JPH10503086A - 大規模プラスミド精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、大規模微生物発酵からのプラスミドＤＮＡの大規模単離精製方法に関する。本発明の方法を使用すると、超らせん（Ｉ型）、ニックないし弛緩型環状（II型）及び線状化（III型）の全３種の型のプラスミドＤＮＡを個々に単離することができる。本発明の方法によると、医薬組成物に組込むのに適した高純度ＤＮＡが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 大規模プラスミド精製方法 発明の背景 微生物発酵からプラスミドＤＮＡを単離するために従来使用されている方法は 小規模又は実験室規模のプラスミド製造に適している。このような方法の１例は 、プラスミドを含む微生物宿主細胞のアルカリ溶解後、酢酸中和によって宿主細 胞ゲノムＤＮＡ及びタンパク質を沈殿させ、例えば遠心分離によって除去する。 液相に含まれるプラスミドＤＮＡをアルコール沈殿後、エチジウムブロミドの存 在下でＣｓＣｌを用いて等密度遠心分離にかける。エチジウムブロミドは完全プ ラスミドＤＮＡを超らせん型（Ｉ型）、ニック環状（II型）及び線状化（III型 ）の３種の異なる型に分けるために必要であり、こうして所望のプラスミド型を 収集する。残留エチジウムブロミドを除去するためには更にブタノール抽出が必 要であり、その後、アルコールを用いてＤＮＡを沈殿させる。次いで付加的精製 工程によって宿主細胞タンパク質を除去する。宿主タンパク質の除去は、フェノ ール又はフェノールとクロロホルムの混合物による抽出を繰り返すことにより実 施される。プラスミドＤＮＡをアルコー ル沈殿させ、イソアミル／クロロホルム抽出を繰り返して残留フェノールを除去 する。アルコール沈殿後の最終プラスミドＤＮＡを水又は適切な緩衝液に溶解す る。 この方法には、以下の点をはじめとする多数の欠点及び制約がある。 ａ）この方法は高価で危険な化学物質を使用する必要がある（密度勾配遠心分離 でＣｓＣｌとＥｔＢｒを使用するが、ＥｔＢｒは公知の突然変異誘発物質であり 、産物から除去しなければならず、また、プラスミドにニックを形成し得る挿入 剤でもある）； ｂ）密度遠心分離段階は大規模化しにくい： ｃ）残留ＥｔＢｒを除去するために有機溶剤抽出が必要である： ｄ）残留タンパク質及びＤＮアーゼを除去するためにフェノール抽出を使用する が、この工程はフェノール／水エマルジョンを分離するために遠心機を必要とす る； ｅ）工程を何度も繰り返さなければならないので、手間と時間がかかる（単離に 数日間を要する）； ｆ）化学的溶解段階の大規模化が障害になり、即ちリゾチーム／アルカリ／ＫＯ Ａｃ処理段階は小規模細胞溶解には有効であ るが、大規模処理では粘度が増加するので非常に困難である； ｇ）溶解前に微生物細胞壁を酵素により弱化するために多量のリゾチームを使用 する。 その後、酸を加えて混合物を中和すると、高分子量染色体ＤＮＡが沈殿する。 高濃度のＫ０Ａｃ塩を加えると、高分子量ＲＮＡ及びタンパク質−ＳＤＳ複合体 が沈殿する。遠心分離後、プラスミド産物は清澄化上清中に残留する。ここでは 、フェノール抽出まで除去されないヌクレアーゼの活性を遅延させるために迅速 に氷上で処理しなければならないという制約がある。産物と共に上清中に残留す る主汚染物質はＲＮＡである。 細菌からプラスミドＤＮＡを単離精製するために一般に使用されている別の方 法は、非常に小規模の製造のみに適した迅速法である。 ＨｏｌｍｅｓとＱｕｉｇｌｅｙ（１９８１，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．, １１４，ｐｐ１９３−１９７）は簡単で迅速なプラスミド製造法を報 告しており、この方法では細菌をリゾチームで処理した後、適当な緩衝液（ＳＴ ＥＴ）中で約１００℃で２０〜４０秒間煮沸し、溶液中に主汚染物質としてＲＮ Ａと共にプラスミドを残してゲノムＤＮＡ、タンパク 質及び破片の不溶性凝塊を形成する。この方法を実施するためには明らかにリゾ チームが必要であるため、ヒト又は家畜用ＤＮＡの大規模製造には望ましくない 処理段階が加わる。他方、リゾチームを加えることにより溶解中のプラスミド遊 離を促進することができる。