JP2003518380A - 核酸および他の細胞性汚染混入物質からウイルスベクターを分離するための濾過助剤の使用方法 - Google Patents

核酸および他の細胞性汚染混入物質からウイルスベクターを分離するための濾過助剤の使用方法

Info

Publication number
JP2003518380A
JP2003518380A JP2001548668A JP2001548668A JP2003518380A JP 2003518380 A JP2003518380 A JP 2003518380A JP 2001548668 A JP2001548668 A JP 2001548668A JP 2001548668 A JP2001548668 A JP 2001548668A JP 2003518380 A JP2003518380 A JP 2003518380A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
virus
diafiltered
onto
concentrated
resin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001548668A
Other languages
English (en)
Inventor
デイビッド・エス・マクニーリー
ウィリアム・オー・オズバーン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genzyme Corp
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of JP2003518380A publication Critical patent/JP2003518380A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 被包ウイルスの精製方法が開示される。該方法は、精製用ヌクレアーゼのかわりに濾過助剤を低濃度の金属イオンとともに使用するという点において有利である。これにより商業的規模のウイルス精製のための重要な利点が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、珪藻質の（珪土質の）土または他の濾過助剤を用いることにより、
細胞溶解物中のウイルス粒子を、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび他の宿主細胞成分から分
離するための非酵素的方法に関し、その結果、濾過ならびに密度勾配遠心分離ま
たはカラムクロマトグラフィーのいずれかを用いて後で行われるウイルス（特に
、被包されたウイルスベクター）の精製が、混入成分である宿主細胞から最小限
の妨害を受けて進行しうる。
【０００２】 発明の背景 感染した（すなわち宿主）細胞からのウイルス（複数も可）の放出後、宿主細
胞ＤＮＡおよびＲＮＡの除去は、被包されたウイルスの製造（すなわち精製）途
中におけるさらなる（「下流」）工程の操作および効率を改善するための重要な
工程である。このことは、動物（ヒトを含む）において臨床的に使用されるウイ
ルスに関して特に重要である。これらのウイルスの例はアデノウイルスセロタイ
プ（または株）２および５ならびにアデノ随伴ウイルス（本明細書において、そ
れぞれＡｄ２およびＡｄ５、ならびにＡＡＶと略称する）である（これらに限ら
ない）。
【０００３】 現在、ウイルス精製途中で高分子核酸（すなわちＤＮＡおよびＲＮＡ）を除去
するために最も頻繁に使用されている方法は、種々の加水分解ヌクレアーゼ酵素
を用いるものである。これらはまとめてヌクレアーゼと呼ばれ、精製スキームの
初期の「上流」工程でよく使用される。これを行うために、数種の市販ヌクレオ
チドおよびヌクレオチド混合物（「カクテル」）がある。かかる酵素調合品の使
用目的は、宿主細胞のＤＮＡおよびＲＮＡの加水分解または消化である。加水分
解後、より小さなサイズの核酸が除去され（例えば濾過により）、あるいはいく
つかの他の物理的相違により（例えば、塩化セシウムＣｓＣｌ密度勾配超遠心沈
降法における密度の相違を利用することにより）さらに精製されて、ウイルスか
ら分離される。
【０００４】 すべての宿主細胞成分および添加物（ヌクレアーゼのごとき）は、最終精製組
成物中にウイルスとともに共精製されうるという好ましくない潜在能力を有して
いる。細胞溶解物を処理する間に、添加物および宿主細胞の染色体（またはゲノ
ム）ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白、膜および他の細胞残さ成分は、例えば、慣用的なＣ
ｓＣｌ密度勾配遠心分離法を行っている間にウイルスの平衡沈降を妨害しうる。
クロマトグラフィーのごとき別の方法において、汚染混入物質は、クロマトグラ
フィー媒体との相互作用に関してウイルスと競争する可能性があり、また競争す
る。そのことは、正に帯電したアイオン交換クロマトグラフィー樹脂をウイルス
の精製に使用する場合に、特に真実である。混入成分のなかで、その大きな分子
サイズおよび粘度により特徴づけられる唯一のものは、溶解法により放出される
宿主のゲノムＤＮＡである。加水分解（あるいは除去）されない場合には、この
ポリアニオン性核酸は濾過およびクロマトグラフィー装置を頻繁に詰まらせる。
【０００５】 現在のウイルス精製法に伴う操作上の不可避な問題のほかに、ヌクレアーゼの
使用は他の重要な欠点を示す。これらの欠点の例は下記のものを包含する： ａ)市販ヌクレアーゼ調合品の純度およびロットの変動が観察されている。添
加されるヌクレアーゼ試薬は、ウイルス蛋白含有被包に対するダメージを避ける
ほど十分に純粋でなくてはならない。このダメージは、多種の蛋白分解酵素（プ
ロテイナーゼまたはプロテアーゼ）のいずれか１つのごとき潜在的な汚染混入物
質により引き起こされうる。さらにロット間の変動はヌクレアーゼ活性の減少ま
たは増加により生じうる。例えば、一部には市販ヌクレアーゼの通常でない活性
のロットによりウイルス調合品の損失が観察される。 ｂ）ヌクレアーゼ（市販されているもの、ならびに商業用途または臨床用途に
生物学的材料を処理加工するために特別に製造されたもの）は高価であり、大部
分のウイルス製造操作を最も金のかかるものとしている。 ｃ）ウイルス精製を行うための試薬の添加（この場合ヌクレアーゼの添加）は
、最終製品中の特定試薬の不存在を示すように設計された品質管理アッセイの開
発または導入の必要性を生じさせる。プロセスからの試薬（ヌクレアーゼのごと
き）の除去は、そのような試薬の存在に関するアッセイの必要性をなくし、製品
仕様書を簡略化させる。
【０００６】 一部には、Escherichia coli（E. coli）発現系における「ｎａｋｉｄ」プラ
スミドＤＮＡを単離するための適当な方法を検討した結果として、適当な条件下
において細菌ＤＮＡが一定グレードの珪藻土に吸着されることが見出された。珪
藻土は世界中の無機質ビーズ中に見出され、絶滅した海洋生物である珪藻の二酸
化ケイ素（ＳｉＯ２）骨格から構成されていることが知られている。二酸化ケイ
素は珪砂（および、それゆえガラス）中の主要構成成分である。それは不活性で
あり、さらに、硫酸アンモニウムまたは他のカオトロピックな塩の存在下を包含
する特定の適当な条件下で核酸を吸着することが知られている。それは、シリカ
ートのヒドロキシルと核酸上の負に帯電したホスファートとの間に塩橋を作るこ
とにより、これを行う。
【０００７】 ウイルスの発現に使用される動物細胞中にも見出されるＤＮＡ、そしておそら
くＲＮＡ、および他の宿主細胞構成成分が珪藻土と相互作用する場合に、これら
を除去できないか、ということを本発明者らは考えた。実際、ウイルス発現用の
動物細胞システム中に導入された場合、珪藻土は実際に２６０ｎｍにおけるＵＶ
光を吸収する核酸を吸着することが見出された。そして、細胞がウイルスに感染
しているか否かにかかわらず、このことが起こった。精製ウイルス粒子は珪藻土
に吸着しない（また、捕捉されるようにもならない）ことが、さらに見出された
。ウイルスおよび珪藻土を含む懸濁液の濾過による濾液あるいは遠心分離された
上清中に、ほぼ１００％のウイルス粒子を回収することができた。
【０００８】 かくして、一定条件下で、珪藻土または他の適当な濾過助剤をウイルス精製初
期（すなわち、宿主細胞溶解直後）に用いることは、すべてのゲノムＤＮＡおよ
びＲＮＡ、大部分（すべてではないとしても）の細胞性残さ（膜および膜結合分
子のごとき）ならびにいくつかの蛋白を、BenzonaseTMまたは他のヌクレアーゼ
酵素を使用することなく実質的に除去することができよう。そのアイデアは、不
活性な珪藻土の使用に関するさらなる根拠を提供した。すなわち、化学的に定義
され、生物学的に不活性な珪藻土（生物学的起源のヌクレアーゼのかわり）はウ
イルス製品を改善するはずであり、最終製品中のヌクレアーゼ（複数も可）の除
去（すなわち不存在）を示すように設計されなくてはならない仕様に関する試験
をしなくてすむであろう。
【０００９】発明の概要 ウイルス製造の分野において、精製の初期工程の間にＤＮＡを加水分解（言い
換えれば「消化」または「分解」）してより小さい（あるいはより低分子量の）
フラグメントにするために、種々の核酸加水分解酵素（まとめてヌクレアーゼと
いう）が最も頻繁に使用されている。本発明の方法は、ヌクレアーゼのかわりに
、制御された量の、適当な市販されている、化学的に定義され、不活性な濾過助
剤；特に、珪藻土、WhatmanTM CDR [Cell Debris Remover]材料またはDEAE-セル
ロースを使用することにより、かかるヌクレアーゼを用いる必要性を特異的に除
去する。この方法により、宿主由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞残さならびにある種
の蛋白が物理的に除去される。外来性ヌクレアーゼの必要性を除去することは、
濾過およびクロマトグラフィーのごとき下流操作の能力を改善することにより、
それらに関する試験の必要性も除去し、ウイルス製品の品質を改善し、さらにプ
ロセスの収率を高める。
【００１０】 したがって、ウイルス、特に、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチ
ウイルスを包含するレトロウイルス、およびアルファウイルスのごとき被包され
たウイルスの精製に適した精製方法が提供され、該方法において、ＤＥのごとき
適当な濾過助剤がヌクレアーゼ酵素のかわりに用いられる(図１）。好ましくは
、本発明方法は少なくとも２つの工程を含む。第１の工程は、ウイルスを含有す
る細胞培養物または組成物を珪藻土または他の適当な濾過助剤で処理することを
含む。第２の工程は、ＤＥ処理により得られたウイルスを含有する培養物または
組成物を、ウイルスを吸着する、あるいはウイルスに伴う汚染混入物質を吸着す
る、さらなる精製工程に付することを含む。好ましくは、第２の精製工程は、ウ
イルス（および汚染混入物質）と利用可能なクロマトグラフィー媒体との間の相
