JP3905132B2 - Ｐｅｇ存在下でのカラムクロマトグラフィーを使用するプラスミドｄｎａの精製 - Google Patents
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Description
発明の技術分野
本願発明はカラムクロマトグラフィー中でプラスミドＤＮＡを精製する方法、特に遺伝子治療及び遺伝子免疫化における医薬品等級としての使用に適したプラスミドＤＮＡを大規模的に処理する方法に関するものである。
発明の背景
微生物細胞からプラスミドＤＮＡを分離する従来技術は小規模レベル又は実験室レベルの調製に対してのみ適したものである。広く使用されている技術の一つは、プラスミドを含む微生物細胞のアルカリ細胞溶解及び酢酸中性化を含み、これにより宿主ゲノムＤＮＡ及びタンパク質は沈殿させられ、遠心により取り除かれる。残ったプラスミドＤＮＡはエタノールで沈殿され、塩化セシウム／エチジウムブロミド（ＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ）密度勾配遠心にかけられる。エチジウムブロミドはプラスミドＤＮＡをスーパーコイル状、直鎖状及びニックのある環状形状のものに分け、そして所望する形状のものが回収される。残余のエチジウムブロミドはブタノールによる抽出で除かれ、ＤＮＡはエタノールにより沈殿される。宿主細胞タンパク質はフェノールによる抽出の繰り返しにより取り除かれ、次にＤＮＡの沈殿そしてイソアミルアルコール／クロロホルムによる抽出の繰り返しによりフェノールは取り除かれる。プラスミドＤＮＡの分離及び精製に使用されるこれらの一般的実験法は製造方法には適していない。まして、これらの方法は遺伝子治療又は遺伝子免疫化における医薬品等級としての使用に適したプラスミドＤＮＡの生産には適していない。密度勾配遠心は規模を拡張できないし、エチジウムブロミドは突然変異原であると知られており、フェノールは有害な化学物質であり、この方法は労働集約的である。
組換えプラスミドＤＮＡを大規模的に精製する最近の努力はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用した示差沈殿、そしてイオン交換及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーに向けられている。Ｈｏｒｎら、Hum.Gene.Ther.,6:565-573,1995;PCT出願 No. WO95/21250。この方法を使用したプラスミドＤＮＡの収率は一般的に約５０％である。PCT出願 No. WO96/02658は細菌細胞の溶解、陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを含む大規模なプラスミドＤＮＡの精製を開示している。ＤＥ４３２１９０４ Ａ１はカオトロピックの塩の存在下または１Ｍ以上の塩濃度を有する溶液の存在下で、シリカまたはガラスクロマトグラフィーを使用して核酸混合物を分離する方法を教示している。しかし、プラスミドＤＮＡのクロマトグラフィーによる精製の主な問題は、所望の生産物が鋭いピークではなく、広い尾を引いたスメアとして抽出され、そして通過物中に現れることであり、従って溶解成分からの分離が妨げられる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、三価陽イオン（例えば、ヘキサミンコバルト（ＩＩＩ）、スペルミジン）、アルコール及びポリビニルピロリジンを含む多くの試薬は、ＤＮＡ分子が伸張したコイル状から緻密な球状に凝集するのを促進させる。吉川ら、J.Am.Chem.Soc.,118:929-930,1996;皆川らBiopolymers,34;555-558,1994;アルスコットらBiopolymers,30:619-630,1990及びラーマンらProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,68;1886-1890,1971。ポリエチレングリコールのＤＮＡ分子を凝集させる能力は、６．０Ｍで転移点になり（吉川ら）、１．９−１０．０Ｍ ＰＥＧ濃度（皆川ら）で起こるようである。すなわち、低いＰＥＧ濃度では、ＤＮＡ分子は伸張したコイル状態で存在し、高いＰＥＧ濃度ではＤＮＡ分子は小さな球状の状態に縮んでいる（皆川ら）。
カラムクロマトグラフィー中でプラスミドＤＮＡを精製する方法へのニーズは存在する。遺伝子治療及び遺伝子免疫化における医薬やワクチンに使用されるのに十分精製されたプラスミドＤＮＡが大規模な量で必要性なことから、このニーズは、特に緊急である。
発明の概要
本願発明の一つの態様は、カラムクロマトグラフィーを使用して生物学的混合物からプラスミドＤＮＡを精製する改良方法であり、
この混合物にポリエチレングリコールを加える工程、及び、
この混合物からこのＤＮＡをクロマトグラフィーにより分離する工程、
を含む改良方法である。
好ましくは、このポリエチレングリコールは約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量、更に好ましくはポリエチレングリコールは約１％（ｗ／ｖ）の量で加えられる。この好ましい態様の一つの特徴は、ポリエチレングリコールは約７，０００から約９，０００の平均分子量を有しており、もうとつの特徴は、ＰＥＧがＰＥＧ−８０００である。この態様は更に分離する工程が陰イオン交換クロマトグラフィーであることを含む。
本願発明は宿主細胞不純物からプラスミドＤＮＡを精製する方法において、
このプラスミドＤＮＡと宿主細胞夾雑物を含む溶液に、カラムクロマトグラフィー中に宿主細胞不純物からプラスミドＤＮＡを分離させるのに十分量のポリエチレングリコールを加える工程、及び、
カラムクロマトグラフィーを行い、これによりプラスミドＤＮＡが宿主細胞不純物から精製されるようにする工程、
を含む方法も更に提供する。
好ましくは、ポリエチレングリコールの量は、約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量、更に好ましくはポリエチレングリコールは約１％（ｗ／ｖ）の量で加えられる。この好ましい態様の一つの特徴によれば、ポリエチレングリコールは約７，０００から約９，０００の平均分子量を有しており、もうとつの特徴によれば、ＰＥＧはＰＥＧ−８０００である。この態様は更にこのカラムクロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーであることを提供する。
本願発明のもう一つの態様は細胞溶解物の夾雑物からプラスミドＤＮＡを精製する方法において、
このプラスミドＤＮＡと分解夾雑物を含む溶液に、このＤＮＡを凝集させるのに十分量のＤＮＡ凝集剤を加える工程、及び、
この凝集剤を含む溶液をクロマトグラフィーカラムに通過させ、これによりこの溶解夾雑物からこのプラスミドＤＮＡを精製する工程、
を含む方法である。
好適には、凝集剤はポリエチレングリコール、好ましくは約７，０００から約９，０００の平均分子量を有しているもの、更に好ましくはＰＥＧ−８０００である。好ましくは、ポリエチレングリコールの量は約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量、更に好ましくは、この量は約１％（ｗ／ｖ）である。この態様は、クロマトグラフィーカラムが陰イオン交換クロマトグラフィーカラムであることを含む。
好適な態様の詳細な説明
