MXPA01012213A - Metodos de purificacion de adn y adn purificado. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos para la purificacion de ADN de plasmido, que incluyen la remocion de las impurezas de la celula huesped, tales como endotoxinas, ARN, proteinas, y ADN cromosomal, a partir de una solucion acuosa que contiene ADN del plasmido, y metodos para la separacion y purificacion de ADN de plasmido superenrollado a partir de una solucion acuosa que contiene una mezcla de ADN del plasmido superenrollado y mellado o relajado, utilizando soportes de cromatografia de interaccion hidrofobica.

Description

MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ADN Y ADN PURIFICADO CAMPO DE LA INVENCIÓN • La presente invención proporciona métodos para la 5 purificación de ADN de plásmido que incluye la remoción de impurezas de la célula anfitriona, tales como endotoxinas, ARN, proteínas y el ADN de la célula anfitriona, a partir de una solución acuosa que contiene el ADN del plásmido y métodos para la separación y purificación del ADN del plásmido super 10 enrollado a partir de una solución acuosa que contiene una mezcla de ADN de plásmido super enrollado y mellado o relajado usando medio de interacción hidrofóbico. También se proporcionan métodos mejorados para la purificación del ADN a pequeña escala, tal como experimental o de laboratorio, y 15 equipo usado para estos métodos . La presente invención proporciona ADN purificado y/o separado, tal como ADN de plásmido, preferiblemente super enrollado. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia de genes ofrece un nuevo paradigma de 20 tratamiento para curar enfermedades humanas. El uso del ADN para el tratamiento de enfermedades causadas genéticamente, incluyendo la fibrosis cística, varios tipos de cáncer, etcétera, y la inmunización contra enfermedades, es un modo prometedor de terapia que actualmente se está persiguiendo 25 ampliamente. En vez de alterar el fenotipo de la enfermedad usando sustancias que interactúan con los productos del gen, o son ellos mismos productos del gen, la terapia del gen teóricamente puede modificar genes específicos dando como resultado la cura o el tratamiento a una enfermedad. La terapia de genes podría también utilizarse como sistema de administración de fármacos. Para llevar a cabo esto, un gen que produce producto útil (ARN, péptido, proteína, etcétera) o en sí mismo es un producto útil (tal como en el uso de ADN antisentido) se insertaría en el ADN o células de una célula homologa, heteróloga o autóloga de un individuo o célula anfitriona para posteriormente ser administrada a un individuo, ya sea in vivo, ex vivo o in vi tro . Por ejemplo, durante la cirugía de los vasos sanguíneos, un gen que hace un factor anticoagulante podría insertarse en el ADN de las células que forran los vasos sanguíneos para ayudar a evitar que se formen peligrosos coágulos sanguíneos. Muchas otras condiciones podrían también prestarse al tratamiento usando este enfoque general . La terapia de genes se espera que sea una herramienta poderosa para tratar muchos de los más de 4,000 padecimientos genéticos conocidos, incluyendo fibrosis cística, enfermedad del corazón, cáncer, artritis, y otras enfermedades. La terapia de genes generalmente requiere la transferencia de material genético (ADN) en un individuo. La administración de genes o la administración de material genético se puede lograr ya sea mediante la administración directa de virus que contienen genes o de ADN de plásmido a la sangre o a los tejidos, indirectamente a través de la introducción de células • manipuladas en el laboratorio para cultivar ADN extraño o a 5 través de varias técnicas de encapsulación o portadores conocidos en la técnica. Recientes informes sugieren que también puede ser posible la administración directa de ADN. Varios sistemas diferentes están en uso o bajo consideración para la transferencia de genes somáticos. Estos incluyen, por 10 ejemplo, ADN (ya sea desnudos o complejados) , virus de ARN (retrovirus) , y virus de ADN (adenovirus, virus adenoasociados [AAV] , virus de herpes, y poxvirus) . Las ventajas clave del modo no viral de la terapia del gen, tal como el uso de ADN de plásmido, es la facilidad de 15 preparación en grandes cantidades, un alto grado de seguridad, una falta general de integración del ADN heterólogo en el ADN de la célula anfitriona, y la posibilidad de usar genes o fragmentos de genes de tamaño y número virtualmente ilimitado.

^ Además, el uso del ADN de plásmidos en la terapia de genes 20 generalmente no involucra el uso de genes extraños o proteínas que pueden inducir respuesta inmunológica indeseada en el receptor. Además, las alternativas de usar el ADN de plásmido, tales como vectores virales, son relativamente más caro producirlos . 25 Los métodos actualmente usados para producir ADN de plásmido generalmente proporcionan una mezcla de ADN de plásmido super enrollado y un artefacto de ADN mellado (o relajado) , el cual generalmente no es útil en la aplicación final del ADN de plásmido. Los métodos de la presente invención proporcionan una separación no destructiva del ADN de plásmido super enrollado y mellado de manera que mientras los presentes métodos se ejemplifican por la recuperación y uso del ADN de plásmido super enrollado, una persona con experiencia ordinaria apreciará que ya sea la forma separada del ADN del plásmido puede ser considerada un producto útil de los métodos presentes descritos. Más aún, aunque la presente descripción hace énfasis en la necesidad de una pureza mayor del ADN de plásmido super enrollado en el contexto de la terapia de genes, una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará que el ADN de plásmido se usa ampliamente en biología molecular recombinante más allá del uso en preparaciones de terapia de genes y la invención presente descrita encuentra aplicabilidad amplia como un método preparativo para el ADN de plásmido super enrollado aislado y purificado. Los métodos actualmente disponibles para la separación de dos formas de ADN de plásmido utilizan la cromatografía de intercambio de iones (un proceso novedoso, rápido, para la purificación de plásmido para la terapia de genes (Bhikhabhai R. Ollivier M. y Blanche F., Amersham Pharmacia Biotech R & D, 75184 Uppsala, Sweeden y RPR Gencell, Rhone-Poulenc Roer, Center de Recherche de Vitry-Alfortville, 13 quai Jules Guesde, 94400 Vitry sur Siene, France. Publicación número 18-1129-51; purificación preparativa de ADN de plásmido super enrollado usando cromatografía de intercambio 5 de aniones, Duarte Miguel Prazeres, Thomas Schleup, Charles Cooney, Journal of Chromatography A, 606 (1998) , 31-45) o cromatografía por exclusión de tamaño (Prazeres, D.M., A comparison of Gel Filtration Chromatographic Supports for Plasmid Purification, Biotechnology Techniques Vol. 11, No. 6, 10 Junio 1997, páginas 417-420) , acoplado con el uso de aditivos • tales como polietilenglicol (PEG) , detergentes, y otros componentes tales como hexamina cobalto, espermidina, y polivinilpirrolidona (PVP) . Recientemente se otorgó una patente (Horn y colaboradores (Patente de los Estados Unidos de 15 Norteamérica número 5,707,812)) para la purificación del ADN de plásmido super enrollado usando polietilenglicol como un aditivo. Sin embargo, los métodos actualmente conocidos son incapaces de proporcionar una separación eficiente y efectiva flp en costo de ADN super enrollado y mellado (o relajado) . 20 Además, muchos de los métodos conocidos tienen la desventaja de usar polietilenglicol u otros aditivos, que pueden ser no deseados en la fabricación de ADN de plásmido, ya que requieren separación adicional, desecho y métodos de control de calidad, los cuales pueden ser difíciles, más tardados y más caros. 25 Formas alternativas de métodos conocidos para la separación de formas super enrolladas y relajadas del ADN de plásmido utilizan resinas registradas, muy caras, que también utilizan solventes, tales como acetonitrilo, etanol y otros componentes, como trietilamina y fosfato de tetrabutil amonio, durante el procesamiento. Estos métodos generalmente no son convenientes para la producción a gran escala debido al uso de solventes. Más aún, no se pueden aplicar a materiales iniciales que tienen cantidades significativas del ADN de plásmido relajado ya que la cantidad abundante de ADN de plásmido relajado contaminante en los materiales iniciales tiende a reducir las capacidades de resolución de estas resinas. (Green, A P., y colaboradores, Bio. Pharm. Vol. 10, No. 5, páginas 52-62, Mayo 1997). Métodos adicionales para separar ADN super enrollado y relajado se basan en la cromatografía de exclusión de tamaño, que involucra la separación de las dos formas de ADN de plásmido basándose en la diferencia pequeña de tamaño. Estas columnas tienden a ser relativamente largas, planteando problemas significativos de escalamiento, haciéndoles infactibles para implementar en la producción a gran escala. Además los métodos de exclusión de tamaño necesitan soluciones de muestras concentradas, que es infactible obtener con soluciones de ADN de plásmido, debido a la naturaleza altamente viscosa del ADN. Véase, A comparison of gel filtration chromatographic supports for plasmid purification G.N.M.

