光度计测定的每毫升细胞数。
这里使用的“L.O.D.”指检测极限。
这里使用的“MW”是道尔顿分子量。
这里使用的“LRATM”指除脂试剂TM
这里使用的“CTAB”指溴化十六烷基三甲铵或西曲溴铵。
这里使用的“hcCaSiO3”指水合结晶硅酸钙。
这里使用的“IPA”指异丙醇。
这里使用的“MF”指微孔过滤。
这里使用的“UF”指超滤。
这里使用的“STET缓冲液”指含有约50mM Tris-HCl(pH 7.0-9.0)、约50-100mM EDTA、约8％蔗糖以及约2％
Figure A20068000356400141
-X-100的缓冲液。
附图说明
图1展示了沉降超过两天的大肠杆菌溶胞产物。在瓶1中的溶胞产物是用STET缓冲液(本处定义的)重悬细胞并与溶菌酶(500U/mL)在20℃孵育得到。瓶2中的溶胞产物与瓶1中的相似，只是在用溶菌酶孵育后，先加碱将pH调至pH 12，再加酸中和。瓶3中的溶胞产物用含3％PEG 3000的STET缓冲液重悬细胞并与溶菌酶在20℃孵育得到。瓶4中的溶胞产物与瓶3中相似，只是像瓶2描述那样，先后加入碱和酸进行碱化后再中和。本图显示了PEG作为絮凝剂从碱性溶胞产物中絮凝细胞碎片的潜力。
图2展示了装有不同细胞溶胞产物的50ml离心管，这些溶胞产物的起始OD600都是45，然后在16,000×g下离心了5min。管1中的溶胞产物是用STET缓冲液重悬细胞并与溶菌酶在20℃孵育得到。管2中的溶胞产物与管1中相同，只是与溶菌酶孵育后进行了碱化再中和(如图1中所述)。管3中的溶胞产物是用含3％PEG 3000的STET缓冲液重悬细胞并与溶菌酶在20℃孵育得到。管4中溶胞产物与管3中相同，只是与溶菌酶孵育后进行了碱化再中和。管5中的溶胞产物与管2中的相同，只是在碱化再中和步骤后加入了PEG。管6中的溶胞产物与管2中的相同，只是在碱性pH调节/中和步骤后加入了终浓度为5％的PEG 3000。
图3显示了图2中展示的溶胞产物的浊度测量值。
图4A和图4B显示了PEG分子量和絮凝大肠杆菌细胞碎片的效果。细胞与溶菌酶孵育后，进行碱性pH调节/酸中和。将不同分子量(PEG 400-6000)的PEG贮液分别加入10ml等份试样的溶胞产物中，得到PEG终浓度大概介于1.0％至15.0％之间。所得混合物在室温下沉降大约16小时，然后测定各OD600值(图4A)。图4B显示了只用PEG3000时OD600依赖性与溶液中DNA浓度的相关曲线。
图5显示了对于溶菌酶/pH调节后的溶胞产物中提高的PEG 6000浓度(0-8％w/v)，质粒DNA沉降曲线。
图6A和6B对比了大规模质粒DNA纯化工艺中两种终浓缩/精加工步骤的一般过程流程图。
图7A和7B描述了DNA在不同PEG溶液中的溶解性。图7A显示在PEG 8000溶液中，当PEG浓度大于2％w/v时，DNA的溶解性将大幅下降。但在所研究范围内，溶液温度和DNA浓度则对DNA的溶解性没有影响。图7B显示，在所研究范围内，DNA完全溶于400分子量的PEG中；而随着分子量的增加，沉淀DNA所需PEG的临界质量降低。
图8描述了在PEG 8000中DNA沉淀的动力学。图8显示了5分钟后，初始DNA有大于99％的都发生了沉淀。
图9A和9B显示了质粒DNA在水-乙醇混合物中的溶解性数据。NaCl浓度是基于无乙醇时的浓度。图9A显示了NaCl浓度从1.8到3.4M时对质粒的溶解性几乎没有什么影响。在图9B中，对低浓度的NaCl与几种不同浓度的乙醇一起进行了研究。虚线表示质粒的浓度，如没有沉淀，在每个溶液中都应出现。
图10显示了在不同浓度的乙醇中NaCl的溶解性。
图11显示了在两个IPA浓度不同的IPA-NaCl系统中，“盐析”和“盐溶”的极限。
图12A与12B描述了质粒在含有氯化钠和醋酸钠的25％(A)或67％(B)IPA中的溶解度。
图13显示了质粒DNA从3M NaCl溶液中沉淀(0.22μm的纤维素膜，2.1cm2的过滤面积，20in.Hg真空)死端式过滤数据的Vmax曲线。该过滤数据首先从初始浓度为40％的乙醇中校准，然后再增加乙醇至50％浓度。在t/V对V的关系曲线上，相对直的线性表明了一个几乎不可压缩的滤饼。在50％乙醇中，可以观察到过滤效率显著增高。
图14A显示了沉淀质粒的微孔过滤期间随时间变化收集到的渗透体积。对每个数据组都出示了沉淀悬浊液的初始DNA浓度；初始悬浊液体积为500ml。在整个实验过程中没有降低渗透流出量并在过滤时一直维持压力读数为10psig，悬浊液可以很容易地以15mL/min流速进行过滤。图14B显示了沉淀质粒的80％v/v乙醇悬浊液在进行透析过滤时乙醇和NaCl的浓度。
图15A-C显示了在切向流过滤模式(TFF)条件下的微孔过滤时进行三种连续乙醇沉淀的尝试，在过滤期间使用Masterflex size 14(5/16″)管输送和加入乙醇。图15A显示了使用100kD PES膜和40％v/v乙醇沉淀进行连续沉淀/微孔过滤研究的结果。输送至滤筒的流速大约为30ml/min。大约收集到200ml渗透液时，流量需下降至初始值的20％。图15B显示了使用0.1微米PVDF膜和40％v/v乙醇沉淀进行连续沉淀/微孔过滤研究的结果。输送流速也大约为30ml/min，但在容器和滤器之间含1分钟延迟时间。图15C显示了一个与图15B相似实验的结果(0.1微米PVDF膜，1分钟延迟时间)，但使用了50％的乙醇而不是40％的乙醇来进行质粒DNA的沉淀。在用40％v/v乙醇尝试时，渗透液流量的下降程度轻微减弱(图15B)，但压力的升高使过滤实验难以连续进行超过30分钟。
图16A和16B显示了使用TFF模式的微孔过滤所进行的两种连续乙醇沉淀的尝试，在过滤期间使用HPLC管道输送和加入乙醇。图16A显示了使用40％浓度乙醇进行的连续沉淀/微孔过滤并没有延迟时间。
图17A和17B显示了使用实施例8所述的质粒DNA纯化工艺的两个纯化流程中的过程产量(A)和杂质含量(B)。每个质粒的纯化都开始于由17.5-18.6L的发酵液处理出来的75-80L OD600＝70的大肠杆菌溶胞产物。图17A比较了在纯化艺中的不同阶段超螺旋质粒DNA质量数(“scDNA(g)”)和超螺旋DNA百分比(“％scDNA”)：细胞溶胞产物(“Lys”)；通过絮凝宿主细胞碎片后的澄清溶胞产物(“CL”)；由硅酸钙第一次吸附和过滤后的DNA浆(“LRA1F”)；由硅酸钙第二次吸附和过滤后的DNA浆(“LRA2F”)；重悬在PEG沉淀和后续微孔过滤步骤中成为干粉的DNA(“FRB”)。图17B在图17A描述的纯化工艺的同一阶段比较了内毒素的量(log EU/mL)，蛋白含量(％)和RNA含量(％)。
图18显示了用BCA法测定在PEG 6000絮凝的细胞溶胞产物经最终CTAB沉淀后的蛋白含量，这里的CTAB是由加入含2％(w/v)CTAB的40mM NaCl溶液的方式引入的。
发明详述
本发明涉及一种纯化临床级质粒DNA的可调节的方法学，该方法可降低生产成本并提高生产工艺的稳定性。通常认为质粒DNA纯化的主要单元操作包括细胞溶解、过滤(微孔过滤/超滤)以及色谱分离。然而，在大规模分离药用级质粒DNA时，所述的被确认为是主要单元操作的方法一定要适应生产目标，即高产量和最低单位成本下的高质量。比如，原材料的花费，如树脂和缓冲液，在应用于大规模质粒DNA纯化工艺时，已发现多步层析造成了高昂单位成本以及低下的生产量。在最近公开的一份美国专利申请No.09/875,379(美国公开号US2002/0012990)中，确定了一种替代的质粒DNA纯化工艺，该工艺去除了相对昂贵色谱分离步骤，而确立了克级临床级(能至少应用于人类疫苗和基因治疗)质粒DNA的分离方法。本发明还详述了建立经济的、可控的临床级质粒DNA纯化方法的目标。为此，本发明确定了两种可选的质粒DNA纯化工艺的核心操作，即一种澄清细胞溶胞产物的生产和超螺旋质粒DNA的终浓缩和精加工。
因此，本发明涉及同为质粒DNA纯化工艺中的两种核心单元操作，包括一种新型的上游纯化程序(即宿主细胞溶胞产物的澄清及其前处理)和一种新型的下游纯化程序(即溶胞产物的后期纯化)。公开的上游纯化步骤包括两部分，细胞溶解和溶胞产物的澄清，借此首先从宿主细胞，包括但不仅限于微生物细胞，产生含超螺旋质粒DNA的细胞溶胞产物，然后利用絮凝作用去除宿主细胞碎片，澄清所述的溶胞产物。目的质粒DNA仍然保留于溶胞产物中，能通过下游工艺进行进一步提纯。本发明公开的下游纯化步骤包含一种最终的浓缩/精加工步骤，包括首先使质粒DNA从前期纯化得到的富含该DNA的溶液中沉淀出来的工艺，然后将这个富集后的产物使用切向流过滤模式下的微孔过滤(″MF″)以除去剩余的杂质。纯化后的质粒DNA可以干燥成粉状质粒DNA产品。作为在此进一步的描述和示例，本发明的上游和下游纯化步骤与另外的纯化工艺结合，包括但决不仅限于在美国专利申请No.09/875,379(如上)公开的纯化方法。这样，本发明范围包括了使用在此描述的纯化步骤的两者之一或者两者全部来建立一种整体可调控的用以分离临床级质粒DNA的纯化工艺。技术人员可以对于许多特殊的质粒DNA和按质量要求自由的调节所需的纯化策略。在此列举了使用本发明所述的新型纯化步骤的几个不同实施例，但本公开决不仅限于这几个实施例。
本发明的一个实施方案涉及一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)裂解含有超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；(b)使用絮凝宿主细胞碎片方法澄清步骤(a)所述的溶胞产物。在本发明的另一个实施方案中使用聚乙二醇(“PEG”)絮凝宿主细胞碎片。因此，本发明的一个实施方案涉及一种从大规模微生物发酵中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)裂解含有超螺旋质粒DNA微生物宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；(b)使用PEG絮凝宿主细胞碎片以澄清步骤(a)所述的溶胞产物。
在裂解之前，将宿主细胞从培养基中收集起来并用灭菌的生理性缓冲液(如，标准的STET缓冲液)重悬以适当稀释。本领域的技术人员都会认识到优化的裂解条件部分依赖于在裂解缓冲液中微生物宿主细胞的浓度。裂解缓冲液中宿主细胞的优化裂解浓度(OD600)得容易得以确定，如下文实施例1中以大肠杆菌为例说明。优化裂解条件也能用宿主细胞的干细胞重(“DCW”)稀释法加以测量。使用本发明所述的新型裂解细胞/澄清溶胞产物的工艺来裂解大肠杆菌宿主细胞时，其初始OD600值优选为70(见实施例1)。同样的，此处发明者确定在大概DCW为23g/L的条件下裂解含目的超螺旋质粒DNA的大肠杆菌也会产生很强的裂解效果。所述宿主细胞的裂解后产生的溶液中包括，但不仅限于，将被纯化的染色体外超螺旋质粒DNA、可溶的宿主细胞染色体或基因组DNA以及宿主细胞碎片，如不溶的宿主细胞染色体或基因组DNA、细胞膜、细胞器和变性固体。在本发明的该实施方案中，细胞裂解步骤可在有溶菌酶也可以在无溶菌酶的条件下进行。在细菌类细胞中，溶菌酶能够水解肽聚糖层在N-乙酰胞壁酸(NAM)与N-乙酰葡糖胺(NAG)之间β键，从而降解细菌的肽聚糖细胞壁。这样就暴露出了细胞的内膜，使之极易受到其它的破坏，如去污剂。因此，加溶菌酶的方法是一种温和的裂解细菌血细胞的方法，减少了大质粒受到机械损伤的可能性。
正如本处的实施例所述，不难肯定加溶菌酶对该工艺的最终产出的效果。使用微生物，特别是细菌，作为宿主细胞扩增目的超螺旋质粒DNA时，本领域的技术人员可能凭经验判断溶菌酶的加入是否更有助于所述质粒的纯化，比如最大限度地增加纯化质粒DNA的产量。在本发明的一个实施方案中，使用含溶菌酶的标准STET缓冲液(比如：50mM Tris-HCl，100mM EDTA，2％v/v
Figure A20068000356400181
-X-100，8％w/v蔗糖，pH 8.2)来裂解含目的超螺旋质粒DNA的宿主微生物细胞，如实施例中所例举的大肠杆菌细胞。对于本领域的技术人员来说，将这里公开的重悬液配方修改为其它任何碱性缓冲体系并适合在本发明中使用是显而易见的。因此，任何没有实质效果或改变本工艺产量的碱性缓冲液配方应该属于此处描述的工艺范畴内。但是，本发明优选的裂解步骤应在生理性缓冲液中进行，包括能有效去除二价阳离子如Mg2+和Ca2+的螯合剂(如EDTA)，一种非离子去污剂(如基于
Figure A20068000356400191
的去污剂)以及蔗糖，特别是打算进行下游基于CTAB的沉淀时。EDTA通过螯合能活化DNA酶的二价金属离子来抑制其的活性。EDTA也非常有利于基于CTAB的下游沉淀步骤，因为二价金属离子能阻止质粒与CTAB的络合。另外，CTAB沉淀质粒DNA的浓度范围依赖于TritonR和DNA的浓度(见美国专利申请09/875,379；上文)。缓冲液的pH范围可以进行调节以得到最好的结果，这主要是由具体微生物种类所决定；但优选的pH范围介于约7.0-9.0，最优化的范围是在约8.0-8.5。
在本发明的另一个实施方案中，完全的细胞裂解可能包括让宿主细胞通过一个热交换装置，该法在PCT国际申请Nos.PCT/US95/09749(公开号：WO96/02658)和PCT/US96/07083(公开号：WO96/36706)中公开，在此作为参考文献，其中所述细胞可使用也可不使用溶菌酶处理，优选方法是在热处理之前使用溶菌酶处理。我们知道高压匀浆器可产生强烈的流体动力而并不适宜于用在本发明宿主细胞的裂解步骤，因为它可能造成超螺旋质粒DNA的损害和/或将基因组DNA剪切成与设计的质粒相当的大小。不过，已证明能保护DNA不受剪切损害的机械细胞裂解技术还是能够使用，如在存在某种紧缩试剂的条件下进行的裂解，这种紧缩试剂是一些小的多聚阳离子，能够凝聚核酸(如美国专利申请号10/158,753，2002年12月26日以US20020197637公开中所述)。
本发明的另一个方面包括将如上述步骤(a)产生的宿主细胞溶胞产物调至碱性pH值，然后再中和至接近所述溶胞产物的初始pH，即最初裂解细胞所用缓冲液的pH值。因此，在本发明的一个实施方案中，从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物纯化超螺旋质粒DNA包括方法：(a)裂解含有超螺旋质粒DNA宿主微生物细胞，形成宿主细胞溶胞产物；(b)将从步骤(a)得到的宿主细胞溶胞产物调节至碱性pH，然后再中和；(c)絮凝宿主细胞碎片澄清所述pH调节后的溶胞产物。在另一个实施方案中，使用PEG絮凝宿主细胞碎片以澄清所述pH调节后的溶胞产物。宿主细胞溶胞产物的碱化和后续的中和可以在加入溶胞产物絮凝剂之前进行。也可替换加絮凝剂至宿主细胞溶胞产物中的方法，如絮凝剂可以作为初始裂解缓冲液的一种成份，或在细胞裂解之后碱化和中和步骤之前加入。在本发明的一个实施方案中，起始细胞溶胞产物的pH值接近于约pH 7.0到约pH 9.0之间，优选在约pH 8.0到约pH 8.5之间，这主要是由悬浮和裂解细胞所用的缓冲液产生的效果(如一种标准的STET缓冲液，由50mM Tris-HCl，100mMEDTA，2％v/v
Figure A20068000356400201
-X-100，8％w/v蔗糖组成，pH 8.2)。碱性pH值的调节包括调节溶胞产物的pH值至能使可溶的宿主细胞染色体DNA完全变性的值，比如接近在约pH12到约pH13之间。长时间暴露于这种高pH环境中，超螺旋质粒DNA也会发生变性，但是因为质粒DNA较小，当环境回复中性时，它又很容易复性。重要的是，溶胞产物的pH不能升到高于pH 13，因为这样质粒DNA会迅速发生变性，从而增加它对剪切损害的敏感性。可向溶胞产物中加入高浓度的碱性溶液，包括但不仅限于5N的氢氧化钠(NaOH)，来提高它的pH值；然后保持碱化的溶胞产物处于高pH一段时间以确保染色体DNA的变性(比如大概60分钟)。然后溶胞产物的pH用加入高浓度酸溶液，包括但不仅限于高浓度的醋酸溶液(比如大概1.7至2.5当量浓度的醋酸)，来进行中和，以降低溶胞产物的pH值至接近初始裂解宿主细胞的缓冲液的pH值。
不受任何特殊理论限制，这里的pH调节可能与Birnboim和DoIy(1979，Nucleic Acid Res.7：1513-1523)描述经典的碱裂解技术相混淆。都知道Birnboim和DoIy的碱裂解方法能通过变性作用同时去除宿主细胞基因组DNA和蛋白质并选择性的沉淀变性的物质。传统的碱裂解过程使用的细胞重悬液包括Tris缓冲液加葡萄糖或果糖，溶解细胞时加入强碱性溶液和十二烷基磺酸钠(SDS)去污剂。强碱选择性地彻底变性高分子量的染色体DNA。当溶胞产物用pH 5.5的3M醋酸钾(含醋酸)中和时，染色体DNA就被沉淀出来，而质粒DNA则保留在上清液中。但重要的是，用这种传统的碱裂解法来大规模纯化质粒DNA时有较大的缺陷，包括但不仅限于大的处理体积、需要多个处理容器、报道的在高pH值下DNA的剪切敏感性以及高用量的醋酸钠(见Chamsart，S.等.，2001，Biotechnol.Bioeng.75：387-392)。如以上解释，本发明的这个实施方案中，碱性pH调节对变性在初始微生物细胞溶胞产物中的染色体或者基因组DNA也是重要的。在此描述的研究高pH(如pH 12)对超螺旋质粒DNA影响的实验(见实施例7，下文)显示超螺旋质粒DNA暴露在pH12环境中并用叶轮高速搅拌超过1小时也没有任何损伤。而这里所述碱化和后续的中和步骤能够去除溶液中的一部分宿主基因组DNA，清除并不彻底，还需要后续的絮凝程序。因此，进行本发明的碱化与后续的中和步骤是为了给宿主细胞溶胞产物的絮凝程序做准备，而不是本质上的裂解细胞或澄清溶胞产物。因此，没有任何特定理论的支持，本发明中的pH调节证明是对后续的细胞碎片絮凝作用的重要的准备步骤(下文有进一步描述；见实施例1)。