本願発明はカラムクロマトグラフィー中にプラスミドＤＮＡを精製する方法を提供することである。短鎖重合アルコール、好ましくはポリエチレングリコール、またはもう一つのＤＮＡ凝集剤はカラムクロマトグラフィーにかける前にＤＮＡサンプルに加えられる。短鎖重合アルコール又は凝集剤はプラスミドＤＮＡの分離を改善し、大規模な精製に、特に医薬品等級としてのプラスミドＤＮＡの製造に使用できるかもしれない。
宿主細胞の夾雑物からクロマトグラフィーによりプラスミドＤＮＡを精製する際の大きな問題点は、所望の生産物がはっきりしたピークというよりむしろ広がった不純物として抽出され、そして通過物に現れることであり、従ってこれらの夾雑物からプラスミドＤＮＡの分離を妨げることである。本願発明の方法はこの問題を解決する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような短鎖重合アルコールまたはもう一つのＤＮＡ凝集剤の存在で、プラスミドＤＮＡははっきりしたピークになって抽出され、そして、通過物には現れず、従って精製を促進させ、収率を増加させる。
特別な理論により制限されることなく、クロマトグラフィーカラムへのプラスミドＤＮＡの均一な結合は、ＤＮＡ分子が伸張したコイル状態から緻密な球状態に凝集したことから起こるのかもしれない。プラスミドＤＮＡはスーパーコイル状、直鎖状及びニックを持つ環状形状の混合物で存在する。イオン交換カラムにＤＮＡサンプルを供することにより、多種類のプラスミドＤＮＡは、異質な形態でそして異なった相対結合係数でクロマトグラフィーマトリックスへ結合するものと見ることができる。伸張したコイルの緻密は球状への収縮は、より均質な形態でそして類似の結合係数で陰イオン交換マトリックスへ結合するのを増大させる原因であるかもしれない。多種類のＤＮＡ凝集剤は、本願のクロマトグラフィーの方法によりプラスミドＤＮＡの精製を促進させるものとして、従って予期することができる。
ポリエチレングリコールの存在下でクロマトグラフィーカラムへのプラスミドＤＮＡの結合の増大を説明するであろうもう一つの理論は、配座型への疎水性相互作用の貢献である。多種類の試薬により疎水性相互作用が崩されることで、ＤＮＡ分子はより均質な形態でそして類似の結合係数でクロマトグラフィーマトリックスへ結合するのを促進させる配座型になると想定することができるかもしれない。疎水性相互作用を媒介する化学試薬も本願発明で有用なものとして当然想定することができる。
ポリエチレングリコールのような短鎖重合アルコール及びプラスミドＤＮＡを精製の目的のために均質なものとして機能させる他のＤＮＡ凝集剤の使用は、イオン交換クロマトグラフィーに限定されるものではない。これはサイズ排除クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーを含む他のクロマトグラフィー方法に拡張できる。確かに、この方法は、例えばダイアフィルトレーション、ウルトラフィルトレーション及びろ過一般の他の精製方法にも広く拡張でき、多様なプラスミドＤＮＡ種を一種類のものとして機能させることにより、ＲＮＡ、タンパク質及び他の夾雑物からのプラスミドＤＮＡの分離は促進される。
本願発明の方法は、プラスミドＤＮＡの高い生産物回収率を含む多くの利点を提供することができる。これらの方法を使用するＤＮＡの収率はクロマトグラフィー工程に対して少なくとも９０％である。更に、この発明は、人への使用に十分な精製純度のプラスミドＤＮＡを大規模な量で生産するのに適用可能である。
プラスミドＤＮＡは一般的に微生物の発酵物の構成成分から分離される。酵母細胞及び細菌細胞を含む多種多様な微生物細胞が、本願発明の方法の使用に適していることは当業者には明かである。好ましい微生物発酵は細菌発酵である。好ましい細菌発酵は大腸菌発酵である。微生物発酵物は使用される細菌の成長に適するいかなる液体培地中でも生育させることができる。
本願発明の方法により精製されるＤＮＡプラスミドはいかなる染色体外ＤＮＡであってもよい。プラスミドは実質的にいかなる大きさ又は性質であってもよいということは当業者には明かである。これらのプラスミドは高コピー数、低コピー数のもの又は制御できないプラスミドであってもよい。これらは、選択できる遺伝子、ポリリンカー、複製開始点、プロモーター、エンハンサー、リーダー配列、ポリアデニル化部位及び終結配列を含む遺伝子要素の領域を含む。プラスミドは基本的にはいかなる起源の人の遺伝子及び動物のものを含むことができる。
プラスミドＤＮＡを含む微生物細胞は発酵培養液から最初に収集され、細胞ペーストを生じさせる。液体培養液から細胞を収集するいかなる従来方法も適用できる。そのような方法は遠心、ろ過及び沈殿法を含む。
次は、細胞溶解である。典型的には、細胞は緩衝液中に懸濁される。我々は細胞壁を弱くするいかなる酵素処理も奨励しない。これは、使用しなければならない動物の酵素はこれらの方法により生産されるプラスミドＤＮＡの受容者に感染する動物ウイルスを保持するかもしれないからである。
細胞破片及び他の不純物は遠心、ろ過、沈殿のような標準的な方法により次に取り除かれる。我々は珪藻土でろ過することにより結果として生じる上清の不純物を取り除く。珪藻土によるろ過もこの上清に関して宿主ＲＮＡの濃度を減少させる。
この後、プラスミドＤＮＡは適当な条件下で沈殿剤を使用して不純物を取り除いた上清から沈殿させ、収集されそして緩衝液中に再懸濁させることができる。次に、我々は、プラスミドＤＮＡを妨害するものとして宿主ＲＮＡ、タンパク質及びリポ多糖をこの目的に好適な条件下で沈殿剤により沈殿させる。最後に、ろ過物は収集され、そしてプラスミドＤＮＡはこれらの好適な条件下で沈殿試薬を使用することにより再度沈殿される。次に、カラムクロマトグラフィーである。
ＤＮＡペレットはカラムクロマトグラフィーに先立ちカラム緩衝液中に再懸濁させる。この緩衝液はポリエチレングリコールまたはもう一つのＤＮＡ凝集剤を、単独でまたは組み合わせて含む。典型的には、ＤＮＡ溶液中のＰＥＧの濃度は約０．１から約４％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）である。もし、ＰＥＧの濃度が０．１％（ｗ／ｖ）以下の場合、プラスミドＤＮＡの結合の増加は起こらない。もしＰＥＧ濃度が４％（ｗ／ｖ）以上の場合、ＤＮＡは溶液から沈殿しはじめる。ＰＥＧ−８０００に対しては、約０．１％から約４％の範囲は、１．７×１０-4Ｍから６．７×１０-3Ｍのモル濃度に対応する。
プラスミドＤＮＡはＤＮＡサンプルと同様の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに供された。多種多様な入手可能な陰イオン交換マトリックスは、POROS陰イオン レンジ、Qiagen、Toso Hass、Sterogene、Spherodex、Nucleopac及びファルマシアから得られるものを含むが、これらに限定されず、本願発明に使用するのに適している、このカラムはベッド容量の数倍の緩衝液で洗浄される。通過するピークは実質的にプラスミドを含まず、このことはカラムマトリックスにほとんど完全にＤＮＡが結合していることを示す。これとは反対に、ポリエチレングリコールを含まない緩衝液を使用するときはプラスミドＤＮＡは通過する部分に存在する。
プラスミドＤＮＡはポリエチレングリコールを含む緩衝液中で１段階の塩溶出によりカラムから溶出される。カラムフラクションはアガロースゲル電気泳動によりプラスミドＤＮＡが分析される。プラスミドＤＮＡを含むフラクションはプールされ、沈殿させられ、再懸濁させられ、そして更なる処理のためゲルろ過カラムに供される。最後にカラムで精製されたＤＮＡは究極的最終的な組成、無菌フィル、最終品に調製される。