Ferreira, J.M.S. Cabral y D.M.F. Prazeres, Biotechnology Techniques, Volumen 11, No. 6, Junio 1997, páginas 417-420. Las preparaciones de plásmido de ADN, que se producen de preparaciones bacterianas frecuentemente contienen una mezcla de ADN de plásmido relajado y super enrollado, frecuentemente requieren remoción de endotoxinas, como lo solicita la FDA, como endotoxinas producidas por muchas anfitrionas bacterianas ya que se sabe que causan reacciones inflamatorias, tales como fiebre o sepsis en el anfitrión que recibe el ADN de plásmido. Estas endotoxinas generalmente son lipopolisacáridos, o fragmentos de los mismos, que son componentes de la membrana externa de bacterias Gram negativas, y están presentes en la preparación de ADN como artefactos de las células anfitrionas o como parte de artefactos mayores, tales como membranas celulares anfitrionas o macromoléculas, usadas en expresión y manufactura del ADN de plásmido para terapia de genes, por ejemplo. Por lo tanto la remoción de endotoxinas es un paso crucial y necesario en la purificación del ADN de plásmido para uso terapéutico o profiláctico. La remoción de endotoxinas a partir de soluciones de ADN de plásmidos principalmente han usado la estructura cargada negativamente de las endotoxinas; sin embargo el' ADN de plásmido también está cargado negativamente y por lo tanto la separación usualmente se logra con resinas de intercambio de anión que enlazan a ambas de esas moléculas y, en ciertas condiciones, preferencialmente eluyen el ADN del plásmido mientras se enlazan las endotoxinas. Esta separación da como resultado solamente una remoción parcial ya que cantidades significativas de endotoxinas se eluyen con el ADN de plásmido y/o se logra una recuperación muy pobre de ADN de plásmido. Otros métodos patentados utilizan detergentes, los cuales podrían plantear problemas. (Process for the depletion or removal of endotoxins, Copian, Metin, Moritz, Peter, Schorr, Joachim, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,747,663) . Además, la capacidad de enlace de estas resinas solamente es del orden de 103 hasta 104 UE (unidades de endotoxinas) /mililitro de resina ya que la resina está ocupada tanto por endotoxina como ADN de plásmido, por ejemplo, típicamente requiriendo de 3 a 80 litros de resina, basándose en capacidades reportadas de 50,000 UE/mililitro hasta 2000 UE/mililitro (Green, A. P. y colaboradores, Bio. Pharm. Vol. 10, No. 5, páginas 52-62, Mayo 1997. Sterogene technical profile DNA Etox, Sterogene, 5922 Farnsworth Cr., Carlsbad, CA 92008) . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para la separación de ADN de plásmido, aislamiento y/o purificación que se puede usar en combinación o independientemente. Específicamente, la presente invención proporciona métodos para separación, purificación y/o aislamiento de ADN de plásmido super enrollado y relajado así como métodos de separación, purificación y/o aislamiento de ADN de plásmido a partir de impurezas de la célula anfitriona, tal como componentes o fragmentos que contienen endotoxinas. Composiciones de ADN de 5 plásmido purificado, separado y/o aislado, específicamente ADN de plásmido super enrollado, también se proporcionan por la presente invención. La presente invención también proporciona métodos y aparatos para la separación, aislamiento y/o purificación en laboratorio o a escala experimental del ADN de 10 plásmido. ? La presente invención proporciona métodos para aislar tipos deseados de polinucleótidos a partir de otros componentes presentes en mezclas que contienen estos polinucleótidos, produciendo composiciones enriquecidas en el tipo deseado de 15 polinucleótidos. Los métodos incluyen la separación de polinucleótidos a partir de componentes indeseados poniendo en contacto mezclas que contienen los polinucleótidos con medios interactivos hidrofóbicos. La separación de los A polinucleótidos de otros componentes, así como la separación de 20 tipos de polinucleótidos es resultado de diferir afinidades de los polinucleótidos y de otros componentes no deseados para el medio interactivo hidrofóbico bajo condiciones de diferencia iónica. De este modo, en los métodos de la invención un medio interactivo hidrofóbico se usa porque tiene un enlace muy 25 preferencial por lipopolisacáridos y lipoproteínas en relación con los polinucleótidos; este enlace preferencial se presenta sobre el rango de condiciones iónicas usadas en el proceso de separación. También se incluye en la invención métodos que separan ADN super enrollado y ADN relajado. Los métodos utilizan condiciones iónicas en donde el ADN super enrollado se enlaza preferencialmente con medios interactivos hidrofóbicos en relación con el ADN relajado. Se entiende que, cuando se describe una concentración de sal usada en los métodos de esta invención, que un equivalente de fuerza iónica de una sal diferente se puede usar. También se entiende que, especialmente con respecto a los métodos los cuales agotan y/o eliminan la endotoxina, estos métodos se aplican a ADN de plásmidos así como ADN de no plásmidos . Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos de separación, aislamiento y/o purificación de ADN de plásmidos a partir de impurezas de células anfitrionas contaminantes . Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de separación, purificación y/o aislamiento de ADN de plásmidos y componentes o fragmentos que contienen endotoxina. Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de separación, purificación y/o aislamiento de ADN de plásmido super enrollado y relajado. También composiciones de ADN de plásmido purificado, separado y/o aislado, específicamente de ADN de plásmido super enrollado, son proporcionados por la presente invención. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para separar endotoxinas y otras impurezas de la célula anfitriona (es decir, ARN, ADN cromosómico, proteína) a partir de ADN de plásmido que involucra poner en contacto un lisado de células con un medio de interacción hidrofóbico bajo condiciones en donde la endotoxina y otras sustancias contaminantes se enlazan al medio de interacción hidrofóbico para formar un complejo y separar el ADN del plásmido y el complejo. La endotoxina separada en el método de esta modalidad incluye endotoxina de micro-organismos Gram negativos así como fragmentos y componentes celulares y subcelulares enlazados a estas endotoxinas y fragmentos de endotoxina. El medio de interacción hidrofóbico también enlaza ARN, incluyendo ARN-t, ARN-r y ARN-M, proteínas de la célula anfitriona y ADN cromosómico. El medio de interacción hidrofóbico útil en la presente invención puede estar en forma de endotoxinas, membranas u otros medios de soporte. Una forma preferida de esta modalidad incluye la carga de ADN de plásmido, con otros componentes de célula anfitriona contaminantes opcionales, incluyendo endotoxina, estando presentes, en una columna o matriz de lecho que contiene el medio de interacción hidrofóbico, de una manera en la cual la endotoxina y las impurezas de la célula anfitriona preferencialmente se enlazan o son retenidas por el medio de interacción hidrofóbico, y el ADN del plásmido se recolecta como efluente (a través del flujo) del proceso de carga o en lavados posteriores opcionales del medio de interacción hidrofóbico que no perturban ni interrumpen la retención de las impurezas de la célula anfitriona y endotoxinas sobre y/o en el medio de interacción hidrofóbico. Después de la recolección del ADN de plásmido, la columna o la matriz del lecho se puede regenerar eluyendo las impurezas de la célula anfitriona retenida o enlazada y la endotoxina alterando, cambiando o modificando, las condiciones de interacción hidrofóbica de la columna o el lecho mediante, por ejemplo, alterar la concentración de sal rodeando la columna o la matriz del lecho. Modalidades alternativas de la presente invención proporcionan métodos de separación en ausencia ya sea de cromatografía de intercambio de iones como de cromatografía de exclusión de tamaño. En una forma preferida de esta modalidad, el volumen de la columna o del lecho inicialmente se equilibra con una solución de reacción de sulfato de amonio a una concentración que permite el enlace selectivo de las impurezas contaminantes con la columna de interacción hidrofóbica, preferiblemente, una concentración de aproximadamente 2M. Las sales que se pueden usar en el método de la presente invención incluyen mezclas de aniones y cationes seleccionados del grupo que consiste en, pero no se limitan a, acetato, fosfato, carbonato, S042", Cl", Br", N03\ Mg2+, Li\ Na+, K+, NH4+ . Mezclas de sales se pueden usar. Más aún, la mezcla del ADN de plásmido y otras impurezas f^ contaminantes, tales como endotoxina, preferiblemente se 5 dializan con regulador de diálisis antes de ponerse en contacto con la columna o la matriz de lecho para remover las sales y otros contaminantes que pueden alterar la hibrofobicidad de la endotoxina y el ADN del plásmido y otras impurezas contaminantes, tales como endotoxinas, en la solución de 10 reacción de sulfato de amonio. La solución de la reacción ^fc preferiblemente se regula con, por ejemplo, Tris-HCl a un pH en el rango de, pero sin limitarse a, 6.8 a 8.5, preferiblemente 7.4. Otros reguladores, también conocidos por los expertos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, Tris, TES (ácido 15 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoetano-sulfónico) , Tricina (N- tris (hidroximetil) metilglicina) , fosfato, PIPES (ácido Piperazina-N,N' -bis (2-etano sulfónico), MOPS (ácido 3- (N- morfolino) -propanosulfónico) , MES (ácido 2- (N-morfolino) - etanosulfónico), MEPES (ácido 3-N (N-morfolino) etilpiperazina- 20 N' -2 -etanosulfónico) , y Bicina (N,N-bis (2-hidroxietil) glicina) se pueden usar. Los métodos de la presente invención proporcionan ADN de plásmido aislado y/o purificado, y una composición que contiene el ADN del plásmido, la cual tiene un contenido de 25 endotoxina sustancialmente reducida, o está libre de endotoxina, de manera que la carga de endotoxina del ADN del plásmido se ha reducido en más del 95 por ciento, preferiblemente más del 98 por ciento, todavía más preferiblemente más del 99 por ciento, alternativamente, más del 99.9 por ciento y todavía más preferiblemente más del 99.99 por ciento hasta el 99.999 por ciento. El método de la presente invención se puede usar para separar grandes cargas iniciales de endotoxina, tales como cuando menos de 200,000 a 400,000 unidades de endotoxina (UE) /mililitro de solución, proporcionando una capacidad de cuando menos 600,000 a 3 millones de UE/mililitro de matriz hidrofóbica. Más aún, el proceso de la presente invención proporciona una composición de ADN de plásmido de producto que contiene un rango menor de aproximadamente 10 a menos de aproximadamente 2500 UE o un rango de menos de aproximadamente 1 a menos de aproximadamente 300 UE/miligramo de ADN. Alternativamente, el' proceso de la presente invención proporciona una composición de ADN de plásmido de producto que contiene un rango de menos de aproximadamente 50 a menos de aproximadamente 1000 unidades de endotoxina (UE) o un rango de menos de aproximadamente 10 a menos de aproximadamente 50 UE/miligramo de ADN. El método de la presente invención también reduce el contenido de proteína a menos de 0.1 por ciento (peso/peso) de ARN a menos de 1 por ciento (peso/peso) y de ADN cromosomal a menos del 1 por ciento (peso/peso) .

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para separar ADN de plásmido super enrollado a partir de ADN de plásmido relajado el cual incluye los pasos de poner fl) en contacto una mezcla del ADN de plásmido super enrollado y 5 ADN de plásmido relajado con un medio de interacción hidrofóbico bajo una primera condición en donde tanto el ADN de plásmido super enrollado como el ADN del plásmido relajado se enlazan al medio de interacción hidrofóbico para formar una primera mezcla de enlace, alternando las primeras condiciones 10 que circundan el enlace de la primera mezcla con unas segundas condiciones para remover el ADN del plásmido relajado de la primera mezcla enlazada para formar componentes separados que contienen una segunda ligadura de mezcla y el ADN de plásmido relajado, y modificar las segundas condiciones que rodean el 15 segundo enlace de mezcla con terceras condiciones que remueven el ADN del plásmido super enrollado de la segunda mezcla de enlace para formar componentes separados que contienen el medio de interacción hidrofóbico y el ADN de plásmido super enrollado . 20 En otra forma de esta modalidad, la alteración y modificación se pueden realizar cambiando las condiciones del pH y el regulador de elución o solución, de manera que las formas relajadas y super enrolladas podrían eluirse a diferentes condiciones de pH, con o sin cambiar las condiciones 25 en la sal .