細胞の熱処理によってＤＮアーゼも変性するという 利点もある。しかし、この方法は大量微生物発酵まで大規模化するのには適さず 、５リットル未満の発酵を目的としている。 ＣｓＣｌを使用する等密度遠心分離に代わるプラスミド精製方法も報告されて いる。これらの方法は、 ａ）処理量に元々制限があるサイズ排除クロマトグラフィー、 ｂ）効率のために高濃度尿素を必要とするという欠点のあるヒドロキシアパタイ トクロマトグラフィー、 ｃ）逆相クロマトグラフィー、及び ｄ）イオン交換クロマトグラフィーを利用するものであり、実験室規模のプラス ミド単離にしか適していない。 従って、大量の微生物発酵からプラスミドＤＮＡを大規模に単離精製するには 、改善されたプラスミド製造方法を開発することが必要である。多くの分子生物 学分野では最近の発展によ り大規模プラスミドＤＮＡ製造用単離精製方法が必要とされている。特に、ヒト 用ポリヌクレオチドベースワクチンの分野及び潜在的にヒト遺伝子療法における 最近の進歩により、多量のポリヌクレオチドワクチンを高純度で製造できること が必要になっている。 商業的に有効な大規模なＤＮＡの発酵、単離、精製及び生物薬剤としての特性 決定方法を開発／実施するための新規技術が必要とされている。発明の要約 プラスミドＤＮＡを単離精製するために現在使用されている実験室法は、工業 的製造法には適さない一連の古典的な実験室技術から構成される。例えば、密度 勾配遠心分離は大規模化できないし、精製工程は公知突然変異誘発物質であるエ チジウムブロミド等の危険で高価な化学物質／溶剤の使用を必要とし、労働集約 的且つ時間消費的である。そこで、大規模化可能な代替方法を開発し、ここに開 示するものである。更に、方法の諸段階を通してプラスミド産物を追跡し、プラ スミド型を区別するＨＰＬＣアッセイも確立した。プラスミドを含む微生物細胞 を懸濁し、場合により界面活性剤を含む緩衝液中でリゾチーム と共にインキュベートし、流動熱交換器を使用して加熱し、細胞を溶解した後、 遠心分離する。遠心分離後、主にＲＮＡとプラスミド産物を含む清澄化溶解物を ０．４５ミクロンフィルターで濾過し、次いで透析濾過した後、アニオン交換カ ラムに添加する。場合によりプラスミド産物を濾過前もしくは濾過後又は初期も しくは後期段階にＲＮアーゼで処理してもよい。プラスミドを含むアニオン交換 産物フラクションを逆相カラムに添加し、適当な緩衝液で溶離すると、ヒト用に 適した高純度プラスミドＤＮＡが得られる。図面の簡単な説明 図１．適切な熱交換装置の概略図である。 図２．出口温度と流速の関係をグラフにより示す。 図３．５０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ ＥＤＴＡを用いた清澄化上清中の完 全プラスミドの比較クロマトグラムを示す。 図４．出口温度の関数として超らせん型プラスミドの収率を示す。 図５．ＲＮアーゼ処理（太線）及び未処理（細線）清澄化溶解物のアニオン交換 カラム溶離曲線を示す。 図６．カラムに添加する前に透析濾過した清澄化溶解物又はカ ラムに添加する前に透析濾過しなかった清澄化溶解物のアニオン交換クロマトグ ラフィー溶離曲線を示す。 図７．細胞溶解物からのプラスミドＤＮＡの溶離曲線を示す。 図８．種々の中間精製段階で得られたＤＮＡ産物のアガロースゲル電気泳動分析 を示す。 図９．ＤＮＡ産物のアニオン交換ＨＰＬＣ分析の追跡結果によりＤＮＡ産物の純 度を示す。発明の詳細な説明 本発明者らは、大規模プラスミド単離精製のための新規で大規模化可能な代替 溶解／破片除去方法として、迅速加熱法を利用して細胞溶解を誘導し、プラスミ ドを溶液中に維持しながらゲノムＤＮＡ)タンパク質及び他の破片を沈殿させる 方法を発見した。この方法の利点は、プラスミドＤＮＡを大規模に単離精製でき ることである。本発明者らは、微生物細胞を（以下に記載する）変性ＳＴＥＴ緩 衝液に懸濁した後、懸濁液を流動熱交換器で約７０〜１００℃まで加熱すると、 優れた溶解が得られることを知見した。溶解物の連続流又はバッチ式遠心分離に より、細胞破片、タンパク質及びゲノムＤＮＡの大半を含むペレットを形成し、 他方、プラスミドは上清中に残留する。本発 明は、化学的溶解よりも産物回収率が高く、ＤＮアーゼを不活化し、操作が簡単 で大規模化可能であるなどの多数の利点を提供する。 