互作用に関して少なくとも２つの異なる物理的特性を利用するクロマトグラフィ
ー工程を含む。もちろん、得られる精製組成物の純度および／または安定性をさ
らに向上させるためにさらなる精製工程を用いるプロセスを使用してもよい。
【００１１】 BenzonaseTMまたは他のヌクレアーゼ酵素を用いずに宿主細胞ＤＮＡおよびＲ
ＮＡを除去するための別法は、イオンに基づいて機能するWhatmanTM CDR [Cell
Debris Remover]材料のごとき濾過助剤を用いるデッドエンド濾過（dead end fi
ltration）の使用を含む。ＡＡＶ（ＤＥＡＥ−セルロースに結合しない）の場合
には、BenzonaseTM用いることなく宿主細胞ＤＮＡおよびＲＮＡを除去するため
の別法は、WhatmanTM DEAE-セルロースのごときＤＥＡＥ−セルロースを濾過助
剤として用いることを含む。ＤＥＡＥ−セルロースに結合しうるアデノウイルス
および他のウイルスに関してＤＥＡＥ−セルロースを用いるためには、イオン強
度等の条件を調節して、ウイルスがＤＥＡＥ−セルロースから容易に溶離し、あ
るいはそれに結合しないようにしなくてはならない。ウイルスの精製にＤＥを用
いるのと同様に、これらの別システムは、精製プロセスにおいてBenzonaseTMま
たは他のヌクレアーゼ酵素を必要とせずに宿主細胞ＤＮＡおよびＲＮＡの除去を
行うという利点を有する。かくして、もう１つの具体例において、本発明は、ヌ
クレアーゼ酵素を使用することなく、被包ウイルスを含む組成物から宿主ＤＮＡ
およびＲＮＡを除去する方法を含み、該方法は、ウイルスを含有する細胞培養物
または組成物を珪藻土、WhatmanTM CDRまたはDEAE-セルロースのごとき濾過助剤
で処理すること、ならびにウイルスまたはウイルスに伴う汚染混入物質のいずれ
かを吸着する１またはそれ以上のさらなる精製工程を含む。
【００１２】 好ましい具体例において、カリウム（Ｋ＋）またはナトリウム（Ｎａ＋）のよ
うな１価イオン、より好ましくはニッケル（Ｎｉ２＋）、亜鉛（Ｚｎ２＋）、バ
リウム（Ｂａ２＋）、コバルト（Ｃｏ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、マン
ガン（Ｍｎ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）のような２価イオン、あるいは鉄イ
オン（Ｆｅ３＋）のような３価イオンのごとき金属イオンを濾過中に使用して、
最大ＤＮＡおよびＲＮＡ結合を促進する。金属イオンを塩の形態として、例えば
、酢酸亜鉛または塩化ニッケルとして添加してもよい。本発明においては、塩化
物、クエン酸塩、リン酸塩および硫酸塩を包含する他の形態の塩も有用でありう
る。
【００１３】 したがって、本発明は、細胞培養物からの被包ウイルスの精製方法を含む。好
ましい具体例において、本発明の方法は下記工程を含む： （ａ）被包ウイルスを含む細胞培養物を溶解させ； （ｂ）工程（ａ）から得られた組成物を、珪藻土（ＤＥ）およびポリ−アニオ
ン性セルロース濾過助剤（例えば、WhatmanTM CDRまたはDEAE-Cellulose）から
なる群より選択される物質を用いる濾過に供して濾液を得て； （ｃ）工程（ｂ）の濾液を１またはそれ以上の適当な濃縮およびダイアフィル
トレーション（diafiltration）工程に供して、濃縮されダイアフィルトレーシ
ョンされた保持液を得て；次いで （ｄ）工程（ｃ）の濃縮されダイアフィルトレーションされた保持液を１また
はそれ以上の適当な精製工程に供し、被包ウイルスを含む精製された組成物を収
集する。
【００１４】 好ましい具体例において、例えば、細胞溶解の前に十字流濾過または遠心分離
を用いてウイルス含有細胞を細胞培養ブロスから収穫してもよい。別法として、
未収穫細胞を含む細胞培養物に対して直接的に細胞溶解を行ってもよい。好まし
い具体例において、マイクロフルイダイゼーション（microfluidization）、ス
タチックミキサー（static mixer）を用いる、あるいは用いない界面活性剤処理
、あるいは凍結／融解サイクルに付すことにより細胞溶解を行ってもよい。当該
分野で知られたいずれの方法により細胞溶解を行ってもよい。
【００１５】 本発明の主な特徴は、工程（ｂ）にて説明された濾過助剤の使用にある。この
工程は、珪藻土、ポリ−アニオン性セルロース（またはポリ−アニオン性担体）
をベースにした濾過を用いて、細胞培養物中に存在するＤＮＡおよびＲＮＡ種か
らのウイルスの分離を改善してもよい。好ましくは、濾過工程は少量の金属イオ
ンまたは塩の存在を含む。金属イオンまたは塩はＤＮＡまたはＲＮＡの結合促進
に適したいずれの金属イオンであってもよい。好ましい具体例において、金属イ
オンは、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、塩化ニッケル、硫酸ニッケル、塩化鉄、塩化銅お
よび塩化バリウムからなる群より選択される塩の使用により提供される。先行技
術の方法は、かかるＤＮＡおよびＲＮＡ種を分解するために、BenzonaseTMのご
とき消化酵素をよく使用していた。しかしながら、上記のごとく、かかる方法は
重大な欠点を有する。
【００１６】 濾過に続いて、本発明の方法は、１またはそれ以上の濃縮および／またはダイ
アフィルトレーション工程、ならびに精製工程を含む。濃縮、ダイアフィルトレ
ーションおよび精製のための方法は当該分野においてよく知られており、当業者
はかかる工程の最適な組み合わせを選択することができる。かかる最適化は本発
明の範囲内であり、本発明から逸脱しない。本明細書にてさらに説明するように
、工程（ｃ）の濃縮およびダイアフィルトレーション工程ならびに工程（ｄ）の
精製工程を反復して行ってもよい。それゆえ、工程（ｂ）の保持液を濃縮工程に
供して、濃縮されたダイアフィルトレーションされていないウイルス粒子を含む
組成物を得てもよい。この組成物を工程（ｄ）の１またはそれ以上の精製工程に
供してもよい。得られる組成物は精製され濃縮されたウイルス粒子を含み、これ
を１またはそれ以上のダイアフィルトレーション工程に供してもよく、次いで、
さらなる精製工程に供してもよい。同様に、工程（ｂ）の未濃縮濾液を１または
それ以上のダイアフィルトレーション工程に供してもよい。次いで、ダイアフィ
ルトレーションされた未濃縮ウイルス粒子を含む組成物を工程（ｄ）の１または
それ以上の精製工程に供してもよい。得られる組成得物は精製されダイアフィル
トレーションされたウイルス粒子を含み、これを１またはそれ以上の濃縮工程に
供してもよく、次いで，さらなる精製工程に供してもよい。
【００１７】 好ましくは、本発明のダイアフィルトレーション工程（複数も可）は、十字流
濾過を用いる透析（バッファー交換）に保持液を供することを含んでもよい。あ
る好ましい具体例において、工程（ｂ）の濾過助剤による濾過の前に、十字流濾
過を用いる１またはそれ以上のダイアフィルトレーション工程を用いてもよい。
これらの方法において、十字流濾過を用いる１またはそれ以上のダイアフィルト
レーション工程を工程（ｂ）に続いて行うのがさらに望ましい。
【００１８】 好ましい具体例において、本発明方法は、最大のＤＮＡおよびＲＮＡ結合を促
進するためにＤＥまたはポリ−アニオン性セルロース（または他のポリ−アニオ
ン性担体）による濾過の間における最適濃度の金属イオン塩の使用を含む。金属
イオンまたは塩は、ＤＮＡおよびＲＮＡの結合を促進するのに適したいずれのイ
オンであってもよいが、好ましくは、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃ
ｏ、ＫまたはＮａからなる群より選択され、例えば、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、塩化
ニッケル、硫酸ニッケル、塩化鉄、塩化銅、塩化バリウム、塩化マグネシウム、
塩化マンガン、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリ
ウム、リン酸カリウムおよび酢酸カリウムである。
【００１９】 他の具体例において、金属イオンまたは塩は、カリウム、マグネシウム、ナト
リウム、コバルト、およびマンガンのごとき他の金属、ならびに酢酸塩、硫酸塩
、クエン酸塩およびリン酸塩のごとき他の塩の形態を包含しうる。塩化ナトリウ
ムおよび塩化マグネシウムのごときある種の金属イオンに関しては、痕跡量の金
属イオン、好ましくは亜鉛が存在することが好ましい。好ましい方法において、
ＤＥまたはポリ−アニオン性セルロース（または他のポリ−アニオン性担体）に
よる濾過の間に最適濃度の金属イオンを用いて、最大ＤＮＡおよび／またはＲＮ
Ａ結合を促進し、該方法はさらに、金属イオンと宿主細胞ヌクレオチドまたはウ
イルスのいずれかとの結合を修飾しうるヒスチジン、イミダゾールまたは別のア
ミノ酸を含んでいてもよい。ある好ましい具体例において、濾過助剤はポリ−ア
ニオン性セルロースをベースにした濾過助剤であり、宿主細胞ヌクレオチドがポ
リ−アニオン性セルロースに結合し、ウイルスがフィルターから濾液中に流出す
るように塩濃度が調節される。
【００２０】 本発明のさらに他の具体例において、本発明の方法は、工程（ｂ）からの濾液
を生物学的分子の濃縮に使用されるデバイス中に導入することを含む。他の具体
例において、本発明方法は、ウイルス粒子の保持に適した孔サイズを有する膜を
含む透析またはバッファー交換デバイスを用いることを含む。他の具体例におい
て、本発明の方法はさらに、保持されたウイルス粒子を限外濾過により溶液中に
濃縮することを含んでいてもよい。
【００２１】 他の具体例において、工程（ｃ）は下記のものの１つを含んでいてもよい：（
１）より大きいおよびより小さい分子サイズの汚染混入物質からウイルス粒子を
分離することができる孔サイズを有する樹脂を含む透析またはバッファー交換デ
バイスを用いること；（２）ウイルス粒子よりも小さい分子サイズの物質の通過
に適した孔サイズの膜を含む濃縮デバイスを用いること；（３）濃縮前にウイル
ス粒子を含む組成物を透析またはバッファー交換すること；（４）ダイアフィル
トレーション前にウイルス粒子を含む組成物を濃縮すること。
【００２２】 さらなる具体例において、工程（ｃ）のダイアフィルトレーション工程により
、ダイアフィルトレーションされ、濃縮されていないウイルス粒子が得られ、そ
れは適当なアニオン交換クロマトグラフィー樹脂、適当な疎水性相互作用クロマ
トグラフィー樹脂上に負荷されて素通しプールが得られ、それは適当な偽アフィ
ニティー樹脂、または適当なカチオン交換クロマトグラフィー樹脂上に負荷され
る。
【００２３】 他の好ましい具体例において、工程（ｃ）の濃縮されダイアフィルトレーショ
ンされた保持液は、濃縮されたウイルス粒子を塩化セシウムと混合することに適
したものであるか；あるいは濃縮されたウイルス粒子を適当なアニオン交換クロ
マトグラフィー樹脂上に負荷（そしてそれへの吸着を促進）することに適したも
のである。
【００２４】 他の好ましい具体例において、工程（ｃ）の濃縮工程により、濃縮された、ダ