En otra forma de esta modalidad, la alteración y modificación se puede realizar a través de elución isocrática, en donde una solución de la misma composición, preferiblemente a una concentración de sal que pueda eluir ambas formas del ADN de plásmido, cuando pasa a través de la columna que contiene plásmido de enlace, secuencialmente eluiría las dos formas de manera distinta, en fracciones separadas. En otra modalidad, las condiciones de sal y/u otras condiciones se pueden modificar de una manera que la forma relajada del plásmido podría recolectarse como la fracción sin enlazar, mientras que la forma super enrollada se enlaza con la resina. La forma super enrollada posteriormente se puede eluir usando condiciones señaladas anteriormente. En otra forma de esta modalidad, la alteración y modificación se puede realizar mediante el uso de moléculas o una mezcla de moléculas que se enlazan competitivamente a los ligandos ( "desplazadores" ) y remueven las formas de ADN de plásmido enlazado de la matriz como componentes separados) . En otra forma de esta modalidad, las moléculas o mezcla de moléculas que se puedan enlazar a través de la interacción hidrofóbica o de otro modo, se pueden mezclar con soluciones de ADN de plásmido, las cuales, al cargarse en la columna se podrían desplazar secuencialmente, dando como resultado la separación de diferentes formas de ADN. En las dos formas alternativas anteriores de la modalidad, comúnmente conocidas como modo de "desplazamiento" y modo "frontal" de cromatografía, la molécula añadida puede coeluírse con el producto el cual, la mayoría de los casos se puede separar efectivamente usando métodos conocidos para los expertos en la técnica. La cromatografía por desplazamiento es un modo de cromatografía en el cual dos o más moléculas se enlazan a una resina se desplazan usando una molécula desplazadora que tiene alta afinidad para la resina resultante en el desplazamiento secuencial y por lo tanto la elución de dos o más moléculas enlazadas. Recientemente, los desplazadores de resina de interacción hidrofóbica han sido identificados, los cuales consisten en copolímeros de tribloques incluyendo metacrilato de polimetilo, ácido acrílico, y metacrilato de polidimetilaminoetilo (véase Ruaan y colaboradores, "Hydrophobic displacement chromatography of proteins using triblock copolymers as displacers" , 1998 AIChE meeting) . Otros desplazadores se han desarrollado con éxito para la cromatografía de desplazamiento con resinas de interacción hidrofóbica (véase Shukla y colaboradores, Hydrophobic displacement chromatography of proteins in 1998 Annual AIChE meeting) . Los desplazadores tales como 2- (2-butoxietoxi) etanol se han usado como desplazadores en cromatografía de fase inversa, los cuales podrían ser útiles. Después de enlazar las dos formas del plásmido, un desplazador, tales como los enlistados anteriormente podrían usarse para desplazar secuencialmente el ADN super enrollado y relajado a partir de resinas de HIC (columna de interacción hidrofóbica) descrita en la presente. En el modo "frontal" de cromatografía, la columna se carga con una mezcla binaria, difiriendo en su afinidad de la resina, y después sobrecargando continuamente la columna, un componente desplaza al otro y da como resultado la elución secuencial de los dos componentes. En la aplicación de este método para la presente invención, las dos formas de ADN, por ejemplo, podrían cargarse en una columna HIC y sobrecargando la muestra podría dar como resultado el efecto de desplazamiento conduciendo al desplazamiento de la forma relajada, la cual se puede recolectar por separado de la forma super enrollada. En una forma de esta modalidad, la alteración y modificación se combinan en un proceso continuo de una elución de gradiente del ADN de plásmido relajado y el ADN de plásmido super enrollado mezclando la primera mezcla enlazada con solución de sal, tal como solución de sulfato de amonio, con una concentración continuamente variante de sal, tal como sulfato de amonio, la concentración preferiblemente se varía de aproximadamente 3M hasta aproximadamente ÍM de sal , tal como sulfato de amonio. El ADN de plásmido relajado se recolecta en esta forma de esta modalidad de la invención en un primer volumen eluido y el ADN del plásmido super enrollado se recolecta en un segundo volumen eluido. En otra forma preferida de esta modalidad, las formas super enrollada y relajada del ADN de plásmido se separan primero enlazando ambas formas del ADN con un medio de interacción hidrofóbica en un lecho o columna a concentraciones altas de sal, o a fuerzas iónicas equivalentes, tales como 2.5 M hasta 4 M, preferiblemente 3 M, de sulfato de amonio, y luego eluyendo, ya sea de una manera de gradiente escalonado o de gradiente continuo, las dos formas separadas del ADN del plásmido de la columna, cambiando la concentración de sal, o las fuerzas iónicas equivalentes, a un primer rango de aproximadamente 2.45 M a aproximadamente 2.35 M de sulfato de amonio y luego a un segundo rango de aproximadamente 0 M (posiblemente 1 M) hasta aproximadamente 2.3 M de sulfato de amonio (en la modalidad de elución escalonada) o cambiando continuamente la concentración de sulfato de amonio del rango de aproximadamente 2.5 M a aproximadamente 4 M a un segundo rango de aproximadamente 0 M (posiblemente 1 M) a aproximadamente 2.3 M sobre un volumen de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 30 volúmenes de columna o lecho, preferiblemente cuando menos 6 volúmenes de columna o lecho (en la modalidad de gradiente continuo) . En cada una de estas formas, el ADN de plásmido relajado se eluye de la columna o del medio del lecho a una concentración de sal (sulfato de amonio) en un rango de aproximadamente 2.35 M. hasta aproximadamente 2.45 M mientras que el ADN de plásmido super enrollado se eluye del medio de la columna o lecho a una concentración de sal (sulfato de amonio) en el rango de aproximadamente 0 M hasta aproximadamente 2.3 M. En otra modalidad, la invención proporciona métodos para aislar ADN de plásmido super enrollado los cuales incluyen: aplicar una muestra que contiene plásmido super enrollado a un medio de interacción hidrofóbico bajo condiciones iónicas mediante lo cual el plásmido super enrollado preferencialmente se enlaza con el medio con respecto al plásmido no super enrollado; y ajustar las condiciones iónicas de manera que el plásmido super enrollado enlazado se remueve del medio. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un método para enriquecer la cantidad de ADN super enrollado en relación con el ADN relajado en una mezcla de los mismos, incluyendo el método (1) interactuar la mezcla que contiene ADN super enrollado y ADN relajado con un medio interactivo hidrofóbico que contiene una fracción alquilo bajo condiciones iónicas en donde el ADN super enrollado preferencialmente se enlaza con el medio interactivo hidrofóbico; (2) tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN relajado y super enrollado bajo condiciones iónicas que permiten la remoción preferencial del ADN relajado; y (3) eluir el ADN super enrollado del medio interactivo hidrofóbico . En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un método para remover lipipolisacárido (LPS) de una composición que contiene ADN, incluyendo el método los pasos de (1) interactuar la mezcla que contiene ADN y LPS con medio interactivo hidrofóbico que contiene una fracción alquilo, en donde la interacción está bajo condiciones iónicas en donde el LPS preferiblemente se enlaza con el medio interactivo hidrofóbico relativo al ADN; y (2) tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN y LPS con condiciones iónicas que permiten la remoción selectiva del ADN. Los métodos de la presente invención proporcionan ADN de plásmido super enrollado aislado y/o purificado, y una composición que contiene el ADN de plásmido super enrollado, que preferiblemente está libre de endotoxina, de manera que la cantidad de ADN de plásmido super enrollado presente en la composición producida por los métodos actualmente descritos es de cuando menos aproximadamente 50 por ciento en peso de la cantidad de plásmido total a un cuando menos aproximadamente 99 por ciento en peso, preferiblemente cuando menos aproximadamente 60 por ciento en peso a cuando menos aproximadamente 95 por ciento en peso, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 70 por ciento en peso hasta cuando menos aproximadamente 90 por ciento en peso, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 75 por ciento en peso hasta cuando menos aproximadamente 85 por ciento en peso, ^) de ADN de plásmido super enrollado. 5 Los porcentajes en peso se pueden medir, como se ejemplifica en la presente, mediante resolución de cromatografía líquida de alto rendimiento en una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento ADN-NPR, a través de un gradiente, dando como resultado los picos con áreas 10 correspondientes a la cantidad de cada componente. El porcentaje de forma super enrollada se calculó como una • fracción del área pico correspondiente al ADN super enrollado contra el área total de los picos de ADN de plásmido super enrollado y relajado. 15 El medio de interacción hidrofóbico preferido que se puede usar en los métodos de la presente invención incluye resinas de cromatografía de interacción hidrofóbica que, por ejemplo, contienen polímero de metacrilato o estructuras ^^ centrales de copolímero, tales como copolímeros de 20 metracilato/etilenglicol y/o metacrilato/propilenglicol (TosoHaas, Montgomeryville, PA) , y/o un agarosa o sefarosa (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , tal como polímero que contiene agarosa, sefarosa, dextrán, óxido de silicio reticulado o no reticulado, polímeros orgánicos (naturales o 25 sintéticos), una estructura central, o una matriz de -gel que contiene cerámica, o una combinación de cualquiera de estos, con alquilo con de 3 a 10 átomos de carbono, ramificado o recto, ligandos de cadena lateral pendientes. Los ligandos pendientes preferidos incluyen propilo, butilo, hexilo y/o ligandos octilo. Estos ligandos proporcionan la interacción de enlace preferencial que se explota en la separación, purificación y/o métodos de aislamiento de la presente invención. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará que las resinas de interacción hidrofóbica pueden incluir ligandos además de o en lugar de los ligandos alquilo, que también serán útiles en el método de la presente invención. Ejemplos de estos ligandos incluyen, pero no se limitan a, fenilo, octilo, butilo, propilo, neopentilo, hidroxipropilo, bencilo, octadecilo, difenilo, y metilo así como derivados sustituidos y no sustituidos de los mismos, y combinaciones de los mismos. La resina o materiales de medio convenientes útiles en la presente invención incluyen los descritos, por ejemplo, en la Patente Europea número 964057, Solicitud de Patente Europea número 99109441, Patente Japonesa 2000035423, Patente Japonesa 99127700 y Patente Japonesa 98127665 (Kitamura y colaboradores) el contenido entero de las cuales se incorporan mediante referencia en la presente. El medio de interacción hidrofóbico puede estar en forma de cuentas, que se pueden empacar o cargar en una columna o reactor de lecho, o un medio poroso reticulado. El tamaño del medio de cuentas puede variar de 2.5 mieras a más de o igual a 100 mieras. El tamaño del medio de cuentas preferiblemente está en el rango de aproximadamente 30 a aproximadamente 110 mieras de diámetro, tal como aproximadamente 35 a aproximadamente 100 mieras de diámetro, o, alternativamente en el rango de 35 a 90 mieras de diámetro. El medio de interacción hidrofóbica puede estar presente en forma de membranas, tales como celulosa o estructuras centrales derivadas de celulosa, poliéter sulfonas, polisulfonas, y derivados de las mismas y/u otros materiales conocidos en la técnica de filtración y separación, incluyendo plásticos, tales como e incluyendo placas de microtitulación y cajas y contenedores de cultivo celular o de petri. Las cuentas usadas en "Streamline" (Amersham Pharmacia Biotech) en columnas típicamente son mayores en tamaño con diferentes densidades, y están hechas por diferentes fabricantes, incluyendo Amersham Pharmacia Biotech, Biosepra Ine, pero no se limitan a éstos, donde el lisado clarificado podría fluir a través de las columnas de "lecho expandido" , dando como resultado la remoción de contaminantes a través del enlace con las cuentas que contienen los ligandos interactivos hidrofóbicos . Los tamaños de cuentas más pequeños, típicamente se usan en separaciones de alto rendimiento, incluyendo cromatografía líquida de alto rendimiento, en donde esta invención se puede utilizar para proporcionar un método analítico cuantitativo para el ADN de plásmido y/o diferentes formas de ADN. Las cuentas para el propósito de uso de esta 5 invención, particularmente la separación de las dos formas de ADN de plásmido no necesitan ser porosas ya que el ADN del plásmido generalmente es demasiado grande para ser capaz de ocupar los poros, y por lo tanto proporciona cualquier capacidad adicional. Sin embargo, para los propósitos de 10 enlace con contaminantes, los poros efectivamente podrían aumentar la capacidad ya que las moléculas de contaminantes tales como ARN, proteína, endotoxina y fragmentos de ADN son comparables o menores que el tamaño de los poros. En este caso la porosidad representará un papel y por lo tanto las resinas 15 porosas pueden ser útiles. Los métodos de la presente invención preferiblemente no requieren solventes orgánicos, o aditivos o detergentes, tales como glicoles, polietilenglicol, hexamina cobalto, espermidina o polivinil pirrolidona, los cuales más tarde 20 requerirían separación del producto ADN del plásmido super enrollado antes de usarlo en, por ejemplo, terapia de genes. Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra un diagrama de flujo de los distintos pasos involucrados en realizar el método 25 ejemplificado de separar ADN de plásmido super enrollado y relajado . La Figura 2 muestra una representación conceptual de los distintos soportes de interacción hidrofóbica con las químicas de ligandos unidas a ellos que se usaron en el método ejemplificado. La Figura 3 muestra un diagrama de flujo de los distintos pasos involucrados en realizar el método ejemplificado de separar endotoxina de ADN de plásmido. La Figura 4 (inserto) muestra una imagen escaneada de un gel de agarosa a partir del ejemplo 5 (butilo HIC) teñido con SYBR GOLD en donde la franja 1 contiene una escalera de ADN super enrollada; las franjas 2 y 3, contienen muestras de pico 1 (relajado) y las franjas 3-5 contienen muestras de pico 2 (super enrollado) . (Las franjas están numeradas de izquierda a derecha) . El cromatograma del Ejemplo 5 de absorbancia contra volumen muestra la separación de ADN relajado (pico 1) y super enrollado (pico 2) . La Figura 5 (inserto) muestra una imagen escaneada de un gel de agarosa a partir del Ejemplo 6 (butilo HIC) teñido con SYBR GOLD en donde la franja 1 contiene un marcador; las franjas 2 y 3 contienen muestras de pico 1 (relajado) y las franjas 4-6 contiene fracciones de pico 2 (forma super enrollada) . (Las franjas se numeran de izquierda a derecha) . El cromatograma del Ejemplo 6 muestra la separación de las formas de ADN relajado (pico 1) y super enrollado (pico 2) .