イオン交換カラムから溶出されたプロファイルは異なるＤＮＡ調製物に対応する。この成功は下記の実施例４に示す大規模なＤＮＡの調製に拡張することができる。こうように、ＤＮＡ凝集剤がカラム緩衝液中に存在する場合に、再現可能なクロマトグラフィーによる精製が達成される。
本願方法において多くのＤＮＡ凝集剤を使用することは予期できる。そのような試薬は、炭素を１〜４個有する短鎖重合アルコール（例えばポリエチレングリコール）、３価の陽イオン（例えばヘキサミンコバルト（ＩＩＩ）、スペルミジン）、短鎖アルコール（例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール）及び他のポリマー（例えばポリビニルピロリドン）を含むが、これに限定させるものではない。平均分子量が７，０００〜９，０００であるポリエチレングリコールが好ましく、そして平均分子量が８，０００であるポリエチレングリコール、ＰＥＧ−８０００が本願発明で使用するのに特に好ましいが、他の平均分子量を有するポリエチレングリコールも更に予期できる。これらは例えば、ＰＥＧ−２００、ＰＥＧ−５００、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−８０００及びＰＥＧ−１０，０００を含む。ここで述べる方法で使用する特定のＤＮＡ凝集剤の好ましい選択及び量は、例えば、実施例１〜５の述べる実験を行い、そしてコントロール試験を行う一方で、試験変数に科学的方法論を適用することにより、当該技術分野の当業者によって容易に決定することができる。
プラスミドＤＮＡは、以下の実施例で述べるように細菌細胞溶解及びカラムクロマトグラフィーにより分離された。
実施例１
小規模な細菌細胞溶解及びプラスミドの回収
大腸菌細胞を含むＶＣＬ−１００５Ｇ／Ａ、約５０グラムを使用した。プラスミドＤＮＡ（ＶＣＬ−１００５Ｇ／Ａ）はｐＢＲ３２２プラスミドに由来した。これは約５，０００ｂｐの大きさであった。これはカナマイシン耐性タンパク質（Ｔｎ９０３）をコードする遺伝子を発現した。これは、ＨＬＡ−Ｂ７と呼ばれるクラス１の主要組織適合性遺伝子複合体のＨ鎖（ヒト ＨＬＡ−Ｂ７ ｃＤＮＡ）及びＬ鎖（チンパンジー β−２ ミクログロブリン ｃＤＮＡ）タンパク質もコードした。これらの２つのタンパク質は、バイシストロニック ｍＲＮＡで発現された。このｍＲＮＡの真核細胞転写は３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）由来のラウス肉腫瘍ウイルスプロモーター配列及びウシ成長ホルモン遺伝子由来の転写終結／ポリアデニル化シグナル配列に依存した。Ｈ鎖の真核細胞発現は５’キャップ依存性タンパク質翻訳開始部位より調節された。Ｌ鎖の発現は、脳心筋炎ウイルス由来のキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）配列によって調節された。細菌細胞におけるこのプラスミドの複製は細菌性複製開始点の存在下で調節された。
プラスミドＤＮＡを含む細胞は６１ｍＭグルコース、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍｌ中に懸濁した。溶解は１％ＳＤＳを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ、６００ｍｌを添加し、そして８分間インキュベートした後に生じた。細胞破片は３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ５．０、４５０ｍｌにより沈殿させ、そして８分間インキュベートした。溶解物中に残る細胞破片はセライト ハイフロ スーパーセル（Celite Hyflo Super cel,flux calcined,Celite Corp.,Lompoc, CA）１３０ｇを加えることで取り除かれ、そして真空下でブフナーフィルター(Buchner filter)中でセライト プレコート Ａ／Ｅフィルター ディスク（Celite pre-coated A/E filter disk, Gelman Sciences, Ann Arbor,MI）を通過させた。ろ過物はワットマン＃４フィルターカップ(Whatman#4 filter cup)で微粒子を取り除き、そして１．６Ｍ ＮａＣｌ中に３０％ＰＥＧを最終的に８％ＰＥＧ濃度となるよう加えることより、プラスミドＤＮＡを沈殿させた。このサンプルは４−８℃で一晩攪拌された。
プラスミドＤＮＡは６，０００×ｇで４０分間遠心することにより集めた。このペレットは１０分間乾燥され、５０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁させた。同量の５Ｍ酢酸アンモニウムをサンプルに加え、そして氷上で１５分間インキュベートした。サンプルは２，０００×ｇで３０分間遠心された。上清中のプラスミドＤＮＡは０．６容量の−２０℃のイソプロパノールを加えることで沈殿させた。−２０℃で２時間インキュベートした後、サンプルは２，０００×ｇで３０分間遠心された。ＤＮＡペレットは１０分間乾燥され、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴＥ、３０ｍｌ中に懸濁された。
プラスミドＤＮＡはＰＥＧの存在及び不存在の両方で、下記に述べるように陰イオン交換クロマトグラフィーに供された。
実施例２
陰イオン交換クロマトグラフィー
実施例１に従って調製した３０ｍｌのプラスミドＤＮＡを２つに分けた。そのサンプルの一つに固体のＰＥＧ−８０００で最終濃度で１％（ｗ／ｖ）となるように加えた。ＰＥＧ−８０００は他の１５ｍｌのサンプルには加えなかった。Ｑ−セファロース（登録商標）ファーストフロー(Fast Flow)陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア、Piscataway,NJ)(5.0 X 5.0cm)はファルマシア バイオパイロット（登録商標）システムを使用して圧力充填された。このカラムは、ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．７Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）または緩衝液Ａで平衡化された。各１５ｍｌのアリコートはそれぞれこのバイオパイロット スーパーループにかけられた。ＰＥＧを含むサンプルをかけた後、４倍のベット容量のＰＥＧを含む緩衝液Ａで洗浄した。コントロールサンプル（ＰＥＧなし）がかけられた後、４倍のベット容量の緩衝液Ａで洗浄した。通過ピークを集め、アガロースゲルでの分析のため保存した。このＤＮＡはその後、ＰＥＧを含むＤＮＡサンプルに対してＰＥＧ−８０００を含む１００％緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を、コントロールＤＮＡサンプルに対しては緩衝液Ｂ（ＰＥＧなし）を、４ベット容量用いてカラムから溶出した。５０ｍｌのフラクションを得た。通過物及び緩衝液Ｂで洗浄後に溶出したフラクションの両方はエチジウムブロミドの存在下、０．８％アガロースゲル電気泳動により分析した。結果は１％ＰＥＧの存在下で、ほぼすべてのＤＮＡサンプルがカラム上に保持され、実質的に通過物中にＤＮＡは存在しないことを示した。これに対して、ＰＥＧ−８０００の不存在では、カラムからプラスミドＤＮＡがかなり漏出し、そこではプラスミドＤＮＡは多様な夾雑物とともに通過物中に溶出され、ＤＮＡの完全な結合は得られていないことを示した。ＰＥＧ−８０００の存在により、プラスミドＤＮＡの回収率を２０％と少ないものから一般的には８０％まで改善した。