イアフィルトレーションされていないウイルス粒子が得られ、それは適当な疎水
性相互作用クロマトグラフィー樹脂上への負荷に適したものであり、負荷されて
素通しプールが得られるか；あるいは適当なカチオン交換クロマトグラフィー樹
脂上に負荷（そしてそれへの吸着を促進）することに適したものである。
【００２５】 工程（ｄ）の精製工程に関して、被包ウイルス含有組成物を処理するために１
またはそれ以上の精製工程の多数の順列および組み合わせが可能であり、それら
は下記のものを包含する：（１）被包ウイルスを適当なアニオン交換クロマトグ
ラフィーカラムに吸着させること；（２）被包ウイルスを偽アフィニティー樹脂
に吸着させること；（３）素通しプールを適当なカチオン交換樹脂上に負荷する
こと；（４）被包ウイルスを塩化セシウムと混合し、混合物を超遠心にかけるこ
と；（５）素通しプールが得られる条件下で被包ウイルスを適当な疎水性相互作
用クロマトグラフィー樹脂上に負荷し、素通しプール中に被包ウイルスを含む精
製組成物を集めること；ならびに上記の組み合わせ。
【００２６】 かくして、例えば、本発明のある具体例において、工程（ｄ）の精製工程は、
濃縮されたウイルス粒子を塩化セシウムと混合し、混合物を超遠心にかけること
を含む。他の具体例において、精製工程は、先ずダイアフィルトレーションされ
た未濃縮ウイルス粒子を含む組成物を適当なアニオン交換クロマトグラフィーカ
ラム上に負荷し、被包ウイルスをこれに吸着させ、適当な溶出を用いて被包ウイ
ルスを含む精製組成物を集めることを含んでいてもよい。他の好ましい具体例に
おいて、精製工程は、被包ウイルスを含む工程（ｃ）の濃縮されダイアフィルト
レーションされた保持液を適当なアニオン交換クロマトグラフィー樹脂上に負荷
して、被包ウイルスを含む精製組成物を得て、次いで、素通しプールが得られる
条件下で被包ウイルスを含む精製組成物を適当な疎水性相互作用クロマトグラフ
ィー樹脂上に負荷し、素通しプール中に被包ウイルスを含む精製組成物を集める
第２精製工程を行う。さらにもう１つの好ましい具体例において、工程（ｄ）の
精製工程は、濃縮され、ダイアフィルトレーションされていないウイルス粒子を
適当な疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂上に負荷して、素通しプールを得
て、次いで、素通しプールを適当なカチオン交換樹脂上に負荷し、適当な溶出条
件を用い、被包ウイルスを含む精製組成物を集めることを含む。
【００２７】 他の好ましい具体例において、工程（ｄ）の精製工程は、工程（ｃ）の濃縮さ
れダイアフィルトレーションされた保持液を適当なアニオン交換クロマトグラフ
ィー樹脂に吸着させ、適当な溶出条件を用いて、被包ウイルスを含む精製組成物
を集めることを含む。さらに他の具体例において、工程（ｄ）の生成工程はさら
に、素通しプールが得られる条件下で被包ウイルスを含む精製組成物を適当な疎
水性相互作用クロマトグラフィーカラム上に負荷し、被包ウイルスを含む精製組
成物を該素通しプール中に集めることを含む。他の具体例において、工程（ｄ）
の精製工程はさらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムからの素通しプ
ールからの被包ウイルスを含む精製組成物を、適当なカチオン交換樹脂に吸着さ
せ、適当な溶出条件を用いて、被包ウイルスを含有する精製組成物を集めること
を含む。
【００２８】発明の詳細な説明 以下の説明において、下記略号を用いる： Ａｄ２−アデノウイルス、セロタイプ２ Ａｄ５−アデノウイルス、セロタイプ５ ＡＥＸ−アニオン交換 ＣｓＣｌ−塩化セシウム ＣＤＲ−WhatmanTM 細胞残さ除去ポリ−アニオン性セルロースをベースにした濾
過助剤 ＤＥ−珪藻土 ＤＥＡＥ−ジエチルアミノエチル、アニオン交換樹脂 ＤＦ−ダイアフィルトレーション ＨＦＦ−ホローファイバー濾過 ＨＩＣ−疎水性相互作用クロマトグラフィー Ｌｙｓａｔｅ−ウイルスを放出するようにマイクロフルイダイゼーションあるい
は破壊された細胞 ＮＭＷ−公称分子量 ＰＢＳ−リン酸塩緩衝化セイライン ＰＣＲ−ポリメラーゼ連鎖反応 ＳＥＣ−サイズ排除クロマトグラフィー ＴＦＦ−十字流濾過 Ｔｒｉｓ−２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール
；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ＵＦ−限外濾過 ＺｎＣｌ２−塩化亜鉛 ＮａＣｌ−塩化ナトリウム （ＮＨ４）２ＳＯ４−硫酸アンモニウム ２９３細胞−ヒト胚性腎臓細胞の系統
【００２９】支持する方法 ：細胞の収穫 ：細胞懸濁液を適当な容器中にデカンテーションまたはポンピングす
ることにより、あるいは好ましくは、先ず細胞を適当な容器に移し、次いで，Ｈ
ＦＦデバイスを用いてそれらを濃縮しダイアフィルトレーションすることにより
ウイルス含有細胞を細胞培養物から取る。細胞溶解 ：当該分野に知られているいずれかの適当なホモジナイズ法によりウイ
ルス含有細胞を溶解させる。２つの典型的な方法は：１）凍結／融解 培地および細胞を適当サイズの遠心チューブに注ぎ、ドライアイス−エタノー
ルバスに浸すことにより凍結させた。懸濁液が完全に凍結された後、遠心チュー
ブを３７℃の水浴で融解させた。この手順を２回以上繰り返して完全な細胞溶解
を確実なものにした。 次いで、溶液を適当サイズの容器に移してさらなる処理を行い、あるいは将来
使用するまで材料を凍結した。２）マイクロフルイダイゼーション（microfluidization） 細胞融解の前に、マイクロフルイダイゼーション装置（Microfluidics model
110, Microfluidics Co, Cambridge Ms, U.S.A.）を適当な緩衝液中で始動させ
た。 適当な配管を用いて細胞含有培地を収穫容器からマイクロフルイダイゼーショ
ン装置へと導いた。キャビテーションにより細胞を破壊した。次いで、溶解物を
適当な収集容器に集めた。
【００３０】ＣＤＲでの処理 ． １０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有す
る１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４を含む同体積の溶液を添加す
ることにより、ウイルス含有溶解物を希釈する。次いで、ＣＤＲ（細胞残さ除去
剤、WhatmanTM Biochemicals, Maidstone, England）を、０．１ｇ ＣＤＲ／溶
液ｍＬの割合で添加懸濁液に添加する。次いで、一緒にしたウイルス／細胞溶解
物／ＣＤＲ懸濁液を４℃で３０分撹拌して均一な懸濁を達成する。懸濁液を撹拌
している間に、宿主細胞ＤＮＡ、ＲＮＡおよび他の宿主細胞成分がＣＤＲに吸着
される。次いで、デッド−エンド（dead-end）Biocap濾過デバイス（CUNO Fluid
Purification, Meriden, CT, USA）を通して懸濁液をポンピングすることによ
り細胞残さおよびＣＤＲを除去する（注：ウイルス粒子を流すことができ、同時
に、ＣＤＲ−ＤＮＡ複合体および他の細胞関連固体を保持する、当該分野で知ら
れているいずれのタイプのデッド−エンドあるいはデプス（depth）濾過デバイ
スであってもこの工程に使用できる）。
【００３１】 十字流濾過（ＴＦＦ）法：限外濾過（ＵＦ）およびダイアフィルトレーション（
ＤＦ） 後の（すなわち下流）精製工程のための調製において、デプス濾過工程から回
収されたウイルス含有濾液を、公称分子量（ＮＭＷ）カットオフ５０００００ダ
ルトン（５００ｋＤ）を有する膜を装備したAG/T UFP 500 C9A TFFデバイスを用
いる限外濾過（ＵＦ）により濃縮する。ＵＦ濃縮工程後、同じＴＦＦデバイスを
用いて、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）法により保持されたウイルス粒子を
透析する（注：ウイルス粒子を保持（ＴＦＦ）、あるいはサイズにより他の混入
成分を分離する（例えばＳＥＣ）、当該分野で知られたいずれのタイプのＴＦＦ
（またはサイズ排除クロマトグラフィー、すなわちＳＥＣ）デバイスであっても
、この工程に使用することができる。さらに、透析溶液は、ｐＨ６ないし８の範
囲に緩衝化する能力を有するもの、例えばリン酸塩バッファーであってよい。）
。 この段階において、ウイルス豊富で、宿主細胞の核酸および細胞残さが枯渇し
た懸濁液は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配遠心または当該分野で知られた
種々のクロマトグラフィーのごとき方法のいずれかによりさらにウイルスを精製
するのに適している。
【００３２】ウイルス感染性の測定（力価アッセイ） アッセイに使用する前に３７℃のイン
キュベーターでヒト２９３細胞を培養する。このプレートを細胞プレートという
。ウイルス試料を１００００００倍に系列希釈し、次いで、１５０μlの希釈さ
れた試料を９６ウェルマイクロタイタープレートの４つのウェルに移す。その後
、試料を１：２の割合でさらに１２回系列希釈する。希釈された試料を細胞プレ
ートに移し、感染細胞プレートを３７℃で７２時間インキュベーションする。 発色目的で使用される（当該分野で知られた方法により使用される）すべての
ベクター中に存在する導入遺伝子は、倒立型蛍光顕微鏡で観察した場合、緑色蛍
光蛋白を発現する。細胞をインキュベーターから顕微鏡に即座に移した後、プレ
ートを感染に関して評点（すなわち感染性単位（infectivity units））付けす
る。そのうえ、この単純な方法は何ら試薬を要しない。
【００３３】 ウイルス精製 限定するものではないが、アデノウイルスの精製に適した偽アフ
ィニティー樹脂の例は、Mimetic Blue (1 および 2) A6XL、Mimetic RED (2 お
よび 3) A6XL、Mimetic Orange (1, 2 および 3) A6XL、Mimetic Yellow (1 お
よび 2) A6XLならびにBlue Sepharose CL-6BおよびRed Sepharose CL-6B (Amers
hamPharmacia Biotech, Upsala, Sweden)を包含する。限定するものではないが
、アデノウイルスの精製に適したＨＩＣ樹脂の例は、ＥＭＤフェニルおよびＥＭ
Ｄプロピル（EM Separations Technology, Gibbstown, NJ, USA）、フェニルセ
ファロースおよびオクチルセファロース（AmershamPharmacia Biotech, Upsala,
Sweden）ならびにＴＳＫエーテル、ＴＳＫブチルおよびＴＳＫフェニル（TosoH
aas, Montgomeryville, PA, USA）を包含する。限定するものではないが、適当
なアニオン交換樹脂の例は、EMD DEAE (EM Separations Technology, Gibbstown
, NJ, USA)、DEAEセファロース（AmershamPharmacia Biotech, Upsala, Sweden