La Figura 6 (inserto) muestra una imagen escaneada de un gel de agarosa a partir del ejemplo 7 en donde la franja 1 contiene un marcador, las franjas 2 y 3 contienen material flp) cargado en la columna; la franja 4 contiene material del pico 5 de artefacto; la franja 5 contiene material de la elución de 2.4 M AS; y la franja 6 contiene material de la elución de 1 M AS. (Las franjas se enumeran de izquierda a derecha). El cromatograma muestra la separación de las formas relajada y super enrollada del ADN de plásmido en donde el pico de 10 artefacto es un pico primero amplio (izquierdo) , seguido a la derecha por picos relajado y super enrollado, respectivamente. La Figura 7 (inserto) muestra una imagen escaneada de un gel de agarosa a partir del Ejemplo 8 (hexilo HIC) en donde la franja 1 contiene un marcador; las franjas 2-4 contienen 15 material del pico 1 (forma relajada); y las franjas 5 y 6 contienen fracciones del pico 2 (forma super enrollada) . (Las franjas y los picos se numeran de izquierda a derecha) . El cromatograma demuestra la separación de las formas relajadas de super enrollada. 20 La Figura 8 muestra una imagen escaneada de una electroforesis de gel de agarosa de muestras SYBR GOLD teñidas, a partir del ejemplo 9, en donde la franja 1 es un marcador; la franja 2 contiene el material cargado en la columna; las franjas 3, 4 y 5 contienen los lavados 1, 2 y 3, 25 respectivamente; la franja 6 contiene la elución 1 M; y la franja 7 contiene la elución de agua. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los métodos de la presente invención explotan las • diferencias en hidrofobicidad de ADN de plásmido super 5 enrollado, ADN de plásmido relajado y contaminantes celulares, tales como endotoxina. Los métodos descritos en la presente son útiles para purificar y aislar ADN de plásmido super enrollado, cósmidos, y vectores fagémidos . Estos vectores y el ADN de plásmido 10 podrían purificarse de cualquier fuente. Además, el ADN de • plásmido y los cósmidos presentes en levaduras y células de mamífero también se pueden purificar, ya que mezclas similares de contaminantes, incluyendo endotoxinas, ARN, proteínas y ADN cromosómico, podrían estar presentes en estas preparaciones. 15 También hay la necesidad de obtener formas super enrolladas del plásmido y ADN de cósmido de estas fuentes y por lo tanto, los métodos descritos en la presente podrían usarse para purificar el ADN en muchas de estas aplicaciones. "Medio de interacción hidrofóbico" es un material que 20 comprende (a) una fracción de soporte y (b) una fracción hidrofóbica unida ya sea directa o indirectamente a la fracción de soporte. Los ejemplos de fracciones de soporte y de fracciones hidrofóbicas se describen en la presente y son conocidas en la técnica. La fracción hidrofóbica proporciona 25 la base para el enlace preferencial usado en los métodos de separación descritos en la presente. Varios ejemplos de "medios de interacción hidrofóbica" se conocen en la técnica y se describen en la presente. Otros términos usados en la presente también denotan medios de interacción hidrofóbica y ejemplos de los mismos, tales como "resina", "matriz", "columna", "medio", "cuentas" y "ligando de interacción hidrofóbica" . "ADN" significa cualquier forma de ácido desoxirribonucleico, incluyendo, pero sin limitarse a, plásmido (ya sea super enrollado y/o relajado o mellado) , cósmido, o cromosoma artificial. ADN "mellado" o "relajado" significa ADN que no es super enrollado. El ADN "super enrollado" es un término bien entendido en la técnica. Una "impureza contaminante" es una sustancia de la cual se desea separar, o aislar, el ADN. Las impurezas contaminantes incluyen, pero no se limitan a, proteínas de la célula anfitriona, endotoxina, ADN de la célula anfitriona y/o ARN. Se entiende que, lo que se considera una impureza contaminante puede depender del contexto en el cual se practican los métodos de la invención. Una "impureza contaminante" puede o no derivarse de la célula anfitriona, es decir, puede o no ser una impureza de la célula anfitriona. "Aislar" o "purificar" un primer componente (tal como ADN) significa el enriquecimiento del primer componente a partir de otros componentes con los cuales el primer componente se encuentra inicialmente. Extensiones de purificación deseada y/u obtenible se proporcionan en la presente. Preferiblemente, los métodos de la invención dan como resultado aproximadamente un enriquecimiento de cinco veces, preferiblemente un enriquecimiento de aproximadamente 10 veces, preferiblemente un enriquecimiento de aproximadamente 20 veces, preferiblemente un enriquecimiento de aproximadamente 50 veces, preferiblemente un enriquecimiento de aproximadamente 100 veces, preferiblemente un enriquecimiento de aproximadamente 200 veces, preferiblemente un enriquecimiento de aproximadamente 500 veces, preferiblemente un enriquecimiento de aproximadamente 1000 veces. Alternativamente, el grado de purificación se puede expresar como un porcentaje del primer componente con respecto a otro componente, o con respecto a la preparación resultante. Ejemplos de estos porcentajes se proporcionan en la presente. El enlace o remoción "preferencial" o "selectivo" de un componente significa que, para una condición dada, el primer componente se enlaza o es removido a un grado mayor con respecto a otro componente. Como se entendería por los expertos en la técnica, "remoción" o "enlace" no necesariamente, o deseablemente, significa completo, o remoción o enlace al 100 por ciento. Una solución "acuosa" generalmente indica una solución basada en agua (es decir, que el solvente principal es agua) ,1o cual puede o no ser 100 por ciento agua como solvente. El aislamiento del ADN de plásmido producido en células bacterianas recombinantes involucra la lisis de las células y la remoción de desechos celulares, lo cual se puede llevar a cabo a través de varios métodos. La solución final contiene ADN de plásmido, que contiene típicamente cantidades extremadamente grandes de endotoxina entre otros contaminantes. Los métodos de la presente invención proporcionan la remoción de cantidades significativas de contaminantes clave, tales como ARN, ADN genómico, proteínas y endotoxinas que usan cromatografía de interacción hidrofóbica como un primer paso, en donde el ADN del plásmido no enlazado fluye a través. Un método de la presente invención involucra, opcionalmente dializar la solución mezclada obtenida de la lisis bacteriana en un regulador en el rango de pH de 6.8 a 8.5, preferiblemente un pH de 6.8 a 7.4, que contiene, preferiblemente, 2 M de sulfato de amonio, con o sin lOmM de ácido etilenodiaminatetra-acético (AEDT) , y hacer fluir la solución opcionalmente dializada a través de una columna de cromatografía empacada que contiene un soporte cromatográfico con un ligando o ligandos de interacción hidrofóbica, tales como cualquiera de, o una mezcla de, un ligando propilo, butilo, octilo o hexilo, los cuales han, preferiblemente sido previamente equilibrados con un regulador en el rango de pH 6.8 a 8.5 (preferiblemente de 6.8 a 7.4), conteniendo también 2M de sulfato de amonio, con o sin lOmM de AEDT. La solución de flujo a través típicamente está a aproximadamente una concentración de 2M de sales, tales como • sulfato de amonio, y predominantemente contiene ADN de plásmido 5 (mezcla de super enrollado y relajado) con menos de 2 por ciento de contaminantes. Dependiendo de las variaciones en los pasos corriente arriba, el porcentaje del ADN super enrollado puede variar en cualquier lado entre 50 y 95 por ciento en peso, típicamente aproximadamente del 75 al 85 por ciento, 10 alternativamente, 80 al 85 por ciento, requiriendo purificación • adicional, e involucrando la remoción de la forma relajada del ADN de plásmido de la mezcla. Los métodos de la presente invención también hacen posible producir ADN de plásmido purificado que tienen niveles 15 de endotoxina de bajos niveles especificados, es decir, típicamente <10 UE/miligramo de ADN de plásmido. Los métodos de remoción de endotoxina de la presente invención ya sea se adaptan a la producción a gran escala como a pequeña escala, fl permitiendo la producción económica de material grado 20 terapéutico y de aboratorio. Estos métodos explotan el enlace selectivo de endotoxina con resinas hidrofóbicas descritas en la presente las cuales, para la producción a gran escala, pueden contener capacidades que exceden un millón de unidades por mililitro de resina usada. 25 Los métodos convencionalmente disponibles de remoción de endotoxina tienen bajas capacidades (1,000 a 50,000 UE/mililitro de resina) y/o dan como resultado recuperaciones de ADN de plásmido bajas y/o involucran el uso de componentes químicos y/o métodos que no se pueden usar fácilmente en la preparación de material de grado terapéutico (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,747,663) . El método de remoción de endotoxina de la presente invención involucra suspender la solución que contiene ADN de plásmido y endotoxina en una sal, la cual es sulfato de amonio o cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 2M que hace la endotoxina significativamente más hidrofóbica que el ADN del plásmido y asegura el enlace o la interacción preferencial y separación de la endotoxina en un ligando hidrofóbico que contiene resina sobre una resina que contiene ligandos de interacción hidrofóbica, tales como butilo, octilo, y/o grupos hexilo, en comparación con el ADN del plásmido. La concentración de sal usada preferiblemente se puede optimizar para enlazar el ARN, la proteína y la endotoxina. Una concentración de sal más baja puede ser suficiente para proporcionar sólo el enlace con la endotoxina ya que la endotoxina tiene una afinidad mayor por los ligandos de interacción hidrofóbica descritos en la presente . Una característica atractiva de este método de remoción de endotoxina es la inmensa capacidad de la resina para la endotoxina, de aproximadamente 1,000,000 UE/mililitro de resina, además de la simplicidad y >95 por ciento de recuperación de ADN de plásmido. Por ejemplo, una solución de ADN de plásmido que contiene 500 miligramos de plásmido y 10 millones de UE de endotoxina se puede purificar usando 10 mililitros de resina, mientras que, cuando menos de 1,000 a 4,000 mililitros de una resina de intercambio de aniones se requeriría para enlazar el ADN del plásmido y la endotoxina, con la desventaja añadida de malas recuperaciones en esta resina de intercambio de aniones. El método de la presente invención por lo tanto da como resultado ahorros de 100 a 400 veces en el costo de la resina, y ahorros adicionales en el costo de la columna y recuperación aumentada del producto. La resina Etox de ADN disponible comercialmente actualmente es 8 veces más cara que las resinas usadas en el método de la presente invención. Otra resina comercial (PolyFlo - PureSyn Inc., 87 Great Valley Pkwy Malvern, PA 19355) con química registrada que es útil en la remoción de endotoxinas es de 5 a 10 veces más cara y requiere el uso de solventes y de productos químicos que aparean iones. Los métodos de la presente invención proporcionan ADN de plásmido de alta calidad que comprende más del 90 por ciento de ADN de plásmido super enrollado a partir de material inicial de menor calidad (es decir, un material inicial compuesto de una mezcla de ADN relajado y super enrollado) . Adicionalmente, los métodos de la presente invención son aplicables para procesos a gran escala típicamente usados para la producción de ADN de plásmido para terapia de genes. Los métodos de la presente invención permiten la producción confiable de ADN de plásmido de alta calidad, independiente de las variaciones que típicamente conducen a la reducción en calidad es decir la generación de la forma relajada/mellada de ADN de plásmido. Estas variaciones podrían presentarse durante el crecimiento de bacterias que producen el ADN de plásmido y los pasos posteriores de aislamiento y purificación. Los métodos para separar ADN de plásmido super enrollado y relajado, y los métodos de separar ADN de plásmido y endotoxina, de la presente invención se basan en un descubrimiento que las formas del ADN de plásmido y la endotoxina exhiben diferentes especificidades de enlace sobre resinas de cromatografía de interacción hidrofóbica que, por ejemplo, contienen alquilo con de 4 a 10 átomos de carbono, ramificado recto, ligandos, y preferiblemente contienen ya sea un ligando butilo o hexilo. Estos ligandos proporcionan la interacción de enlace preferencial que se explota en la separación, purificación y/o métodos de aislamiento de la presente invención. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará que las resinas hidrofóbicas pueden incluir ligandos además de o en lugar de estos ligandos alquilo, los cuales también serán útiles en el método de la presente invención. Ejemplos de estos ligandos también se describen anteriormente. Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran los métodos de la invención actualmente descrita. Los métodos generales que siguen fueron o podrían usarse. Los plásmidos para las aplicaciones de terapia de genes se extrajeron de una bacteria anfitriona conveniente, por ejemplo, Escherichia coli , siguiendo la fermentación. En la siguiente ejemplificación de la invención descrita, se usó E. coli STBL-2, la cual contiene el plásmido pElA-K2. El plásmido pEl-A-K2 es un plásmido pUC derivado que contiene un gen supresor a partir del adenovirus Tipo 5, y contiene un gen canamicina como un marcador seleccionable. La fermentación se llevó a cabo en un medio aerobio conveniente de extracto de levadura/glucosa que contenía sales inorgánicas, sales tales como fosfato monobásico de potasio, fosfato dibásico de sodio, sulfato de amonio y sulfato de magnesio a un pH de 6.5 a 7.8, preferiblemente 7.0, y a una temperatura de 37 °C. La aeración se fijó en un volumen de aire por volumen de medio y la agitación se fijó en 800 rpm. Las células se cultivaron en este modo hasta que la glucosa se agotó del medio, entonces el DO del fermentador se controló mediante alimentación de glucosa y agitación. La alimentación contenía una solución concentrada de glucosa (160 g/L) y extracto de levadura (80 g/L) y sales (1.5 g/L de sulfato de amonio, MgS04, 1.5 g/L en regulador de fosfato) . Después de terminar la fermentación, las células se cosecharon por centrifugación o por filtración a través de membranas de ultra o microfiltración, y se lavaron con TE (véase más adelante) regulador, pH 7.4. Las células se lisaron poniendo en contacto la suspensión con un volumen igual de una ! solución de 0.15N hasta 0.2N NaOH y 1 por ciento de dodecil 5 sulfato de sodio (pH 11.5 a 13) con mezclado vigoroso. La solución alcalina se neutralizó con una solución de acetato de potasio. El material se aclaró ya sea por centrifugación o pasando la suspensión a través de una serie de filtros de profundidad. Las soluciones de plásmido se 10 concentraron mediante membranas de ultrafiltración y se diafiltraron contra regulador TE, pH 7. Lo retenido de diafiltro se puede aplicar directamente al medio descrito en la presente . El contenido de ADN de plásmido de lisado 15 generalmente es menor del 2 por ciento del ácido nucleico total con el volumen de contenido siendo ARN o ADN cromosomal .