大規模なプラスミドの精製は以下に述べるように行った。
実施３
大規模な細菌細胞溶解及びプラスミドの回収
細胞含む５００ｇのＶＣＬ−１００５Ｇ／Ａを８ガロンのＡＳＭＥ ３１６Ｔで溶解した。細胞は、６１ｍＭグルコース、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｌ中に懸濁した。１％ＳＤＳを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ、６Ｌを加え、そして８分間インキュベートした後、溶解が起こった。細胞破片は３Ｍ 酢酸カリウム、ｐＨ５．０、４．５Ｌを使用し、そして８分間インキュベートすることにより沈殿させた。溶解中の細胞破片は６７５ｇのセライト ハイフロ スーパーセル(Celite Hyflo Super cell, flux calcined)を加え、そして7 cell SP50 カートリッジ(CUNO, Inc., Meriden,CT)を含む Cuno 8ZP1P316Tステンレス カートリッジ ホルダーを加圧下で通過させた。不純物を取り除いた溶解物は濃縮され、そして、6 FT2 PTQK TFFカートリッジ(Millipore Corp., Bed ford, MA)を使用して緩衝液の交換を行った。７０１Ｓポンプ（Watson Marlow, Inc.,Wilmington,MA）は４Ｌ／ｍｉｎの流速で使用した（チューブは3/8”ID Masterflex Pharmed）。６倍容量に減少させ、そして２容量の１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０でダイアフィルトレーションを行った。
プラスミドＤＮＡは、１．６Ｍ ＮａＣｌ中で、４℃で一晩、ゆっくり攪拌しつつ、３０％ＰＥＧ−８０００を最終濃度で８％と成るように加えることにより、不純物を除いた溶解物から沈殿させた。プラスミドＤＮＡは、Jouan KR4 22遠心器を使用して、６，０００×ｇで４０分間遠心することにより集めた。ペレット化したプラスミドＤＮＡを４００ｍｌ ＴＥ中に懸濁し、そして等量の５Ｍ酢酸アンモニウムを加えた。この溶液は完全に混合し、氷上で１５分間インキュベートし、そして６，０００×ｇで２０分間遠心した。プラスミドＤＮＡは、−２０℃の最上級の２−プロパノール（Fisher）、０．６倍容量を加えることにより、上清から沈殿させた。−２０℃で最低２時間インキュベートした後、沈殿したＤＮＡは、Jouan KR4 22遠心器を使用して６，０００×ｇで２０分間で、ペレット化した。このペレットは１％ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液Ａ、３００ｍｌ中に再懸濁された。２６０ｎｍの吸光度により決定される最終的なプラスミド濃度は約４ｍｇ／ｍｌであり、核酸の全体量は１．３ｇであった。
プラスミドＤＮＡは下記に述べるように陰イオン交換クロマトグラフィーに供された。
実施例４
陰イオン交換クロマトグラフィー
ファルマシア ＢＰＥ １００／５００ カラムは、製造業者の指示に従いファルマシア バイオパイロット（登録商標）システムを使用して圧力充填された。最終的なカラムの大きさは１０×１３ｃｍであり、ベット容量は約１，０００ｍｌであった。このカラムは１％ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液Ａを４容量用いて３５ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化した。実施例３に従って調製された部分的に精製されたプラスミドＤＮＡは、０．４５μｍ滅菌アクロディスク シリンジ フィルター(sterile Acrodisc syringe filter,Gelman Sciences)を通し、バイオパイロット スーパーループをかけた。サンプルをカラムにかけた後、３倍ベット溶量の緩衝液Ａで洗浄した。通過したピークは２Ｌのローラーボトル(roller bottle)に集め、ゲル分析用に保存した。このＤＮＡは次に、追加的な２倍のベット容量に対して、１％ＰＥＧ−８０００を含む１００％緩衝液Ｂを２倍のベット容量を用いてカラムから溶出させた。フラクション（４５ｍｌ）は１００％緩衝液Ｂへのステップの後に集められた。クロマトグラフィーの後に、カラムは１カラム容量の２Ｍ ＮａＣｌで洗浄され、そして２カラム容量の１Ｍ ＮａＯＨで洗浄された。フラクションと通過物は、０．８％アガロースゲルによる電気泳動により分析され、プラスミドＤＮＡを含むフラクションはプールされ、そして０．６容量の冷却２−プロパノールで沈殿された。
実施例２で得られた結果と同様に、通過物には基本的にプラスミドＤＮＡは存在しなかった。プラスミドＤＮＡは塩勾配（緩衝液Ｂ）の工程の適用後にのみ溶出された。
１％ＰＥＧ−８０００の存在下で陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られたプラスミドＤＮＡは下記に述べるようにゲルろ過クロマトグラフィーにより更に精製された。
実施例５
ゲルろ過クロマトグラフィー
ファルマシア ＢＰＥ １００／９５０ ゲルろ過カラムはSEPHACRYL（登録商標）S-1000 バイオパイロット システムを使用して圧力充填された。最終的なカラムの大きさは、１０×８５ｃｍであり、ベット容量は約６．５Ｌであった。実施例４からイソプロパノールで沈殿させたプラスミドＤＮＡは、６，０００×ｇで２０分間遠心することより集められ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁させ、０．２２μｍ滅菌酢酸セルロース アクロディスク シリンジ フィルター(sterile cellulose acetate Acrodisc syringe filter)を通過させた。このＤＮＡをカラムにかけた。このカラムのランニング緩衝液は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであり、流速は８ｍｌ／ｍｉｎであった。フラクション（４５ｍｌ）は集められ、０．８％アガロースゲル電気泳動により分析された。大部分がスーパーコイルであるＤＮＡを含むフラクションはプールされ、２倍容量の冷エタノールにより沈殿された。
本願発明は詳細な説明に記載したこれらの態様のみに限定されるものではないことを注意すべきである。本願発明の精神を含むいかなる態様もこの範囲内にあるものと考慮すべきである。しかしながら、この発明は下記の請求の範囲によってのみ限定される。
本願発明はカラムクロマトグラフィー中でプラスミドＤＮＡを精製する方法、特に遺伝子治療及び遺伝子免疫化における医薬品等級としての使用に適したプラスミドＤＮＡを大規模的に処理する方法に関するものである。
発明の背景
微生物細胞からプラスミドＤＮＡを分離する従来技術は小規模レベル又は実験室レベルの調製に対してのみ適したものである。広く使用されている技術の一つは、プラスミドを含む微生物細胞のアルカリ細胞溶解及び酢酸中性化を含み、これにより宿主ゲノムＤＮＡ及びタンパク質は沈殿させられ、遠心により取り除かれる。残ったプラスミドＤＮＡはエタノールで沈殿され、塩化セシウム／エチジウムブロミド（ＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ）密度勾配遠心にかけられる。エチジウムブロミドはプラスミドＤＮＡをスーパーコイル状、直鎖状及びニックのある環状形状のものに分け、そして所望する形状のものが回収される。残余のエチジウムブロミドはブタノールによる抽出で除かれ、ＤＮＡはエタノールにより沈殿される。宿主細胞タンパク質はフェノールによる抽出の繰り返しにより取り除かれ、次にＤＮＡの沈殿そしてイソアミルアルコール／クロロホルムによる抽出の繰り返しによりフェノールは取り除かれる。プラスミドＤＮＡの分離及び精製に使用されるこれらの一般的実験法は製造方法には適していない。まして、これらの方法は遺伝子治療又は遺伝子免疫化における医薬品等級としての使用に適したプラスミドＤＮＡの生産には適していない。密度勾配遠心は規模を拡張できないし、エチジウムブロミドは突然変異原であると知られており、フェノールは有害な化学物質であり、この方法は労働集約的である。