同样，本发明的一个实施方案涉及到一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)裂解含有超螺旋质粒DNA的宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；(b)通过絮凝宿主细胞碎片，澄清步骤(a)中所述的溶胞产物。在宿主细胞溶胞产物产生并选择性地进行上述碱化和随后的中和步骤之后，使用絮凝作用去除宿主细胞溶胞产物中的宿主细胞碎片(如不溶的宿主细胞基因组DNA、细胞膜和变性固体)，产生澄清后的溶胞产物，其中成分包括但不仅限于超螺旋质粒DNA和可溶的染色体或基因组DNA。在本发明的一个实施方案中，对宿主细胞碎片起絮凝作用的絮凝剂是初始裂解缓冲液的一个成分。可选择的是，所述的絮凝剂也可在宿主细胞裂解之后再加入宿主细胞溶胞产物中。这里公开的絮凝溶胞产物的方法可以大大地增强所述微生物细胞溶胞产物的可分离性。一种低切去污剂的沉淀步骤(如CTAB)能在絮凝作用之后进行，进一步降低可溶蛋白的含量。细胞碎片在絮凝作用后可以从溶液中沉降出来(比如沉降/倾倒)，或很容易通过离心(如15,000X g，15分钟)除去，包括但不仅限于连续离心。除了离心，还可以使用精离过滤(如，使用纤维素的或基于硅藻土的厚度滤器)从溶胞产物中除去残留固体。除去絮凝的细胞碎片后，留在溶胞产物上清的超螺旋质粒DNA可以通过下游纯化工艺，包括本领域已知工艺(如，美国专利申请No.09/875,379，上文)和/或作为本发明一部分公开的新型下游步骤，进一步从其它的污染物中纯化出来。
宿主细胞碎片的絮凝作用表示细胞颗粒的聚集，即形成细胞碎片凝聚体。絮凝剂或絮凝作用试剂是一种用于澄清颗粒悬浮液的物质，将该物质加入悬浮液后，可诱导形成凝聚体。被絮凝物质，指不溶的颗粒物质，通常可以在重力作用下沉降。不过，大量的不溶性絮状物(即由絮凝作用形成的聚集物)，包括此处描述的细胞碎片絮状物，能用低速离心或单纯过滤法容易地除去。多种不同因素可以影响絮凝作用的程度，包括但不仅限于被絮凝物质的表面电荷、理化性质；絮凝剂的吸收率和浓度；颗粒物的碰撞率和浓度；以及悬浮液的搅拌情况。絮凝作用的发生被认为由于所加絮凝剂的电荷(“电荷中和”)或者它的分子量(“桥接絮凝”)作用的结果(见Gumming，R.H.等.，1996，Bioseparation 6：17-23)。电荷中和的絮凝作用通过带相反电荷的絮凝试剂与被絮凝物的结合，引起整个表面电荷呈中性或局部呈相反电荷，促进有效的碰撞作用并加速絮状物的生长。电荷中和机制絮凝作用的效果与絮凝剂的分子量或它聚合程度无关。对应地，细胞物质通过桥接絮凝发生的聚集可以由带电的或非离子性的絮凝剂造成，这种聚集更多依赖于絮凝剂的分子量和/或聚合程度。桥接絮凝通常通过加入一种高分子量的聚合物到胶颗的分散相中进行。絮凝剂用它的环状或尾状构象吸附不止一个的颗粒到其表面，使它们结合在一起。
有很多不同的絮凝剂能够用于凝集此处所述的宿主细胞碎片，包括但不仅限于合成聚合物(如聚乙二醇)或天然聚合物(如壳聚糖)、带电的(如阴离子的或阳离子)或不带电的。因此，在本发明的一个实施方案中，用一种聚合物的絮凝剂用于宿主细胞溶胞产物中引发细胞碎片产生如上所述的聚集。在当前工艺中，选择影响细胞碎片凝聚的絮凝剂时，兼顾考虑拟被絮凝并后续废弃的物质和试图保留的物质的性质是非常重要的。在质粒DNA的纯化策略中，需要考虑的一个非常重要的问题是，DNA是带负电的大分子，使用最为熟知的用于絮凝细菌细胞碎片的带正电的絮凝剂是不理想的。带正电荷的絮凝剂会将细胞碎片和拟纯化的质粒DNA同时聚集。所以，应优选一种带负电和最好不带电的聚合物来进行此处所述的絮凝步骤。最终，显示出对于含质粒DNA的溶胞产物来说，聚乙二醇(PEG)是一种无毒、低成本而高效率的絮凝剂。PEG，是一种非离子聚合物，由400到超过15,000个重复单元(-O-CH2-CH2-)组成(如，市面上能购得分子量高达400,000的PEG聚合物)。PEG与大多数有机溶剂相容并具有很好的水溶性。同时，PEG具有已证实的安全性，作为多种非处方药和软膏的成份。如此处的实施例所示，在微生物溶胞产物溶液中，PEG诱导了宿主细胞碎片的絮凝作用；但是PEG诱导絮凝作用的确切机制还不清楚。很可能PEG通过传统的桥接絮凝机制发挥作用，细胞碎片直接与PEG聚合物反应而被吸附至其表面。也可能PEG能从溶液中清除溶胞产物的一种尚未确定的成分，然后这个被清除出来的物质起了絮凝宿主细胞碎片的作用。因此，在这里PEG被确定为微生物宿主细胞碎片的絮凝剂，此处的“絮凝剂”被定义为通过直接或间接机制诱导宿主细胞碎片发生絮凝作用的一种物质。
Lis和Schleif(1975；如上文)展示足够浓度的PEG能够沉淀DNA；因此，如果选择PEG作为此处描述方法的絮凝剂，那么非常重要的是在进行本发明絮凝步骤期间，应使用最低限度减小质粒DNA沉淀可能性的PEG浓度。如上所述，因为PEG是一种非离子聚合体，其絮凝作用的程度可能依靠分子量和聚合体的聚合程度。本领域的技术人员可实践确定PEG最适的浓度和分子量以达到宿主细胞碎片的最佳絮凝效果，应考虑各种不同的因素，比如拟纯化的质粒DNA的大小和用于扩增质粒DNA的特定宿主细胞。如在此使用的，用于絮凝特定宿主细胞溶胞产物的PEG聚合体的最适浓度和分子量表示该条件对所述溶胞产物能产生最有效的絮凝作用，即最大量地絮凝细胞碎片而伴随最小量地质粒DNA沉淀。比如，使用高分子量而低浓度的PEG和使用低分子量而高浓度的PEG可实现同等的絮凝效果。因此，应该理解在PEG聚合体的浓度和分子量之间有一种紧密的相互关系，这样，此处所公开的用于絮凝目的的任何特定PEG浓度和PEG分子量都应该看成是一种指导而不应从整体上限制发明。
在实施例1中，初始筛选研究的目的是整体描述在沉降细菌细胞碎片时PEG絮凝作用的效果。确定了PEG是一种大肠杆菌细胞碎片的高效絮凝剂，特别在碱/酸处理大肠杆菌胞溶产物之后(比如，调节pH从大概pH8.5至大概pH12.5，然后再调回大概pH8.5)。从含有一种目的质粒DNA的大肠杆菌发酵液来的细菌细胞溶胞产物由四种不同的方法(如图1所示)得到：(1)用STET缓冲液(上文所述)重悬细胞并在20℃与溶菌酶孵育；(2)用STET缓冲液重悬细胞并在20℃与溶菌酶孵育，然后将溶胞产物用碱/酸处理；和(4)用含3％PEG3000的STET缓冲液重悬细胞并在20℃与溶菌酶孵育，然后将溶胞产物用碱/酸处理。从图1的结果可以看出，在仅有重力作用下沉降超过2天后，经过pH调节和PEG处理的溶胞产物(溶胞产物#4)具有高效的细胞碎片絮凝效果。对在图1所示的溶胞产物地进行了进一步实验，用以描述所观察到的PEG诱导的絮凝作用(见图2)。将各组溶胞产物孵育15分钟然后离心。浊度测定反映了PEG作为絮凝剂絮凝碱/酸处理后的溶胞产物的效果，使用5％PEG 3000絮凝后，溶液浊度显示为16NTU(溶胞产物#6)，而对照组溶胞产物(溶胞产物#2)则为730NTU。这些结果表明连续离心能作为从含质粒DNA的悬浊液中分离被絮凝物质的澄清方案，在没有使用精细过滤的情况下，制备的澄清溶胞产物的浊度可低于20NTU。实施例1进一步表明PEG浓度和分子量在絮凝细菌细胞碎片时的效果，描述了本领域技术人员在设计获得最佳宿主细胞碎片絮凝效果的方案时怎样确定合适的PEG浓度和分子量。PEG浓度和分子量在絮凝含质粒DNA的宿主细菌细胞碎片时的效果可以通过一种基于细胞碎片沉淀情况的快速筛选法进行研究。含有质粒DNA的大肠杆菌首先在有溶菌酶的条件下进行裂解，然后使用上文所述的碱/酸处理。将不同的PEG贮液(PEG 400-6000)分别与10ml溶胞产物混合，使PEG终浓度介于大概1％-15％(w/v)之间。将混合物在室温下静置大概16小时后，测定沉降固体的体积和上清的浊度(OD600)(见图4A)。使用PEG3000作为絮凝剂(图4B)的DNA浓度(使用AEX分析法确定)和上清浊度被进一步的研究。这些如果表明，例如，存在一个PEG 3000浓度范围，在这个范围之内能够絮凝细胞碎片但DNA不会沉淀。使用PEG6000时，大约在0％至10％(w/v)的浓度范围内，一条相似的质粒DNA的沉淀曲线也被制作了出来(见图5)。
因此，在本发明的一个实施方案中，一种从大规模微生物发酵中纯化超螺旋质粒DNA的方法包括：(a)裂解含超螺旋质粒DNA的宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；(b)使用一种聚合物，包括但不仅限于聚乙二醇(PEG)，絮凝宿主细胞碎片，以澄清步骤(a)所述的溶胞产物。步骤(a)中，在一种生理性缓冲液(例如上文所述的一种标准的STET缓冲液)中裂解宿主细胞，可以使用也可以不用溶菌酶，优选使用溶菌酶。也可选择让收集的宿主细胞通过一种热交换装置进行裂解，该方法在PCT国际申请Nos.PCT/US95/09749(如上文)和PCT/US96/07083(如上文)中公开。在步骤(b)中使用一种聚合体，包括但不仅限于PEG来产生对宿主细胞碎片絮凝作用，使绝大多数的细胞碎片凝集成絮状物，而该絮状物仅含有极小量的沉淀的质粒DNA。在本发明的一个实施方案中，使用加入PEG的方法来絮凝宿主细胞碎片，PEG优选分子量大于约1000，更优选的分子量介于约1450至约15000，最优选的是PEG6000，使用的终浓度应介于约2％至约5％(w/v)，更优选介于约3％至约4％(w/v)，最优选约3.7％(w/v)。
在本发明的另一个实施方案中，在絮凝宿主细胞碎片前，特别是选择PEG作为絮凝剂来进行所述的溶胞产物的澄清程序时，对宿主细胞溶胞产物进行这里所述的碱化和后续的中和处理。因此，所述实施例包括了一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)裂解含有超螺旋质粒DNA的宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；(b)将由步骤(a)所得到的宿主细胞溶胞产物调至碱性pH值，然后再中和；使用一种聚合体，包括但不仅限于聚乙二醇来絮凝宿主细胞碎片，以澄清步骤(b)所述的pH调节后的溶胞产物。在本发明的一个实施方案中，初始细胞溶胞产物的pH值接近约pH 7至约pH 9之间，优选约pH 8.0至pH 8.5之间，该pH值由初始悬浮和裂解细胞的缓冲液造成(如标准STET缓冲液，由50mM Tris-HCl，100mM EDTA，2％v/v
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-X-100，8％w/v蔗糖组成，pH 8.2)。调节细胞溶胞产物的pH到一个能使可溶的染色体DNA完全变性的pH值，如接近约pH 12至约pH 13。如上所述，pH可以通过加入一种浓碱溶液进行调高，包括但不仅限于5N NaOH；然后，将调节pH后的细胞溶胞产物在这个高pH值下保持一段时间，以保证染色体DNA变性(如60分钟)。但重要的是pH不能升得过高以至于使质粒DNA迅速变性而对剪切损害的敏感性升高(如大于pH 13)。然后通过加入一种高浓度酸溶液，包括但不仅限于浓的醋酸溶液(如介于约1.7到2.5的当量浓度)，来中和细胞溶胞产物，降低其pH至接近宿主细胞初始裂解缓冲液的pH值。这样本发明的一个实施方案涉及一种从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)在一种生理性缓冲液中裂解含有超螺旋质粒DNA的宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；(b)通过升高从步骤(a)得到的宿主细胞溶胞产物的pH值至约pH 12到约pH 13之间来碱化该溶胞产物；(c)中和步骤(b)所得到的碱化细胞溶胞产物，使之pH降到接近初始裂解宿主细胞的生理缓冲液的pH值，优选约pH7至约pH 9之间，更优选约pH 8.0至约pH 8.5之间；(d)使用一种多聚体，包括但不仅限于聚乙二醇(PEG)来絮凝宿主细胞碎片以澄清所述的pH调节并中和后的宿主细胞溶胞产物。用于细胞裂解的生理性缓冲液(如这里所述的标准STET缓冲液)可以含也可以不含溶菌酶。碱化和后续的中和步骤可选择在加PEG至细胞溶胞产物之后进行。例如，PEG可以加入初始裂解缓冲液中，其浓度可以用实验确定以达到有效地絮凝宿主细胞碎片，然后对该含有PEG的细胞溶胞产物进行本处描述的碱化/中和步骤以获得对所述细胞碎片的高效絮凝作用(见实施例1)。本发明进一步涉及到从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的一种方法，所述方法包括：(a)在生理性缓冲液中裂解含有超螺旋质粒DNA的宿主细胞，以形成宿主细胞溶胞产物；(b)通过升高步骤(a)得到的宿主细胞溶胞产物的pH值至约pH 12到约pH 13之间来碱化该溶胞产物；(c)中和从步骤(b)的碱化细胞溶胞产物，使之pH接近步骤(a)的宿主细胞溶胞产物的pH值；(d)通过加入PEG 6000到步骤(c)的细胞溶胞产物中絮凝宿主细胞碎片，以澄清该溶胞产物；(e)离心除去步骤(d)所述的被絮凝的宿主细胞碎片，得到含超螺旋质粒DNA的上清液。在本专利本部分的一个实施方案中，步骤(a)中的生理性缓冲液是一种含有溶菌酶的标准STET缓冲液，其pH在大概7到9之间，优选pH在大概8到8.5之间。在另一个实施方案中，一种浓的PEG 6000溶液加入到了所述的溶胞产物中并使终浓度达到3.7％(w/v)。在本专利本部分的再一个实施方案中，在步骤(d)的碱化、中和后的宿主细胞溶胞产物进行连续离心时注入PEG絮凝剂，获得被絮凝的细胞碎片团，而质粒DNA则保留在上清液中。
在本发明的一个实施方案中，含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞在溶菌酶存在或不存在情况下，优选存在下，于生理缓冲液中培养。调节至碱性pH值，随后进行中和步骤(如上所述)。这说明进一步制备通过絮凝细胞碎片(如不溶基因组或染色体宿主细胞DNA，细胞膜或修饰体)澄清作数微生物溶胞产物的新的裂解步骤，它在上清液中留下超螺旋质粒DNA。该溶胞过程以两倍于U.S专利No.6,197,553中描述的浓度进行，后者授权给Lee和Sagar，包括溶菌酶裂解后快速加热和冷却，公开了大规模纯化质粒DNA的溶胞过程的浓度。因此本发明新的溶胞澄清方法能大大降低反应体积。此外，此处描述的新的溶胞方法比早先公开的溶胞技术更简单。例如，与U.S专利No.6,197,553中加热溶胞过程要求的两个大容器相比，它的进行只在一个容器中，大大节约了资本，而且只要求混合和添加组分，而不是复杂的线上热交换。此外，本发明新的溶胞和澄清过程制造了轻易除去细胞碎片的输送环节，包括但不限于沉降絮凝细胞碎片，倒出含质粒DNA的上清液，离心。可以使用能在形成过程中持续除去含质粒DNA上清液的批次离心或持续离心。本发明新的溶胞澄清(通过絮凝宿主细胞碎片)技术的后面是下游纯化过程，包括但不限于(i)从澄清的溶胞产物中沉淀质粒DNA，使用阳离子去垢剂，优选CTAB；(ii)用盐溶液再溶解质粒；和，(iii)用水合硅酸钙吸附残留杂质。优选的下游步骤保留用PEG或醇类诱导沉淀的浓缩和精加工，然后是微孔过滤分离(见下文)。因此，本发明另一个实施方案依赖除此处新公开的两步溶胞澄清过程外的纯化步骤。本发明一部分的结合方法步骤包括，例如：(i)在溶菌酶存在或缺少下溶胞，优选溶菌酶存在；(ii)通过絮凝细胞碎片澄清溶胞产物，包括但不限于PEG诱导的絮凝；(iii)用去垢剂单独或分级沉淀质粒DNA，如CTAB；(iv)盐溶液选择性溶解质粒；(v)hcCaSiO3单独或分级吸附除去残留杂质；和，(vi)PEG或醇类(如乙醇)诱导沉淀纯化的质粒DNA，生成稳定批量产品，制备浓缩溶液。
在本发明的一个实施方案中描述的方法用于从微生物细胞中纯化临床级质粒DNA，这些微生物细胞包括但不仅限于细菌细胞、植物细胞、酵母和杆状病毒，其中大肠杆菌是优选的微生物宿主。对于本领域的技术人员来说，能很容易发现除了大肠杆菌发酵以外的适合用于本发明的微生物发酵。另外，本发明的方法不限于仅仅从微生物细胞中纯化临床级质粒DNA，只要能获得适当的细胞密度，本方法还包括从其它的细胞类型包括哺乳动物细胞中纯化所述的质粒DNA。因此，无论是从哺乳动物培养系统还是从微生物发酵中纯化扩增的临床级质粒DNA都应考虑为本发明的一部分。改变和优化本发明的特殊部分从而调节适应不同宿主细胞类型的特异性在所属领域技术人员的权限内。比如，依靠对宿主细胞的选择，就可能不需要将含有扩增质粒DNA初始细胞溶胞产物进行碱化和后续的中和作为溶胞产物絮凝的准备步骤，仅使用溶菌酶孵育和/或结合热裂解可能就足够有效地让细胞溶胞产物适合于絮凝作用了。本领域技术人员很容易更改此处详细公开的收集、裂解细胞和澄清胞溶产物的工艺，以适应用于从细菌细胞到哺乳动物细胞中纯化质粒DNA。如所述的技术人员可看到加入溶菌酶对裂解细菌细胞很有效，但对哺乳动物细胞的裂解则没有必要。反而此处近述的碱化过程则很可能完全降解哺乳动物细胞。同样，替换溶菌酶为酵母裂解酶(如lytocase)才可能利于从酵母细胞中纯化质粒DNA，虽然酵母裂解酶可能不需要用在此所述的碱化过程。这样，本领域的技术人员利用在此的公开和详细的实施例能容易地改变作为本发明部分所描述的方法，并将它应用于扩增质粒DNA的任何宿主细胞种类。因此，虽然本申请写作集中在从大规模“微生物发酵”中纯化质粒DNA，但本发明并不局限于“微生物发酵”这个术语。所以，在本说明书的所有地方，“微生物发酵”这个术语都能替换为任何形式的宿主细胞繁殖或扩增过程。