Además, el lisado se contamina con endotoxina y proteínas celulares . La presente invención también proporciona métodos de 20 producción a pequeña escala, escala a laboratorio o escala experimental de ADN aislado o purificado, y columnas y separadores de equipo útiles en la presente. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará que la producción a pequeña escala del ADN de plásmido introduce desafíos 25 diferentes, en comparación con la producción a gran escala.

Específicamente, la separación a pequeña escala conlleva la separación de una proporción más grande de ARN contaminante en el material inicial, de manera que mientras la proporción de plásmido contra ARN en el material inicial a gran escala puede 5 ser de aproximadamente 2 por ciento (peso/peso) , como se notó anteriormente, la proporción a pequeña escala es de aproximadamente 0.1 por ciento (peso/peso). Más aún, el volumen de cultivo de las muestras a pequeña escala generalmente son de aproximadamente 2 mililitros a 10 aproximadamente 2 litros, en oposición a aproximadamente 5 fl) litros hasta aproximadamente 1000 litros en la separación a gran escala. Las separaciones a pequeña escala de la presente invención involucran aproximadamente 100 microgramos hasta aproximadamente 1 miligramo de plásmido con un reactor o 15 volumen de lecho en columna de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mililitros; usualmente en el rango de aproximadamente 10 mililitros a aproximadamente 15 mililitros. La presente invención proporciona por lo tanto, producción ^ eficiente a pequeña escala de ADN aislado y/o purificado, 20 preferiblemente ADN super enrollado, de impurezas, tales como endotoxina, ARN, y ADN relajado. Aunque varios procedimientos se usan en la presente ejemplificación, una persona con experiencia ordinaria apreciará que otros métodos preparativos y materiales iniciales 25 se pueden usar en la invención actualmente descrita.

Ejemplo 1: Remoción de endotoxina usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo (HIC por sus siglas en inglés) (pequeña escala) fl Células de E. coli que habitaban el plásmido pElA-K2 5 se cultivaron, y se lisaron usando métodos químicos, y se aclararon a través de métodos de filtración. Todos los reguladores usados en todo el proceso se filtraron a través de un filtro de 0.2 mieras, y se almacenaron muestras para endotoxina en tubos de ensayo de poliestireno. 10 Un retenido de diafiltración (aproximadamente 400 ^k mililitros) se dializó en TE pH 7.4 (50mM Tris, lOmM AEDT ajustado a pH 7.4 con HCl) se usó para el experimento. El sulfato de amonio (AS) (por sus siglas en inglés) como se requiere para hacer la muestra 2M se añadió a 100 mililitros de 15 TE más 2M AS, pH 7.4 de regulador y parcialmente disuelto. Esta solución se añadió a la muestra dializada para hacer un volumen final de 575 mililitros, de los cuales se usaron 475 mililitros para el experimento. ^ Una columna de butilo 650S (resina Butyl 650S de 20 TosoHaas Inc., 156 Keystone Drive, Montgomeryville, PA 18936) de 2.6 centímetros de diámetro y 15 centímetros de altura del lecho, de aproximadamente 75 mililitros de volumen del lecho fue empacado y equilibrado con regulador TE, pH 7.4, que contenía 2M AS. La muestra se cargó a una velocidad de flujo 25 de 5 mililitros/minuto. El flujo a través se recolectó, y las muestras se tomaron para análisis (concentración de ADN, gel de agarosa, y ensayos de endotoxina) . El ensayo de endotoxina se realizó con picos y muestras se diluyeron adecuadamente para • obtener recuperaciones de control positivo del producto en el 5 rango considerado aceptable. Las concentraciones de endotoxina se determinaron usando el ensayo Biowhittaker Kinetic-QCL Chromogenic LAL como se describe en BW publicación número P50- 650U-5, Kinetic-QCL Test Kit Manual. Después de la carga de la muestra, TE que contenía 2M de sulfato de amonio se hizo fluir 10 a través de la columna, y se recolectó y se muestreó. La fl columna posteriormente se lavó con regulador TE-pH 7.4, agua purificada USP, y se limpió con 0.5N hidróxido de sodio, y se enjuagó con >15 volúmenes de agua purificada USP. La endotoxina estuvo presente en cada uno de estos lavados como se 15 muestra más adelante en la Tabla 1. Además de esta eficiencia de remoción de endotoxina sorprendente, cantidades significativas de ARN, proteína, y fragmentos de ADN se removieron, dejando la muestra significativamente purificada.