組換えプラスミドＤＮＡを大規模的に精製する最近の努力はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用した示差沈殿、そしてイオン交換及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーに向けられている。Ｈｏｒｎら、Hum.Gene.Ther.,6:565-573,1995;PCT出願 No. WO95/21250。この方法を使用したプラスミドＤＮＡの収率は一般的に約５０％である。PCT出願 No. WO96/02658は細菌細胞の溶解、陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを含む大規模なプラスミドＤＮＡの精製を開示している。ＤＥ４３２１９０４ Ａ１はカオトロピックの塩の存在下または１Ｍ以上の塩濃度を有する溶液の存在下で、シリカまたはガラスクロマトグラフィーを使用して核酸混合物を分離する方法を教示している。しかし、プラスミドＤＮＡのクロマトグラフィーによる精製の主な問題は、所望の生産物が鋭いピークではなく、広い尾を引いたスメアとして抽出され、そして通過物中に現れることであり、従って溶解成分からの分離が妨げられる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、三価陽イオン（例えば、ヘキサミンコバルト（ＩＩＩ）、スペルミジン）、アルコール及びポリビニルピロリジンを含む多くの試薬は、ＤＮＡ分子が伸張したコイル状から緻密な球状に凝集するのを促進させる。吉川ら、J.Am.Chem.Soc.,118:929-930,1996;皆川らBiopolymers,34;555-558,1994;アルスコットらBiopolymers,30:619-630,1990及びラーマンらProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,68;1886-1890,1971。ポリエチレングリコールのＤＮＡ分子を凝集させる能力は、６．０Ｍで転移点になり（吉川ら）、１．９−１０．０Ｍ ＰＥＧ濃度（皆川ら）で起こるようである。すなわち、低いＰＥＧ濃度では、ＤＮＡ分子は伸張したコイル状態で存在し、高いＰＥＧ濃度ではＤＮＡ分子は小さな球状の状態に縮んでいる（皆川ら）。
カラムクロマトグラフィー中でプラスミドＤＮＡを精製する方法へのニーズは存在する。遺伝子治療及び遺伝子免疫化における医薬やワクチンに使用されるのに十分精製されたプラスミドＤＮＡが大規模な量で必要性なことから、このニーズは、特に緊急である。
発明の概要
本願発明の一つの態様は、カラムクロマトグラフィーを使用して生物学的混合物からプラスミドＤＮＡを精製する改良方法であり、
この混合物にポリエチレングリコールを加える工程、及び、
この混合物からこのＤＮＡをクロマトグラフィーにより分離する工程、
を含む改良方法である。
好ましくは、このポリエチレングリコールは約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量、更に好ましくはポリエチレングリコールは約１％（ｗ／ｖ）の量で加えられる。この好ましい態様の一つの特徴は、ポリエチレングリコールは約７，０００から約９，０００の平均分子量を有しており、もうとつの特徴は、ＰＥＧがＰＥＧ−８０００である。この態様は更に分離する工程が陰イオン交換クロマトグラフィーであることを含む。
本願発明は宿主細胞不純物からプラスミドＤＮＡを精製する方法において、
このプラスミドＤＮＡと宿主細胞夾雑物を含む溶液に、カラムクロマトグラフィー中に宿主細胞不純物からプラスミドＤＮＡを分離させるのに十分量のポリエチレングリコールを加える工程、及び、
カラムクロマトグラフィーを行い、これによりプラスミドＤＮＡが宿主細胞不純物から精製されるようにする工程、
を含む方法も更に提供する。
好ましくは、ポリエチレングリコールの量は、約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量、更に好ましくはポリエチレングリコールは約１％（ｗ／ｖ）の量で加えられる。この好ましい態様の一つの特徴によれば、ポリエチレングリコールは約７，０００から約９，０００の平均分子量を有しており、もうとつの特徴によれば、ＰＥＧはＰＥＧ−８０００である。この態様は更にこのカラムクロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーであることを提供する。
本願発明のもう一つの態様は細胞溶解物の夾雑物からプラスミドＤＮＡを精製する方法において、
このプラスミドＤＮＡと分解夾雑物を含む溶液に、このＤＮＡを凝集させるのに十分量のＤＮＡ凝集剤を加える工程、及び、
この凝集剤を含む溶液をクロマトグラフィーカラムに通過させ、これによりこの溶解夾雑物からこのプラスミドＤＮＡを精製する工程、
を含む方法である。
好適には、凝集剤はポリエチレングリコール、好ましくは約７，０００から約９，０００の平均分子量を有しているもの、更に好ましくはＰＥＧ−８０００である。好ましくは、ポリエチレングリコールの量は約０．１から約４％（ｗ／ｖ）の間の量、更に好ましくは、この量は約１％（ｗ／ｖ）である。この態様は、クロマトグラフィーカラムが陰イオン交換クロマトグラフィーカラムであることを含む。
好適な態様の詳細な説明
本願発明はカラムクロマトグラフィー中にプラスミドＤＮＡを精製する方法を提供することである。短鎖重合アルコール、好ましくはポリエチレングリコール、またはもう一つのＤＮＡ凝集剤はカラムクロマトグラフィーにかける前にＤＮＡサンプルに加えられる。短鎖重合アルコール又は凝集剤はプラスミドＤＮＡの分離を改善し、大規模な精製に、特に医薬品等級としてのプラスミドＤＮＡの製造に使用できるかもしれない。
宿主細胞の夾雑物からクロマトグラフィーによりプラスミドＤＮＡを精製する際の大きな問題点は、所望の生産物がはっきりしたピークというよりむしろ広がった不純物として抽出され、そして通過物に現れることであり、従ってこれらの夾雑物からプラスミドＤＮＡの分離を妨げることである。本願発明の方法はこの問題を解決する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような短鎖重合アルコールまたはもう一つのＤＮＡ凝集剤の存在で、プラスミドＤＮＡははっきりしたピークになって抽出され、そして、通過物には現れず、従って精製を促進させ、収率を増加させる。