这里公开的方法中所分离和纯化的质粒可以是任何染色体外的DNA分子，例如，一个细胞的高拷贝数或低拷贝数，任何大小。这样，对本领域的技术人员来说，显而易见任何能在宿主细胞，优选微生物细胞，中扩增的质粒都能用本发明的方法进行纯化。由这里描述的方法纯化的临床级质粒DNA对作为疫苗或基因治疗载体在人体内用药是极为有用的。
如上文的详细描述，本发明新的细胞裂解/溶胞产物澄清(通过絮凝微生物细胞碎片)的工艺打算用于从大规模微生物发酵中纯化临床级质粒DNA，以应用于像多核酸疫苗或基因治疗载体等领域。本发明另外涉及一种产生含超螺旋质粒DNA的澄清溶胞产物的方法，包括了这里所述的新的细胞裂解/溶胞产物澄清的工艺。重要的是，该新型细胞裂解/溶胞产物澄清技术可以延伸到从微生物宿主纯化任何重组生物分子，包括但不仅限于蛋白质、单克隆抗体、融合蛋白、基因组DNA、RNA、脂类和多糖。因此，该细胞裂解/溶胞产物澄清工艺，包括(i)生产宿主细胞溶胞产物，(ii)一个可选的碱化以及后续的中和步骤和(iii)通过絮凝宿主细胞碎片澄清所述的细胞溶胞产物，可以延伸到使用例如大肠杆菌，或其它的细菌宿主，其它的微生物宿主(如酵母)或哺乳动物细胞来生产任何的重组生物分子。调节对特殊的细胞类型或纯化特殊的生物分子产品的适用性都属于技术人员更改本发明的裂解细胞/溶胞产物澄清(通过絮凝作用)的工艺的范围。例如，当为纯化非质粒DNA的生物分子设计一种涉及本发明公开的经济有效的裂解细胞/溶胞产物澄清工艺时，需要考虑在进行所述的碱化/中和步骤时样品处于高pH环境中的时间以及最高的pH稳定性。只要拟纯化的生物分子耐受短时间的高pH值并在低浓度的聚乙二醇中不沉淀，此处所述的包括碱化的上游纯化步骤可能成为非常吸引人的纯化步骤。另外，在那些将DNA作为污染物的工艺(如蛋白纯化工艺)中，PEG的浓度可能提高至在絮凝细胞碎片同时沉淀DNA。
本发明中的大规模微生物发酵可以在任何适合于所选微生物细胞生长的液体基质中培养。再次说明，本发明能容易地更改应用于从大规模哺乳动物细胞培养中纯化质粒DNA，其中任何适合于哺乳动物细胞生长的培养基都能使用。已经公开的方法能适合于小的发酵或培养体积，而本发明特别有用的方面就是可调节适用为大规模细胞发酵或培养。这里使用的术语“大规模”被认为是总细胞发酵体积大于5升或从发酵中收集的细胞体积大于5升。本发明的大规模发酵工艺可适合于临床级生产，即表示，但不限于，大概300-2000升的发酵。作为本发明一部分，对于所述的上游纯化工艺，含有目的超螺旋质粒DNA的宿主细胞首先从培养基中收集起来成为细胞糊或浆。收集步骤的目的是为了浓缩并洗涤细胞以用于纯化。任何常规的从液体培养基中收集细胞方法都是适合的，包括但不仅限于离心或微孔过滤。如，收集步骤可以由一个过滤过程构成，包括(i)用正交流向过滤法通过500kD截留分子量的A/G Tech膜以浓缩细胞；(ii)使用生理盐水透析过滤浓缩的细胞。在这样过滤工艺中，临界参数包括可透性膜压、入口压力、正交流动率、浓缩因子和流量。另外，细胞也可以利于连续离心法收集。对于详细描述细菌细胞的收集程序，见下文实施例部分9。
本发明还涉及一种新的从大规模发酵方案中分离临床级质粒DNA的下游纯化工艺，即一种终浓缩/精加工步骤而最终得到粉状的质粒DNA产品。作为在此使用的涉及质粒DNA纯化的方案，一种下游纯化工艺表示该工艺是在初始宿主细胞溶胞产物得到澄清之后才进行的，而宿主细胞溶胞产物的澄清是上游纯化工艺的结果(如，作为本发明的一部分所描述的上游纯化工艺的絮凝步骤之后)。在进行所述的上游纯化工艺后，目的质粒DNA保留于澄清的溶胞产物中。本发明的终浓缩/精加工步骤表示用以除去细胞溶胞产物中残留杂质一种下游纯化技术，该细胞溶胞产物作为上游工艺和前下工艺的处理产物富含超螺旋质粒DNA。所述的残留杂质可以包括宿主细胞基因组DNA、前期纯化工艺后残留的细胞蛋白质或者前期纯化步骤中引入的成分(如，用于选择性沉淀质粒DNA的试剂)。显然，所述的作为本发明一部分的新型下游纯化步骤可以与多种组合的前期步骤合用，以从残留杂质中纯化超螺旋质粒DNA，同时也浓缩了所述的DNA并允许重悬成为一个更可行的缓冲体积。因此，如在此描述和例证的，本发明的新型下游纯化步骤需与另外的纯化工艺结合，包括但决不仅限于在美国专利申请No.09/875,379(如上文)中所公开的纯化方法以及作为本发明一部分所公开的新型上游纯化工艺。当设计一种用于临床级质粒DNA回收的整体可调节的纯化工艺时，包含了在此所述的新型下纯化步骤，一种终浓缩/精加工的纯化技术，都属于本发明范围内。对于更改纯化策略以适宜对特别大量和有质量要求的质粒DNA的纯化由技术人员自由决定。
因此，本发明的一个实施方案包括了一种涉及从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的下游浓缩/精加工步骤，包括：(a)沉淀所述的超螺旋质粒DNA；(b)使用切向流过滤模式(TFF)下的微孔过滤(MF)浓缩所述的沉淀的超螺旋质粒DNA。作为质粒DNA纯化方案的最终精加工步骤的一部分，对沉淀使用MF来浓缩质粒DNA而不是用超滤(UF)，是得益于多个原因。首先，当增加超滤过程以满足工厂生产量的纯化时，溶解态的质粒DNA易受到剪切损害。另外，在微孔过滤条件下溶液的粘度下降，使得物质在高浓度下更易处理并允许降低滤膜面积。这也能大大降低所需透析过滤缓冲液的体积。在以上步骤(a)中需沉淀的超螺旋质粒DNA已经在前期的上游和下游工艺中得以富集在细胞溶胞产物中，这样使得本发明的浓缩/精加工纯化技术成为整个质粒纯化方案中的最后程序之一。例如，在本发明的一个实施方案中，从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA应用的一种工艺包括但不限于以下步骤：(i)细胞裂解，可以用也可以不用溶菌酶，优选使用溶菌酶；(ii)溶胞产物澄清，包括但不限于如此处所述的使用一种多聚体(如PEG)来絮凝细胞碎片；(iii)使用去污剂如阳离子去污剂(例如CTAB)一次性或分级沉淀质粒DNA；(iv)用一种盐溶液选择性地溶解质粒DNA；(v)用一次或分级的hcCaSiO4吸附除去残留的杂质；(vi)通过沉淀和对沉淀后的质粒DNA进行切向流过滤模式下的微孔过滤以浓缩质粒DNA。在这个列表中，本发明的终浓缩/精加工步骤指的是单元操作(vi)。以上列出的另外的纯化工艺对技术人员来说是熟知的或者是在本申请和/或美国专利申请No.09/875,379(如上文)中举例详细描述的，在此作为参考文献。
在进行本发明的最后下游浓缩/精加工的纯化步骤之前，超螺旋质粒DNA已经被富集于宿主细胞溶胞产物中，这由前期的上游和下游纯化步骤完成。比如，本发明所述的终浓缩/精加工的纯化步骤能被整合于美国专利申请No.09/875,379(如上文)所例举的多程序质粒DNA纯化方案中，得到大量的临床级质粒DNA干粉。例如，在澄清微生物宿主细胞溶胞产物之后(如通过一种上游纯化工艺，包括但不限于本发明一部分所述新型上游纯化工艺)，可以使用阳离子去污剂(如十六烷基三甲铵溴化物或氯化物，如CTAB)来从所述的澄清溶胞产物中沉淀质粒DNA。当优选CTAB用于选择性沉淀质粒DNA时，其它的单烷基三盐也可以使用，包括但不仅限于十四烷基三甲铵溴化物或氯化物(TTA)、烷基三甲基铵氯化物、烷基芳香基三甲基铵氯化物、十二烷基三甲铵溴化物或氯化物、十二烷基二甲基-2-苯氧乙基铵溴化物、氯化或溴化癸铵盐、十二烷胺或其氯化物盐以及十六烷基二甲基乙基铵溴化物或氯化物。另外，可选季铵化合物用于选择性沉淀质粒DNA，比如单盐(例子包括作为BTC的烷基二甲基苯基铵氯化物和氯化苄乙铵)，二烷基二甲基铵盐(商品化产品包括作为DB的溴化度灭芬，双十二烷基二甲基铵卤化物以及辛基十二烷基二甲基铵氯化物或溴化物)，杂环铵盐(商品化产品包括鲸蜡基吡啶卤化物，(CPC或其溴化物盐，以及十六烷基吡啶溴化物或氯化物)1-[3-氯烯丙基]-3，5，7-三氮杂-1-偶氮基金刚烷的顺式异构体，烷基异喹啉溴化物和烷基二甲基萘甲基铵氯化物(BTC 1110))。多取代季铵盐(可买到的商品化产品包括，但不仅限于，烷基二甲基苯基铵糖和烷基二甲基苯基铵环已基氨基磺酸盐)、双季铵盐(产品实施例包括1，10-双(2-甲基-4-喹啉铵氯化物)-癸烷，1，6-双[1-甲基-3-(2，2，6-三甲基环己基)-丙基二甲基铵氯化物]己烷或曲比氯铵，以及Buckman Brochures的称为CDQ的bis-quat)和多聚季铵盐(包括聚离子如聚[氧乙烯基(二亚甲基)乙烯基(二亚甲基)乙烯基二氯化物]，聚[N-3-(二甲基铵)丙基]N-[3-乙炔-氧-乙烯(二甲基铵)丙基]脲氯化物和α-4-[1-三(2-羟乙基)铵氯化物]。
阳离子去污剂，包括但不仅限于CTAB，能用于从絮凝后的和/或澄清后的宿主细胞溶胞产物中一步或分级沉淀质粒DNA，其实施例在美国专利申请No.09/875,379(如上文)中公开。一种分级沉淀工艺包括低切和高切沉淀步骤。低切沉淀步骤能用于从细胞溶胞产物中沉淀细胞碎片和非超螺旋质粒DNA，剩下目的超螺旋质粒DNA于上清之中。在本发明的一个实施方案中，所述的细胞溶胞产物可能已被絮凝但还没有清除被絮凝物质或可能已经被澄清(即絮凝和溶胞产物澄清后，如离心除去被絮凝物质)。在这种低切沉淀后接着可进行高切沉淀步骤，这时目的超螺旋质粒DNA沉淀出来并与可溶性杂质如蛋白质、RNA和内毒素分离。如美国专利申请No.09/875,379(如上文)中详细所述，一种分级加入阳离子去污剂CTAB的方法包括：加入2％(w/v)CTAB溶液至STET缓冲体系的澄清溶胞产物中，在大约0.25％至0.35％(w/v)CTAB浓度范围内产生第一批CTAB诱导沉淀，在大约0.40％至0.60％之间产生第二批CTAB诱导沉淀，所述范围最适合使用标准的STET裂解缓冲液(如大约50mM Tris-HCl，pH约7.0-9.0，约50-100mM EDTA，约8％蔗糖和约2％
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-X-100)。对于技术人员可更改沉淀范围以适合不同缓冲体系的特性。这样在本发明的一个实施方案中，低切去污剂步骤用于进一步从絮凝后含DNA质粒的细胞溶胞产物中去除残留蛋白质和内毒素(见下文例1)。更具体地说，将含2％(w/v)CTAB的40mM NaCl溶液加入细胞溶胞产物中至CTAB终浓度为大约0.15％，整个过程需进行一小时以防止热过滤。如果这个低切去污剂沉淀步骤在溶胞产物絮凝后而澄清前(即在除去絮凝的细胞碎片之前)进行，能单用离心方法或与精加工过滤步骤一起将所述的溶胞产物进行后续的澄清。在本发明的另一个实施方案中，一个单独的高切去污剂沉淀步骤可用于作为整个下游质粒DNA纯化工艺的第一步(即在溶胞产物澄清之后)。这样，在一个实施方案中，加入CTAB至由本发明的新型上游纯化工艺制得的絮凝后和/或澄清后的溶胞产物中，使其终浓度介于约0.40％至0.60％之间，这里所述的范围最适合使用上文所述的标准STET裂解缓冲液。再次说明，对于技术人员可更改沉淀范围以适合不同缓冲体系的特性。这样，无论在去除宿主细胞碎片絮状物(如单独或与精加工过滤结合使用沉降/倾倒或离心方法)之前或之后，阳离子去污剂(如CTAB)可以以2％(w/v)溶液的形式加入细胞溶胞产物至某终浓度以至于沉淀残留的蛋白质和内毒素(低切步骤)和/或沉淀超螺旋质粒DNA(高切步骤)，其中两个去污剂沉淀步骤能进一步从杂质中分离质粒DNA。一个单一或分级的基于阳离子去污剂的步骤与过滤步骤联用产生滤饼状沉淀(含超螺旋质粒DNA)以用于后续的盐溶解(如美国专利申请No.09/875,379中所述)。回收滤饼(含超螺旋质粒DNA)的盐溶解在一种具有最佳离子强度和组成的缓冲溶液中进行。盐浓度由测定超螺旋质粒DNA在不同盐浓度溶液中的浓度或间接测定溶液粘度来确定。
可以用来帮助产生富含质粒DNA溶胞产物，并通过本发明部分描述的新的浓缩/精加工步骤从中纯化超螺旋质粒DNA的另一种现有下游纯化技术是用单独或分级方式将残留杂质吸附到水合结晶硅酸钙(hcCaSiO3)，如合成水合硅酸钙LRATM(Advanced MineralsCorporation，Lompoc，CA 93438)。如美国专利申请号09/875,379(上文)详细描述，向微生物宿主溶胞产物加入hcCaSiO3导致对超螺旋质粒DNA中残留杂质的吸附。水合硅酸钙结合多种杂质，包括但不仅限于去垢剂(如CTAB，TritonR)、内毒素、基因组DNA。质粒降解物、蛋白质和RNA。需要加入的hcCaSiO3的精确量的控制通过(i)存在的杂质量；(ii)缓冲液条件(如盐浓度)；(iii)溶液中总DNA量；(iv)溶液体积；和(v)可以是其他可变因素包括温度和纯化方法中使用的盐的种类。因此明显的在一个特殊的纯化过程中加入的hcCaSiO3量可以变化。预计加入的hcCaSiO3量的范围高达200克hcCaSiO3/克总DNA，依赖于如上所述的条件以及依赖该特殊过程获得的hcCaSiO3分量的潜在差异。实施例8部分给出了范围在约8-200克hcCaSiO3/克总DNA的指导。在典型的质粒DNA纯化过程中，hcCaSiO3加入的优选范围为约125-200克hcCaSiO3/克总DNA，更优选为约30-70克hcCaSiO3/克总DNA。发明人发现典型质粒纯化过程需要约30-70gLRAII/g总DNA。但是再次，hcCaSiO3吸附的条件可以相对于上述条件上调或下调，因此潜在地需要hcCaSiO3加入范围的上限端值更高，到200克hcCaSiO3/克总DNA。例如，更高浓度的NaCl增加了LRATM对DNA和其他杂质的能力。因此，在某些例子中考虑更高的盐浓度是有用的，可以降低所需hcCaSiO3的量。希望有用的盐浓度范围，以NaCl为例，高达5M NaCl。如上所示，单独或分级方式中产生hcCaSiO3对杂质的吸附。如此处实施例8所述，分级LRA吸附方法导致更强烈的再溶解，其中第一次溶解步骤与去垢剂诱导的沉淀质粒DNA的盐溶解结合。然后第二阶段使用硅酸钙来(a)重悬浮中最小化硅酸钙的量，和(b)用作最初的精加工步骤来减少残留溶胞产物、开环质粒和线性质粒DNA。
随着超螺旋质粒DNA中富含的溶胞产物的产生，导致多种现有上流和下游纯化技术，通常进行一些浓缩和最后缓冲液交换，表示所有过程的最终产物纯化步骤。最终的浓缩/精加工步骤保证大体上所有的杂质从含质粒DNA的溶液终去除，并且降所述质粒DNA以所需的产品浓度浓缩到生理上可接受的缓冲液中。本发明涉及公开一种新的最终浓缩/精加工步骤，包括结合使用的切向流过滤模式下的微孔过滤，使用带DNA沉淀剂(如聚乙二醇、醇类、PEI、多胺、阳离子去垢剂、群集(crowding)聚合物、三联试剂(triplex agent)和其他有机试剂)的已知方法沉淀质粒DNA。此处描述的新的最终浓缩/精加工(polishing)步骤的终极目的是质粒DNA纯化为粉末形式。然而，当把所述粉末产品重悬于所需液体中时也可以得到液体形式。该部分本发明解决了常常折磨大规模质粒DNA纯化制法中提高规模的问题。使用诸如PEG或醇类结合微滤浓缩沉淀质粒DNA可以直接代替质粒DNA纯化过程最终缓冲液交换/浓缩步骤中通常使用的最终超滤步骤。超滤常常需要高速再循环率和提供最低限度污染物清除的大量细胞膜面积。在先申请US专利申请No.09/875,379(上文)公开的基于醇类批次沉淀的批处理方法避免了这些限制，彻底降低了所需的膜面积和再循环率，生产出的粉末DNA能最小化大量贮存的要求。然而，醇类批次沉淀需要高比例溶剂和过量溶剂废液处理，不实用于大规模溶剂沉淀。本发明基于微滤的方法大大降低了另一种液体大量微滤途径所需的膜面积；当于醇类沉淀结合使用时，持续的溶剂复原系统避免了醇类沉淀产物批处理类型过滤中常常出现的困难。
因此，本发明涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)沉淀所述超螺旋质粒DNA；和(b)切向流过滤模式下微孔过滤浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA。在本发明的一个实施方案中，从包含聚乙二醇(PEG)和醇类(包括但不限于乙醇、甲醇和异丙醇)的组里选择沉淀剂在步骤(a)沉淀所述超螺旋质粒DNA。步骤(a)中可以用来沉淀超螺旋质粒DNA的其他DNA沉淀剂包括，但不限于，PEI、多胺、阳离子去垢剂、群集(crowding)聚合物、三联试剂(triplex agent)和其他有机试剂。