Tabla 1 Capacidad de endotoxina por mililitros de resina: 3 millones UE/ml Reducción de endotoxina en la muestra: 99.992% Ejemplo 2: Remoción de endotoxina usando cromatografía de interacción hidrofóbica con butilo (a gran escala) Células de E. coli que tenían el plásmido pElA-K2 se cultivaron, y se lisaron usando métodos químicos, y se aclararon a través de métodos de filtración. El retenido de diafiltración (aproximadamente 650 mililitros) se dializó en TE pH 7.4 (50mM Tris, lOmM AEDT ajustado a pH 7.4 con HCl) y el sulfato de amonio requerido para hacer la muestra 2M se añadió a 1200 mililitros de TE que contenía 2M de sulfato de amonio, pH 7.4 de regulador y se disolvió. El volumen de esta solución se hizo 1300 mililitros. Esta solución se añadió a la muestra dializada para hacer un volumen final de 1950 mililitros, y el pH se ajustó a 7.4 usando HCl . Una columna de butilo 650S de 5 centímetros de diámetro y 15 centímetros de altura del lecho, de • aproximadamente 275 mililitros de volumen del lecho fue 5 empacado y equilibrado con regulador TE, pH 7.4, que contenía 2M de sulfato de amonio. La muestra se cargó a una velocidad de flujo de 20 mililitros/minuto. El flujo a través se recolectó, y las muestras se tomaron para análisis (concentración de ADN, gel de agarosa, y ensayos de endotoxina, 10 como se describió anteriormente) . Después de la carga de la V muestra, se puso a fluir TE que contenía 2M de sulfato de amonio a través de la columna, y se recolectó y se muestreó. La columna posteriormente se lavó con regulador TE-pH 7.4, agua purificada USP, y se limpió con 0.5N de hidróxido de sodio, y 15 se enjuagó con >15 volúmenes de agua purificada USP. La endotoxina estuvo presente en cada uno de estos lavados como se muestra más adelante en la Tabla 2. Además de esta remoción de endotoxina extremadamente sorprendente eficiente, se removieron cantidades significativas de ARN, proteína, y fragmentos de 20 ADN, dejando la muestra significativamente purificada.

• Capacidad de endotoxina por mililitros de resina: 0.64 millones UE/ml 10 Reducción de endotoxina en la muestra: 99.993% Ejemplo 3: Remoción de endotoxina usando cromatografía de interacción hidrofóbica hexilo (a escala pequeña) Células de E. coli que tenían el plásmido pElA-K2 se 15 cultivaron, y se lisaron usando métodos químicos, y se aclararon a través de métodos de centrifugación. El sobrenadante se dializó en un regulador de potasio fosfato 20 mM (20mM solución monobásica de potasio fosfato combinado con 20mM de potasio fosfato dibásico en una proporción para obtener 20 un pH de 6.8) , pH 6.8 y sulfato de amonio requerido para hacer que la muestra de 2M se añadió a 20 mililitros de KPB (20mM regulador de potasio fosfato) que contenía 2M de sulfato de amonio, pH 6.8 de regulador y se disolvió. Esta solución se añadió a 5 mililitros de muestra dializada para hacer una muestra final de 25 mililitros y el pH se ajustó a 6.8. Una columna de Hexyl 650C (TosoHaas) de un diámetro de 1.6 centímetros y altura del lecho de 4 centímetros, de aproximadamente volumen del lecho de 8 mililitros se empacó y equilibró con KPB, pH 6.8, que contenía 2M de sulfato de amonio. La muestra se cargó a una velocidad de flujo de 2 mililitros/minuto. El flujo a través se recolectó y las muestras se tomaron para análisis (concentración de ADN, gel de agarosa, y ensayos de endotoxina, anteriormente) . Después de la carga de la muestra, el KPB que contenía 2M de sulfato de amonio se dejó fluir a través de la columna, y se recolectó y se muestreó. La columna posteriormente se lavó con regulador KPB pH 6.8, agua purificada USP, y se limpió con 0.5N de hidróxido de sodio, y se enjuagó con >15 volúmenes de agua purificada USP. La endotoxina estuvo presente en cada uno de estos lavados como se muestra más adelante en la Tabla 3. Además de esta eficiencia de remoción de endotoxina extremadamente sorprendente, una cantidad significativa de ARN, proteína, y fragmentos de ADN, se removió, dejando la muestra significativamente purificada.

Tabla 3 • • Capacidad de endotoxina por mililitros de resina: 3.7 10 millones UE/ml Reducción de endotoxina en la muestra: 99.999% Ejemplo 4: Remoción de endotoxina usando cromatografía de interacción hidrofóbica octilo (a escala pequeña) 15 Células de E. coli que tenían el plásmido pElA-K2 se cultivaron, y se lisaron usando métodos químicos, y se aclararon a través de métodos de centrifugación como se describió anteriormente. El sobrenadante se usó para el experimento. El sulfato de amonio requerido para hacer la 20 muestra 2M se añadió a 20 mililitros de TE más 2M de sulfato de amonio, pH 7.4 de regulador y se disolvió. Esta solución se añadió a 10 mililitros de muestra dializada para hacer un volumen final de 25 mililitros y el pH se ajustó a 7.4.