本発明は、微生物発酵からのプラスミドＤＮＡの大規模単離精製方法に関する 。本明細書で使用する大規模微生物細胞発酵とは、約５リットル以上の総細胞発 酵容量、又は約５リットル以上の発酵容量から回収された細胞を意味する。 本発明は更に、ヒト用に適した高純度形態のプラスミドＤＮＡを提供すること にも関する。ヒト用ＤＮＡの非限定的な例としては、ポリヌクレオチドワクチン や、ヒト遺伝子療法用ＤＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチドワクチンはヒトに 直接注射するように構成されている［Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら，１９ ９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１６９，ｐｐ．２４４−２４７； Ｕｌｍｅｒ， Ｊ．Ｂ．ら，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９，ｐｐ．１７４５−１７４９］ 。 本発明は更に、単離精製段階を通して種々の型のプラスミドＤＮＡを追跡する ためのインラインモニター法にも関する。本発明の方法により個々に単離できる 上記種々の型のプラスミドＤＮＡとは、Ｉ型（超らせん型プラスミド）、II型（ ニック又 は弛緩型プラスミド）及びIII型（線状化プラスミド）である。 本発明の方法は、微生物発酵一般で使用するのに適している。当業者に容易に 理解される通り、非限定的な例として酵母を含む真菌細胞や細菌細胞等の多種多 様の微生物細胞が本発明の方法で使用するのに適している。好適微生物発酵の１ 例は、単離精製しようとするプラスミドを含む細胞の細菌発酵である。好適細菌 発酵の１例は、単離精製しようとするプラスミドを含む大腸菌の発酵である。当 業者に容易に理解される通り、大腸菌発酵以外の細菌発酵も本発明で使用するの に適している。微生物発酵は、使用する細菌の増殖に適した任意の液体培地で実 施できる。 本発明の方法により単離精製されるプラスミドは、任意の染色体外ＤＮＡ分子 であり得る。プラスミドは１細胞当たり高コピー数でもよいし、１細胞当たり低 コピー数でもよい。プラスミドは更に実質的に任意の寸法でよい。微生物細胞中 の実質的に任意のプラスミドを本発明の方法により単離できることは当業者に容 易に理解されよう。 プラスミドを含む微生物細胞を発酵培地から回収し、細胞ペースト又はスラリ ーを提供する。液体培地から細胞を回収する ためには、非限定的な例として遠心分離やマイクロ濾過等の任意の慣用手段が適 している。 回収した微生物細胞から現用実験室規模手順を使用してプラスミドＤＮＡを単 離する方法は、主に微生物細胞を酵素処理して細胞壁を弱化してから細胞溶解を 行っている。精製段階ではＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ遠心分離を繰り返した後、有機溶 剤抽出及び沈殿によりｔＲＮＡ、残留タンパク質、ＥｔＢｒ及び他の宿主汚染物 質を除去している。これらの段階は大規模化できないので、大規模処理で使用す るのには適していない。これとは対照的に、分取規模クロマトグラフィーはＤＮ Ａプラスミド産物を精製するために分解能が高く、操作が容易で生産性の高い強 力な精製手段である。ヒト用に必要な厳密なレベルまでＤＮＡプラスミドを精製 するには、逆相及びアニオン交換の２種の異なるクロマトグラフィー法が適して いることが判明した。逆相による分離は疎水性相互作用を利用し、アニオン交換 による分離は静電相互作用を利用するものである。これらの２種の直交クロマト グラフィー段階により、種々の型のプラスミド（超らせん型、弛緩型開環状、線 状及びコンカテマー）を分離し、ＬＰＳ（内毒素）、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び残留タ ンパク質等の宿 主汚染物質を除去することができる。 本発明の方法では、回収した微生物細胞を約５０ｍＭ ＴＲＩＳ、約５０〜１ ００ｍＭ ＥＤＴＡ、約８％スクロース、約２％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、及 び場合によりμｇ以下の濃度のリゾチームから構成されるｐＨ範囲６．