因此，本发明涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)用聚乙二醇沉淀所述超螺旋质粒DNA；和(b)切向流过滤模式下微孔过滤浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA。PEG沉淀质粒DNA快速而温和，对DNA几乎没有损害(Humphreys，G.O等.，1975，Biochim.Biophys.Acta.383：457-463)。此处如前所述，PEG沉淀质粒DNA大大依赖DNA溶液中聚合物的浓度(见Humphreys等人，1975，上文)。将PEG加入到清除过的细胞质提取物直到终浓度为10％，显示了能沉淀所述提取物包含的所有质粒DNA，只在溶液中留下RNA和绝大部分蛋白质(Pulleyblank，D.等，1983，MoUc.Biol.Rep.9：191-195)。Lis和Schlief(1975，上文)证明可用PEG分离不同分子量的DNA分子。确定了高分子量DNA优选在低PEG浓度中沉淀后，他们基于用不同PEG浓度沉淀所述分子开发了对质粒DNA分子按大小进行分级分离的方法。PEG促进DNA分子从延长卷曲状态向紧密球形状态压缩(Minagawa，K等人，1994，Biopolymers 34：555-558)，其中所述DNA分子经历了一级相(first-orderphase)转移(Yoshikawa，K.等人，1996，J.Am.Chem.Soc.118：929-930)。在低浓度的PEG中，DNA分子处于延长卷曲态，而在高浓度时，它们收缩为小球形态。不受任何特殊理论的局限，PEG被认为通过体积排斥沉淀DNA，即是说当PEG加入到含质粒的溶液中，它与水分子而不是DNA相互反应。DNA不同PEG反应是因为它的负极表面电荷。随着越来越多的PEG加入，这种排斥效应迫使越来越多的DNA分子聚在一起成为小口袋直到，最终，局部DNA浓度超过了溶解性限制。如此处实施例所示，完全沉淀所需的PEG浓度主要是盐浓度、PEG分子量、产物杂质和质粒大小所起的作用。
如上所示，PEG诱导的质粒DNA沉淀机制紧紧依赖含质粒DNA溶液中PEG沉淀剂的浓度和分子量。如以下实施例部分所述，检验了分子量范围400-10000Da的PEG沉淀溶液中质粒DNA的能力(图7B)。所述研究证明DNA在10％(w/v)的PEG400中完全溶解；但是随着PEG分子量的增加，沉淀DNA的关键PEG量降低。因此，此处例举的纯化方法使用PEG 6000或PEG 8000作为本发明该部分的沉淀剂，本领域技术人员能够理解实际上任何分子量的PEG都能有效沉淀质粒DNA，特别是PEG MW范围为约3000-20000。然而，作为此处描述的最终浓缩/精加工技术的一部分，当选择一个特殊分子量的PEG来沉淀超螺旋质粒DNA，PEG浓度必须调节补充到适合所述PEG分子量。这种确定在本领域技术人员的权限之内，特别是按照本申请中的教导。例如，此处说明为了从后-LRA滤液中完全沉淀质粒DNA，确定PEG 8000的合适浓度(实施例3部分)。在不同的温度和总DNA浓度下进行检验，所述DNA浓度在0.3-1.0mg/mL之间变化，因为这是在大规模纯化过程中可能遇到的。当PEG浓度大于2％(w/v)时，会发现PEG 8000溶液的DNA溶解性陡然下降(见图7A)。然而在研究范围内溶液温度或DNA浓度对DNA溶解性不起作用。尽管图7A的结果显示了检验范围内的DNA被约4％的PEG 8000完全沉淀，实施例3部分描述的其余的研究选择了8％浓度的PEG 8000，给予了2X安全因子。可替代地，实施例8例举地纯化过程使用10％的PEG 6000溶液来沉淀质粒DNA。图5显示的浓度范围说明质粒DNA在至少8％的PEG 6000溶液中能完全沉淀。因此，在本发明的一个实施方案中，将浓缩的PEG溶液(如50％w/v)加入富含超螺旋质粒DNA的溶胞产物中(例如为在先纯化过程的结果，包括但不限于CTAB诱导选择沉淀质粒DNA和硅酸钙吸附杂质)，使终浓度为10％(w/v)，这作为本发明新的下游浓缩/精加工方法的第一步。估计用PEG培养含质粒DNA的溶胞产物所用的时间也很重要，从而保证DNA沉淀完全。可以研究PEG沉淀动力学从而保证加入PEG后的维持时间对于DNA完全沉淀是足够的。以下实施例部分(实施例3)公开的研究为与PEG培养约五分钟后沉淀了99％以上的DNA，说明此处例举的纯化过程使用的例如两小时的维持时间远远足够了。
如以下实施例部分所详细描述，U.S.专利申请No.09/875,379(上文)公开的纯化过程使用膜超滤/浓缩步骤作为从富含质粒DNA的E.coli溶胞产物(例如，后-硅酸钙滤液，如后-LRA滤液)中纯化质粒DNA的最终精加工过程的一部分。随后是10X透析过滤，交换缓冲液到PBS缓冲液(见图6A)。尽管最终精加工步骤满意于约100L或更小的体积，更大制造规模的纯化过程显示了抽油泵泵径和流动速率开始达到技术局限。因此为了避免规模扩大出现的问题，本发明涉及用PEG沉淀步骤，随后是包括在切向流过滤模式下微孔过滤的DNA浓缩过程(比较图6A和6B)，代替在质粒DNA纯化制法常规使用的最终精加工技术(例如第一次超滤，浓缩后透析过滤，交换缓冲液步骤)。切向流过滤模式下的微孔过滤能够代表分级过滤方法的组成部分，其中所述微孔过滤(和随后的透析过滤)是所述方法的第一步，帮助清除DNA沉淀溶液中的残留RNA和杂质。第二步过滤(和随后的透析过滤)进一步浓缩DNA，用乙醇代替PEG，给DNA脱水，使得最终的湿产物能在全真空下干燥获得精制的粉末形式。尽管与现有公开方法的超滤/透析过滤技术相比，最终浓缩/精加工技术需要更多的步骤，此处公开的PEG沉淀方法对于大规模的制造体积来说可以轻易变化达到，无需损害产品质量或要求使用极大的油泵和流动速率。重要地，这种新方法包括进一步降低杂质的纯化步骤，而现有方法仅仅用来浓缩和交换缓冲液。此外，DNA产物干燥后无需无菌过滤因为在上述第二次过滤/透析过滤步骤中加入了乙醇，只要所述步骤是无菌进行的。重要地，粉末产物也能重悬于液体制剂中。因此，此处描述的新操作单元的优点是进一步降低残留RNA水平，可能有2log或更多，去除过度的流速和大油泵，降低循环时间，生产粉末产物来降低需要的贮存空间和可能提供更稳定的产品。
一旦如上所述用PEG沉淀质粒DNA，通过同时浓缩PEG沉淀的质粒DNA浆体的微孔过滤步骤从溶液中除去杂质，其中所述微孔过滤步骤发生在切向流过滤模式下。因此，这一微孔过滤过程在渗余物中浓缩沉淀的质粒DNA，而杂质随着渗透流失。膜过滤是纯化制法中广泛使用的分离技术。根据膜类型，可以分为微孔过滤或超滤。微孔过滤表示不计尺寸，压力驱使的膜方法，使用的典型膜孔径约为0.1-10.0微米。有两种主要的膜过滤方法：(1)单通道，死端或直接流体过滤(“DFF”)，和(2)横向流动或切向流过滤(“TFF”)。当使用DFF时发现应从沉淀质粒DNA浆体中除去的杂质常常与沉淀质粒DNA一起在膜表面阻塞。TFF通过再次循环质粒沉淀溶液，允许溶液正切流向膜表面(术语交叉流动的同义)，解决阻塞问题。流体的流过作用使得凝胶层形式和表面污垢最小化；因此，TFF通常比DFF更快更有效。所有的切向流技术涉及两个主要变量，分别是跨膜压力(即推动杂质通过滤孔的力)和横向流速(即通过膜的溶胞产物流速)。从输送的样品中泵出流体经过过滤器的膜表面(横向流)然后作为渗余物回到样品。夹子或阀门产生的用于渗余物的反压制造了跨膜压力，驱使小于膜孔径的杂质通过过滤器到滤液(或渗透物)部分。横向流流过停留在膜表面的大分子，将它们作为渗余物带回样品。因此有效利用TFF的关键在于调节跨膜压力和横向流速，使得最大量的样品能过滤并且不会堵塞孔道。
以下实施例部分表示微孔过滤时TFF的应用，用于沉淀后浓缩沉淀质粒DNA(即降低工作体积)，洗去任何残留的RNA和溶液中剩下的非产物可溶性物质。在公开的特别实施例中，如U.S.专利申请No.09/875,379(上文)定义的后-LRA滤液是含质粒的溶液，含3M NaCl，10mg/mL的纯化DNA和一些残留RNA。使用PEG 8000MW沉淀质粒DNA，加入的溶液浓度为33％(w/v)，反应15分钟，直到终浓度为约8％(w/v)。沉淀2小时然后使用0.45微米的中空纤维膜切向流过滤沉淀。膜承载180g DNA/m2膜面积；再循环速率为9L/m2/min；流量控制在2.5L/m2/min。收集渗透物直到达到20X浓度。本发明的一个实施方案中，如此处所述在TFF下使用微孔过滤浓缩PEG沉淀的DNA后，随即对PEG溶液透析过滤沉淀，其中所述透析过滤缓冲液包括PEG和盐，其浓度足够保证质粒DNA在渗透沉淀中保持沉淀。例如，如果透析过滤缓冲液包括与之前沉淀步骤使用的大约相同百分比的PEG(如，上述例子和实施例3部分进一步描述的8％w/v的PEG8000)和约1.2M NaCl，质粒DNA将能保持沉淀。实验显示优选盐浓度为约100-600mM NaCl来维持DNA在50％(v/v)的乙醇溶液中沉淀。因此为了以下描述的第二次过滤/透析过滤使得操作接近600mMNaCl的上限，优选第一次透析过滤中出现的盐浓度约为1.2M。尽管可以使用更高的NaCl浓度值，但可能在随后的乙醇加入/脱水步骤中引起大量残留盐的沉淀(下面进一步描述)。可替代地，可以用具有较低NaCl浓度(如100mM)的缓冲液透析过滤沉淀DNA；然而在这些条件下，应该增加所述缓冲液的PEG浓度来指明是低盐。如此处实施例所示，如果最初使用溶液终浓度约8％的PEG 8000沉淀质粒DNA，则在上述TFF微孔过滤后优选含1.2M NaCl的约8％(w/v)的PEG 8000溶液透析过滤沉淀DNA浆体。既然PEG通过体积排斥沉淀DNA，而不像乙醇沉淀通过脱水，则PEG沉淀质粒形成柔软的凝胶状沉淀物，可通过混合分离成小片。
本发明的最终浓缩/精加工步骤的第二次过滤/透析过滤方法，其中首先用PEG沉淀质粒DNA，包括：(a)加入乙醇部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA；(b)通过过滤浓缩步骤(a)脱水的质粒DNA沉淀物；和(c)用100％乙醇透析过滤沉淀的质粒DNA。PEG沉淀浓缩(通过之前的MF/透析过滤步骤)的质粒脱水可通过将乙醇溶液(如100％或200度)加入到透析过滤沉淀物中得到最终乙醇浓度，使得沉淀特征从体积排斥变为脱水机制。结果沉淀质粒DNA的物理性质也由凝胶状物质变为更硬、压缩更少的沉淀物。得到的沉淀物包裹入多孔结构导致第二次过滤步骤(以上步骤(b))良好的流量和高效承载的能力。根据本发明，用乙醇部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA发生在用含100％(v/v)乙醇的乙醇溶液培养沉淀DNA时。这样，可使用不同的乙醇浓度达到上述步骤(a)的部分脱水；然而，优选最终乙醇浓度的范围为约30-80％(v’/v)。低于30％(v/v)的浓度有把DNA再溶解回溶液中的风险；而高于80％(v/v)的浓度开始一同沉淀盐和质粒DNA。本发明的一个实施方案中，PEG沉淀、浓缩(通过上述MF/透析过滤步骤)的质粒通过加入100％(200度)的乙醇到终浓度为50％(v/v)进行脱水。对质粒DNA沉淀物脱水后，所述沉淀DNA浆体进一步浓缩(如，到约30g/L)，通过过滤，随后用100％乙醇透析过滤，从而准备真空干燥。此处提供的例子中，脱水质粒DNA浆体的浓缩通过允许加压过滤和真空干燥的搅动细胞操作，通常认为是单板Nutsche过滤干燥器，在过滤干燥器中进行所述第二次过滤。所述体系的搅动细胞操作用搅动叶轮在过滤器表面生成醇沉淀DNA流速，而不是通过所述溶液经过管道的再循环。使用过滤干燥器来例证此处公开的第二次过滤/透析过滤方法适合25um的不锈钢网眼过滤器。因此，新的下游浓缩/精加工方法的第二次过滤步骤优选使用细胞搅动模式下的单板Nutsche过滤干燥器，过滤器孔径在约＜0.1μm至100μm之间，优选孔径为25μm。孔径尺寸的重要性仅仅在于捕获过滤器上的质粒DNA沉淀物同时使滤液和任何相伴的杂质通过过滤器。在以下实施例中，浓缩的DNA沉淀物用100％(200度)醇类透析过滤，流速控制在3.2L/m2/min，在相同的过滤干燥单元中。过滤后，粉末在真空中干燥约24小时，25-37℃，形成精制产品粉末。可替代地，粉末状DNA产物可重悬在特别的制剂缓冲液中。进行第二次过滤/透析过滤过程来从溶液中除去任何残留的PEG，进一步脱水产物和除去尽可能多的盐。
因此，本发明涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)用聚乙二醇沉淀所述超螺旋质粒DNA；和(b)用切向流过滤模式下微孔过滤的分级过滤方法浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA。这种分级过滤方法包括：(a)切向流过滤模式下进行微孔过滤的第一次过滤浓缩步骤；(b)用含PEG的透析过滤缓冲液进行第一次透析过滤，其中所述透析过滤缓冲液包含足够浓度的PEG，任意盐，从而使超螺旋质粒DNA保持沉淀状态；(c)脱水步骤，其中通过加入乙醇部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA；(d)第二次过滤浓缩步骤；和，(e)用100％(v/v)乙醇进行第二次透析过滤步骤。在一个优选的实施方案中，(b)步骤的透析过滤缓冲液包括约10％(w/v)的PEG6000和约1.2M的NaCl。沉淀的超螺旋质粒DNA经过微孔过滤和第一次透析过滤步骤后，可以在步骤(c)进行脱水，加入乙醇至终浓度为约30％-80％(v/v)。在一个优选的实施方案中，向微孔过滤/透析过滤渗余物加入乙醇至终浓度为50％(v/v)，部分脱水所述沉淀的超螺旋质粒DNA。在另一个优选实施方案中，上面步骤(d)和(e)的第二次过滤和微孔过滤发生在有不锈钢网眼(或等同物)滤网的过滤干燥器，包括但不限于细胞搅动模式下的单板Nutsche过滤干燥器。因此，本发明涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)用PEG沉淀所述超螺旋质粒DNA；(b)使用切向流过滤模式下的微孔过滤浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA；(c)加入乙醇部分脱水所述浓缩的沉淀质粒DNA；和，(d)在细胞搅动过滤干燥器中浓缩所述部分脱水的沉淀DNA。
本发明还涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)用醇类(包括但不限于乙醇、甲醇和异丙醇)沉淀所述超螺旋质粒DNA；和(b)切向流过滤模式下微孔过滤浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA。偏向使用沉淀(通过PEG或醇类)而不是超滤来浓缩产物质粒DNA因为当用标准泵(如叶泵)将超滤法调节到工厂规模大小的生产时，溶液相的质粒溶液受到切力损伤。U.S.专利申请No.09/875,379(上文)描述的早前进展工作证明了在批处理模式中使用乙醇作为沉淀溶剂来获得质粒DNA的干粉形式。然而，这一过程却不符合后-沉淀过滤和洗涤步骤，显示了如果不采用渐增的洗涤梯度就会出现缓慢的过滤率和极度的团状压缩。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的最终下游浓缩/精加工步骤特别使用切向流过滤模式下的微孔过滤加强醇类沉淀，从而最终产生纯化的质粒DNA的大量粉末形式。作为该过程的强化方法，用同时发生的微孔过滤不断沉淀可以显著降低与醇类批沉淀方法相关低容器体积。
如早前所示，包括第一步从溶胞产物沉淀超螺旋质粒DNA(包括但不限于用PEG或醇类沉淀)的本发明的最终下游浓缩/精加工步骤之前，超螺旋质粒DNA在所述溶胞产物中富集，作为上游和之前下游纯化过程(详见上文描述)的结果。一旦产生了富含超螺旋质粒DNA的溶胞产物，所述含质粒DNA的溶胞产物进一步处理除去任何残留杂质，这表示质粒DNA纯化制法的最终精加工步骤。为了说明含有醇类沉淀的本发明的最终下游浓缩/精加工步骤，超螺旋质粒DNA首先从后-LRA滤液中沉淀(如U.S.专利申请No.09/875,379定义；上文)。不受任何特殊理论约束，此处实施例部分出现的检验不同溶剂(乙醇、异丙醇和甲醇)和盐沉淀质粒DNA的能力的试验洞穿了DNA沉淀的机制。DNA含有互相排斥的疏水碱基对和负电荷磷酸盐基团。如果磷酸盐的斥力占优势，疏水区就堆积起来，DNA从溶液中沉淀。图9B显示随着盐或溶剂的加入，质粒溶解性降低。溶液离子强度(盐浓度)静电性地影响溶解度，借此阳离子屏蔽负电荷磷酸盐基团的斥力。本领域技术人员运用此处提供的研究和现有技术，将能理解当用醇类沉淀质粒DNA作为本发明最终浓缩/精加工纯化步骤的第一步，溶剂和盐的相互作用。
如上所述，本发明的一个实施方案涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)用乙醇沉淀所述超螺旋质粒DNA；和(b)切向流过滤模式下微孔过滤浓缩所述沉淀的质粒DNA。此处实施例部分详细描述的研究说明0.5g/L的质粒溶液中，乙醇浓度约30％-33％(v/v)，NaCl浓度约1.8-3.4M，质粒DNA溶解性会发生陡然下降。如上所述，本领域技术人员将认识到溶液离子强度(盐浓度)在醇类沉淀质粒DNA的效率方面发挥作用，因此将理解需要给特别DNA浓度的质粒溶液提供足够浓度的盐和乙醇从而达到沉淀所述质粒。此外，该领域技术人员将认识到维持所述组分合适浓度的重要性，以确保随后的过滤和洗涤步骤中质粒DNA保持沉淀。本发明的一个实施方案中，将乙醇加入到富含质粒DNA的溶胞产物中至终浓度为40％(v/v)，沉淀超螺旋质粒DNA，作为此处公开的下游浓缩/精加工方法(上述步骤(a))的第一步，其中所述溶胞产物含有约3M的NaCl。