Una columna de flujo rápido Octil Sefarosa 4 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) de un diámetro de 1.0 centímetro y altura del lecho de 10 centímetros, de aproximadamente volumen del lecho de 8 mililitros se empacó y equilibró con TE, pH 7.4, que contenía 2M de sulfato de amonio. La muestra se cargó a una velocidad de flujo de 2 mililitros/minuto. El flujo a través se recolectó y las muestras se tomaron para análisis (concentración de ADN, gel de agarosa, y ensayos de endotoxina) . Después de la carga de la muestra, el TE que contenía 2M de sulfato de amonio se hizo fluir a través de la columna, y se recolectó y se muestreó. La columna posteriormente se lavó con TE pH 7.4, agua purificada USP, y se limpió con 0.5N de hidróxido de sodio, y se enjuagó con >15 volúmenes de agua purificada USP. La endotoxina está presente en cada uno de estos lavados como se muestra más adelante en la Tabla 4. Tabla 4 Capacidad de endotoxina por mililitros de resina: 7.41 millones UE/ml Reducción de endotoxina en la muestra: 99.996% Ejemplo 5: Separación de las formas super enrollada y relajada del ADN de plásmido usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo-elución de gradiente Células de E. coli que albergaban el plásmido pElA-K2 se cultivaron, y se lisaron usando métodos químicos, y se aclararon a través de métodos de filtración, como se describió anteriormente. La purificación gruesa de ADN de plásmido para eliminar los contaminantes mayores tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN cromosomal, etcétera se realizó usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo, en donde, a una concentración de 2M de sulfato de amonio, el ADN de plásmido fluye a través de la columna mientras que los contaminantes se enlazan a la columna (véase anteriormente) . El flujo a través que contiene el ADN de plásmido se dializó y se procesó sobre una columna de intercambio de anión (BioSepra) que no proporcionó ninguna purificación adicional. El procesamiento a través de la columna de intercambio de aniones Q y diafiltraciones no son necesarias para lograr la separación de la columna de butilo. La elución de la columna de intercambio de aniones Q fue diafiltrada usando membrana de celulosa regenerada de 30 kD (O.lm2, Millipore Corporation). El material dializado se ajustó a 3M de sulfato de amonio usando sulfato de amonio sólido. Una columna de Butilo (Toyopearl Butyl 650S TosoHaas) de un diámetro de 2.6 centímetros y aproximadamente • 15 centímetros de altura se empacó a una velocidad de flujo de 5 15-20 mililitros/minuto. La columna se equilibró con 3M de sulfato de amonio en regulador Tris-AEDT pH 7.4. La muestra se cargó a un régimen de flujo de 5 mililitros/minuto. El plásmido se enlazó a la columna a 3M de sulfato de amonio. La columna se lavó entonces con 2-3 volúmenes de columna de una 10 solución de sulfato de amonio 3M en regulador. La columna se (B eluyó con un gradiente de concentración de sulfato de amonio desde 3M a ÍM sobre 6 volúmenes del lecho. Durante la elución del gradiente, resultaron dos picos, el primer pico conteniendo la forma relajada del ADN de plásmido, y el segundo pico 15 conteniendo la forma super enrollada de ADN de plásmido como fue evidenciado en gels de agarosa de fracciones (Figura 4A) . El cromatograma se muestra en la Figura 4B. Los resultados fueron confirmados adicionalmente mediante un ensayo de cromatografía líquida de alto rendimiento para determinar el 20 porcentaje de las dos formas (Tabla 5) . Dentro de los límites de sensibilidad del ensayo, se confirmó que el segundo pico contenía 85 por ciento de forma super enrollados, mientras que el material inicial solamente contenía del 50 al 60 por ciento de la forma super enrollada. 25 Cuando menos 90 por ciento del ADN de plásmido super enrollado inicial se recuperó. La resolución de los picos fue adecuada para efectuar la separación, aún con altura de columna de 15 centímetros. Esto demuestra la separación efectiva de las formas super enrollada y relajada del plásmido usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo. Además de esta excelente separación, la cantidad residual de ARN, proteína, y endotoxina podría removerse dando como resultado un producto que satisface las especificaciones para la terapia de genes . Tabla 5 Ejemplo 6: Separación de las formas super enrollada y relajada del ADN de plásmido usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo-columna larga de elución de gradiente Células de E. coli que albergaban el plásmido pElA-K2 se cultivaron, y se lisaron usando métodos químicos, y se aclararon a través de métodos de filtración, como se describió anteriormente. La purificación gruesa de ADN de plásmido para eliminar los contaminantes mayores tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN cromosomal, etcétera se realizó usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo, en donde, a una concentración de 2M de sulfato de amonio, el ADN de plásmido fluye a través de la columna mientras que los contaminantes se enlazan a la columna (véase lo anterior) . El • flujo a través que contiene el ADN de plásmido se dializó y 5 procesó en una columna de intercambio de iones que no proporcionan ninguna purificación adicional . La elución de la columna Q se diafiltró usando membrana de celulosa regenerada 30kD. El material dializado se ajustó a 3M de sulfato de amonio usando sulfato de amonio sólido, como se describió 10 anteriormente en el Ejemplo 5. Una columna de Butilo (Toyopearl Butyl 650S TosoHaas) de un diámetro de 2.6 centímetros y aproximadamente 30 centímetros de altura se empacó a una velocidad de flujo de 15-20 mililitros/minuto. La columna se equilibró con 3M de 15 sulfato de amonio en regulador Tris-AEDT pH 7.4. La muestra se cargó a un régimen de flujo de 5 mililitros/minuto. El plásmido se enlazó a la columna en 3M de sulfato de amonio. La columna se lavó entonces con 2-3 volúmenes del lecho con solución reguladora de 3M regulador sulfato de amonio. La 20 columna se eluyó con un gradiente de concentración de sulfato de amonio desde 3M a ÍM sobre 6 volúmenes del lecho. Durante la elución del gradiente, resultaron dos picos, el primer pico conteniendo la forma relajada del ADN de plásmido, y el segundo pico conteniendo la forma super enrollada de ADN de plásmido 25 como fue evidenciado en gels de agarosa de fracciones (Figura 5A) . El cromatograma se muestra en la Figura 5B. Los resultados fueron confirmados por un ensayo de cromatografía líquida de alto rendimiento usado para determinar el porcentaje de las dos formas (Tabla 6) . Dentro de los límites de sensibilidad del ensayo, se confirmó que el segundo pico contenía 90 por ciento de forma super enrollada, mientras que el material inicial solamente contenía el 50 por ciento de la forma super enrollada. La resolución de la línea base de los picos se obtuvo con la columna más larga. Este ejemplo claramente demuestra la separación efectiva de las formas super enrollada y relajada del plásmido usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo. Además de esta excelente separación, la cantidad residual de ARN, proteína, y endotoxina pudieron removerse dando como resultado un producto que satisface las especificaciones para la terapia de genes. Tabla 6 Ejemplo 7: Separación de las formas super enrollada y relajada del ADN de plásmido usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo-columna larga de elución de paso Células de E. coli que albergaban el plásmido pElA-K2 • se cultivaron, y se usaron usando métodos químicos, y se 5 aclararon a través de métodos de filtración, como se describió anteriormente. La purificación gruesa de ADN de plásmido para eliminar los contaminantes mayores tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN cromosomal, etcétera se realizó usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo, en donde, 10 a una concentración de 2M de sulfato de amonio, el ADN de • plásmido fluye a través de la columna mientras que los contaminantes se enlazan a la columna (véase Ejemplo 1 anterior) . El flujo a través y el lavado se depositaron y concentraron usando una membrana de ultrafiltración de 30kD 15 usando filtración de flujo tangencial. El ADN de plásmido concentrado se ajustó a 3M de sulfato de amonio, usando sulfato de amonio sólido. Una columna de Butilo (Toyopearl Butyl 650S TosoHaas) de un diámetro de 1 centímetro y aproximadamente 30 20 centímetros de altura se empacó a una velocidad de flujo de 6 mililitros/minuto. La columna se equilibró con 3M de sulfato de amonio en regulador Tris-AEDT pH 7.4. La muestra se cargó a un régimen de flujo de 2 mililitros/minuto. El plásmido se enlazó a la columna en 3M de sulfato de amonio. La columna se 25 lavó entonces con 2-3 volúmenes del lecho con solución reguladora de 3M sulfato de amonio. La columna se eluyó con varias concentraciones de sulfato de amonio - 2.8M, 2.7M, 2.6M, 2.55M, 2.5M, 2.4M, ÍM - usando 2-3 volúmenes de columna. Se observaron picos en las eluciones de 2.4M y de ÍM. La electroforesis de gel de agarosa de los picos se muestra en la Figura 6. El gel indica clara separación de las formas super enrollada y relajada. La elución de 2.4M contiene la forma relajada, mientras que la elución de ÍM contiene el ADN super enrollado. El cromatograma se muestra en la Figura 6. Los resultados fueron confirmados adicionalmente mediante un ensayo de cromatografía líquida de alto rendimiento usado para determinar el porcentaje de las dos formas (Tabla 7) . Dentro de los límites de sensibilidad del ensayo, se confirmó que el segundo pico contenía 93 por ciento de forma super enrollada, mientras que el material inicial solamente contenía el 62 por ciento de la forma super enrollada. Estos resultados se confirmaron mediante experimentos posteriores en donde eluciones de 2.3M y 2.2M no proporcionaron la resolución, y la elución de 2.4M repetidamente proporcionó la remoción significativa de la forma relajada, mediante lo cual se enriqueció la forma super enrollada en la elución de ÍM. La separación llevada a cabo usando la elución de pasos es significativa en separaciones a gran escala, lo cual se realiza más confiablemente usando eluciones por pasos. Este ejemplo claramente demuestra la separación efectiva de las formas super enrollada y relajada del plásmido usando elución por pasos de la cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo. Además de esta excelente separación, la cantidad residual de ARN, • proteína, y endotoxina pudo removerse dando como resultado un producto que satisface las especificaciones para la terapia de genes . Tabla 7 10 • Ejemplo 8: Separación de las formas super enrollada y relajada del ADN de plásmido usando cromatografía de interacción hidrofóbica de hexilo-columna larga de elución de 15 gradiente Células de E. coli que albergaban el plásmido pElA-K2 se cultivaron, y se lisaron usando métodos químicos, y se aclararon a través de métodos de filtración, como se describió anteriormente. La purificación gruesa de ADN de plásmido para 20 eliminar los contaminantes mayores tales como endotoxina, ARN, proteína, ADN cromosomal, etcétera se realizó usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo, en donde, a una concentración de 2M de sulfato de amonio, el ADN de plásmido fluye a través de la columna mientras que los 25 contaminantes se enlazan a la columna (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1 anterior) . El flujo a través que contiene el ADN de plásmido se dializó y procesó en una columna de intercambio de aniones que no proporcionó purificación adicional. La elución de la columna Q se diafiltró usando una membrana de celulosa 5 regenerada de 30 kD. El material dializado se ajustó a 3M de sulfato de amonio usando sulfato de amonio sólido (véase anteriormente) . Una columna de Butilo (Toyopearl Hexyl 650C TosoHaas) de un diámetro de 1 centímetro y aproximadamente 10 longitud de 30 centímetros se empacó a una velocidad de flujo ^^ de 5 mililitros/minuto. La columna se equilibró con 3M de sulfato de amonio en regulador Tris-AEDT pH 7.4. La muestra se cargó a un régimen de flujo de 2 mililitros/minuto. El plásmido se enlazó a la columna en 3M de sulfato de amonio. La 15 columna se lavó con 2-3 volúmenes del lecho con solución reguladora de 3M sulfato de amonio. La columna se eluyó con un gradiente de concentración de sulfato de amonio de 3M a ÍM sobre 6 volúmenes del lecho. Durante la elución de gradiente, { resultaron dos picos, el primer pico conteniendo 20 predominantemente la forma relajada del ADN de plásmido, y el segundo tipo conteniendo predominantemente la forma super enrollada de ADN de plásmido como se hace evidente en gel de agarosa de fracciones (Figura 7) . El cromatograma se muestra en la Figura 7B. 25 Cualitativamente, el segundo pico contenía proporción significativamente más alta de plásmido super enrollado que el material inicial basado en electroforesis de gel de agarosa. Resolución excelente de los picos se obtuvo, considerando el • hecho de que el tamaño de cuenta fue 100: m para el Hexilo, en 5 comparación con 35 :m para el Butilo. Ejemplo 9 Remoción de endotoxina usando cromatografía de interacción hidrofóbica de butilo (usando cloruro de sodio) Células de E. coli que albergaban el plásmido pElA-K2 se cultivaron, y se lisaron usando métodos químicos, y se 10 aclararon a través de métodos de centrifugación. El • sobrenadante se usó para el experimento. La muestra se purificó a través de una columna de intercambio de aniones (Q Hyper D - BIOSEPRA Inc.) . Una elución de cloruro de sodio 2M de la columna se usó para este experimento. La muestra estuvo 15 presente en 50 mM Tris lOmM AEDT pH 7.4 regulador con 2M NaCl. Una columna de HIC Butilo (usando resina Butyl 650S - TosoHaas) de diámetro 1 centímetro y altura 20 centímetros de aproximadamente volumen 10 mililitros empacó y equilibró con TE que contenía 2M de cloruro de sodio. La muestra se cargó a un 20 régimen de flujo de 2 mililitros/minuto. El flujo a través se recolectó, y se tomaron muestras para análisis (concentración de ADN, gel de agarosa, y ensayo de endotoxina) . Después de la carga de la muestra, se puso a fluir TE que contenía 2M de sulfato de amonio a través de la columna, se recolectó y 25 muestreó. La columna se lavó posteriormente con pH 7.4.