特別な理論により制限されることなく、クロマトグラフィーカラムへのプラスミドＤＮＡの均一な結合は、ＤＮＡ分子が伸張したコイル状態から緻密な球状態に凝集したことから起こるのかもしれない。プラスミドＤＮＡはスーパーコイル状、直鎖状及びニックを持つ環状形状の混合物で存在する。イオン交換カラムにＤＮＡサンプルを供することにより、多種類のプラスミドＤＮＡは、異質な形態でそして異なった相対結合係数でクロマトグラフィーマトリックスへ結合するものと見ることができる。伸張したコイルの緻密は球状への収縮は、より均質な形態でそして類似の結合係数で陰イオン交換マトリックスへ結合するのを増大させる原因であるかもしれない。多種類のＤＮＡ凝集剤は、本願のクロマトグラフィーの方法によりプラスミドＤＮＡの精製を促進させるものとして、従って予期することができる。
ポリエチレングリコールの存在下でクロマトグラフィーカラムへのプラスミドＤＮＡの結合の増大を説明するであろうもう一つの理論は、配座型への疎水性相互作用の貢献である。多種類の試薬により疎水性相互作用が崩されることで、ＤＮＡ分子はより均質な形態でそして類似の結合係数でクロマトグラフィーマトリックスへ結合するのを促進させる配座型になると想定することができるかもしれない。疎水性相互作用を媒介する化学試薬も本願発明で有用なものとして当然想定することができる。
ポリエチレングリコールのような短鎖重合アルコール及びプラスミドＤＮＡを精製の目的のために均質なものとして機能させる他のＤＮＡ凝集剤の使用は、イオン交換クロマトグラフィーに限定されるものではない。これはサイズ排除クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーを含む他のクロマトグラフィー方法に拡張できる。確かに、この方法は、例えばダイアフィルトレーション、ウルトラフィルトレーション及びろ過一般の他の精製方法にも広く拡張でき、多様なプラスミドＤＮＡ種を一種類のものとして機能させることにより、ＲＮＡ、タンパク質及び他の夾雑物からのプラスミドＤＮＡの分離は促進される。
本願発明の方法は、プラスミドＤＮＡの高い生産物回収率を含む多くの利点を提供することができる。これらの方法を使用するＤＮＡの収率はクロマトグラフィー工程に対して少なくとも９０％である。更に、この発明は、人への使用に十分な精製純度のプラスミドＤＮＡを大規模な量で生産するのに適用可能である。
プラスミドＤＮＡは一般的に微生物の発酵物の構成成分から分離される。酵母細胞及び細菌細胞を含む多種多様な微生物細胞が、本願発明の方法の使用に適していることは当業者には明かである。好ましい微生物発酵は細菌発酵である。好ましい細菌発酵は大腸菌発酵である。微生物発酵物は使用される細菌の成長に適するいかなる液体培地中でも生育させることができる。
本願発明の方法により精製されるＤＮＡプラスミドはいかなる染色体外ＤＮＡであってもよい。プラスミドは実質的にいかなる大きさ又は性質であってもよいということは当業者には明かである。これらのプラスミドは高コピー数、低コピー数のもの又は制御できないプラスミドであってもよい。これらは、選択できる遺伝子、ポリリンカー、複製開始点、プロモーター、エンハンサー、リーダー配列、ポリアデニル化部位及び終結配列を含む遺伝子要素の領域を含む。プラスミドは基本的にはいかなる起源の人の遺伝子及び動物のものを含むことができる。
プラスミドＤＮＡを含む微生物細胞は発酵培養液から最初に収集され、細胞ペーストを生じさせる。液体培養液から細胞を収集するいかなる従来方法も適用できる。そのような方法は遠心、ろ過及び沈殿法を含む。
次は、細胞溶解である。典型的には、細胞は緩衝液中に懸濁される。我々は細胞壁を弱くするいかなる酵素処理も奨励しない。これは、使用しなければならない動物の酵素はこれらの方法により生産されるプラスミドＤＮＡの受容者に感染する動物ウイルスを保持するかもしれないからである。
細胞破片及び他の不純物は遠心、ろ過、沈殿のような標準的な方法により次に取り除かれる。我々は珪藻土でろ過することにより結果として生じる上清の不純物を取り除く。珪藻土によるろ過もこの上清に関して宿主ＲＮＡの濃度を減少させる。
この後、プラスミドＤＮＡは適当な条件下で沈殿剤を使用して不純物を取り除いた上清から沈殿させ、収集されそして緩衝液中に再懸濁させることができる。次に、我々は、プラスミドＤＮＡを妨害するものとして宿主ＲＮＡ、タンパク質及びリポ多糖をこの目的に好適な条件下で沈殿剤により沈殿させる。最後に、ろ過物は収集され、そしてプラスミドＤＮＡはこれらの好適な条件下で沈殿試薬を使用することにより再度沈殿される。次に、カラムクロマトグラフィーである。
ＤＮＡペレットはカラムクロマトグラフィーに先立ちカラム緩衝液中に再懸濁させる。この緩衝液はポリエチレングリコールまたはもう一つのＤＮＡ凝集剤を、単独でまたは組み合わせて含む。典型的には、ＤＮＡ溶液中のＰＥＧの濃度は約０．１から約４％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）である。もし、ＰＥＧの濃度が０．１％（ｗ／ｖ）以下の場合、プラスミドＤＮＡの結合の増加は起こらない。もしＰＥＧ濃度が４％（ｗ／ｖ）以上の場合、ＤＮＡは溶液から沈殿しはじめる。ＰＥＧ−８０００に対しては、約０．１％から約４％の範囲は、１．７×１０-4Ｍから６．７×１０-3Ｍのモル濃度に対応する。
プラスミドＤＮＡはＤＮＡサンプルと同様の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに供された。多種多様な入手可能な陰イオン交換マトリックスは、POROS陰イオン レンジ、Qiagen、Toso Hass、Sterogene、Spherodex、Nucleopac及びファルマシアから得られるものを含むが、これらに限定されず、本願発明に使用するのに適している、このカラムはベッド容量の数倍の緩衝液で洗浄される。通過するピークは実質的にプラスミドを含まず、このことはカラムマトリックスにほとんど完全にＤＮＡが結合していることを示す。これとは反対に、ポリエチレングリコールを含まない緩衝液を使用するときはプラスミドＤＮＡは通過する部分に存在する。
プラスミドＤＮＡはポリエチレングリコールを含む緩衝液中で１段階の塩溶出によりカラムから溶出される。カラムフラクションはアガロースゲル電気泳動によりプラスミドＤＮＡが分析される。プラスミドＤＮＡを含むフラクションはプールされ、沈殿させられ、再懸濁させられ、そして更なる処理のためゲルろ過カラムに供される。最後にカラムで精製されたＤＮＡは究極的最終的な組成、無菌フィル、最終品に調製される。
イオン交換カラムから溶出されたプロファイルは異なるＤＮＡ調製物に対応する。この成功は下記の実施例４に示す大規模なＤＮＡの調製に拡張することができる。こうように、ＤＮＡ凝集剤がカラム緩衝液中に存在する場合に、再現可能なクロマトグラフィーによる精製が達成される。
本願方法において多くのＤＮＡ凝集剤を使用することは予期できる。そのような試薬は、炭素を１〜４個有する短鎖重合アルコール（例えばポリエチレングリコール）、３価の陽イオン（例えばヘキサミンコバルト（ＩＩＩ）、スペルミジン）、短鎖アルコール（例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール）及び他のポリマー（例えばポリビニルピロリドン）を含むが、これに限定させるものではない。平均分子量が７，０００〜９，０００であるポリエチレングリコールが好ましく、そして平均分子量が８，０００であるポリエチレングリコール、ＰＥＧ−８０００が本願発明で使用するのに特に好ましいが、他の平均分子量を有するポリエチレングリコールも更に予期できる。これらは例えば、ＰＥＧ−２００、ＰＥＧ−５００、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−８０００及びＰＥＧ−１０，０００を含む。ここで述べる方法で使用する特定のＤＮＡ凝集剤の好ましい選択及び量は、例えば、実施例１〜５の述べる実験を行い、そしてコントロール試験を行う一方で、試験変数に科学的方法論を適用することにより、当該技術分野の当業者によって容易に決定することができる。