本发明的另一个实施方案中，醇类(包括但不限于乙醇、甲醇和异丙醇)沉淀质粒DNA后，通过分级过滤方法浓缩所述沉淀质粒。所述分级过滤方法包括：(a)含切向流过滤模式下微孔过滤的第一次过滤浓缩步骤；(b)使用乙醇溶液的第一次透析过滤步骤，其中所述溶液的乙醇浓度足够保持所述超螺旋质粒DNA沉淀；(c)第二次过滤浓缩步骤；和(d)使用100％(v/v)乙醇的第二次透析过滤步骤。此处描述的实施例中，尝试用抽滤瓶和0.2微米膜过滤器(2.1cm2过滤面积)在直接流速过滤下用80％(v/v)EtOH透析过滤沉淀质粒溶液(约40％(v/v)乙醇和约3M NaCl沉淀0.86g/L质粒溶液)。随着过滤的进行，流速显著下降，导致凝胶状过滤团的形成。对于大规模批过滤，估计使用5ft直径，0.2微米过滤器(19.6ft2膜面积)，直接流速下过滤243小时。由于这种不实际的过滤时间，考虑大面积的切向流过滤(”TFF”)膜作为替代方法。最终，使用0.22μm PVDF切向流过滤膜微孔过滤在约40％(v/v)乙醇和3M NaCl中沉淀的质粒DNA。溶液于15mL/min顺利过滤，在实验过程中渗透流速不会降低。这说明固体物质可以从膜表面随意除去，不会形成堆积层。
伴随着醇类导致的质粒沉淀的分级过滤方法的微孔过滤和第一次透析过滤目的是从溶液中清除残留盐和多余水从而同时浓缩醇类沉淀(如乙醇沉淀)的质粒DNA。该方法浓缩渗余物中的沉淀质粒DNA(即降低工作体积)，同时使盐和水随着渗透物流失。然后透析过滤浓缩的沉淀质粒DNA，也有助于除去盐。本发明的一个实施方案中，TFF微孔过滤的乙醇沉淀质粒DNA随后用含约60％-100％乙醇的溶液透析过滤。因为质粒DNA在80％v/v的乙醇溶液中完全不溶解，甚至在没有盐的情况下也是这样，可以使用80％的乙醇微孔过滤，在维持质粒DNA不溶的条件下从悬浮液中除去NaCl。然后通过第二次过滤步骤和100％(200度)乙醇第二次透析过滤进一步浓缩沉淀质粒DNA浆体。本发明的一个实施方案中，第二次过滤/透析过滤方法在过滤干燥器中进行，包括但不限于单板Nutsche干燥器，如上所述。湿粉可以真空干燥(如，25-37℃)；和，获得的粉末DNA产物可以在特别的制剂缓冲液中重悬。
批处理模式中醇类导致的质粒沉淀需要足够大的容器放置处理体积和沉淀需要的乙醇量。然而，如果加入料和乙醇不断泵入较小的通过微孔过滤自发出去液体从而保证体积不变的中间容器，那么就不需要大的沉淀容器，即使沉淀在高溶剂比率中进行。在这种模式下，可以通过不断蒸馏渗透物和向沉淀容器循环使得溶剂废弃物最小化。因此本发明的一个实施方案涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)用醇类(包括但不限于乙醇、甲醇和异丙醇)沉淀所述超螺旋质粒DNA；和(b)切向流过滤模式下微孔过滤浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA；其中步骤(a)和(b)在持续的沉淀/微孔过滤条件下进行。当把乙醇和质粒溶液不断加入搅动的容器同时微孔过滤自发在相同的容器中进行，保持体积不变，就产生了所述持续沉淀/微孔过滤方法。作为该过程的调节，渗透物的不断蒸馏为沉淀提供循环的浓缩乙醇，使得所需溶剂体积最小化，以及在更高甚至更好的醇类浓度下沉淀。因此，本发明包括的持续沉淀/微孔过滤方法可以包括也可以不包括醇类(如乙醇)回收。如下面的实施例部分详述，在进行微孔过滤之前，质粒颗粒充分脱水需要足够的反应时间以避免微孔过滤膜的堵塞。保证沉淀质粒DNA充分脱水也有助于消除水合大颗粒堵住管道引起的潜在压力增加。持续沉淀/微孔过滤过程或许对某些对沉淀要求高醇水平的制备方法特别有吸引力。
本发明的一个实施方案中，此处描述的新的上游和新的下游纯化方法与从大规模微生物发酵中的溶胞产物中分离超螺旋质粒DNA的单独方法结合。因此，本发明还涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)在生理缓冲液中裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成溶胞产物；(b)通过絮凝宿主细胞碎片，在溶液中保留超螺旋质粒DNA，澄清所述宿主细胞；(c)沉淀所述超螺旋质粒DNA；和，(d)使用切向流过滤模式下的微孔过滤浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA。本发明该部分的一个实施方案中，通过在含溶菌酶的标准STET缓冲液中裂解微生物宿主细胞产生上述步骤(a)的溶胞产物。本发明该部分的另一个实施方案中，如PCT国际申请Nos.PCT/US95/09749和PCT/US96/07083公开的让微生物宿主通过热交换装置产生步骤(a)的溶胞产物。如以上详述，此处显示聚乙二醇(PEG)宿主细胞碎片的有效絮凝剂，目的是从微生物细胞中下游纯化超螺旋质粒DNA，产生澄清的溶胞产物。因此，本发明该部分的一个实施方案中，上述步骤(b)的溶胞产物用PEG澄清。PEG絮凝剂可以是最初溶胞缓冲液的组分，也可以在溶胞作用发生后加入到溶胞产物。如前所解释，用来澄清溶胞产物的PEG絮凝剂数量依赖于它的分子量。本发明的一个优选实施方案中，约3.7％(w/v)的PEG 6000用来絮凝宿主细胞碎片，如此处所述；然而，由于PEG聚合物浓度和分子量在絮凝方面的密切相互影响，此处公开的任何特殊的PEG浓度和PEG分子量可以看作有指导意义，并不限于本发明整体。为了制备絮凝的溶胞产物，所述溶胞产物倾向于pH调至碱性，随后在絮凝之前进行中和反应。pH调至碱性包括通过加入浓缩碱基，将溶胞产物的pH升高到pH 12-pH 13的碱性值。随后调节溶胞产物碱性的中和作用包括降低所述溶胞产物的pH到约pH 7-pH9(即，pH降低到碱性调节前溶胞产物的相同水平上)。pH调至碱性和随后的中和过程在PEG絮凝剂加入前后都可以进行。因此，本发明涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：(a)在含溶菌酶的生理缓冲液中裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞；(b)将所述溶胞产物pH调至碱性，随后进行中和；(c)用PEG絮凝剂絮凝宿主细胞碎片，澄清所述溶胞产物；(d)沉淀所述超螺旋质粒DNA；和(e)在切向流过滤模式下使用微孔过滤浓缩所述沉淀超螺旋质粒DNA。本发明的一个实施方案中，在步骤(d)用选自包括醇类(如40％v/v乙醇)和PEG(如10％w/v PEG 6000)的沉淀剂沉淀溶液中的超螺旋质粒DNA。此外，上述浓缩步骤(e)可以是分级过滤方法。如果所述质粒DNA首先用PEG沉淀，所述分级过滤方法包括：(a)第一次过滤浓缩，包括切向流过滤下的微孔过滤；(b)用含PEG的透析过滤缓冲液进行第一次透析过滤步骤，其中所述透析过滤缓冲液包括足够的PEG和盐以保持所述超螺旋质粒DNA沉淀；(c)脱水步骤，其中加入乙醇部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA；(d)第二次过滤浓缩步骤；和，(e)用100％(v/v)乙醇进行第二次透析过滤步骤。如果所述质粒DNA首先用醇类(如乙醇)沉淀，所述分级过滤方法包括：(a)第一次过滤浓缩，包括切向流过滤下的微孔过滤；(b)用含醇溶液(如乙醇)的透析过滤缓冲液进行第一次透析过滤步骤，其中醇溶液浓度足够保持所述超螺旋质粒DNA沉淀；(c)第二次过滤浓缩步骤；和，(d)用100％(v/v)的醇类(如100％乙醇)进行第二次透析过滤步骤。
最后，本发明还涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的结合方法，包括：(a)从发酵液或培养基中收集微生物宿主细胞；(b)在足够量的生理裂解液中裂解宿主细胞；(c)通过将所述溶胞产物的pH升高到pH 12-pH 13的碱性值，使溶胞产物的pH调至碱性；(d)中和调节碱性的溶胞产物至裂解缓冲液的pH；(e)用PEG絮凝宿主细胞碎片，澄清步骤(d)的溶胞产物；(f)除去所述絮凝的宿主细胞碎片；(g)用溴化十六烷基三甲基铵诱导的沉淀作用选择性沉淀超螺旋质粒DNA；(h)在含有水合结晶硅酸钙和优化离子强度的精制缓冲液中再溶解超螺旋质粒DNA，吸附杂质；(i)第二次用水合结晶硅酸钙诱导的吸附作用吸附残留杂质；(j)用PEG沉淀超螺旋质粒DNA；(k)使用切向流过滤模式下的微孔过滤浓缩沉淀的超螺旋质粒DNA；(l)加入乙醇部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA；(m)在细胞搅动干燥器中浓缩脱水的超螺旋DNA；(n)干燥除去乙醇，留下精制粉末DNA产物。本发明的一个实施方案中，上述纯化方法使用分级去垢剂沉淀。所述分级方法包括第一次低切沉淀步骤用以从溶胞产物中除去残留蛋白质和内毒素，接着是高切沉淀步骤来沉淀质粒DNA。第一次的低切步骤可以在除去絮凝宿主细胞碎片之前进行。在这种情况下，可以使用澄清的溶胞产物进行高切沉淀步骤(即，在除去宿主细胞碎片之后)，如上述步骤(g)所示。
本发明还涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的结合方法，包括：(a)从发酵液或培养基中收集微生物宿主细胞；(b)在足够量的含溶菌酶的标准STET缓冲液中裂解宿主细胞；(c)通过将所述溶胞产物的pH升高到pH 12-pH 13的碱性值，使溶胞产物的pH调至碱性；(d)中和调节碱性的溶胞产物至STET缓冲液的pH；(e)用PEG絮凝宿主细胞碎片，澄清步骤(d)的溶胞产物；(f)除去所述絮凝的宿主细胞碎片；(g)用溴化十六烷基三甲基铵诱导的沉淀作用选择性沉淀超螺旋质粒DNA；(h)在含有水合结晶硅酸钙和优化离子强度的精制缓冲液中再溶解超螺旋质粒DNA，吸附杂质；(i)第二次用水合结晶硅酸钙诱导的吸附作用吸附残留杂质；(j)用PEG沉淀超螺旋质粒DNA；(k)使用切向流过滤模式下的微孔过滤浓缩沉淀的超螺旋质粒DNA；(l)加入乙醇部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA；(m)在细胞搅动干燥器中浓缩脱水的超螺旋DNA；(n)干燥除去乙醇，留下精制粉末DNA产物。本发明的一个实施方案中，上述纯化方法使用分级去垢剂沉淀。所述分级方法包括第一次低切沉淀步骤用以从溶胞产物中除去残留蛋白质和内毒素，接着是高切沉淀步骤来沉淀质粒DNA。第一次的低切步骤可以在除去絮凝宿主细胞碎片之前进行。可以使用澄清的溶胞产物进行所述高切沉淀步骤(即在除去宿主细胞碎片之后)，如上述步骤(g)所示。
本发明还涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的结合方法，包括：(a)从发酵液或培养基中收集微生物宿主细胞；(b)在足够量的生理裂解液中裂解宿主细胞；(c)通过将所述溶胞产物的pH升高到约pH 12-约pH 13的碱性值，使溶胞产物的pH调至碱性；(d)中和调节碱性的溶胞产物至裂解缓冲液的pH；(e)用PEG絮凝宿主细胞碎片，澄清步骤(d)的溶胞产物；(f)除去所述絮凝的宿主细胞碎片；(g)用溴化十六烷基三甲基铵诱导的沉淀作用选择性沉淀超螺旋质粒DNA；(h)在含有水合结晶硅酸钙和优化离子强度的精制缓冲液中再溶解超螺旋质粒DNA，吸附杂质；(i)第二次用水合结晶硅酸钙诱导的吸附作用吸附残留杂质；(j)用PEG沉淀超螺旋质粒DNA；(k)使用切向流过滤模式下的微孔过滤浓缩沉淀的超螺旋质粒DNA；(l)加入乙醇部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA；(m)在细胞搅动干燥器中浓缩脱水的超螺旋DNA；(n)干燥除去乙醇，留下精制粉末DNA产物。本发明的一个实施方案中，上述纯化方法使用分级去垢剂沉淀。所述分级方法包括第一次低切沉淀步骤用以从溶胞产物中除去残留蛋白质和内毒素，接着是高切沉淀步骤来沉淀质粒DNA。第一次的低切步骤可以在除去絮凝宿主细胞碎片之前进行。在这种情况下，可以使用澄清的溶胞产物进行高切沉淀步骤(即，在除去宿主细胞碎片之后)，如上述步骤(g)所示。
本发明还涉及从大规模微生物发酵中的溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的结合方法，包括：(a)从发酵液或培养基中收集微生物宿主细胞；(b)在足够量的含溶菌酶的标准STET缓冲液中裂解宿主细胞；(c)通过将所述溶胞产物的pH升高到pH 12-pH 13的碱性值，使溶胞产物的pH调至碱性；(d)中和调节碱性的溶胞产物至STET缓冲液的pH；(e)用PEG絮凝宿主细胞碎片，澄清步骤(d)的溶胞产物；(f)除去所述絮凝的宿主细胞碎片；(g)用溴化十六烷基三甲基铵诱导的沉淀作用选择性沉淀超螺旋质粒DNA；(h)在含有水合结晶硅酸钙和优化离子强度的精制缓冲液中再溶解超螺旋质粒DNA，吸附杂质；(i)第二次用水合结晶硅酸钙诱导的吸附作用吸附残留杂质；(j)用PEG沉淀超螺旋质粒DNA；(k)使用切向流过滤模式下的微孔过滤浓缩沉淀的超螺旋质粒DNA；(l)加入乙醇部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA；(m)在细胞搅动干燥器中浓缩脱水的超螺旋DNA；(n)干燥除去乙醇，留下精制粉末DNA产物。本发明的一个实施方案中，上述纯化方法使用分级去垢剂沉淀。所述分级方法包括第一次低切沉淀步骤用以从溶胞产物中除去残留蛋白质和内毒素，接着是高切沉淀步骤来沉淀质粒DNA。第一次的低切步骤可以在除去絮凝宿主细胞碎片之前进行。可以使用澄清的溶胞产物进行所述高切沉淀步骤(即，在除去宿主细胞碎片之后)，如上述步骤(g)所示。
为了描述和公开本发明可能相关的方法和材料，此处纳入提到的所有出版物。本文的所有内容都不应被视作承认本发明可以根据在先发明而预料得到。
参照附图，表述了本发明优选的实施方案，可以理解本发明并不局限于这些确切的实施方案。本领域技术人员在不违背权利要求定义的本发明精神的范围内可以作出多种变更和修饰。
下面提供实施例说明本发明，但却不限于此：
实施例1
用PEG进行宿主细胞碎片的絮凝作用
分析方法-所用的分析方法包括：(i)阴离子-交换(″AEX″)HPLC测定；(ii)用E-凝胶进行的凝胶电泳(Invitrogen；具有溴化乙锭的0.8％琼脂糖)；和(iii)利用Taq man PCR测定的qPCR。以每孔20μL加样量对E-凝胶于60伏运行50分钟。在实施E-凝胶测定之前，用乙醇沉淀(2倍等体积)来对样品进行预处理，并在Eppendorf微量离心机中离心5分钟。轻轻倒出上清液，在重悬于10mM Tris缓冲液pH 8.0之前，让沉淀干燥5分钟。随后在加样到E-凝胶上之前，将预处理的样品稀释在1X TAE缓冲液中。对于用作qPCR分析的样品进行同样的预处理。
用溶菌酶进行裂解-进行初始大肠杆菌裂解研究以评估溶菌酶，碱/酸处理(添加碱至pH 12-13，随后通过添加酸至大约pH 7-9进行中和)，和温度对裂解效能的影响。利用重悬至OD600为45的细胞来评估细胞裂解。不用溶菌酶的裂解，不论温度或碱/酸处理，都导致产量较低。当与在37℃进行裂解相比较时，在20℃用标准STET缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM EDTA，2％v/v
Figure A20068000356400481
-X-100，8％w/v蔗糖，pH8.2)中的溶菌酶(500U/mL Ready-LyseTM；Epicentre)，但无碱/酸处理，进行裂解，产生较低的质粒DNA回收量(质粒DNA浓度为ca.0.3g/L)。利用溶菌酶孵育(500U/mL)随后进行碱/酸处理获得最高的产量。碱/酸处理由下列步骤组成：添加浓NaOH(5M母液；最终溶液浓度0.25M)，孵育15分钟，添加醋酸(5M母液；最终溶液浓度0.25M)。由在20℃或37℃进行孵育并进行碱/酸处理的OD60045溶胞产物获得的质粒DNA产量为约0.5g/L。
溶胞产物絮凝作用研究-进行筛选研究以表征PEG絮凝作用对于细胞碎片沉积的影响。图1显示四个具有不同OD60045大肠杆菌溶胞产物(包含质粒DNA)的Nalgene瓶。瓶1包含通过将细胞重悬于STET缓冲液(上面所述)并用溶菌酶(500U/mL Ready-LyseTM)于20℃孵育而生成的溶胞产物。瓶2包含与瓶1中相同的溶胞产物，但是在溶菌酶孵育后实施碱/酸步骤(pH从ca.8.5转变至ca.12.5并回到ca.8.5)。瓶3中的溶胞产物是通过将细胞重悬在包含3％PEG 3000的STET缓冲液中并用溶菌酶(500U/mL)于20℃孵育而生成的。瓶4包含与瓶3中相同的溶胞产物，但是在溶菌酶孵育后实施碱/酸步骤。PH转变的，PEG处理过的材料在2天的时间里通过重力单独作用沉积，提示在离心过程中将实现提高的效能。据测定PEG是极好的细胞碎片，特别是在宿主细胞溶胞产物的碱/酸处理之后(即，pH从约pH 8.5转变至约pH 12.5，随后回到约pH 8.5；如上所述)。事实上，如果应用于未进行过碱/酸处理的溶胞产物，添加PEG具有相反的作用，即碎片变得更加难以沉淀。