０〜１０ ．０の変性（modified）ＳＴＥＴ緩衝液に再懸濁する。本発明の方法で任意に使 用するリゾチームの濃度は、当該技術分野で公知の方法で使用されるリゾチーム の濃度を実質的に下回る。当業者に容易に理解される通り、この基本緩衝液組成 を変更しても本発明で使用するのに適している。本発明の方法の成果に実質的に 影響や変化を生じないようなこの基本緩衝液組成の変更は本発明の方法の範囲に 含まれるものとする。ｐＨ範囲は、使用される特定細菌株に最良の結果が得られ るように調節することができる。好適ｐＨ範囲は約８．０〜８．５である。次に 懸濁液を流動熱交換器で約７０〜１００℃、好ましくは約７０〜７７℃まで加熱 する。溶解物を遠心分離して大きい細胞破片、タンパク質及び大半のゲノムＤＮ Ａをペレット化する。 プラスミドを含む微生物細胞の流動熱溶解が実施可能であることを立証するた めに、典型的熱交換器を構成した。特定熱交 換器は、コイル状の１０フィート×０．２５インチＯ．Ｄ．ステンレス鋼管から 構成した。コイルを一定の高温水浴に完全に浸した。コイルの保持容量は約５０ ｍＬであった。熱電対と温度計を使用して入口と出口の温度及び水浴温度をそれ ぞれ測定した。シリコーンチューブを取り付けたＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ蠕動ポン プを使用して加熱コイルに産物流を供給した。コイルから排出される細胞溶解物 を次にＢｅｃｋｍａｎ Ｊ−２１バッチ遠心機で遠心分離し、清澄化した。図１ はこの特定装置の概略図であるが、例えば非限定的な例としてシェルとチューブ から構成するなど他の好適な型の熱交換器構成も本発明で使用するのに適してい る。 遠心分離後、清澄化溶解物を場合によりＲＮアーゼで処理し、プラスミド産物 を濾過して小さい破片を更に除去してもよい。本方法で使用するには多種多様の 濾過手段が適しており、非限定的な例としては小さい細孔寸法をもつ膜で濾過す る方法などがある。好適濾過方法の１例は０．４５ミクロンフィルターによる濾 過である。 ＤＮＡ産物から汚染物質を更に除去するために、物質を透析濾過してもよい。 本方法で使用するには、当該技術分野で公知 の標準技術による標準市販透析濾過材料が適している。好適な透析濾過方法の１ 例は、プラスミド寸法に依存して３０，０００〜５００，０００の範囲の分子量 カットオフをもつ限外濾過膜を使用する透析濾過である。アニオン交換カラムに 添加する前に限外濾過膜（約１００，０００分子量カットオフ）を使用して上記 ＤＮＡ調製物をカラム緩衝液で透析濾過する。アニオン交換カラムの前に透析濾 過するのが好ましく、その結果、カラムに添加できる溶解物の量を著しく増加で きる。 本発明で使用するには多種多様の市販アニオン交換担体が適しており、非限定 的な例としてはＰＯＲＯＳ Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｒｅｓｉｎｓ、Ｑ ｉａｇｅｎ、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ、 Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ及びＰｈａｒｍａｃｉａの市販品が挙げられる。まず最初に カラム（Ｐｏｒｏｓ II ＰＩ／Ｍ，４．５ｍｍ×１００）を２０ｍＭ Ｂｉｓ ／ＴＲＩＳ Ｐｒｏｐａｎｅ（ｐＨ７．５）及び０．７Ｍ ＮａＣｌで平衡化す る。試料を添加し、同一初期緩衝液で洗浄する。次に０．５Ｍ→０．８５Ｍ Ｎ ａＣｌの溶離勾配約２５カラム容量を加えてフラクションを集める。アニオン交 換クロマトグラフィーはＲＮＡ、ゲノ ムＤＮＡ及びタンパク質を除去するのに優れているので、理想的な第１精製段階 である。図５（太線）はアニオン交換カラムからの濾過清澄化細胞溶解物の試料 溶離曲線を示す。アガロースゲル分析によると、流動後に出現する第２のピーク はプラスミド産物から構成されることが判明した。初期の大きいピークはＲＮＡ による。これは、カラムに添加する前に清澄化細胞溶解物をリボヌクレアーゼと 共にインキュベートすることによって確認され、その場合、大きいピークは消え 、代わりにリボヌクレアーゼ消化分解産物による数個のより小さいピークがより 迅速に溶出した。 