プラスミドＤＮＡは、以下の実施例で述べるように細菌細胞溶解及びカラムクロマトグラフィーにより分離された。
実施例１
小規模な細菌細胞溶解及びプラスミドの回収
大腸菌細胞を含むＶＣＬ−１００５Ｇ／Ａ、約５０グラムを使用した。プラスミドＤＮＡ（ＶＣＬ−１００５Ｇ／Ａ）はｐＢＲ３２２プラスミドに由来した。これは約５，０００ｂｐの大きさであった。これはカナマイシン耐性タンパク質（Ｔｎ９０３）をコードする遺伝子を発現した。これは、ＨＬＡ−Ｂ７と呼ばれるクラス１の主要組織適合性遺伝子複合体のＨ鎖（ヒト ＨＬＡ−Ｂ７ ｃＤＮＡ）及びＬ鎖（チンパンジー β−２ ミクログロブリン ｃＤＮＡ）タンパク質もコードした。これらの２つのタンパク質は、バイシストロニック ｍＲＮＡで発現された。このｍＲＮＡの真核細胞転写は３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）由来のラウス肉腫瘍ウイルスプロモーター配列及びウシ成長ホルモン遺伝子由来の転写終結／ポリアデニル化シグナル配列に依存した。Ｈ鎖の真核細胞発現は５’キャップ依存性タンパク質翻訳開始部位より調節された。Ｌ鎖の発現は、脳心筋炎ウイルス由来のキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）配列によって調節された。細菌細胞におけるこのプラスミドの複製は細菌性複製開始点の存在下で調節された。
プラスミドＤＮＡを含む細胞は６１ｍＭグルコース、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍｌ中に懸濁した。溶解は１％ＳＤＳを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ、６００ｍｌを添加し、そして８分間インキュベートした後に生じた。細胞破片は３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ５．０、４５０ｍｌにより沈殿させ、そして８分間インキュベートした。溶解物中に残る細胞破片はセライト ハイフロ スーパーセル（Celite Hyflo Super cel,flux calcined,Celite Corp.,Lompoc, CA）１３０ｇを加えることで取り除かれ、そして真空下でブフナーフィルター(Buchner filter)中でセライト プレコート Ａ／Ｅフィルター ディスク（Celite pre-coated A/E filter disk, Gelman Sciences, Ann Arbor,MI）を通過させた。ろ過物はワットマン＃４フィルターカップ(Whatman#4 filter cup)で微粒子を取り除き、そして１．６Ｍ ＮａＣｌ中に３０％ＰＥＧを最終的に８％ＰＥＧ濃度となるよう加えることより、プラスミドＤＮＡを沈殿させた。このサンプルは４−８℃で一晩攪拌された。
プラスミドＤＮＡは６，０００×ｇで４０分間遠心することにより集めた。このペレットは１０分間乾燥され、５０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁させた。同量の５Ｍ酢酸アンモニウムをサンプルに加え、そして氷上で１５分間インキュベートした。サンプルは２，０００×ｇで３０分間遠心された。上清中のプラスミドＤＮＡは０．６容量の−２０℃のイソプロパノールを加えることで沈殿させた。−２０℃で２時間インキュベートした後、サンプルは２，０００×ｇで３０分間遠心された。ＤＮＡペレットは１０分間乾燥され、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴＥ、３０ｍｌ中に懸濁された。
プラスミドＤＮＡはＰＥＧの存在及び不存在の両方で、下記に述べるように陰イオン交換クロマトグラフィーに供された。
実施例２
陰イオン交換クロマトグラフィー
実施例１に従って調製した３０ｍｌのプラスミドＤＮＡを２つに分けた。そのサンプルの一つに固体のＰＥＧ−８０００で最終濃度で１％（ｗ／ｖ）となるように加えた。ＰＥＧ−８０００は他の１５ｍｌのサンプルには加えなかった。Ｑ−セファロース（登録商標）ファーストフロー(Fast Flow)陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア、Piscataway,NJ)(5.0 X 5.0cm)はファルマシア バイオパイロット（登録商標）システムを使用して圧力充填された。このカラムは、ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．７Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）または緩衝液Ａで平衡化された。各１５ｍｌのアリコートはそれぞれこのバイオパイロット スーパーループにかけられた。ＰＥＧを含むサンプルをかけた後、４倍のベット容量のＰＥＧを含む緩衝液Ａで洗浄した。コントロールサンプル（ＰＥＧなし）がかけられた後、４倍のベット容量の緩衝液Ａで洗浄した。通過ピークを集め、アガロースゲルでの分析のため保存した。このＤＮＡはその後、ＰＥＧを含むＤＮＡサンプルに対してＰＥＧ−８０００を含む１００％緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を、コントロールＤＮＡサンプルに対しては緩衝液Ｂ（ＰＥＧなし）を、４ベット容量用いてカラムから溶出した。５０ｍｌのフラクションを得た。通過物及び緩衝液Ｂで洗浄後に溶出したフラクションの両方はエチジウムブロミドの存在下、０．８％アガロースゲル電気泳動により分析した。結果は１％ＰＥＧの存在下で、ほぼすべてのＤＮＡサンプルがカラム上に保持され、実質的に通過物中にＤＮＡは存在しないことを示した。これに対して、ＰＥＧ−８０００の不存在では、カラムからプラスミドＤＮＡがかなり漏出し、そこではプラスミドＤＮＡは多様な夾雑物とともに通過物中に溶出され、ＤＮＡの完全な結合は得られていないことを示した。ＰＥＧ−８０００の存在により、プラスミドＤＮＡの回収率を２０％と少ないものから一般的には８０％まで改善した。
大規模なプラスミドの精製は以下に述べるように行った。
実施３
大規模な細菌細胞溶解及びプラスミドの回収
細胞含む５００ｇのＶＣＬ−１００５Ｇ／Ａを８ガロンのＡＳＭＥ ３１６Ｔで溶解した。細胞は、６１ｍＭグルコース、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｌ中に懸濁した。１％ＳＤＳを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ、６Ｌを加え、そして８分間インキュベートした後、溶解が起こった。細胞破片は３Ｍ 酢酸カリウム、ｐＨ５．０、４．５Ｌを使用し、そして８分間インキュベートすることにより沈殿させた。溶解中の細胞破片は６７５ｇのセライト ハイフロ スーパーセル(Celite Hyflo Super cell, flux calcined)を加え、そして7 cell SP50 カートリッジ(CUNO, Inc., Meriden,CT)を含む Cuno 8ZP1P316Tステンレス カートリッジ ホルダーを加圧下で通過させた。不純物を取り除いた溶解物は濃縮され、そして、6 FT2 PTQK TFFカートリッジ(Millipore Corp., Bed ford, MA)を使用して緩衝液の交換を行った。７０１Ｓポンプ（Watson Marlow, Inc.,Wilmington,MA）は４Ｌ／ｍｉｎの流速で使用した（チューブは3/8”ID Masterflex Pharmed）。６倍容量に減少させ、そして２容量の１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０でダイアフィルトレーションを行った。