）ならびにTSK DEAE 650およびTSK DEAE 750 (TosoHaas, Montgomeryville, PA,
USA)を包含する。限定するものではないが、適当なカチオン交換樹脂の例は、E
MD SO3およびEMD COO (EM Separations Technology, Gibbstown, NJ, USA)、Ｃ
ＭおよびＳセファロース（AmershamPharmacia Biotech, Upsala, Sweden）なら
びにTSK CMおよびSP (TosoHaas, Montgomeryville, PA, USA)を包含する。
【００３４】蛋白の測定 ＢＣＡ法（Pierce Chemical Co. Rockford, Illinois, USA)を用い
て試料の蛋白濃度を測定した。製造者の説明書に記載されたようにして該アッセ
イ（当該分野に知られた方法により使用される）を行った。
【００３５】ＤＮＡ定量 ＤＥ濾過を完了する前および後の試料中に含まれるＤＮＡレベルを
、Roche High Pure Template Preparation Kits (Roche Molecular Biochemical
s, Indianapolis, Indiana, USA)を用いてアッセイした。製造者の説明書に従っ
て、当該分野で知られた方法を用いてＤＮＡ単離を行った。Lightcycler装置（R
oche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA）を用いて、定量
的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により単離ＤＮＡを定量することによりＤＮＡ
濃度を見積もった。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ）遺伝子用のプライマーおよび蛍光測定プローブがApplied Biosystems (Fo
ster City, California)において設計され、Operon Technologies (Alameda, Ca
lifornia)により合成された。４５回のＰＣＲサイクルを行った。Ｔａｑポリメ
ラーゼによる蛍光測定プローブの分解を各サイクル後に分析した。Clontech（Pa
lo Alto, California）から得たヒトゲノムＤＮＡ用いて標準曲線を得た。
【００３６】ＲＮＡ定量 ＤＥ濾過を完了する前および後の試料中に含まれるＲＮＡレベルを
、Roche High Pure RNA Isolation Kits (Roche Molecular Biochemicals, Indi
anapolis, Indiana, USA)を用いてアッセイした。試料をカラムに負荷した後で
はなく、試料をカラムに負荷する前にＤＮａｓｅ消化を行うこと以外は製造者の
説明書に従って、当該分野で知られた方法を用いてＲＮＡ単離を行った。Lightc
ycler装置（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA）を
用いて、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により単離ＲＮＡを定量すること
によりＲＮＡ濃度を見積もった。ｒＲＮＡ ｃＤＮＡ配列用のプライマーおよび
蛍光測定プローブがApplied Biosystems (Foster City, California)において設
計され、Operon Technologies (Alameda, California)により合成された。逆転
写サイクルの後に、４５サイクルのＰＣＲを行った。Ｔａｑポリメラーゼによる
蛍光測定プローブの分解を、各ＰＣＲサイクル後に分析した。Clontech (Palo A
lto, California)から得たヒト全腎臓ＲＮＡを用いて標準曲線を得た。上記プラ
イマーおおびプローブを用いて単離ＲＮＡ試料をリアルタイムＰＣＲ分析するこ
とによりＲＮＡ試料中のＤＮＡ混入を調べた。４５回のＰＣＲサイクルを行った
。Ｔａｑポリメラーゼによる蛍光測定プローブの分解を各サイクル後に分析した
。Clontech（Palo Alto, California）から得たヒトゲノムＤＮＡ用いて標準曲
線を得た。見積もったＲＮＡ濃度から混入ＤＮＡ濃度を差し引いて、試料の真の
ＲＮＡ濃度を決定した。
【００３７】 下記実施例は、珪藻土（ＤＥ）を濾過助剤として用いるアデノウイルスセロタ
イプ２（Ａｄ２）の精製に関する本発明の１の具体例の実施について説明する。
上記のごとく、当業者がヌクレアーゼ酵素の使用と比較して有利であると認識す
るであろう他の濾過助剤をかかる精製プロセスに使用することができる。実施例
はいかなる点においても限定的なものでなく、当業者は、多くのクロマトグラフ
ィー法および他の精製法を含め、アデノウイルスおよび他のウイルスの精製に関
して多くの変更、付加および修飾を行いうることを、容易に理解するであろう。
【００３８】実施例 実施例１ 珪藻土（ＤＥ）へのＤＮＡ結合の最適化細胞溶解 収穫後、ウイルスに感染し懸濁された細胞（２９３系）をマイクロフルイダイ
ザー（Model 110, Microfluidics Co, Cambridge, Ma, USA）に１回通した（注
：マイクロフルイダイザーの使用は好ましい方法であるが、細胞をホモジナイズ
または溶解するためのいずれの方法であっても使用できる）。
【００３９】珪藻土（ＤＥ）へのＤＮＡ結合の最適化；塩の影響 ＰＣＲ法により測定した場合、塩成分および塩濃度の両方がＤＥへのＤＮＡお
よびＲＮＡの結合において役割を果たしていることがわかった。実験としては、
２５ｍＬの溶解物を、１０％グリセロールおよび０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８０を
含有する２５ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．４で希釈した。酢酸亜
鉛、塩化亜鉛、塩化第二鉄、塩化ニッケル、塩化バリウム、塩化ナトリウムまた
は塩化マグネシウムのごとき金属塩の濃度を調節して、各希釈バッファー中の最
終濃度が、ウイルス含有溶解物を希釈した場合の最終塩濃度の２倍にとなるよう
にした（試験した最終塩濃度を表１に詳述する）。塩化ナトリウムを用いる場合
、痕跡量の亜鉛のごとき別の金属イオンが存在または添加されるのが好ましい。
試験した最終ＭｇＣｌ２およびＮａＣｌ濃度を表２に詳述する。希釈後、２．５
ｇのＤＥを懸濁液に添加した。次いで、懸濁液を室温で撹拌した。３０分後、０
．４５μｍのＣＡフィルター（Gelman Sciences, Ann Arbor MI, USA）を用いて
懸濁液を濾過した。
【００４０】 実験手順を終えた後、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）量およびウイルス回収率を
調べた。種々の金属により除去されたＤＮＡ量を得るために、上記のごとく試料
をアッセイした。結果を図２に示す。図からわかるように、塩濃度の増加ととも
にＤＥへのＤＮＡ結合が増加し、おそらくＤＥへのＲＮＡ結合も増加する。亜鉛
および第二鉄イオンはＤＮＡ除去に同様の濃度を要すると思われる。約１ｍＭの
いずれかの塩の存在下、ｐＨ７．４において、ＤＥは約１００％の宿主細胞ヌク
レオチドを結合する。興味深いことに、結果は、ＤＥへの宿主細胞ヌクレオチド
の最大結合にはバリウムおよびニッケルの最適濃度が必要とされうることを示す
。
【００４１】 塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムを用いて同様の実験を行った。実験と
しては、２５ｍＬの溶解物を、１０％グリセロールおよび０．６２５％ Ｔｗｅ
ｅｎ８０を含有する２５ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．４で希釈し
た。塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムのごとき金属塩の濃度を調節して、
各希釈バッファー中の最終濃度が、ウイルス含有溶解物を希釈した場合の最終塩
濃度の２倍にとなるようにした。７．５ｇのＤＥを溶液に添加した。痕跡量の別
の金属、好ましくは亜鉛を溶液に存在させ、あるいは添加する。混合物を室温で
３０分撹拌した。次いで、０．４５μｍのＣＡフィルター（Gelman Sciences, A
nn Arbor MI, USA）を用いて溶液を濾過した。平衡化されたQiagen-500tip上に
１０ｍＬの濾液を乗せた。製造者の手順に従ってアッセイを行った。説明された
ようにウイルス力価アッセイ（viral titer assay）によりウイルス回収率を調
べた。これらの実験結果を図３（塩化ナトリウム最適化）および図４（塩化マグ
ネシウム最適化）に示す。図からわかるように、アデノウイルスからのＤＮＡお
よびＲＮＡの完全な分離には最適塩濃度が必要とされうる。最適塩濃度は、塩化
ナトリウムおよび塩化マグネシウムに関してそれぞれ１２５ｍＭおよび５０ｍＭ
であった。 濾過の前および後に得られた試料に関して行ったウイルス力価アッセイにより
、ウイルス回収率が平均９６％であることが明らかとなった。
【００４２】ＤＥ濾過の間におけるＤＮＡからのウイルス分離の最適化 アデノウイルスからのＤＮＡおよびＲＮＡの完全な分離には最適金属イオンま
たは塩濃度が必要とされうる。本発明に有用な金属イオンはいずれの金属であっ
てもよいが、高い毒性が知られた金属を避けるべきである。かくして、本発明に
おける使用に適しうる金属はとしては、亜鉛、ニッケル、バリウム、鉄、銅、コ
バルト、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、およびマンガン等が挙げられる
。本発明に有用な塩はいずれの許容される塩形態であってもよく、したがって、
酢酸塩、クエン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、および塩化物等が挙げられる。最適な
金属イオンまたは塩濃度を、下記実施例に記載のごとく実験的に決定してもよい
。かかる常套的な実験は当業者のなし得るところである。以下に最適濃度に関す
る例を示すが、塩化ナトリウム濃度に関しては、好ましくは、約７５ないし約２
００ｍＭの範囲、より好ましくは約１００ｍＭないし約１５０ｍＭの範囲、最も
好ましくは約１２５ｍＭである。塩化マグネシウム濃度に関しては、塩濃度は、
好ましくは、約２０ｍＭないし約１００ｍＭの範囲、より好ましくは約４０ｍＭ
ないし約７５ｍＭの範囲、最も好ましくは約５０ｍＭである。亜鉛、ニッケル、
バリウムを包含する大部分の金属イオンの濃度は、好ましくは、ほぼ痕跡レベル
ないし約１０ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭないし約０．７ｍＭ、最も好ま
しくは約０．２ｍＭないし約０．５ｍＭの範囲である。塩化ナトリウムまたは塩
化マグネシウムのごときナトリウム、カリウムまたはマグネシウム塩の使用に関