アニオン交換産物フラクションを逆相カラムに添加する。本発明で使用するに は多種多様の市販担体が適しており、その非限定的な例としてはＰＯＲＯＳ、Ｐ ｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＰＱ Ｃ ｏｒｐ．、Ｚｏｒｂａｘ及びＡｍｉｃｏｎの市販品が挙げられる。担体はポリマ ーベースでもシリカベースでもよい。逆相カラム（Ｐｏｒｏｓ Ｒ／Ｈ）を約１ ００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．５）で平衡化する。次に０→１１％イソ プロパノール勾配を使用して結合物質を溶離する。この方法によってＩ、 II及びIII型の上記３種のプラスミド型を分離することができる。 その後、溶離したプラスミドＤＮＡを濃縮及び／又は透析濾過し、減量又は緩 衝液を交換してもよい。ヒト用ＤＮＡでは、ＤＮＡ産物を医薬的に許容可能なキ ャリヤー又は緩衝液で透析濾過すると有用であり得る。医薬的に許容可能なキャ リヤー又は緩衝液は当該技術分野で公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈ ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓをはじめとする種々の文献に記載 されているものを含む。ＤＮＡ試料の濃縮に適した任意の方法が本発明で使用す るのに適している。このような方法としては透析濾過、アルコール沈殿、凍結乾 燥等が挙げられ、透析濾過が好適である。透析濾過後、最終プラスミド産物を滅 菌してもよい。ＤＮＡ産物の有効性に支障を生じないものであれば任意の滅菌方 法が適しており、例えば０．２ミクロン以下の十分に小さい細孔寸法をもつ膜に 通して滅菌する。 以下の実施例は本発明の方法を具体的に説明するものであって、これを制限す るものではない。 実施例１ 微生物細胞の増殖、細胞溶解及び清澄化 凍結大腸菌細胞スラリー１リットルを使用してＳＴＥＴ緩衝液（８％スクロー ス、０．５％ ＴＲＩＴＯＮ、５０ｍＭＴＲＩＳ緩衝液，ｐＨ８．５及び５０ｍ Ｍ ＥＤＴＡ）中の細胞懸濁液８リットルを調製した。６００ｎｍにおける細胞 懸濁液の吸光度は約Ｏ．Ｄ．３０であった。懸濁液を連続的に撹拌して均質を確 保した。細胞懸濁液の粘度を測定した処、室温（２４℃）で約１．９４ｃｐであ った。熱交換器中の細胞溶液の滞留時間が約３５秒間になるように流速８１ｍＬ ／分で細胞懸濁液を熱交換器にポンプ供給した。浴温度は９２℃に維持した。細 胞溶液の入口と出口の温度を測定した処、それぞれ約２４℃及び約８９℃（平均 ）であった。約１リットルの試料を熱交換器に流した。溶解物は出発材料よりも 多少粘度を増したが、目に見える管の閉塞は観察されなかった。溶解物を室温ま で冷却し、その粘度を測定した処、約４０ｃｐであった。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ− ２１を使用して細胞溶解物を９０００ＲＰＭで５０分間バッチ遠心分離により清 澄化した。上清を分析した結果、有効な細胞溶解と産物回収が確認された。流動 熱溶 解により生じた産物収率はＱｕｉｇｌｅｙ ＆ Ｈｏｌｍｅｓ煮沸法による収率 と少なくとも同等であった。しかし、後者方法は実験室規模でバッチ式に実施し なければならないので、大規模（５リットル以上）処理には適していない。熱交 換器法は流動式であるので、処理可能な細胞懸濁液の容量の上限がない。従って 、この方法は非常に大規模な細菌発酵を実施することができ、高純度プラスミド ＤＮＡを大量に製造することができる。 その後、０．４５ミクロンの細孔寸法をもつ膜で清澄化溶解物を濾過し、微細 な破片を除去した。次に、約１００，０００の分子量カットオフをもつ膜を使用 して濾液を透析濾過した。 実施例２ 熱交換器による細胞溶解の制御及び再現性 細胞スラリーを熱交換器にポンプ供給する流速（即ち滞留時間）を調節すると 、溶解温度即ち出口温度を厳密に制御することができる。実施例１に記載したよ うに細胞スラリー溶液を調製し、１６０〜８５０ｍＬ／分の流速で熱交換器にポ ンプ供給した。対応する出口温度は９３℃〜６５℃であった。図２は流速と温度 の関係を示す。細胞スラリーの初期温度は２４℃であり、浴温度は９６℃の一定 温度に保った。