プラスミドＤＮＡは、１．６Ｍ ＮａＣｌ中で、４℃で一晩、ゆっくり攪拌しつつ、３０％ＰＥＧ−８０００を最終濃度で８％と成るように加えることにより、不純物を除いた溶解物から沈殿させた。プラスミドＤＮＡは、Jouan KR4 22遠心器を使用して、６，０００×ｇで４０分間遠心することにより集めた。ペレット化したプラスミドＤＮＡを４００ｍｌ ＴＥ中に懸濁し、そして等量の５Ｍ酢酸アンモニウムを加えた。この溶液は完全に混合し、氷上で１５分間インキュベートし、そして６，０００×ｇで２０分間遠心した。プラスミドＤＮＡは、−２０℃の最上級の２−プロパノール（Fisher）、０．６倍容量を加えることにより、上清から沈殿させた。−２０℃で最低２時間インキュベートした後、沈殿したＤＮＡは、Jouan KR4 22遠心器を使用して６，０００×ｇで２０分間で、ペレット化した。このペレットは１％ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液Ａ、３００ｍｌ中に再懸濁された。２６０ｎｍの吸光度により決定される最終的なプラスミド濃度は約４ｍｇ／ｍｌであり、核酸の全体量は１．３ｇであった。
プラスミドＤＮＡは下記に述べるように陰イオン交換クロマトグラフィーに供された。
実施例４
陰イオン交換クロマトグラフィー
ファルマシア ＢＰＥ １００／５００ カラムは、製造業者の指示に従いファルマシア バイオパイロット（登録商標）システムを使用して圧力充填された。最終的なカラムの大きさは１０×１３ｃｍであり、ベット容量は約１，０００ｍｌであった。このカラムは１％ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液Ａを４容量用いて３５ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化した。実施例３に従って調製された部分的に精製されたプラスミドＤＮＡは、０．４５μｍ滅菌アクロディスク シリンジ フィルター(sterile Acrodisc syringe filter,Gelman Sciences)を通し、バイオパイロット スーパーループをかけた。サンプルをカラムにかけた後、３倍ベット溶量の緩衝液Ａで洗浄した。通過したピークは２Ｌのローラーボトル(roller bottle)に集め、ゲル分析用に保存した。このＤＮＡは次に、追加的な２倍のベット容量に対して、１％ＰＥＧ−８０００を含む１００％緩衝液Ｂを２倍のベット容量を用いてカラムから溶出させた。フラクション（４５ｍｌ）は１００％緩衝液Ｂへのステップの後に集められた。クロマトグラフィーの後に、カラムは１カラム容量の２Ｍ ＮａＣｌで洗浄され、そして２カラム容量の１Ｍ ＮａＯＨで洗浄された。フラクションと通過物は、０．８％アガロースゲルによる電気泳動により分析され、プラスミドＤＮＡを含むフラクションはプールされ、そして０．６容量の冷却２−プロパノールで沈殿された。
実施例２で得られた結果と同様に、通過物には基本的にプラスミドＤＮＡは存在しなかった。プラスミドＤＮＡは塩勾配（緩衝液Ｂ）の工程の適用後にのみ溶出された。
１％ＰＥＧ−８０００の存在下で陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られたプラスミドＤＮＡは下記に述べるようにゲルろ過クロマトグラフィーにより更に精製された。
実施例５
ゲルろ過クロマトグラフィー
ファルマシア ＢＰＥ １００／９５０ ゲルろ過カラムはSEPHACRYL（登録商標）S-1000 バイオパイロット システムを使用して圧力充填された。最終的なカラムの大きさは、１０×８５ｃｍであり、ベット容量は約６．５Ｌであった。実施例４からイソプロパノールで沈殿させたプラスミドＤＮＡは、６，０００×ｇで２０分間遠心することより集められ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁させ、０．２２μｍ滅菌酢酸セルロース アクロディスク シリンジ フィルター(sterile cellulose acetate Acrodisc syringe filter)を通過させた。このＤＮＡをカラムにかけた。このカラムのランニング緩衝液は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであり、流速は８ｍｌ／ｍｉｎであった。フラクション（４５ｍｌ）は集められ、０．８％アガロースゲル電気泳動により分析された。大部分がスーパーコイルであるＤＮＡを含むフラクションはプールされ、２倍容量の冷エタノールにより沈殿された。
本願発明は詳細な説明に記載したこれらの態様のみに限定されるものではないことを注意すべきである。本願発明の精神を含むいかなる態様もこの範囲内にあるものと考慮すべきである。しかしながら、この発明は下記の請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (10)
- プラスミドDNAを含む微生物細胞から当該プラスミドDNAを精製する方法であって、以下のステップ：
（ａ）細胞溶解産物を調製し；
（ｂ）細胞破片から上記プラスミドDNAを回収し；
（ｃ）凝集剤を含むバッファー中に上記プラスミドDNAを再懸濁させ；
（ｄ）上記プラスミドを含む上記バッファーを、当該バッファーで平衡にしたクロマトグラフィー・マトリックスに適用することを含むクロマトグラフィーを行って、上記プラスミドを精製し；
ここで、上記マトリックスは、イオン交換クロマトグラフィー・マトリックス、ケイズ排除クロマトグラフィー・マトリックス、クロマトフォーカシング・マトリックス、アフィニティー・クロマトグラフィー・マトリックス、疎水性相互作用クロマトグラフィー・マトリックス、及び逆相クロマトグラフィー・マトリックスから成る群から選ばれる、
を含む、前記方法。 - 前記クロマトグラフィー・マトリックスが陰イオン交換クロマトグラフィー・マトリックスである、請求項１に記載の方法。
- 前記溶解産物が、希釈塩基及び洗剤を用いて調製される、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記溶解産物が、珪藻土によるろ過により清澄化される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーに先立って、プラスミドDNAを、前記清澄化された溶解産物から沈澱させる、請求項４に記載の方法。
- 前記凝集剤が、ポリエチレン・グリコールである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ポリエチレン・グリコールが、0.1％（Ｗ／Ｖ）〜４％（Ｗ／Ｖ）の量で添加される、請求項６に記載の方法。
- 前記ポリエチレン・グリコールが、約１％（Ｗ／Ｖ）の量で添加される、請求項７に記載の方法。
- 前記ポリエチレン・グリコールが、7,000〜9,000の平均分子量を有する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ポリエチレン・グリコールが、PEG−8000である、請求項９に記載の方法。
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