しては、痕跡量の亜鉛、バリウム、銅、第二鉄、またはニッケルのごとき金属イ
オンの存在または添加も好ましい。「痕跡量」は、検出可能レベル、あるいは少
なくとも約１．０μＭである金属イオン量を意味する。
【００４３】 金属イオンに加えて、あるいはその代わりに、１またはそれ以上の下記物質が
本発明の方法において有用でありうる：ヒスチジン、イミダゾール、グリソグリ
シンおよびチミジン。金属イオンに加えて、あるいはその代わりに、スペルミン
、スペルミジン、ポリエチレングリコール、ならびにこれらのポリマーの変種あ
るいはＤＮＡ濃縮活性を有することが知られている他のポリマーもしくは化合物
のごときＤＮＡ濃縮剤も有用でありうる。また本発明は、金属キレーター（例え
ば、金属イオン）および／または上記のごときＤＮＡ濃縮剤がＤＮＡおよび／ま
たはＲＮＡの精製方法に有用でありうることを提案する。
【００４４】 珪藻土（ＤＥ）での処理に関して、好ましい濃度は、ＤＥ約１０ｇ／溶解物１
Ｌないし約１００ｇ／１Ｌ、より好ましくは約３０ないし約５０ｇ／溶解物１Ｌ
、最も好ましくは約３５ないし約４５ｇ／溶解物１Ｌである。 本発明の方法に関するｐＨ範囲は、塩の形成を破壊しうる極端な酸性またはア
ルカリ性を避けるものであることが好ましい。よって、ｐＨが約５ないし約９の
範囲であることが好ましく、より好ましくは約６ないし約８、最も好ましくは約
６．５ないし約７．５の範囲である。
【００４５】 いくつかの例において、ウイルスもＤＥに結合しうることが見出された。これ
らの条件下において、ｐＨ、塩化ナトリウム濃度、金属イオン濃度の調節により
、あるいは痕跡量のある種のアミノ酸またはアミノ酸アナログ、例えばヒスチン
またはイミダゾールの添加により、宿主細胞ポリヌクレオチドからのウイルスの
分離が最適化されうることが見出された。
【００４６】珪藻土（ＤＥ）での処理 酢酸亜鉛を用いる例： 細胞融解後、１０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗ
ｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４を含有す
る同体積の溶液を添加することによりウイルス含有溶解物を希釈する。混合物を
撹拌し、５Ｍの酢酸亜鉛を希釈溶解物に添加して最終濃度０．３５ｍＭとする。
次いで、２ｍＬの希釈溶解液に対して０．１ｇのＤＥの割合で、ＤＥ（医薬グレ
ード CellPureTM P300, Advenced Minerals, Santa Barbara, CA, USA）を細胞
残さの懸濁液に添加する。次いで、一緒にしたウイルス／細胞溶解物／ＤＥ懸濁
液を４℃で３０分撹拌して、均一な懸濁液を得る。懸濁液を撹拌している間に、
宿主細胞ＤＮＡ、ＲＮＡおよび他の宿主細胞成分がＤＥに吸着される。次いで、
デッドエンドBiocap濾過デバイス（CUNO Fluid Purification, Meriden, CT, US
A）により細胞残さおよびＤＥを除去する（注：ウイルス粒子を通過させ、同時
にＤＥ−ＤＮＡ複合体および他の細胞関連固体を保持する、当該分野で知られた
いずれのタイプのデッドエンドまたはデプス濾過デバイスであってもこの工程に
使用できる）。亜鉛以外の金属イオンを用いてＤＥへのＤＮＡ結合を促進できる
ことに注意。これらの金属の例は、第二鉄、ニッケル、およびバリウムを包含す
るが、これらに限らない。これらの金属イオンに関する最適濃度の実験による決
定は当業者のなし得るところである。
【００４７】 塩化マグネシウムを用いる例： 細胞融解後、１０％グリセロール、０．２５
％ Ｔｗｅｅｎ８０、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および好ましくは痕跡量の金属イ
オン、好ましくは亜鉛を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．
４を含有する同体積の溶液を添加することによりウイルス含有溶解物を希釈する
。２ｍＬの希釈溶解液に対して０．１ｇのＤＥの割合で、ＤＥ（医薬グレード C
ellPureTM P300, Advenced Minerals, Santa Barbara, CA, USA）を細胞残さの
懸濁液に添加し、４℃で３０分撹拌する。懸濁液を撹拌している間に、宿主細胞
ＤＮＡ、ＲＮＡおよび他の宿主細胞成分がＤＥに吸着される。次いで、デッドエ
ンドBiocap濾過デバイス（CUNO Fluid Purification, Meriden, CT, USA）によ
り細胞残さおよびＤＥを除去する（注：ウイルス粒子を通過させ、同時に他の細
胞関連固体を保持する、当該分野で知られたいずれのタイプのデッドエンドまた
はデプス濾過デバイスであってもこの工程に使用できる）。
【００４８】 実施例２．WhatmanTM CDR（ＣＤＲ）へのＤＮＡ結合の最適化 １０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭリン酸
ナトリウムバッファーｐＨ７．４を含有する同体積の溶液を添加することにより
ウイルス含有溶解物を希釈する。バッファーのｐＨおよび塩（塩化ナトリウム）
濃度を調節して、それらがいずれも宿主細胞ポリヌクレオチド混入物の結合を最
大にし、その一方でウイルスの回収率を最大にするようにする。次いで、０．１
ｇのＣＤＲ／溶液１ｍＬの割合でＣＤＲ（Cell Debris remover, WhatmanTM Bio
chemicals Maidstone, England）を懸濁液に添加する。次いで、一緒にしたウイ
ルス／細胞溶解物／ＣＤＲ懸濁液を４℃で３０分撹拌して、均一な懸濁液を得る
。当該分野で知られたいずれかのタイプのフィルターを用いて、あるいは遠心分
離により、ウイルス含有溶液を濾過助剤および細胞残さから分離する。
【００４９】ポリ−アニオン性セルロースを用いる濾過 ＤＥ濾過に代わる方法として、ウイ
ルス含有溶解物を１：１の割合で、１０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗｅｅ
ｎ８０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４で希釈した。
塩化ナトリウム濃度を調節して、ウイルスが濾過デバイスを通過して濾液中に至
り、宿主細胞ヌクレオチドが濾過助剤および細胞残さとともに保持されるように
した。次いで、０．１ｇのＣＤＲ／溶液１ｍＬの割合でＣＤＲ（Cell Debris re
mover, WhatmanTM Biochemicals Maidstone, England）を懸濁液に添加した。次
いで、一緒にしたウイルス／細胞溶解物／ＣＤＲ懸濁液を４℃で３０分撹拌して
、均一な懸濁液を得た。懸濁液を撹拌している間に、宿主細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ
および他の宿主細胞成分がＣＤＲに吸着した。次いで、懸濁液をデッドエンドBi
ocap濾過デバイス（CUNO Fluid Purification, Meriden, CT, USA）を通してポ
ンピングすることにより細胞残さおよびＤＥを除去した。さらなる処理のために
Ａｄ２ウイルスを含有するＣＤＲ濾液を集めた。
【００５０】 ＣＤＲでの処理に関して、好ましい濃度は約１０ｇのＣＤＲ／溶解物１Ｌない
し約１００ｇ／溶解物１Ｌ、より好ましくは約３０ないし約５０ｇ／溶解物１Ｌ
、最も好ましくは約３５ないし約４５ｇ／１Ｌである。 （注：ウイルス粒子を通過させ、同時にＣＤＲ−ＤＮＡ複合体および他の細胞
関連固体を保持する、当該分野で知られたいずれのタイプのデッドエンドまたは
デプス濾過デバイスであってもこの工程に使用できる。）
【００５１】 実施例３．珪藻土（ＤＥ）濾過を用いるアデノウイルス精製プロセス珪藻土（ＤＥ）濾過 実施例１のように１０ｍＭのリン酸塩バッファーを用いる
濾過のかわりに、アデノウイルスセロタイプ２（Ａｄ２）を含有する細胞溶解物
を１対１の割合で、１０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有す
る１０ｍＭのＴｒｉｓバッファーｐＨ７．３で希釈した。希釈後、５Ｍの塩化亜
鉛ストックを添加して最終濃度０．３５ｍＭとした。撹拌後、溶解物１Ｌあたり
４０ｇのＤＥの割合でＤＥを溶解物に添加し、１５ないし３０分撹拌して均一な
懸濁液を得た。デッドエンド濾過システムを通して懸濁液をポンピングすること
により、細胞残さおよびＤＥ（吸着した細胞性成分を伴う）を保持した。さらな
る処理のために濾液（ＤＥに吸着されなかったＡｄ２ウイルスを含む）を集めた
。
【００５２】 別法として、１Ｌの溶解物に対して１Ｌのバッファーの割合で、１０％グリセ
ロール、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８０、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ２および痕跡量の亜
鉛イオンを含有するリン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ），ｐＨ７．３で細胞溶
解物を希釈した。撹拌して均一な懸濁液を得た後、溶解物１Ｌあたり４０ｇのＤ
Ｅの割合でＤＥを溶解物に添加し、得られた懸濁液を１５ないし３０分撹拌した
。懸濁液をBiocap（CUNO Fluid Purification, Meriden, CT, USA）濾過デバイ
スを通してポンピングすることにより細胞残さおよびＤＥを保持した。ＤＥ濾液
（Ａｄ２ウイルスを含有）を集めた。
【００５３】十字流濾過（ＴＦＦ） ５０００００ダルトン（５００ｋＤ）の公称分子量（Ｎ
ＭＷ）カットオフを有する膜を装備したAG/T UFP 500 C9A TFFデバイスを用いて
、得られたＤＥ濾液を濃縮した。この工程において、先ず、濾液（Ａｄ２ウイル
スをｇ含有）を限外濾過（ＵＦ）により４ないし８倍に濃縮した。次いで、保持
された濃縮液（保持液）を７ないし１０倍体積の適当なクロマトグラフィーバッ
ファー（例えば、それぞれｐＨ６ないし８のリン酸塩またはＴｒｉｓバッファー
）に対して透析またはダイアフィルトレーション（ＤＦ）した。
【００５４】クロマトグラフィー （注：この実施例において、アニオンまたはカチオン交換
クロマトグラフィーの前に偽アフィニティークロマトグラフィーまたは疎水性相
互作用クロマトグラフィーを用いるが、バッファー条件を適当に操作することに
よりその順番を変更または再配列することができ；当業者が知っている他のクロ
マトグラフィー法を用いることもできる。）
【００５５】 Ａ）偽アフィニティー（pseudo-affinity）クロマトグラフィー Mimetic Blue 1 A6XL樹脂のカラムを、１０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗ
ｅｅｎ８０を含有するｐＢＳ，ｐＨ７．３（平衡化バッファー）で平衡化した。
次いで、ＤＦ保持液をリニアフローレート（linear flow rate）５０ｃｍ／ｈｒ