更に、８０℃の出口 温度を照準にして試験を繰り返した。清澄化上清１Ｌ当たり環状ＤＮＡ２４ｍｇ の収率が安定して得られ、方法の再現性が立証された。 実施例３ プラスミドＤＮＡの精製 実施例１及び２に記載したように微生物細胞及び溶解物を調製し、以下の分析 を実施した。 ５０ｍＭ ＥＤＴＡの代わりに１００ｍＭ ＥＤＴＡを加えると超らせん型Ｄ ＮＡの百分率が増加することを実証し、超らせん型ＤＮＡの回収に関して出口温 度（即ち溶解温度）の許容可能な範囲を決定するために、以下の分析を実施した 。超らせん型のプラスミドＤＮＡは弛緩型環状よりも安定しているので望ましい 。超らせん型ＤＮＡを開環状に変換し得る１つの方法はＤＮアーゼによるニック 形成である。ＳＴＥＴ緩衝液中に５０ｍＭでなく１００ｍＭ ＥＤＴＡを加える と、開環状プラスミドの形成を最小限にできることが判明した。図３は、５０ｍ Ｍ ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ ＥＤＴＡを用いた清澄化上清中の完全プラスミド の比較クロマトグラムを示す。細胞懸濁液は実施例１に記載したように調製した 。これらの試験の操作流 速は約１８６ｍｌ／分であった。入口、出口及び浴の温度はそれぞれ２４℃、９ ２℃及び９６℃であった。 各試験で生成された超らせん型プラスミドの百分率を測定することにより、溶 解温度の許容可能な範囲を決定した。図４は出口温度の関数として超らせん型プ ラスミドの濃度を示す。溶解温度の許容可能な範囲は７５℃〜９２℃である。７ ５℃未満の温度では弛緩型環状プラスミドの生成率が高く、これは恐らくＤＮア ーゼ活性の増加によると思われる。９３℃を越えると、恐らく熱変性によって超 らせん型プラスミドの生成率は低下すると思われる。 連続熱溶解及び遠心分離後、清澄化溶解物１ｍＬをＲＮアーゼ５μｇと共に２ 時間インキュベートするか、又は未処理のまま使用した。次に、溶媒Ａ及びＢ［ ＨＰＬＣ溶媒Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｂｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ，ｐＨ８．０； 及び溶媒Ｂ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｂｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ，ｐＨ８．０中１Ｍ ＮａＣｌ］の５０：５０混合物で予め平衡化しておいたアニオン交換カラム（ Ｐｏｒｏｓ Ｑ／Ｍ ４．６×１００）にＲＮアーゼで処理した試料と未処理試 料を添加した。１００カラム容量を越える５０％→８５％Ｂの勾配を使用して カラムを溶離した。開環状プラスミドは約６８％Ｂで溶出し、超らせん型プラス ミドは約７２％Ｂで溶出する。 ＲＮアーゼで処理した試料（細線）と未処理試料（太線）の清澄化溶解物から のアニオン交換カラム溶出物の比較を図５に示す。約１０分のピークがプラスミ ドＤＮＡであり、未処理試料ではＲＮＡの大きいピークを伴っている。ＲＮアー ゼで処理した試料では大きいＲＮＡピークは消え、プラスミドピークは汚染物質 ピークからよりはっきり分離している。 上述のように、アニオン交換クロマトグラフィーの前に透析濾過を行うと、カ ラムに添加可能な溶解物の量を著しく増加できる。これを図６に示し、同図はア ニオン交換クロマトグラフィー前に透析濾過した清澄化溶解物と透析濾過しなか った清澄化溶解物の比較を示す。一方の試料はアニオン交換カラムに添加する前 に透析濾過し、他方の試料は透析濾過しなかった以外は上記と同様に試料を調製 した。上述のようにカラムを展開及び溶離した。図６から明らかなように、カラ ムから溶出した汚染物質の量は透析濾過しなかった試料のほうが著しく多い。ア ニオン交換カラム担体に多量の汚染物質が結合すると、他の物質と結合するのに 担体を利用できなくなるので、カラムの最大 容量が低下し、ＤＮＡ産物の損失を生じ得る。そこで、透析濾過により汚染物質 を除去すると、より多量のＤＮＡ産物をアニオン交換担体に結合させ得、その結 果、より多量の清澄化溶解物をカラムに添加することができる。 アニオン交換カラムから溶出したプラスミドＤＮＡを逆相ＨＰＬＣ分析により 個々の型に分離した。