为了进一步测试PEG诱导的絮凝作用，将如图2中所述处理的各种细胞溶胞产物等分至50mL离心管中。将瓶在旋转混合器上孵育15分钟，随后进行离心。显示在图2中的结果证实了PEG当添加到进行过碱/酸处理的溶胞产物中时发挥絮凝剂的作用。图3显示图2中测试的六和样品的上清液的浊度测量。与对照(管2)的730NTU浊度相比，用终浓度为5％的PEG(管6)离心后显示15.5NTU的溶液浊度。这表明可以利用离心作为澄清策略以达到sub 20NTU澄清度，而无需利用精加工过滤。这些结果还表明PEG如果在碱/酸处理之前或之后添加的话，是有效的絮凝剂。
PEG分子量对于细胞碎片絮凝作用的影响-基于细胞碎片的沉积效能利用快速筛选方法研究了PEG浓度和分子量对于絮凝作用的影响。将细胞在溶菌酶(500U/mL)存在的情况下孵育并进行如上所述的碱/酸处理。将各种PEG母液混合入10-mL等份的溶胞产物中，让得到的混合物在室温下沉积约16小时。测量沉积的固体体积和上清液的浊度(OD600)(图4A)。还测量了DNA浓度，因为高浓度的PEG是已知的DNA沉淀剂。图4B显示利用PEG 3000进行研究的DNA浓度(由AEX测试法测定)和上清液浊度。结果证实有一个PEG 3000浓度范围用于絮凝细胞碎片，但DNA并未沉淀。结果还证实如果PEG 3000浓度提高到大约5％以上，DNA确实沉淀。
PEG 6000 DNA絮凝作用实验-利用经过碱性-pH转变和随后中和的溶胞产物，生成PEG 6000的质粒DNA沉淀曲线。所述沉淀曲线显示于图5中。由此数据，在本发明的裂解/溶胞产物澄清步骤期间大约3.7％的PEG 6000浓度将足以消除在宿主细胞碎片絮凝作用(＞6％PEG 6000)期间沉淀质粒DNA的任何危险。
用于有效裂解的细胞浆浓度上限-进行了研究以确定细胞的最大浓度，所述细胞可以利用上述新的裂解方法进行裂解，包括溶菌酶孵育，随后进行碱/酸处理和添加PEG用于溶胞产物澄清。研究了若干种细胞浆浓度(以600nm上光密度术语表示，OD600)。确定了起始OD600为70为最佳，致成具有总DNA浓度为约0.7g/L的澄清溶胞产物。在向这种起始细胞溶胞产物中添加碱，酸和PEG溶液后，OD600由其原始值略微稀释至～60。
CTAB低切杂质沉淀-在用PEG 6000进行絮凝作用后，发现可以向絮凝溶胞产物中添加CTAB(在溶胞产物澄清之前)以降低可溶性蛋白的水平。这通过在1小时里添加40mM NaCl中的2％(w/v)CTAB至最终浓度0.15％(w/v)来进行。图18显示BCA测定法测得的蛋白质水平，作为最终CTAB浓度的函数。在0.1％和0.2％(w/v)CTAB之间获得了最小蛋白质浓度。
在絮凝作用过程中持续离心-为了模拟持续离心条件，用模式(CTC 3)Westfalia离心机来测试包含超螺旋质粒DNA的宿主细胞溶胞产物的PEG絮凝作用。尽管这种模式离心机并不能卸去固体，但它与更大的生产型离心机具有相同的内部几何学。该离心机具有2L转子，有1L为固体的存储容量。将包含目标超螺旋质粒DNA并用PEG6000絮凝的宿主细胞溶胞产物(通过溶菌酶孵育，碱性pH转变和随后的中和作用生成)以250mL/min通过以10,000×g运行的设备。在充满转子之前能够将大约18L的溶胞产物穿过设备。尽管固体非常厚并得以压缩，但在运行期间没有DNA浓度的损失。在最终澄清的溶胞产物中浊度＜30NTU。
精加工过滤-除了上述的离心程序之外，可以利用精加工深度过滤来从离心溶胞产物中去除残余固体。例如，可以利用基于纤维质或硅藻土的深度过滤器(例如，Millipore DE40或CE50过滤器)，大致加样量为大约70L/m2。
实施例2
在溶菌酶孵育，碱/酸处理和PEG絮凝作用之后进行质粒DNA纯化
分析方法-见实施例1的方法。
30L裂解：将包含收集自2,000L大肠杆菌发酵法的超螺旋DNA的冷冻细胞在温(约35℃)水浴中解冻，并在带有5-英寸A310叶轮的50L Lee槽中利用STET缓冲液(50mM Tris HCl，100mM EDTA，2％v/v
Figure A20068000356400511
X-100，8％w/v蔗糖，pH 8.2)稀释至OD60070。获得30L的重悬体积。添加Ready-LyseTM溶菌酶(500U/mL，Epicentre)，并将得到的细胞浆在37℃下孵育ca.2小时。随后将细胞浆冷却至20℃，在60分钟里以表面下的方式缓慢添加5M NaOH以便将溶菌酶溶胞产物的pH提高到ca.12。30-分钟静置期后，然后在60分钟里添加2.5M醋酸以便将pH降低到8-9。随后缓慢添加RCM 6(盐水，150mM NaCl)中的PEG 3000(50％w/v)至最终浓度5％(w/v)PEG。在添加NaOH，醋酸，和PEG 3000总的溶胞产物体积从30L(约OD60070)提高到35L(约OD60060)。随后将PEG-絮凝溶胞产物转移到1-L JLA 8.1000离心瓶中并于15.9kG离心15分钟。合并上清液，获得浊度为约17NTU的澄清溶胞产物。随后将合并的澄清溶胞产物保存于4℃。
4.3L 裂解：利用带有3英寸直径A310叶轮的7L加套玻璃容器完成由包含超螺旋质粒DNA的1L大肠杆菌发酵物的相同4.3L裂解。该容器具有圆底，直径10英寸，液体水平为大约8英寸。叶轮以大概15度角放置并以400rpm的速度运转。添加Ready-LyseTM溶菌酶(500U/mL)并让其在pH转变之前于37℃孵育2.5小时。随后将温度降低到20-25℃，并在60分钟内加入5N NaOH(0.0150L，最终溶液浓度0.25M)。添加碱后pH为12.5。添加碱后，将混合速率降至250rpm(以便有助于防止由于叶轮剪切而造成任何DNA降解)，让溶胞产物在高pH下孵育30分钟。在60分钟内加入浓醋酸(2.5N，0.3L)至最终溶液浓度0.25M。五分钟后将叶轮速度提高至350rpm以便更好地混合。添加酸后最终pH为8.4。随后在1小时内添加浓缩的PEG 3000(50％；0.475L)母液。在放置约30分钟后，将溶胞产物等分入1-LBeckman离心瓶中并以15kG离心15分钟。将得到的上清液通过20μm，4英寸直径的不锈钢筛轻轻倒入10L Nalgene容器中以便捕获任何大颗粒。
结果-作为实施例1中所述的探针实验的结果，实施4.3-L裂解步骤。通过凝胶电泳测定法所测，在澄清溶胞产物中的总DNA浓度为0.8g/L。来自宿主基因组DNA浓度的qPCR分析结果显示在表1中。确定了澄清溶胞产物只包含约2％基因组DNA，这在利用热裂解方法一般达到的基因组DNA水平(约10-15％)上是显著的降低。这种基因组DNA的减少归因于肠杆菌基因组DNA相对于质粒DNA的低扩散能力。由于大肠杆菌基因组DNA为400kb而一般的质粒DNA分子为～10kb，质量的差异导致显著不同的扩散性。当DNA在碱性条件下变性时，质粒DNA可以快速重退火，而基因组DNA则不能，导致与细胞碎片二次作用并降低了整体基因组DNA水平。
表1.4.3L裂解的qPCR结果
  描述   总DNA浓度＊(g/L)   体积(L)   质粒DNA质量(g)   基因组DNA浓度(μg/mL)   基因组DNA(％)   基因组DNA减少(％)
  OD60070溶胞产物   0.96   4.3   4.1   64.2±13.1   6.3±1.3   -
  pH转变后   0.85   4.7   4.0   20.9±2.1   2.4±0.2   62±12
  澄清溶胞产物   0.82   4.8   3.9   18.5±2.8   2.2±0.3   65±17
＊来自整合电泳凝胶的数据
还以30L的规模进行裂解步骤。结果是总DNA产量为0.74g/L，伴随着87％峰3，在这里百分比(％)峰3是两种阴离子-交换峰的比例并与超螺旋DNA的百分比相关联。相关性遵循百分比峰3越高，超螺旋质粒DNA的百分比越高。表2显示在裂解过程中不同的步骤上AEX测定结果。表2中的最后一列证明用本文所述的上游纯化方法可提高DNA浓度。此外，澄清溶胞产物具有最终浊度12.1NTU。
表2.30L裂解的AEX测定结果
  描述   AEX测定所用的稀释倍数   总DNA浓度(g/L)   峰3中的％总DNA   峰3浓度(g/L)  测量的总DNA浓度(g质粒DNA每mL原始溶胞产物)
  OD60070溶胞产物   30   0.862   93.9％   0.809   0.862
  pH转变后   30   0.820   74.4％   0.610   0.906
  澄清溶胞产物   30   0.742   87.0％   0.646   0.902
本文所述的新的裂解方法可以在～0.9g/L和OD60070之下进行。因而，这种高浓度允许使用比热裂解方法小得多的槽并需要更少的大型处理容器。这种裂解可以在以往质粒DNA生产方法的两倍浓度上进行，利用单一的槽，降低了大肠杆菌染色体DNA水平，并通过新的基于PEG的絮凝作用步骤简化了下游固体分离。
实施例3
最终的DNA精加工处理：PEG-沉淀和PEG沉淀物的微孔过滤
在美国专利申请号09/875,379(美国公开号US2002/0012990)中描述了一种在先的DNA纯化方法，在方法的最后利用超滤(″UF″)步骤来将硅酸钙(例如，LRA)滤液浓缩至～7+mg/mL DNA，随后进行10X透析过滤用于将缓冲剂交换至制剂缓冲液，PBS中(见图6A)，将所述专利申请号并入本文作为参考。这一最终精加工步骤是令人满意的，体积为大约100L或更小，但较大生产规模的纯化方法显示了泵的大小和流速开始达到技术的极限。为了避免这些操作规模扩大的问题，用PEG沉淀步骤，和随后两个独立的过滤/透析过滤步骤代替质粒DNA方法的最后UF步骤(见图6B)。第一个过滤/透析过滤步骤，包括在切向流过滤模式下微孔过滤，浓缩了沉淀浆并清理了残余的RNA和杂质。第二个过滤/透析过滤步骤用乙醇代替PEG并将DNA脱水。在完全真空下干燥最终的湿产物以获得DNA细粉。由于添加乙醇，没有必要在产物干燥后进行无菌过菌，只要此步骤在无菌条件下进行即可。尽管与新的PEG沉淀方法相比，以往的精加工方法只需要两个步骤，但PEG法对于生产体积来说是可伸缩的，而不会降低产品质量或必需使用极大的泵和流速。新方法还包括增加纯化步骤以进一步减少杂质，而以往的方法只对质粒进行浓缩并提供来进行缓冲液交换。这种新的单元操作能够减少残余的RNA水平，可以是两个数量级或更多，不需要过分的流速和大型泵，减少了周期，并提供粉末状产品，这减少了必需的存储空间并且可以提供更加稳定的产品。
DNA在PEG中的溶解性(沉淀动力学)-在不同的温度和总DNA浓度下检测在LRA后滤液中完全沉淀质粒DNA所必需的PEG8000的浓度。DNA浓度在0.3和1.0mg/mL之间波动，因为这可能是在大规模纯化操作中将会遇到的情况。图7A显示当PEG浓度＞2％(w/v)时PEG 8000溶液中的DNA的溶解性有显著降低。对于所研究的范围来说，溶液温度或DNA浓度对于DNA溶解性没有影响。图7A中的结果显示DNA被大约4％的PEG 8000完全沉淀；不过，在剩下的研究中选择8％的PEG 8000浓度以提供2倍的安全系数。
对不同分子量的PEG进行评估以便确定另一种大小的聚合物是否会更加适于进行沉淀作用。图7B显示对于所研究的范围来说，DNA在400MW PEG中是完全可溶的；但是随着聚合物MW提高，沉淀DNA所必需的PEG的临界质量减小。这表明，例如，可以使用MW3,000和10,000之间的任何PEG来有效沉淀DNA，同时相应地调节PEG浓度。
研究PEG沉淀的动力学来确保添加PEG后2小时的静置时间足以完成DNA沉淀。图8显示大约5分钟后，超过99％的DNA得以沉淀，表明2小时的静置时间完全足够。
实验过程-发展出下列精加工程序以便通过去除残余RNA和其它可溶性杂质来进一步纯化质粒DNA，生成由超螺旋DNA和一些残余盐组成的最终粉末粉产品。可以将所述粉末产品重悬于液体制剂中。
用来演示本发明的新型的，下游浓缩/精加工过程的起始溶液是LRA后滤液，如美国专利申请号09/875,379(上文)中所述。该溶液的组成为3M NaCl，1.0mg/mL纯化DNA和一些残余的RNA。使用PEG 8000MW(Fluka)来沉淀DNA，尽管已经检查过3000-10,000的MW。首先将LRA滤液后加热到20℃并用搅拌棒以中等速度(50rpm)搅动。在15分钟里，加入作为～33％(w/v)浓缩母液的PEG 8000，直到最终溶液浓度为8％(w/v)。将沉淀物放置2小时，随后利用0.45微米中空的纤维膜，来自Amersham Biosciences的切向流滤器进行浓缩。膜上的加样量为180g DNA/m2膜面积。再循环速率为9L/m2/min，并将流出量控制在2.5L/m2/min。收集渗透液直至达到20倍浓缩，随后将浓缩的潴留物在5倍透析过滤体积中相对于1.2M NaCl中的8％(w/v)PEG 8000进行透析过滤。收集这种潴留物并在4.5L/m2膜的体积中用1.2M NaCl中的8％(w/v)PEG 8000来洗涤膜。这种洗涤可以结合以潴留产物。通过在30分钟里表面添加等体积的200号乙醇而将最终潴留物调节至50％(v/v)乙醇。在乙醇添加过程中，将沉淀浆保持良好搅动以避免乙醇“热点(hot spots)”的形成。将此溶液在装配了25微米316L不锈钢(SS)过滤筛的滤器干燥器中浓缩至大约30g/L沉淀DNA浆，随后相对于6倍透析过滤体积的200号乙醇进行透析过滤。流出量控制在3.2L/m2/min。在此透析过滤过程中利用中度的搅动来保持浆液悬浮。滤器加样量为0.3kg DNA/m2，但是这一加样量应当被视为下限，因为这个数字是由利用载荷下的滤器进行的实验而获得的。过滤后，将粉末在真空下于25-37℃干燥24小时。
分析方法-通过在波长260、280和320nm下的UV分光光度计来获得DNA浓度。在260nm波长下，DNA具有50(μg/mL)-1每1吸光度单位的消光系数。采用260/280nm的比例来评估纯度。将样品(500μL)加样到1cm径长的石英微量比色杯中。利用Fourier TransformInfrared Spectroscopy(“FTIR”)来评估PEG浓度。通过RiboGreen测定法来评估RNA浓度。
PEG-沉淀浆液的浓缩(第一个过滤/透析过滤步骤，包括在TFF下进行微孔过滤)-在PEG沉淀后，利用通过切向流过滤(“TFF”)模式的微孔过滤，随后进行透析过滤的第一个过滤/透析过滤步骤，来减少产品的操作体积并减少在沉淀后留在溶液中的任何残余RNA和非产品的可溶性物质。透析过滤缓冲液应当具有合适的PEG和盐浓度以确保质粒DNA在透析过滤期间保持沉淀。例如，如果透析过滤缓冲液包含与在先沉淀步骤中所用大约相同百分比的PEG(例如，上面实施例中的8％w/v PEG)和大约1.2M NaCl，则质粒DNA将会保持沉淀。在上面的示例条件中，如果NaCl浓度降至1.2M以下过多，则必须添加PEG以保持DNA沉淀。实验显示最少需要100和600mM NaCl之间的盐浓度以便保持DNA沉淀于50％(v/v)乙醇溶液中。因而，为了在上限600mM NaCl附近操作，第一次透析过滤后的盐浓度需要为至少1.2M NaCl。1.2M NaCl的值对于后面的乙醇添加步骤也有效起作用。
本文所述的后接微孔过滤/透析过滤步骤的PEG沉淀显示RNA显著减少。表3显示在上述相对于1.2M NaCl中的8％PEG的第一个透析过滤步骤之后的RNA清除率。表4显示各个PEG沉淀步骤后的总清除率。表3显示大多数RNA在起始透析过滤体积后被清除并且到第三个体积时低于可以计量的限度。表4显示残留的RNA降低了几乎2个数量级。如果RNA的输入浓度更高则这种降低可能会更大。最终产品的RNA浓度接近L.O.D.。
表3：在第一次透析过滤过程中RNA的清除率
  RNA浓度(μg/mL)
 LRA后滤液   37.1
 透析过滤体积1×   3.136
 透析过滤体积2×   0.948
 透析过滤体积3×   ＜0.8＊＊
 透析过滤体积4×   ＜0.8＊＊
 透析过滤体积5×   ＜0.8＊＊
 透析过滤体积6×   ＜0.8＊＊
 最终产品   1.12
＊＊检测限度以下
表4：在进入PEG步骤和最终产品之间百分比RNA比较
  DNA浓度(mg/mL)   ％RNA
  LRA后滤液   7.1   0.523
  最终产品＊   4.94   0.023
＊取来自之前稀释到3M NaCl中的LRA后滤液并用来接近于LRA滤液。
PEG清除(第二次过滤/透析过滤步骤)-在第一次过滤(即，微孔过滤)和相对于PEG和NaCl的透析过滤步骤以浓缩质粒DNA并去除杂质之后，在15分钟里通过添加200号乙醇将质粒DNA产物调节至50％v/v乙醇。这改变了沉淀物的特性，从体积排斥变成脱水机制，改变了沉淀DNA的物理特性，从凝胶样物质变成更硬的不太能压缩的沉淀物。得到的沉淀物填塞至多孔结构中，致成良好的流动性和第二次过滤步骤中的高加样容量。对于调节步骤来说可以使用不同的乙醇浓度，但优选大约30-80％v/v之间的乙醇浓度。低于30％的浓度有将DNA重新溶成溶液的危险；而高于80％的浓度开始将盐与DNA一起沉淀。