でカラムに乗せた。２０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する平衡化バッファーでカラ
ムを洗浄し、次いで、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有する平衡化バッファーでウ
イルスを溶出させた。 （注：アデノウイルスの精製に適した偽アフィニティー樹脂の例は、Mimetic
Blue (1 および 2) A6XL、Mimetic RED (2 および 3) A6XL、Mimetic Orange (1
, 2 および 3) A6XL、Mimetic Yellow (1 および 2) A6XLならびにBlue Sepharo
se CL-6BおよびRed Sepharose CL-6B (AmershamPharmacia Biotech, Upsala, Sw
eden)を包含するが、これらに限らない。）
【００５６】 Ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ） ＥＭＤフェニル樹脂のカラムを、１０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗｅｅ
ｎ８０および０．２５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４を含有するＰＢＳ，ｐＨ７．３（
ＨＩＣバッファー）で平衡化した。ＤＦ保持液を、１：１の割合で２Ｘ塩ＨＩＣ
バッファー（１０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８０および０．５Ｍ
（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有するＰＢＳ，ｐＨ７．３）で希釈し、次いで、リニア
フローレート５０ｃｍ／ｈｒでカラムに乗せた。この好ましい具体例において、
ウイルス粒子はＨＩＣ樹脂に吸着されず、粒子は未吸着（すなわち未結合）およ
び洗浄フラクション中に回収され、汚染混入物質はカラムに残る。さらなる処理
のためにウイルスを含有するカラムの素通し画分を集める（ＨＩＣプール）。 注：アデノウイルスをＨＩＣ樹脂に吸着させることもできる。ウイルス粒子が樹
脂に吸着される条件下で、低塩濃度溶出工程において粒子（適当なカラム洗浄工
程後に）を回収することができる。これらの条件下において、汚染混入物質の部
分は素通しおよび洗浄ならびに他の画分に分配され、適当な条件下では、ウイル
ス粒子が除去された後も樹脂に吸着したままである。 （注：アデノウイルスの精製に適したＨＩＣ樹脂の例は、ＥＭＤフェニルおよび
ＥＭＤプロピル（EM Separations Technology, Gibbstown, NJ, USA）、フェニ
ルセファロースおよびオクチルセファロース（AmershamPharmacia Biotech, Ups
ala, Sweden）ならびにＴＳＫエーテル、ＴＳＫブチルおよびＴＳＫフェニル（T
osoHaas, Montgomeryville, PA, USA）を包含するが、これらに限らない。）
【００５７】 Ｃ）アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ） ＥＭＤ ＤＥＡＥ樹脂を含むＡＥＸカラムを、ＡＥＸバッファー（１０％グリ
セロール、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８０、プラス付加的な０．１Ｍ ＮａＣｌおよ
び０．１Ｍ ＫＣｌを含有するリン酸塩平衡化セイライン（ＰＢＳ），ｐＨ７．
３）で平衡化した。次いで、ＨＩＣプールをＡＥＸカラムに乗せた。この条件下
において、ウイルス粒子および混入蛋白が樹脂に吸着される。カラムをＡＥＸ洗
浄バッファー（１０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８０、プラス付加
的な０．１６Ｍ ＮａＣｌおよび０．１６Ｍ ＫＣｌを含有するＰＢＳ，ｐＨ７．
３）で洗浄することにより混入蛋白を除去した。ウイルス粒子を除去し、集める
ために、カラムをＡＥＸ溶出バッファー（１０％グリセロール、０．２５％ Ｔ
ｗｅｅｎ８０、プラス付加的な０．１９Ｍ ＮａＣｌおよび０．１９Ｍ ＫＣｌを
含有するＰＢＳ，ｐＨ７．３）で溶出した。ＡＥＸ溶出液中に出現した精製ウイ
ルスを集め、処方するまで−８０℃で保存した。（注：適当なアニオン交換樹脂
の例は、EMD DEAE (EM Separations Technology, Gibbstown, NJ, USA)、DEAEセ
ファロース（AmershamPharmacia Biotech, Upsala, Sweden）ならびにTSK DEAE
650およびTSK DEAE 750 (TosoHaas, Montgomeryville, PA, USA)を包含するが、
これらに限らない。）
【００５８】 Ｄ）カチオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ） ＥＭＤ ＣＥ樹脂のカラムを、１０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８
０を含有するＰＢＳ，ｐＨ７．３（平衡化バッファー）で平衡化した。ＨＩＣプ
ールを平衡化バッファーで５倍に希釈し、その後、リニアフローレート５０ｃｍ
／ｈｒでカラムに乗せた。カラムを平衡化バッファーで洗浄し、次いで、０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有平衡化バッファーで溶出させた。（注：適当なカチオン交
換樹脂の例は、EMD SO3およびEMD COO (EM Separations Technology, Gibbstown
, NJ, USA)、ＣＭおよびＳセファロース（AmershamPharmacia Biotech, Upsala,
Sweden）ならびにTSK CMおよびSP (TosoHaas, Montgomeryville, PA, USA)を包
含するが、これらに限らない。）
【００５９】 実施例４．WhatmanTM CDR濾過を用いるアデノウイルス精製プロセスWhatmanTM CDRを用いる濾過 １０％グリセロール、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ８０および０．５２Ｍ塩化ナト
リウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０を含有する同
体積の溶液を添加することによりウイルス含有溶解物を希釈する。次いで、溶液
１ｍＬに対して０．１ｇのＣＤＲの割合でＣＤＲ（Cell Debris remover, Whatm
anTM Biochemicals Maidstone, England）を懸濁液に添加する。次いで、一緒に
したウイルス／細胞溶解物／ＣＤＲ懸濁液を４℃で３０分撹拌して、均一な懸濁
液を得る。当該分野で知られたいずれかのタイプのフィルターを用いて、あるい
は遠心分離により、ウイルス含有溶液を濾過助剤および細胞残さから分離する。
【００６０】アデノウイルスのさらなる精製 濾過後、実施例３に記載したのと同様の方法に
よりウイルスを精製した。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【表２】
【００６３】 ｐＨの関数としてのＤＮＡ結合についても調べた。これらのデータを表３に示
す。実験としては、リン酸二ナトリウムまたはリン酸一ナトリウムを添加するこ
とにより２５ｍＬの溶解物のｐＨをそれぞれｐＨ８またはｐＨ６に調節した。上
記のようにして各アリコートに関してＤＥ濾過を行った。ｐＨ調節を行わなかっ
た対照アリコートもＤＥ濾過した。表からわかるようにＤＥへのＤＮＡ結合はｐ
Ｈ依存的であった。ｐＨが低いよりもｐＨが高い場合に多くのＤＮＡがＤＥに結
合した。しかしながら、ＤＥ濾液に関してウイルス力価アッセイを行った場合に
は、単位操作のｐＨが上昇した場合にウイルス回収率の低下が記録された。
【００６４】 表３．ｐＨの関数としてのＤＮＡ除去 試料 除去％ ｐＨ８ ７７．２ ｐＨ７．４ ５９．１ ｐＨ６ ２９．１
【００６５】 表からわかるように、ｐＨの上昇はＤＮＡ除去を促進したが、ｐＨの低下は除
去を阻害した。ウイルス力価アッセイにより決定されたように、ｐＨの上昇とと
もにＤＥ濾液中のウイルス回収率が低下することに注意すべきである。
【００６６】 本明細書にて引用されたすべての刊行物の開示を、参照により本明細書に一体
化させる。 上記試薬、材料および手順に対する多くの修飾および変更が企図され、それら
は当業者のなし得るところである。よって、これらの修飾および変更は本発明の
一部を構成する。アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、単純ヘルペスウイル
スのごとき他の被包ウイルス、ならびにレンチウイルスのごとき他のレトロウイ
ルスの精製に上記試薬、樹脂および他の類似材料を適宜用いてもよいことを認識
するのは当業者の能力の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本明細書で説明する、ＤＥを用いる細胞からのウイルス
の精製方法の特定の具体例のプロセスフローダイヤグラムである。
【図２】 図２は、ＤＥ濾液から得られたＤＮＡ回収率のデータをプロット
したものであり、種々の塩濃度の存在下でＤＥ濾過を行った（表１参照）。定量
的ＰＣＲを用いることによりＤＮＡ濃度の評価を得た。ＤＥによる減少率％とし
てプロットされたＤＮＡ除去率（除去率％、ｙ軸）を決定し、ここに除去率％は
下式により計算した： ％ＤＮＡ除去率＝［（ＤＥ濾過前に回収されたＤＮＡ−ＤＦ濾過後に回収された
ＤＮＡ）／ＤＥ濾過前に回収されたＤＮＡ］Ｘ１００
【図３】 図３は、ＤＥ濾液から得られたＤＮＡ回収率のデータをプロット
したものであり、種々のＭｇＣｌ２濃度の存在下でＤＥ濾過を行った（表２参照
）。製造者の説明書に詳述されたようにしてQiagen DNA精製チップを用いること
によりＤＮＡ濃度の評価を得た。ＤＥによる減少率％としてプロットされたＤＮ
Ａ除去率（除去率％、ｙ軸）を決定し、ここに除去率％は下式により計算した：
％ＤＮＡ除去率＝［（ＤＥ濾過前に回収されたＤＮＡ−ＤＦ濾過後に回収された
ＤＮＡ）／ＤＥ濾過前に回収されたＤＮＡ］Ｘ１００
【図４】 図４は、ＤＥ濾液から得られたＤＮＡ回収率のデータをプロット
したものであり、種々のＮａＣｌ濃度の存在下でＤＥ濾過を行った（表２参照）
。製造者の説明書に詳述されたようにしてQiagen DNA精製チップを用いることに
よりＤＮＡ濃度の評価を得た。ＤＥによる減少率％としてプロットされたＤＮＡ
除去率（除去率％、ｙ軸）を決定し、ここに除去率％は下式により計算した： ％ＤＮＡ除去率＝［（ＤＥ濾過前に回収されたＤＮＡ−ＤＦ濾過後に回収された
ＤＮＡ）／ＤＥ濾過前に回収されたＤＮＡ］Ｘ１００