ニック環状プラスミド（２型）から超らせん型プラスミド （１型）の分離を図７に示す。２形態は容易に分離することができ、個々の型の プラスミドを単離することができた。 実施例４ クロマトグラフィーに基づく方法からの高純度プラスミドＤＮＡ 発酵細胞ペーストを変性ＳＴＥＴ緩衝液に再懸濁した後、バッチ式に熱溶解し た。あるいは、発酵細胞ペーストを変性ＳＴＥＴ緩衝液に再懸濁した後、上記流 動法で熱溶解する。溶解物を上記のように遠心分離した。上清２０ｍｌを上記の ように濾過し、上記緩衝液Ａ及びＢの５０：５０混合物で予め平衡化しておいた アニオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ Ｑ／Ｍ ４．６×１００）に添加した。５０ カラム容量を越える５０％→８５％ Ｂの勾配を１０ｍｌ／分の流速で流した。各２．５ｍｌのフラクションをカラム から集めた。超らせん型プラスミドＤＮＡは７２％Ｂでカラムから溶出した。 次に、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で予め平衡化しておいた 逆相クロマトグラフィーカラム（Ｐｏｒｏｓ Ｒ／Ｈ）にアニオン交換産物を添 加し、０％→８０％メタノールの勾配を使用して結合物質を溶離した。高純度超 らせん型プラスミドＤＮＡは２２％メタノールで溶出した。 精製工程の主段階の各々からの産物フラクションのアガロースゲルを図８に示 す。アガロースゲルと実施例３に記載した比色分析及びＨＰＬＣアッセイによる と、図９に示す最終産物は高純度である。産物は＞９０％の超らせん型プラスミ ドと＜１０％の開環状プラスミドから構成される。ＲＮＡは、使用したアッセイ の検出限界未満であった。ゲノムＤＮＡ及びタンパク質汚染物質レベルも、使用 したアッセイの検出限界未満であった。工程終了時の超らせん型プラスミドの総 収率は清澄化溶解物中の超らせん型プラスミドの約６０％であった。 実施例５ プラスミドＤＮＡのマルチグラム規模精製 凍結大腸菌細胞スラリー４．５Ｌを使用してリゾチーム２５００単位／ｍｌを 含むＳＴＥＴ緩衝液（８％スクロース、２％ Ｔｒｉｔｏｎ、５０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ緩衝液、５０ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．５）中の細胞懸濁液３３．７Ｌを調製し た。６００ｎｍにおける懸濁液の吸光度は約Ｏ．Ｄ．３０であった。懸濁液を室 温で１５分間撹拌して適正な混合を確保した後、３７℃で連続撹拌下に４５分間 インキュベートした。インキュベーション後、室温で混合を続け、細胞懸濁液を ５００ｍｌ／分の流速で熱交換器にポンプ供給した。バッチ温度を１００℃に維 持し、細胞懸濁液の入口及び出口温度を測定した処、それぞれ約２４℃と７０〜 ７７℃であった。熱交換器から排出される細胞溶解物をＢｅｃｋｍａｎ遠心びん （各５００ｍｌ）に集め、溶解物をすぐにＢｅｃｋｍａｎ Ｊ−２１遠心機で９ ０００ＲＰＭで５０分間遠心分離した。遠心分離後、上清はリゾチームインキュ ベーションを実施しない場合に比較して４〜５倍のプラスミド産物を含んでいる ことが判明した。遠心分離の上清産物をすぐに３倍容量のＴＥ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で透析濾過した後、大腸菌ＲＮアーゼ２０× １０⁵ 単位と共に室温で２〜４時間インキュべートした。インキュベーションの 完了後、１００ｋＤ ＭＷＣＯ膜を使用して更に６倍容量のＴＥ緩衝液で産物溶 液を透析濾過した後、０．４５ミクロンフィルターで濾過して残留破片を除去し た。濾過した溶解物を２０ｍＭ Ｂｉｓ／ＴｒｉｓＰｒｏｐａｎｅ−ＮａＣｌ緩 衝液（ｐＨ７．５）で０．７ＭＮａＣｌまで希釈して希釈濾液を調製し、アニオ ン交換カラムに添加した。アニオン交換カラム（３．６Ｌ容、ＰＯＲＯＳＰＩ／ Ｍ）は予め２０ｍＭ Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅと０．７Ｍ ＮａＣｌ で平衡化しておいた。濾過した溶解物をカラムに添加した。この場合は、超らせ ん型プラスミド５ｇをアニオン交換カラムに添加した。