利用后接相对于200号乙醇透析过滤的第二次过滤步骤(见图6B)，来去除溶液中的任何残留PEG，进一步对粉末脱水，并去除尽可能多的盐。通过在搅拌单元模式下于滤器干燥器系统中过滤，随后通过相对于200号乙醇进行6X透析过滤，将乙醇调节的进料降低到DNA浓度为50mg/mL，在上面的实施例中，滤器加载量为0.3kg DNA/m2；不过，这一加载量被认为是下限，因为所用的滤器装置是载荷下的。通过滤器的流量被控制在3.2L/m2/min。当通过FTIR测定最终PEG浓度时，所有读取器都在检测的限度之下(＜0.05％PEG)。随后移除湿粉末并于25-37℃进行真空干燥。如果在干燥产品中残留多余的盐，它将变得坚硬光滑，使得它非常难以再溶解。测试质粒DNA的最终产物纯度＞90％，大约90％DNA，5％NaCl，残留的水，残留的EtOH和有可能残留的PEG。
实施例4
用乙醇沉淀质粒DNA
材料和方法-根据美国专利申请号09/875,379(上文)纯化用于下列实验的质粒DNA，并且随后稀释至指定的浓度。乙醇、甲醇、异丙醇、氯化钠和醋酸钠购自Fisher。在涡旋混合试管实验中获得质粒溶解性数据。在将沉淀剂加入到质粒溶液中去后，利用注射器滤器取上清液样品，通过Molecular Devices的UV板读取器测量过滤样品中质粒的浓度。由于乙醇吸收UV光，利用SpeedVac对所有包含乙醇的样品进行干燥并在测量产重新溶于水中。通过用硝酸银滴淀来测定氯化钠离子浓度，用二氯荧光黄作为指示剂。
用乙醇沉淀质粒-图9A显示在33％、50％和67％的乙醇水平上，在1.8和3.4M之间的NaCl进料浓度上收集的质粒DNA溶解性数据。在百分之30和33的乙醇之间出现显著的溶解性降低。在30％乙醇上，质粒并不在所用的盐浓度下沉淀。在33％和更高的乙醇上，溶解性对应于0.5g/L的起始质粒浓度大约99％的沉淀产量。在乙醇前的基础上报告了所有NaCl浓度，意味着最终溶液中的NaCl浓度低于报告的浓度。图9A显示NaCl在1.8-3.4M的乙醇前浓度上对于质粒溶解性有少许影响。不过，据观察当不使用NaCl时，需要过量70％的乙醇浓度来利用1.0g/L的给料开始从溶液中沉淀质粒。因而，显然NaCl在质粒溶解性上发挥着作用。
为了进一步对此进行研究，利用具有各种浓度乙醇的较低浓度NaCl。结果总结在图9B中。虚线代表如果没有沉淀出现的话，对于每种溶液给出的质粒浓度。此值随着乙醇水平而变化，因为进料质粒浓度保持恒定。观察到清楚的“盐析”效应。图9B的结果引起了对于从过滤DNA中洗涤盐的关注。例如，栓塞型洗涤分布不均的话，可能会出现低盐和低乙醇的组合，重新溶解质粒。为了辅助开发去除氯化钠而不溶解质粒的洗涤方案，测量在各种乙醇组合物中NaCl的溶解性。此数据显示在图10中。
用异丙醇(″IPA″)沉淀质粒-表5总结了对于测试IPA-NaCl系统限度的实验所收集的所有溶解性数据。在乙醇前的基础上报告NaCl浓度。以灰色突出显示观察到95％过量产物的条件。显然提高的乙醇或盐浓度最初引发质粒溶液性的降低。不过，在高乙醇或盐浓度上，进一步添加引发溶解性提高。
表5.在具有NaCl的IPA-水混合物中测量的质粒DNA的溶解性
图11图示了两种IPA浓度上对于IPA-NaCl系统的“盐析”和“盐溶”的极限值。该图仅仅显示了盐的作用；不过，表5显示这种作用还可以在恒定的盐浓度上对于IPA而实现。这些结果类似于蛋白质沉淀，在蛋白质沉淀中静电屏蔽引发“盐析”但足够浓度的高离液序列剂(chaotropes)引发“盐溶”。这表明DNA沉淀是碱基对之间的分子间疏水作用的结果。为了与利用中度高离液序列试剂NaCl获得的结果相比较，在各种条件下测定具有醋酸钠，低液序列试剂(kosmotrope)的IPA中的质粒溶解性。图12A和12B总结了此实验的结果。对于67％的乙醇，醋酸钠的存在降低了质粒溶解性；不过，在其它方面，具有醋酸钠的质粒溶解性事实上高于具有等浓度NaCl的质粒溶解性。
用甲醇沉淀质粒-33％和50％的甲醇浓度结合1-3M NaCl不能沉淀质粒。这使得甲醇对于加工用途不理想，但它能够在67％的浓度上沉淀质粒。表6显示了这些结果。″盐析″现象显而易见。
表6.在甲醇-水混合物中的质粒溶解性.质粒在50％或更低的甲醇中可以完全溶解。
  甲醇百分比   [NaCl]，甲醇前   质粒溶解性   0.5g/L质粒进料的产率
  67   1.8M   0.102g/L   38.7％
  67   2.6M   0.028g/L   82.9％
  67   3.4M   0.0023g/L   98.6％
乙醇沉淀实验的总结-当向包含3MNaCl的质粒溶液中添加乙醇时，在30％和33％乙醇浓度之间出现质粒溶解性的显著降低。对于33％或更高浓度的乙醇来说，0.5g/L质粒溶液的基于溶解性的产率为大约99％。在水-乙醇混合物中，提高NaCl浓度降低质粒的溶解性(即，″盐析″)。在水-EPA混合物中，在盐析浓度之外添加盐引发溶解性提高(″盐溶″)。当取代kosmotropic醋酸钠时，盐析和盐溶在效果上都被减弱了。甲醇具有从强盐溶液中沉淀质粒的能力，但需要过量50％的溶剂水平。
实施例5
最终DNA精加工程序：醇沉淀
如上所示，质粒DNA的PEG沉淀和以TFF模式进行微孔过滤是可行的选择，以代替大规模质粒DNA纯化方法的最后浓缩/精加工步骤中的超滤。在美国专利申请号09/875,379(上文)中介绍的早期开发工作显示乙醇可以被用作沉淀溶剂以得到质粒DNA的干燥粉末。不过，速率低并且显然会出现产物的极度压缩，除非应用逐级洗涤梯度。本实施例介绍一种生成质粒DNA的大量纯化粉末形式的方法，其特征是通过微孔过滤增强的乙醇沉淀。作为这种方法的加强，同时用微孔过滤进行持续沉淀可以相对于批处理方法显著减小容器的体积。
材料和方法-见实施例4中的“材料和方法”。Pellicon XL微孔过滤药筒，随附的压力计，和0.45μm注射器滤器购买自Millipore。真空过滤装置和膜购买自Fisher。
制备大量质粒粉末的分级过滤/透析过滤程序-一旦溶解性数据确定了质粒沉淀所需的条件，则尝试通过过滤来收集沉淀粉末。选择乙醇作为优化溶剂进行沉淀，这是因为它相对于甲醇来说体积需求低并且它相对于IPA来说具有稳定性。
在第一次尝试过滤沉淀质粒中，将134mL乙醇缓慢添加到包含0.86g/L质粒和3M NaCl的200mL LRA后滤液溶液中，以产生最终浓度为40％v/v的乙醇。利用侧向烧瓶和0.2微米膜滤器(过滤面积为2.1cm2)来尝试过滤。对侧向烧瓶提供20英寸真空。初始的过滤尝试显示随着过滤进行流出量显著降低，并且形成胶样过滤块。所用的滤器为Fisherbrand膜，由醋酸纤维素和硝酸纤维素组成。图13显示在利用这种悬浮液的实验过程中收集的过滤数据。在原始的40％v/v乙醇尝试，并且在添加乙醇产生50％v/v的浓度后再次采集数据。在时间/体积(t/V)对体积(V)曲线图中的相对直线显示几乎不能压缩的块。用50％乙醇观察了显著更高的过滤速率。利用这一数据来估测利用直径为5英尺的滤器(19.6ft2膜面积)进行的大规模成批过滤所需要的时间。计算的估值为利用40％乙醇243小时和利用50％v/v乙醇44小时。由于这些不切实际的过滤时间，所以考虑将切向流过滤(“TFF”)膜作为备选方法。
第一次尝试沉淀质粒的微孔过滤使用具有0.22μm PVDF膜的Millipore Pellicon XL TFF药筒。通过在带障板的玻璃混合容器中向经搅拌质粒溶液添加乙醇，达到40％v/v的乙醇浓度来实现沉淀。质粒溶液的起始NaCl浓度为3M。在两个小时里添加沉淀剂并让其静置大约30分钟后，利用30mL/min的再循环流速尝试微孔过滤。图14A显示随着时间而收集的渗透液体积。还对于每个数据组显示沉淀悬液中DNA的起始浓度。悬液于15mL/min易于过滤，在实验过程中渗透液流出量没有降低。在整个过滤中进料压力计保持大约10psig的读数。这一结果表示固体由膜表面被自由地去除并且不形成块层。在每种情况下，起始悬浮液体积都为500mL。
为了将浆液脱水，使它适于过滤和干燥，随后相对于高浓度乙醇来对浓缩悬浮液进行透析过滤。这种透析过滤还在分离和在滤器干燥器中干燥之前去除了任何NaCl。因为质粒在80％v/v乙醇溶液中不可溶，80％v/v乙醇透析过滤可以用来从悬浮液中去除NaCl，同时保持质粒不可溶的条件。图14B显示在透析过滤过程中的乙醇和盐浓度；图9B显示在乙醇浓度达到80％v/v之前残留的少量盐将使得质粒不能再溶解。还显示了整个过滤过程中在不同乙醇浓度下的NaCl溶解性。在沉淀悬浮液的透析过滤中，渗透流出量于大约15mL/min维持恒定。
在第一次尝试生成干燥粉末过程中，在浓缩至大约4g/L DNA后相对于两倍体积的80％v/v乙醇对质粒悬液进行透析过滤。随后通过在25mm直径，0.2微米PES膜上进行真空过滤来收集固体。在过夜干燥后，产物具有岩石样的外观，这是由于在89.4％乙醇下的乙醇/水共沸混合物造成的。因为湿块乙醇浓度小于共沸组合物，水含量在干燥过程中富集，引发固体成块。随后的配剂操作还使用80％v/v乙醇透析过滤，随后进行过滤，但随后添加几种具有纯乙醇的块透析过滤洗液以转换出残留在块中的80％v/v乙醇。所述洗液确保了湿块中的乙醇水平在干燥前超过共沸组分。将粉末在37℃下进行真空干燥。剩余的物质是干燥的，滑顺的白色粉末。将该物质重新溶解于水中并于260nm测量吸光度，表明该粉末纯度为97％。沉淀和微孔过滤的产率为93％。
总结-真空过滤利用乙醇(40-50％v/v)沉淀的质粒提供了一种虽然是胶样，但几乎不可压缩的块状物；不过，过滤速率太慢，表明需要切向流过滤。成功采用切向流微孔过滤来浓缩并且随后脱水(通过乙醇透析过滤)沉淀质粒。不可行的富含乙醇的的过滤和洗涤变得可行，提供了一种通过真空干燥获得的滑顺粉末。沉淀、微孔过滤、回收和干燥组合步骤的产率为93％，固体纯度为97％(A260)。基于实验室规模观察到的流量，利用利用215ft2的膜面积在8小时内本方法可以进行40,000L批量的处理。
实施例6
质粒DNA的持续醇沉淀和微孔过滤：减小的容器和醇体积
批量模式进行质粒沉淀需要大到足够容纳批量体积和沉淀所需的乙醇量的容器。如果进料和乙醇能够连续泵入更小的中间容器中，从该容器中微孔过滤同时除去液体以便维持恒定的体积，那么将不再需要大型沉淀容器，即使是在高溶剂比下进行沉淀。以此模式，通过连续蒸馏渗透液并再循环至沉淀容器中可以将溶剂损耗最小化。
利用超滤和微孔过滤膜首次尝试连续的沉淀/微孔过滤方法，而无乙醇回收。在这些实验中，通过在搅拌容器中向进料溶液中缓慢添加乙醇至大约40％v/v的乙醇浓度而制备初始的500mL沉淀悬液。让颗粒在大约30分钟里充分脱水。利用具有50cm2过滤面积的Pellicon XLTFF药筒对得到的悬液进行微孔过滤。一旦悬液的体积减少到大约300mL，就添加进料和乙醇溶液以保持悬液体积恒定。图15A显示利用100kD PES膜进行连续沉淀/微孔过滤的数据。向药筒中的进料流速为30mL/min。如图显示，在连续过程中收集到大约200mL渗透液之后，流出量降低到其初始值的大约20％。在利用0.22μm药筒的操作中观察到类似的流量降低。在开始添加后立即可以看到跨药筒压力升高。这种压力升高在观察过的批量微孔过滤中没有出现。这种操作使用柔韧的Masterflex 14号管，5/16″内径，在过滤期间添加进料和乙醇。这种柔韧管比用于批量沉淀的窄管更大。
因为在微孔过滤可以成功进行之前脱水时间似乎是必需的，在容器和滤器之间的停顿体积可以产生迟延时间而提高过滤率，其中颗粒可以在到达膜之前干燥。在实验室规模上对这一理论进行测试，通过在沉淀容器和滤器之间插入一段长度的导管以便在30mL/min的流速下产生一分钟的延迟时间。图15B显示一个试验的数据，其在容器和滤器之间并入一分钟的延迟时间。此试验还使用40％v/v乙醇和设定为30mL/min的进料泵；不过，在此例中使用0.1微米的PVDF膜。显然，在200mL的渗透液体积中，具有延迟时间的程序显示了比在图15A中见到的更小的流出量百分比损失。不过，起始速率比在图15A中的数据更慢。有可能用于产生延迟时间的导管长度导致了摩擦阻力，引起蠕动泵滑移并降低了来自搅拌容器的流速。对于这种操作再次观察到跨药筒的压力上升，这种操作也在过滤期间使用Masterflex 14号管用于添加进料和乙醇。
图15C显示使用与图15B相同延迟时间设置的实验数据，同时将乙醇浓度提高到50％v/v。在此试验中，在某种程度上减小了40％v/v乙醇试验的渗透液流量放缓，但压力升高甚至更加显著。在仅仅30分钟后停止过滤，此时它由于压力上升变得不可行。这一操作也在过滤期间使用Masterflex 14号管用于添加进料和乙醇。
图15A-C中的快速压力上升是半连续沉淀/微孔过滤方法可行性的问题。即使渗透速率可接受，但由通道阻塞引发的压力升高可以迫使在达到所需的浆液浓度前过滤终止。好像有可能通道阻塞是由大的含水颗粒引起的。在尝试在连续方法期间生成较小颗粒的过程中，使用狭窄的HPLC导管用于在过滤期间添加进料和乙醇，而非先前实验中所用的5/16″Masterflex导管。图16A显示使用HPLC导管添加进料和乙醇的试验数据，用40％v/v乙醇并且无延迟时间。跨药筒压力升高没有先前实验中显著，并且与无延迟时间的在先实验相比，相关的流量减少得以改善，显示在图15A中。似乎离出狭窄导管的较高线性速率引起乙醇更好地分散入质粒溶液中，由此避免乙醇的局部过量。不均一的乙醇组分将导致沉淀和再水合，产生大的，粘性颗粒，其可以阻塞膜通道。图16B显示用50％v/v乙醇进行的类似操作的数据。由于在50％v/v乙醇下脱水更快，渗透流量放缓速率比在图16A中要慢得多。在较高溶剂浓度下提高的效能充公预示了可以利用高度量的乙醇来沉淀的其它产品。
总结-可以通过连续的方法来减小质粒沉淀容器的尺寸，其中将乙醇和质粒溶液连续添加至搅拌容器中，同时由同一容器进行微孔过滤，保持恒定的体积。作为对此方法的辅助，对渗透液的连续蒸馏提供了富集的乙醇再循环入沉淀作用，使得所需的溶剂体积最小化并且允许在较高甚至更有利的乙醇浓度下沉淀。在用微孔过滤和超滤膜进行的连续沉淀/过滤实验运行中，渗透液流量降低并且随后达到稳定的速率，这种批量沉淀后获得的恒定渗透液流量相反。与批量沉淀的情况相反，还观察到跨药筒压力的升高。通过LASENTEC监测批量沉淀的颗粒大小表明，在添加乙醇之后，静置大约15分钟的时间对于颗粒增大到平衡大小是必需的，有可能反映了同时发生的聚结和脱水作用。在连续方法中不提供这一静置时间可以解释降低的流量值，因为一些新形成的，在孔中结垢的颗粒在切向过滤后立即被除去。在连续的沉淀/微孔过滤方法中在容器和滤器之间加入一分钟停顿积体以便让颗粒静置提高了渗透液流量。在半连续方法期间使用直径较小的导管用于添加进料和乙醇也降低了跨药筒压力并且提高了流量。离开较狭窄导管口的较高线性液体速度有可能提高乙醇的分散并进入批量悬液，由此提供更加均一的，较小的颗粒，其脱水迅速并且不阻塞膜通道。
实施例7
对于pH转变DNA溶胞产物的剪切
材料和方法-在7L加套玻璃容器中，将2L包含目标超螺旋质粒DNA的OD600＝300大肠杆菌细胞在STET缓冲液中重悬至OD600＝70。向其中加入500单位/mL的重组溶菌酶并加热至37±2℃。将收获的细胞在这种裂解缓冲液中孵育至少2小时。移除大约5L材料用于其它研究；利用剩余的4.7升，将溶胞产物暴露于逐渐提高的剪切速率中，端速从300到2000ft/min。在每个端速上，在提高速度之前将材料保持10分钟-最终达到2000ft/min的端速。最后，将端速减小到300ft/min，并将pH 12溶胞产物过夜混合。
结果-为了测量本发明的下游裂解/溶胞产物澄清程序(即，溶菌酶裂解/pH转变/PEG絮凝作用)的实施所伴随的潜在降解问题，测定暴露于多种端速下的pH 12溶胞产物的剪切敏感性。表7显示定量DNA浓度(g/L)和百分比超螺旋质粒DNA含量(″％SC″)的结果，所述数据是通过0.8％琼脂糖凝胶测定的。随着端速提高至2000ft/min，高的总DNA浓度和超螺旋质粒DNA的百分比得以维持。因而，在高达2000ft/min的端速下没有记录到对质粒DNA的损害，表明作为本发明的部分而公开的裂解技术足以裂解宿主细菌细胞，而不会在裂解容器中剪切DNA。
表7.来自pH转变溶胞产物剪切研究的数据
端速(ft/min) RPM 取样时间   DNA浓度(g/L)   来自凝胶的％SC
  300   255   0min   0.51   51.7％
  500   425   11min   0.51   54.0％
  700   594   22min   0.56   ---
  900   764   33.3min   0.60   64.2％
  1100   934   44min   0.64   67.3％
  1300   1104   55.7min   0.67   72.9％
  1500   1274   67min   0.69   74.5％
  2000   1699   78min   0.67   77.3％
  过夜   255   ～16hr   0.52   60.6％
实施例8
质粒DNA的纯化