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウィリアム・オー・オズバーン アメリカ合衆国02135マサチューセッツ州 ブライトン、アパートメント３、アスコッ ト・ストリート５番 Ｆターム(参考） 4B065 AA95X BD17 BD18 BD22 BD33 BD38 BD41 BD50 CA44 CA60

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞培養物からの被包ウイルスの精製方法であって、下記工
    程： （ａ）被包ウイルスを含む細胞培養物を溶解させ； （ｂ）工程（ａ）から得られた組成物を、珪藻土（ＤＥ）およびポリ−アニオ
    ン性セルロース濾過助剤からなる群より選択される物質を用いる濾過に供して濾
    液を得て； （ｃ）工程（ｂ）の濾液を１またはそれ以上の適当な濃縮およびダイアフィル
    トレーション工程に供して、濃縮されダイアフィルトレーションされた保持液を
    得て；次いで （ｄ）工程（ｃ）の濃縮されダイアフィルトレーションされた保持液を１また
    はそれ以上の適当な精製工程に供し、被包ウイルスを含む精製された組成物を収
    集する を含み、工程（ｃ）および工程（ｄ）が反復して行われてもよい方法。
  2. 【請求項２】 工程（ｂ）が、最大ＤＮＡおよびＲＮＡ結合を促進するため
    にＤＥ濾過中に最適濃度の金属イオン塩を用いることを含むものである請求項１
    の方法。
  3. 【請求項３】 金属イオン塩が亜鉛、ニッケル、第二鉄、銅、バリウム、マ
    グネシウム、マンガン、ナトリウム、コバルトまたはカリウムからなる群より選
    択される金属の金属イオン塩である請求項２の方法。
  4. 【請求項４】 工程（ｂ）が、最大ＤＮＡおよびＲＮＡ結合を促進するため
    にＤＥ濾過中に最適濃度の金属イオン塩を用いること、ならびに宿主細胞ヌクレ
    オチドまたはウイルスのいずれかへの金属イオンの結合を修飾しうるヒスチジン
    、イミダゾールまたは他のアミノ酸を用いることを含むものである請求項１の方
    法。
  5. 【請求項５】 工程（ｂ）が、ポリ−アニオン性セルロースをベースにした
    濾過助剤の使用を含むものである請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 宿主細胞のヌクレオチドがポリ−アニオン性セルロースに結
    合し、ウイルスがフィルターを素通りして濾液中に至るように塩濃度が調節され
    る請求項５の方法。
  7. 【請求項７】 工程（ｃ）が、工程（ｂ）からの濾液を生物学的分子の濃縮
    に使用されるデバイス中に負荷することを含むものである請求項３の方法。
  8. 【請求項８】 工程（ｃ）が、ウイルス粒子を保持するに適した孔サイズを
    有する膜を含む透析またはバッファー交換デバイスを用いることを含むものであ
    る請求項３の方法。
  9. 【請求項９】 工程（ｃ）が、ウイルス粒子をより大きな分子サイズの汚染
    混入物質およびより小さな分子サイズの汚染混入物質から分離することのできる
    孔サイズを有する樹脂を含む透析またはバッファー交換デバイスを用いることを
    含むものである請求項３の方法。
  10. 【請求項１０】 工程（ｃ）が、ウイルス粒子よりも小さい分子サイズを有
    する材料の通過に適した孔サイズを有する膜を含む濃縮デバイスを用いることを
    含むものである請求項３の方法。
  11. 【請求項１１】 該プロセスが、保持されたウイルス粒子を限外濾過により
    溶液中で濃縮することをさらに含むものである請求項８の方法。
  12. 【請求項１２】 工程（ｃ）が、ウイルス粒子を含む組成物をダイアフィル
    トレーションして、ダイアフィルトレーションされた未濃縮ウイルス粒子を含む
    組成物を濃縮前に得ることを含むものである請求項９の方法。
  13. 【請求項１３】 工程（ｃ）が、ウイルス粒子を含む組成物を濃縮して、濃
    縮されたダイアフィルトレーションされていないウイルス粒子をダイアフィルト
    レーション前に得ることを含むものである請求項３の方法。
  14. 【請求項１４】 工程（ｃ）のダイアフィルトレーションが、ダイアフィル
    トレーションされた未濃縮ウイルス粒子を適当なアニオン交換クロマトグラフィ
    ー樹脂上に負荷することに適したものである請求項１２の方法。
  15. 【請求項１５】 工程（ｃ）のダイアフィルトレーション工程が、ダイアフ
    ィルトレーションされた未濃縮ウイルス粒子を適当な疎水性相互作用クロマトグ
    ラフィー樹脂上に負荷して素通しプールを得ることに適したものである請求項１
    ２の方法。
  16. 【請求項１６】 工程（ｃ）のダイアフィルトレーション工程が、ダイアフ
    ィルトレーションされた未濃縮ウイルス粒子を適当な偽アフィニティー樹脂上に
    負荷すること（およびウイルス粒子の偽アフィニティー樹脂への吸着を促進する
    こと）に適したものである請求項１２の方法。
  17. 【請求項１７】 工程（ｃ）のダイアフィルトレーション工程が、ダイアフ
    ィルトレーションされた未濃縮ウイルス粒子を適当なカチオン交換クロマトグラ
    フィー樹脂上に負荷すること（およびウイルス粒子のカチオン交換クロマトグラ
    フィー樹脂への吸着を促進すること）に適したものである請求項１２の方法。
  18. 【請求項１８】 工程（ｃ）のダイアフィルトレーション工程が、ダイアフ
    ィルトレーションされ濃縮されたウイルス粒子を適当な偽アフィニティー樹脂上
    に負荷すること（およびウイルス粒子の偽アフィニティー樹脂への吸着を促進す
    ること）に適したものである請求項１２の方法。
  19. 【請求項１９】 濃縮されダイアフィルトレーションされた工程（ｃ）の濾
    液が、濃縮されたウイルス粒子と塩化セシウムとの混合に適したものである請求
    項１０の方法。
  20. 【請求項２０】 濃縮されダイアフィルトレーションされた工程（ｃ）の濾
    液が、濃縮されたウイルス粒子を適当なアニオン交換クロマトグラフィー樹脂上
    に負荷すること（およびウイルス粒子のアニオン交換クロマトグラフィー樹脂へ
    の吸着を促進すること）に適したものである請求項１０の方法。
  21. 【請求項２１】 工程（ｃ）の濃縮工程が、濃縮されたダイアフィルトレー
    ションされていないウイルス粒子を適当な疎水性相互作用クロマトグラフィー樹
    脂上に負荷して、素通しプールを得ることに適したものである請求項１３の方法
    。
  22. 【請求項２２】 工程（ｃ）の濃縮工程が、濃縮されたダイアフィルトレー
    ションされていないウイルス粒子を適当なカチオン交換クロマトグラフィー樹脂
    上に負荷すること（およびウイルス粒子のカチオン交換クロマトグラフィー樹脂
    への吸着を促進すること）に適したものである請求項１３の方法。
  23. 【請求項２３】 工程（ｄ）の精製工程が、濃縮されたウイルス粒子を塩化
    セシウムと混合し、混合物を限外濾過に供することを含むものである請求項３の
    方法。
  24. 【請求項２４】 工程（ｄ）の精製工程が、先ず、請求項１２のダイアフィ
    ルトレーションされた未濃縮ウイルス粒子を適当なアニオン交換クロマトグラフ
    ィーカラム上に負荷し、これに被包ウイルスを吸着させ、次いで、適当な溶出を
    用いて被包ウイルスを含有する精製された組成物を集めることを含むものである
    、請求項１２の方法。
  25. 【請求項２５】 工程（ｄ）の精製工程が、被包ウイルスを含む工程（ｃ）
    の濃縮されダイアフィルトレーションされた濾液を適当なアニオン交換クロマト
    グラフィー樹脂上に負荷して被包ウイルスを含む精製された組成物を得て、次い
    で、素通しプールを得る条件下において被包ウイルスを含む精製された組成物を
    適当な疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂上に負荷して、素通しプール中に
    被包ウイルスを含む精製された組成物を集める第２精製工程を行うことを含むも
    のである、請求項２０の方法。
  26. 【請求項２６】 工程（ｄ）の精製工程が、請求項１３の濃縮されたダイア
    フィルトレーションされていないウイルス粒子を適当な疎水性相互作用クロマト
    グラフィー樹脂上に負荷して素通しプールを得て、その後、素通しプールを適当
    なカチオン交換樹脂上に負荷し、次いで、適当な溶出条件を用いて、被包ウイル
    スを含む精製された組成物を集めることを含むものである、請求項２１の方法。
  27. 【請求項２７】 工程（ｄ）の精製工程が、工程（ｃ）の濃縮されダイアフ
    ィルトレーションされた濾液を適当なアニオン交換クロマトグラフィー樹脂上に
    負荷し、ついで、適当な溶出条件を用いて、被包ウイルスを含む精製された組成
    物を集めることを含むものである、請求項１の方法。
  28. 【請求項２８】 工程（ｄ）の精製工程が、請求項２４の被包ウイルスを含
    む精製された組成物を、素通しプールを得る条件下において、適当な疎水性相互
    作用クロマトグラフィーカラム上に負荷し、次いで、該素通しプール中に被包ウ
    イルスを含む精製された組成物を集めることをさらに含むものである、請求項２
    ４の方法。
  29. 【請求項２９】 工程（ｄ）の精製工程が、請求項２５の素通しプールから
    の被包ウイルスを含む精製された組成物を適当なカチオン交換樹脂上に負荷し、
    次いで、適当な溶出条件を用いて、被包ウイルスを含む精製された組成物を集め
    ることをさらに含むものである、請求項２５の方法。
  30. 【請求項３０】 工程（ｄ）の精製工程が、請求項２６の被包ウイルスを含
    む精製された組成物を適当なカチオン交換樹脂上に負荷し、次いで、適当な溶出
    条件を用いて、被包ウイルスを含む精製された組成物を集めることをさらに含む
    ものである、請求項２６の方法。
JP2001548668A 1999-12-29 2000-12-20 核酸および他の細胞性汚染混入物質からウイルスベクターを分離するための濾過助剤の使用方法 Withdrawn JP2003518380A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17358499P 1999-12-29 1999-12-29
US60/173,584 1999-12-29
PCT/US2000/034953 WO2001048155A2 (en) 1999-12-29 2000-12-20 Method using filtration aids for the separation of virus vectors from nucleic acids and other cellular contaminants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003518380A true JP2003518380A (ja) 2003-06-10