添加後、カラムを２〜４ カラム容量の２０ｍＭ Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ及び０．７Ｍ Ｎａ Ｃｌで洗浄した。２０ｍＭ Ｂｉｓ／ＴｒｉｓＰｒｏｐａｎｅ中０．７Ｍ Ｎａ Ｃｌ→２．０Ｍ ＮａＣｌの１０カラム容量勾配で溶離し、大腸菌タンパク質、 ＲＮＡ及び特定の内毒素の大半を除去した。超らせん型プラスミドフラクション は１．４Ｍ〜２．０Ｍ ＮａＣｌａで溶出した。次に、超らせん型プラスミド４ ｇを含むアニオン交換カラムからの超 らせん型フラクションを発熱物質を含まない水で２〜３回希釈し、１．２％ＩＰ Ａに調整し、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを８．５に調整した。次に、１．２％ＩＰＡ を含む１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで予め平衡化しておいた７Ｌ容逆相カラム （ＰＯＲＯＳ Ｒ２／Ｍ）に、希釈したアニオン交換超らせん型フラクションを 添加した。この場合は、超らせん型プラスミド３．２ｇを逆相カラムに添加した 後、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム中１．２％ＩＰＡ６〜１０カラム容量でカラ ムを洗浄した。こうして十分に洗浄して不純物を除去した。次に、１．２％ＩＰ Ａ→１１．２％ＩＰＡの５カラム容量勾配で溶離した。超らせん型プラスミドフ ラクションは約４％ＩＰＡで溶出する。その後、逆相カラムからの超らせん型産 物フラクションを濃縮し、３０ｋＤ ＭＷＣＯ膜を用いて生理的食塩水で透析濾 過した。最終産物バルクを０．２２ミクロンフィルターで濾過した。表１は、主 要処理段階の各々における不純物の除去と収率を示す精製表である。方法の総産 物収率は、実施例３に記載したアニオン交換ＨＰＬＣアッセイによると、清澄化 細胞溶解物中の超らせん型プラスミドの＞５０％であった。産物の純度は非常に 高く、大腸菌ＲＮＡ及びタンパク質１％未満、大腸菌ゲノムＤＮＡ２．９％未満 であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者 サガー，サンジーサ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．大規模微生物細胞発酵からのプラスミドＤＮＡの大規模単離精製方法であっ て、 ａ）大規模発酵から微生物細胞を回収する段階と、 ｂ）回収した微生物細胞に十分な量の溶解溶液を加える段階と、 ｃ）段階ｂ）の微生物細胞を流動熱交換器で７０℃〜１００℃の温度まで加熱し て粗溶解物を形成する段階と、 ｄ）粗溶解物を遠心分離する段階と、 ｅ）段階ｄ）の上清を濾過及び透析濾過して濾液を提供する段階と、 ｆ）段階ｅ）の濾液をアニオン交換担体に接触させる段階と、 ｇ）アニオン交換担体からプラスミドＤＮＡを溶離及び収集する段階と、 ｈ）段階ｇ）からのプラスミドＤＮＡを逆相高性能液体クロマトグラフィー担体 に接触させる段階と、 ｉ）段階ｈ）の逆相高性能液体クロマトグラフィー担体からプラスミドを溶離及 び収集する段階と、 ｊ）場合により段階ｉ）の産物を医薬的に許容可能なキャリヤ ーで濃縮及び／又は透析濾過する段階と、 ｋ）場合によりＤＮＡ産物を滅菌する段階を含む前記方法。 ２．段階ｂ）の溶解溶液が変性ＳＴＥＴ緩衝液である請求項１に記載の方法。 ３．段階ｃ）の加熱が７０℃〜７７℃の温度まで行われる請求項１に記載の方法 。 ４．段階ｂ）の溶解溶液がμｇ以下の濃度のリゾチームを含有する請求項１に記 載の方法。 ５．場合により段階ａ）の後の任意段階にＲＮアーゼ処理を含む請求項１に記載 の方法。 ６．請求項１に記載の方法により得られた単離精製プラスミドＤＮＡ。 ７．前記プラスミドがヒトに投与するのに適している請求項６に記載のプラスミ ドＤＮＡ。 ８．前記プラスミドがヒト以外の動物に投与するのに適している請求項６に記載 のプラスミドＤＮＡ。 ９．前記プラスミドがポリヌクレオチドワクチンである請求項６に記載のプラス ミドＤＮＡ。 １０．ヒトに投与するのに適した単離精製プラスミドＤＮＡ。 １１．前記プラスミドＤＮＡがポリヌクレオチドワクチンである請求項１０に記 載のプラスミドＤＮＡ。