裂解/溶胞产物澄清-首先将包含目标质粒DNA的大肠杆菌细胞重悬于STET缓冲液(50mM Tris，100mM EDTA，2％Triton X-100，和8％w/v蔗糖，～pH8.2)中至OD600～70。添加1167U/mL(Epicentretechnologies)的重组溶菌酶，并首先将混合物送至37±5℃，随后孵育2小时。孵育结束后，在1小时里向溶胞产物中加入5N NaOH至最终浓度0.24N并让其孵育1小时。在0.5-1小时里通过加入2.5N醋酸将溶液返回pH 8.0±1.0。随后用PEG6000对溶胞产物进行絮凝，所述PEG6000是在1小时里以50％w/v浆液(在150mM NaCl中)至3.7％w/v添加的。通过离心(例如，Sharpies AS26离心机)进行絮凝溶胞产物的澄清以除去絮凝的细胞碎片，尽管批量离心也是一个选择。离心后的浊度＜30NTU。如果需要更低的离心后浊度，可以利用精加工过滤来帮助去除残留的细胞碎片。例如，能够以大约70L/m2的加样量利用具有Millipore DE40或CE50深度滤器的12-英寸Cuno过滤机，来达到低于10NTU的浊度。
此外，可以实施CTAB低切沉淀步骤至大约0.15％(w/v)以除去可溶性蛋白质和内毒素，特别是如果实施了下游LRAII过滤的话。这可以通过在1小时里向絮凝溶胞产物添加40mM NaCl中的2％(w/v)CTAB来进行以防止热点过滤。随后所述材料就可以进行如上所述的澄清作用了。
CTAB沉淀-以单一的0.50％w/v CTAB诱导沉淀步骤在10g/LCelpure P300(硅藻土)存在的情况下由澄清的宿主细胞溶胞产物中将超螺旋质粒DNA沉淀出来。在2小时里将40mM NaCl中的2％w/vCTAB溶液添加至澄清溶胞产物中以防止热点形成。过滤溶胞产物，首先用四分之一批量体积的含有50mM NaCl的5％IPA洗涤过滤块。随后用十分之一批量体积的50mM NaCl来洗涤过滤块。CTAB和X-100的分子团是造成DNA沉淀的原因。CTAB/Triton X-100分子团比游离的CTAB提高了对于质粒DNA的选择性，是由于分子团中CTAB电荷的排列间隔以双链DNA主链上的磷酸根电荷。随后取洗涤过的块进行重新溶解步骤。
重新溶解和硅酸钙批量吸附-重新溶解必需人工从搅拌滤器槽中除去包含CTAB-沉淀DNA的块。随后将此块重悬于3M NaCl中，达到1.2g/L的目标DNA浓度(其中所述目标DNA浓度可以从大约0.3到大约1.2g/L)。起始3M NaCl装料包含25g LRAIIg DNA并被孵育至少4小时。这种起始LRAII孵育能够以分级程序进行，其中将12.5gLRAD/g DNA的起始装料孵育至少4小时，随后将第二个12.5gLRAD/g DNA装料再孵育一段时间(最少6小时)。随后对重悬材料测定浓度(例如，AEX测定)并进行凝胶电泳(E-凝胶运行于60V 30-50分钟)。在此起始孵育步骤之后，对每个E-凝胶电泳测得85％SC之下的百分比超螺旋点添加0.5-0.75g LRAIIg DNA。让此混合物静置过夜，对该批次再次测定浓度和超螺旋百分比。如果该材料＞85％SC，则开始过滤；如果不是，则添加更多的LRAII。
利用Cuno 12英寸机(4-high)用和批量溶液中Celpure和LRAII成比例的膜面积来过滤重新溶解的质粒DNA溶液。一般地，1克Celpure或LRAII占用高达～4mL的体积。基于LRA和Celpure的总量，在上面的Cuno过滤机中利用适当数目的Millipore CE50深度过滤药筒(十二英寸周长，6室)。过滤结束后，装入足够量的3M NaCl以填充该机并再流通30分钟。保存所述材料，并重复洗涤。这些洗涤步骤是要回收夹带于Celpure和LRAII块中的高百分比的质粒DNA。随后将所述材料置入另一个槽中作第二次LRAII处理。
第二次硅酸钙批量吸附-进行第二次LRAII孵育以保证基本去除残余的大肠杆菌宿主细胞DNA。向质粒溶液中添加大约10g LRAII/gDNA并孵育4小时。随后通过凝胶电泳(E-凝胶60V 30-50分钟)测定溶液并与LRAII一起以2g/g DNA每2小时的速度装料，直到达到＞90％的超螺旋质粒DNA纯度，在随后每一次添加之前进行测定。过滤，如果此第二次LRAII步骤利用1-2Millipore Series 2000机的话，所述1-2Millipore Series 2000机具有，30″，0.45μm Durapore滤器，具有足够的块容量并防止水合硅酸钙旁流入下游步骤中。
基于PEG的沉淀和乙醇粉末化-通过添加聚乙二醇(PEG)后接两个独立的过滤/透析过滤步骤的沉淀步骤代表了DNA纯化方法中的最后精加工步骤。向第二次LRAII滤液中添加50％w/v PEG 6000溶液至最终浓度10％w/v，产生1.2M NaCl的最终盐浓度。利用中空的纤维MF膜步骤，浓缩沉淀的浆液并清除残余RNA和杂质来实施第一个过滤步骤。随后将浓缩的浆液相对于1.2M NaCl中的5倍透析过滤体积的10％w/v PEG 6000进行透析过滤。随后利用基于第二个搅拌过滤容器的过滤步骤来进一步浓缩潴留物。首先，通过在30分钟里表面添加等体积的200号乙醇而将潴留物调节至50％(v/v)乙醇，用乙醇替换PEG并将DNA脱水。随后利用25微米孔径的不锈钢筛在设备中对溶液进行浓缩，并相对于6倍透析过滤体积的200号乙醇进行透析过滤。在真空下将最终的乙醇沉淀产物进行干燥以获得精细粉末形式的DNA。一旦产生了成批粉末，可以将所述材料重悬(例如，5-9g/L)。利用Millipore Millipak 200滤器(0.22μm，PVDF)以大约400克/平方米的加样量以1500mL/min/m2的流速可以进行重悬DNA溶液的无菌过滤。
代表性的方法产量/杂质清除数据-以上方法对于两种DNA质粒，质粒A和质粒B的产量分别为17.2和19.0克(见图17A和B)。图17A显示两种生产运行的超螺旋质粒DNA的总产量，而图17B显示在操作过程中的主要杂质水平。测定结果证实所有的主要杂质都被减少至测定量化水平之下。
实施例9
细菌细胞收获程序
收获步骤的目的是浓缩和洗涤包含目标生物分子(包括但不限于，超螺旋质粒DNA)的宿主细胞用于纯化。此实施例描述了携带目标质粒DNA的大肠杆菌宿主细胞的收获。
同时用500MWCO(UFP-5OO-E-75)操作六只3.7m2GEHealthcare(原A/G Tech)中空纤维药筒，总共22.2m2。关键参数为跨膜压(“TMP”)，入口压力，交叉流速，浓缩倍数和流量。收获时的培养物光密度为80-100OD600，而测定体积的产率为～1g质粒/L。在收获时将发酵罐肉汤冷却至＜10℃。通过在潴留物容器和/或潴留物线上冷却而在整个微孔过滤和分装过程中保持此温度。通过控制阀调节潴留物背压开始将TMP保持于10psig而进行收获步骤。将交叉流速设定至50mL/min/纤维(对于22.2m2来说为300LPM)。随着批量产物变浓，进料压力提高。当进料压力达到25psig(TMP～15psig)，根据需要减小交叉流速以保持～25psig的进料压力。浓缩倍数是基于与OD600相关的干细胞重量(DCW)。OD600最终为300是纯化目标。基于在开发过程中获得的80-100的起始培养物OD600，将需要3-4倍的浓缩倍数。
进行浓缩直到达到目标浓缩倍数或直到观察到显著的流量减少(在高生物量培养物的情况下)。可以定义临界值流量水平，以便结束浓缩。在浓缩结束时，以大约4倍透析过滤体积的磷酸钠溶液(RCM635-0.12M NaCl，5mM磷酸氢二钠(无水Na2HPO4)，1mM磷酸二氢钠(一水NaH2PO4))进行透析过滤，以洗涤浓缩细胞。如果在浓缩过程中没有达到目标浓缩倍数，那么将该批次在透析过滤结束后进一步进行浓缩。以进料和出料的模式来进行浓缩和透析过滤，通过调节肉汤向槽中的进料速率以抵偿渗透速率而在潴留物容器中维持恒定的液体水平。
当透析过滤结束时，细胞浆在分装过程中于＜10℃保持充分混合的状态。将等份分装在2-L Nalgene瓶或8-L Stedim袋中并冷冻至＜-60℃作随后的储存。干冰浴或在立式冰箱中静态冷凝是可接受的冷冻方法。
对于宿主细胞收获所用的加工设备规格的示例列于表8中。在此例中，称作潴留物容器的600-L容器将限制可以加工的材料的量。假定最小浓缩倍数为3倍，则可以收获～1200L的优化加工体积。这一体积确保了在槽中对于透析过滤之前浓缩浆的选择性稀释有足够的空间。1200L培养物体积的膜加样将会是54L/m2。
表8：DNA收获步骤的设备规格
  潴留物容器  600L轻便槽(VE-5140)
  潴留物容器工作体积  420L
  过滤垫木  大型微孔过滤垫板(MF-4510)
  进料泵最大值＊  420LPM
  膜持有能力  22.2M2(6×3.7M2)
＊在零背压下的最大泵。泵容量将随着背压的提高而降低。
推荐在浓缩后基于进行中的肉汤光密度测量和～300的OD600目标来计算该批次的浓缩倍数。利用这一实例，1200L的起始培养体积将生成＞300L的细胞浆用于下游加工。该批次首先将被浓缩至少3倍(或直到在高生物量培养物的情况下观察到流量减少)，随后用4倍透析过滤体积的磷酸钠溶液进行透析过滤，最后浓缩至最终目标300 OD600。对于透析过滤来说需要最少1600L的缓冲液，另需400L用于膜的使用前调制。

Claims (36)

1.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：
(a)裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；和，
(b)通过絮凝宿主细胞碎片来澄清所述宿主细胞溶胞产物。
2.权利要求1的方法，其中将所述溶胞产物用聚乙二醇(PEG)絮凝剂絮凝。
3.权利要求2的方法，其中将步骤(a)的宿主细胞在含溶菌酶的标准STET缓冲液中裂解。
4.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：
(a)裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；和，
(b)通过用PEG絮凝宿主细胞碎片来澄清所述宿主细胞溶胞产物。
5.权利要求4的方法，其中将步骤(a)的宿主细胞在含溶菌酶的标准STET缓冲液中裂解。
6.权利要求5的方法，其中STET缓冲液含PEG。
7.权利要求5的方法，其中在溶胞作用后向溶胞产物中加入PEG。
8.权利要求7的方法，其中PEG絮凝剂的分子量约在1450Da到约15,000Da之间。
9.权利要求7的方法，其中在加入PEG前将宿主细胞溶胞产物的pH调至碱性，随后再中和。
10.权利要求9的方法，其中将pH调至碱性和随后的中和反应包括将宿主细胞溶胞产物的pH升高到约pH 12-约pH 13的碱性值，随后降低所述细胞溶胞产物的pH到约pH 7-约pH 9。
11.权利要求10的方法，其中在连续的离心条件下将PEG加入到经过碱性调节和中和的宿主细胞溶胞产物中，在上清液中获得带超螺旋质粒DNA的絮凝细胞碎片小球。
12.权利要求7的方法，其中在加入PEG后将宿主细胞溶胞产物的pH调至碱性，随后再中和。
13.权利要求12的方法，其中将pH调至碱性和随后的中和反应包括将含PEG的宿主细胞溶胞产物的pH升高到约pH 12-约pH 13的碱性值，随后降低所述溶胞产物的pH到约pH 7-约pH 9。
14.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：
(a)在生理裂解缓冲液中裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；
(b)通过将所述溶胞产物的pH升高到约pH 12-约pH 13的碱性值，使步骤(a)中的宿主细胞溶胞产物的pH调至碱性；
(c)中和步骤(b)中调节碱性的细胞溶胞产物约至裂解缓冲液的pH；
(d)通过用PEG絮凝宿主细胞碎片，来澄清步骤(c)的细胞溶胞产物；和，
(e)除去步骤(d)的絮凝的宿主细胞碎片，获得含可溶超螺旋质粒DNA的溶液上清液。
15.权利要求14的方法，其中步骤(a)的生理裂解缓冲液是标准STET缓冲液。
16.权利要求14的方法，其中在步骤(d)和(e)之间进入去垢剂诱导的沉淀步骤，沉淀碎片和非超螺旋质粒，进一步澄清细胞溶胞产物。
17.权利要求17的方法，其中去垢剂是溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)
18.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：
(a)沉淀所述超螺旋质粒DNA；和
(b)通过切向流过滤模式下微孔过滤来浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA。
19.权利要求18的方法，其中使用选自醇和PEG的沉淀剂，在步骤(a)中沉淀超螺旋质粒DNA。
20.权利要求19的方法，其中用PEG沉淀超螺旋质粒DNA。
21.权利要求20的方法，其中用分级过滤方法浓缩所述沉淀的超螺旋DNA，包括：
(a)第一次过滤浓缩步骤，包括切向流过滤下的微孔过滤；
(b)用含PEG的透析过滤缓冲液进行第一次透析过滤步骤，其中所述透析过滤缓冲液包括足够的PEG和盐以保持所述超螺旋质粒DNA沉淀；
(c)脱水步骤，其中通过加入乙醇来部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA；
(d)第二次过滤浓缩步骤；和，
(e)用100％(v/v)乙醇进行第二次透析过滤步骤。
22.权利要求21的方法，其中步骤(b)所述的透析过滤缓冲液含有约10％(w/v)的PEG6000和约1.2M NaCl。
23.权利要求22的方法，其中加入乙醇至终浓度约50％(v/v)来部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA。
24.权利要求21的方法，其中所述第二次过滤浓缩步骤在细胞搅动过滤干燥器中进行。
25.权利要求18的方法，其中用乙醇沉淀超螺旋质粒DNA。
26.权利要求25的方法，其中用分级过滤方法浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA，包括：
(a)第一次过滤浓缩步骤，包括切向流过滤下的微孔过滤；
(b)用乙醇溶液进行第一次透析过滤步骤，其中所述乙醇溶液浓度足够保持所述超螺旋质粒DNA沉淀；
(c)第二次过滤浓缩步骤；和，
(d)用100％(v/v)的乙醇进行第二次透析过滤步骤。
27.权利要求26的方法，其中步骤(b)乙醇溶液中乙醇的浓度约为80％(v/v)。
28.权利要求27的方法，其中所述第二次过滤浓缩步骤在细胞搅动过滤干燥器中进行。
29.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：
(a)用PEG沉淀所述超螺旋质粒DNA；
(b)通过切向流过滤模式下微孔过滤浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA；
(c)通过加入乙醇来部分脱水所述的浓缩的沉淀DNA；和，
(d)在细胞搅动过滤干燥器中浓缩所述部分脱水的沉淀DNA。
30.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：
(a)在生理裂解缓冲液中裂解含超螺旋质粒DNA的微生物宿主细胞，形成宿主细胞溶胞产物；
(b)通过用PEG絮凝宿主细胞碎片来澄清所述宿主细胞溶胞产物；
(c)用PEG沉淀所述超螺旋质粒DNA；和
(d)通过切向流过滤模式下微孔过滤浓缩所述沉淀的超螺旋质粒DNA。
31.权利要求30的方法，其中步骤(a)所述宿主细胞在标准STET缓冲液中裂解。
32.权利要求31的方法，其中在加入PEG絮凝剂前将宿主细胞溶胞产物的pH调至碱性，随后再中和。
33.权利要求32的方法，其中将pH调至碱性和随后的中和反应包括将宿主细胞溶胞产物的pH升高到约pH 12-pH 13的碱性值，随后降低所述溶胞产物的pH到约调节碱性之前的pH。
34.从大规模微生物发酵的细胞溶胞产物中纯化超螺旋质粒DNA的方法，所述方法包括：
(a)从发酵液中收集微生物宿主细胞；
(b)在足够量的生理裂解溶液中裂解宿主细胞；
(c)通过将所述溶胞产物的pH升高到约pH 12-约pH 13的碱性值，使宿主细胞溶胞产物的pH调至碱性；
(d)中和调节碱性的细胞溶胞产物至裂解缓冲液的pH；
(e)加入PEG絮凝宿主细胞碎片，来澄清步骤(d)的细胞溶胞产物；
(f)除去所述絮凝的宿主细胞碎片；
(g)用溴化十六烷基三甲基铵诱导的沉淀作用选择性沉淀超螺旋质粒DNA；
(h)在含有水合结晶硅酸钙和优化离子强度的精制缓冲液中再溶解超螺旋质粒DNA，和吸附杂质；
(i)第二次用水合结晶硅酸钙诱导的吸附作用来吸附残留杂质；
(j)用PEG沉淀超螺旋质粒DNA；
(k)使用切向流过滤模式下的微孔过滤来浓缩沉淀的超螺旋质粒DNA；
(l)加入乙醇来部分脱水沉淀的超螺旋质粒DNA；
(m)在细胞搅动过滤干燥器中浓缩脱水的超螺旋DNA；和，
(n)干燥除去乙醇。
35.权利要求34的方法，其中所述微生物细胞在标准STET缓冲液中裂解。
36.权利要求34的方法，其中在步骤(e)和(f)之间加入溴化十六烷基三甲基铵诱导的低切沉淀步骤，沉淀碎片和非超螺旋质粒，进一步澄清细胞溶胞产物。
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