Family

ID=22632682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001548668A Withdrawn JP2003518380A (ja) 1999-12-29 2000-12-20 核酸および他の細胞性汚染混入物質からウイルスベクターを分離するための濾過助剤の使用方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20010043916A1 (ja)
EP (1) EP1246904A2 (ja)
JP (1) JP2003518380A (ja)
AU (1) AU2911501A (ja)
CA (1) CA2395820A1 (ja)
WO (1) WO2001048155A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010517569A (ja) * 2007-02-08 2010-05-27 エンブレックス・インコーポレイテッド 制御された剪断力を使用してスポロシストをオーシストから放出させる方法
JP2021526829A (ja) * 2018-06-14 2021-10-11 リジェネクスバイオ インコーポレイテッド 組換えａａｖ生成のためのアニオン交換クロマトグラフィー

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7479222B2 (en) * 2004-02-05 2009-01-20 Millipore Corporation Porous adsorptive or chromatographic media
US7776322B2 (en) * 2004-08-16 2010-08-17 Stefan Kochanek Modified viral vector particles
WO2007054297A2 (de) * 2005-11-11 2007-05-18 Csl Behring Gmbh Verwendung hydrophober interaktionschromatographie zur virusabreichung
US9433922B2 (en) 2007-08-14 2016-09-06 Emd Millipore Corporation Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same
US20090130738A1 (en) * 2007-11-19 2009-05-21 Mikhail Kozlov Media for membrane ion exchange chromatography
CN102985536B (zh) 2010-04-14 2017-12-05 Emd密理博公司 生产高效价、高纯度的病毒母液的方法及使用其的方法
EP2643455B1 (en) * 2010-11-26 2018-07-18 ProBioGen AG Depletion of host cell components from live virus vaccines
EP3054006A1 (en) 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Recombinant adeno-associated virus particle purification with multiple-step anion exchange chromatography
EP3054007A1 (en) 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Recombinant adeno-associated virus particle purification comprising an immuno-affinity purification step
GB201614050D0 (en) * 2016-08-17 2016-09-28 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Method for purifying viral vectors
US10428370B2 (en) * 2016-09-15 2019-10-01 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
US11959125B2 (en) 2016-09-15 2024-04-16 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
US11603527B2 (en) * 2017-12-27 2023-03-14 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Method and kit for viral vector isolation
US11028124B2 (en) * 2018-05-07 2021-06-08 Repligen Corporation Methods, devices and systems for 3-stage filtration
CN108864278B (zh) * 2018-07-27 2021-02-19 珠海宝锐生物科技有限公司 一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法
CN113265395A (zh) * 2021-05-18 2021-08-17 苏州博腾生物制药有限公司 菌体裂解液澄清试剂以及在质粒提取工艺中的应用
CN114085829B (zh) * 2021-11-18 2023-08-11 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种环境介质中病毒高效富集方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3214369A (en) * 1961-12-21 1965-10-26 Laval Turbine Method of removing virus from water
US5075430A (en) * 1988-12-12 1991-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth
EP0968284B1 (en) * 1996-11-20 2006-12-13 Introgen Therapeutics, Inc. An improved method for the production and purification of adenoviral vectors

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010517569A (ja) * 2007-02-08 2010-05-27 エンブレックス・インコーポレイテッド 制御された剪断力を使用してスポロシストをオーシストから放出させる方法
JP2021526829A (ja) * 2018-06-14 2021-10-11 リジェネクスバイオ インコーポレイテッド 組換えａａｖ生成のためのアニオン交換クロマトグラフィー
JP7385603B2 (ja) 2018-06-14 2023-11-22 リジェネクスバイオ インコーポレイテッド 組換えａａｖ生成のためのアニオン交換クロマトグラフィー

Also Published As

Publication number Publication date
EP1246904A2 (en) 2002-10-09
WO2001048155A2 (en) 2001-07-05
US20010043916A1 (en) 2001-11-22
WO2001048155A3 (en) 2002-01-03
CA2395820A1 (en) 2001-07-05
AU2911501A (en) 2001-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003518380A (ja) 核酸および他の細胞性汚染混入物質からウイルスベクターを分離するための濾過助剤の使用方法
JP6689251B2 (ja) Ｒｎａを高収率で単離するための方法
US10184145B2 (en) Rapid method for isolating extracellular nucleic acids
EP2295567B1 (en) Methods for using a solid support to purify DNA
US7615347B2 (en) Method for trapping nucleic acids using divalent metal ions
US20090043087A1 (en) DNA purification and recovery from high particulate and solids samples
JP2002502856A (ja) 核酸の単離および精製方法
JP3979996B2 (ja) 固体支持体を使用してｒｎａを精製するための組成物および方法
US20040157223A1 (en) Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor
US20230159911A1 (en) Nucleic acid isolation and inhibitor removal from complex samples
US20150299769A1 (en) Method for lysing a fixed biological sample
CA2694411A1 (en) An improved nucleic acid purification method
US20040126796A1 (en) Extraction of DNA from biological samples
JPH10503086A (ja) 大規模プラスミド精製方法
US20230357747A1 (en) Method for isolating rna with high yield
US20210246160A1 (en) Biomolecule isolation and inhibitor removal
JP3082908B2 (ja) リボ核酸の単離方法
US20180291367A1 (en) Automatable method for nucleic acid isolation
JP4482517B2 (ja) 銀ナノ粒子を利用した標的物質の精製方法
JP2020518291A (ja) 生物試料からの高品質核酸の迅速精製
JPH11178571A (ja) 核酸抽出方法およびそのための試薬

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20080304