Tabla 8 • 5 Capacidad de endotoxina por mililitros de resina: 1570 UE/ml Reducción de endotoxina en la muestra: 98% Ejemplo 10: Purificación de plásmido a pequeña escala con cromatografía de interacción hidrofóbica butilo 10 La purificación de ADN de plásmido a pequeña escala se lleva a cabo usando el juego comercialmente disponible, el más comúnmente conocido de los cuales es un juego Miniprep de Qiagen. Los métodos descritos en la presente se pueden usar para purificación de ADN de plásmido para proporcionar varias 15 ventajas sobre juegos comerciales. El siguiente ejemplo demuestra el uso del método de cromatografía de interacción hidrofóbica de la presente invención para la purificación de ADN de plásmido a pequeña escala. El material inicial para la purificación se obtuvo a 20 través de métodos estándares. Específicamente, células de E.coli que altergaban plásmido de aproximadamente tamaño 4.65 Kb se cultivaron en caldo de Luria que contenía 100 microgramos/mililitro de ampicilina a 37°C. Las células se cultivaron a una densidad óptica de 2.7. Las células se removieron del medio a través de centrifugación. Posteriormente, el aglomerado de células se resuspendió en 50mM Tris-HCl, lOmM AEDT a pH 8.0. Un volumen igual de 200 mM NaOH, 1 por ciento de solución SDS se añadió, se mezcló bien y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Este paso dio como resultado la lisis de las células, liberando el contenido celular, incluyendo el ADN de plásmido. La solución de neutralización que consistía en acetato de potasio 31M (pH 5.5) se añadió en volumen igual (original) y se mezcló bien. El lisado neutralizado se filtró entonces a través de manta de cielo y filtros para remover el precipitado. El lisado clarificado se precipitó con 70 por ciento de isopropanol (añadiendo 2.1 mililitros de isopropanol por 3 mililitros de lisado clarificado) . El precipitado se separó a través de centrifugación y el aglomerado se lavó con 70 por ciento de etanol, se secó y se disolvió en lOmM Tris-HCl, 0. lmM AEDT regulador, pH 8.0. Esta preparación se congeló a -20 °C hasta su uso y fue el material inicial para los experimentos de purificación. Una columna de butilo 650S con un volumen de lecho de 20 mililitros y una altura de lecho de 10 centímetros se empacó en una columna de 1.6 centímetros de diámetro (Pharmacia XK16/20) y se equilibró con 2.2M sulfato de amonio (AS) en 50mM Tris-HCl, lOmM AEDT (TE) regulador, pH 7.4. La muestra para carga se preparó añadiendo sulfato de amonio sólido a una fl) concentración final de 2.2M. La muestra se diluyó con 2.2M de sulfato de amonio en Tris-AEDT, pH 7.4 a 10 mililitros. Las condiciones de purificación se diseñaron para 5 permitir que el ADN de plásmido se recolecte en el flujo a través y los contaminantes se liguen a la resina. El ejemplo se cargó a 2 mililitros/minuto y se recolectó el flujo a través. La columna se lavó con 35 mililitros de 2.2M sulfato de amonio en regulador TE y se 10 recolectó como lavado 1 (10 mililitros), lavado 2 (14.5 mililitros) , y lavado 3 fracciones (10 mililitros) . Resultó un pico durante el lavado. La columna se eluyó con 55 mililitros de ÍM sulfato de amonio en regulador TE, pH 7.4 y se recolectó como ÍM lavado 1 (10 mililitros) y ÍM lavado 2 (45 mililitros) . 15 Resultó un pico durante la elución de ÍM sulfato* de amonio. La columna se eluyó con 50 mililitros de agua purificada USP. Resultó un pico. La tabla enseguida muestra el ácido nucleico presente total en cada una de las fracciones anteriores. Las concentraciones se calcularon basándose en la absorbancia a 20 260nm (Conc. (Microgramo/mililitro) = A260 * 50) Tabla 9 Una electroforesis de gel de agarosa de las muestras se preformó. La Figura 8 muestra una fotocopia del gel. La fotografía del gel muestra el ADN de plásmido en las fracciones de lavado (franja 3, 4, 5). En comparación con la muestra de carga (franja 2) no hay ARN visible en las fracciones de lavado. Las fracciones de elución contienen ARN como se ve en las franjas 6 y 7. La endotoxina en el depósito de lavado se midió usando un ensayo de endotoxina QCL cinético. No se detectó endotoxina en la muestra al nivel de sensibilidad del ensayo, el cual fue de .005 UE/ml. El rendimiento del plásmido fue de 733 microgramos de 100 mililitros de cultivo que es similar a lo obtenible con juegos comerciales. El contenido entero de las referencias citadas en la presente y más adelante se incorporan completamente por referencia . La producción de /ADN de plásmido en grado farmacéutico, Magda Marquet, Nancy Horn, Jennifer Meek, Gregg • Budahazi, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5 5,561,064 Concentración y fraccionamiento por tamaño de ácidos nucleicos y virus en medio poroso, Colé, Kenneth D., Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,707,850 Purificación de ADN de plásmido durante cromatografía 10 en columna, Nancy Horn, Greg Budahazi, Magda Marquet, Patente • de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,707,812

Claims (32)

REIVINDICACIONES

1. Un método para purificar ADN de plásmido a partir de una mezcla del mismo que contiene cuando menos una impureza de la célula anfitriona que comprende los siguientes pasos: (a) formar una solución añadiendo suficiente sal a la mezcla para permitir el enlace selectivo de la cuando menos una impureza de la célula anfitriona a un medio de interacción hidrofóbico; (b) poner en contacto la solución que contiene el ADN de plásmido con el medio de interacción hidrofóbico bajo condiciones que la al menos una impureza se enlace con el medio de interacción hidrofóbica para formar un complejo; y (c) recolectar ADN de plásmido sin enlazar a partir del complejo y del medio de interacción hidrofóbico; en donde este método se lleva a cabo en ausencia de solventes, detergentes, glicoles, hexamina cobalto, espermidina, y polivinil-pirrolidona .

2. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la cuando menos una impureza se selecciona del grupo que consiste en ARN, endotoxina, ADN cromosomal y proteína.

3. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la cuando menos una impureza es una endotoxina.

4. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo que consiste en acetato, fosfato, carbonato, S042", Cl", Br" , N03", Mg+, Li\ Na+, K+, NH4+.

5. El método de conformidad con lo reclamado en la • reivindicación 4, caracterizado porque la sal es sulfato de 5 amonio en un rango de concentración de 2M a 4M.

6. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 5, caracterizado porque el sulfato de amonio está presente a una concentración de aproximadamente 2M.

7. El método de conformidad con lo reclamado en la 10 reivindicación 1, caracterizado porque la solución comprende • sales de sodio en un rango de concentración de 2M a 4M.

8. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 7, caracterizado porque la sal de sodio es cloruro de sodio. 15

9. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 8, caracterizado porque la sa.1 de sodio es cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 2M.

10. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el pH de la solución 20 tiene un rango de aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.4.

11. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el pH de la solución es aproximadamente 7.4.

12. El método de conformidad con lo reclamado en la 25 reivindicación 1, caracterizado porque el medio de interacción hidrofóbico comprende un soporte de cromatografía con grupos hidrofóbicos pendientes.

13. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 12, caracterizado porque los grupos pendientes se seleccionan del grupo que consiste en grupos alquilo con de 3 a 10 átomos de carbono y mezclas de los mismos.

14. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 12, caracterizado porque el medio de interacción hidrofóbico se selecciona del grupo que consiste en un polímero de metacrilato o estructura central de copolímero enlazada a cuando menos uno de un ligando propilo, butilo, hexilo, octilo, nonilo o decilo.

15. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14, caracterizado porque el medio es cuando menos uno de estructura central de copolímero de metacrilato-etilenglicol o una estructura central de agarosa reticulada.

16. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 12, caracterizado porque la resina está en forma de una cuenta en un rango de tamaño de 15 a 100 mieras.

17. Un método para separar -ADN de plásmido super-enrollado a partir de una mezcla de ADN de plásmido super-enrollado y ADN de plásmido relajado y, opcionalmente, cuando menos una impureza de la célula anfitriona que comprende los siguientes pasos: (a) formar una solución añadiendo una sal a la mezcla de ADN de plásmido superenrollado y ADN de plásmido relajado y, cuando está presente, la cuando menos una impureza de la célula anfitriona; (b) poner en contacto la solución con un medio de interacción hidrofóbico bajo una primera condición en donde tanto el ADN de plásmido superenrollado como el ADN de plásmido relajado se enlaza al medio de interacción hidrofóbico para formar una primera mezcla enlazada; (c) alterar las primeras condiciones que rodean la primera mezcla enlazada a segundas condiciones para remover el ADN de plásmido relajado a partir de la primera mezcla enlazada para formar componentes separados que contienen una segunda mezcla enlazada y ADN de plásmido relajado; y (d) modificar las segundas condiciones que rodean la segunda mezcla enlazada a terceras condiciones para remover el ADN de plásmido superenrollado de dicha segunda mezcla enlazada para formar componentes separados que contienen medios de interacción hidrofóbico y ADN de plásmido superenrollado.

18. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, caracterizado porque la cuando menos una impureza de la célula anfitriona se selecciona del grupo que consiste en ARN, endotoxina, ADN cromosomal y proteína.

19. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, caracterizado porque la cuando menos una impureza de la célula anfitriona es una endotoxina.

20. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, caracterizado porque el medio de interacción hidrofóbico comprende un soporte de cromatografía con grupos hidrofóbicos pendientes.

21. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, caracterizado porque los grupos pendientes se seleccionan del grupo que consiste en grupos alquilo con 3 a 10 átomos de carbono.

22. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, caracterizado porque el medio de interacción hidrofóbico se selecciona del grupo que consiste en un polímero de metacrilato o estructura central de polímero o copolímero de metacrilato enlazado a cuando menos un propilo, butilo, hexilo, octilo, nonilo, o una mezcla de éstos como ligandos.

23. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, caracterizado porque el medio es cuando menos uno de estructura central de copolímero de metacrilato etilenglicol o una agarosa reticulada.

24. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, caracterizado porque el medio es una resina en forma de cuentas de rango de tamaño entre 15 y 100 mieras.

25. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, caracterizado porque la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo que consiste en acetato, fosfato, carbonato, S042", Cl", Br", N03", Mg+, Li+, Na+, K\ NH4+ .

26. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 25, caracterizado porque la sal es sulfato de amonio en un rango de concentración de 2.5M a 4M.

27. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, caracterizado porque las primeras condiciones comprenden equilibrar el medio con una solución de sal que contiene sulfato de amonio que está presente en un rango de concentración de aproximadamente 2.5M a 4M.

28. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, caracterizado porque las segundas condiciones comprenden lavar el medio con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de aproximadamente 2.35M a aproximadamente 2.45M.

29. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 17, caracterizado porque las terceras condiciones comprenden lavar la segunda mezcla de enlace con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de aproximadamente ÍM a 2.3M.

30. Un método para separar endotoxina de ADN de plásmido que comprende poner en contacto una mezcla de endotoxina y ADN de plásmido con un medio de interacción hidrofóbico bajo condiciones en donde la endotoxina se enlaza con el medio de interacción hidrofóbico para formar un complejo y separar el ADN del plásmido y el complejo.

31. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la sal comprende un anión o catión seleccionado del grupo que consiste en acetato, fosfato, carbonato, S042", Cl", Br" , N03", Mg2+, Li+, Na+, K\ NHJ .

32. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la mezcla además comprende una sal de amonio en un rango de concentración de 1.5 a 4M. 32. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 32, caracterizado porque la sal de amonio es sulfato de amonio que está presente a una concentración de aproximadamente 2M. 34. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque el medio de interacción hidrofóbico comprende un soporte de cromatografía con grupos hidrofóbicos pendientes. 35. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 34, caracterizado porque los grupos pendientes se seleccionan del grupo que consiste en grupos alquilo con 3 a 10 átomos de carbono. 36. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 34, caracterizado porque el medio de interacción hidrofóbico se selecciona del grupo que consiste en una estructura central de polímero o copolímero de metacrilato enlazado a cuando menos uno de un propilo, butilo, hexilo, octilo, nonilo, o una mezcla de estos como ligandos. 37. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 34, caracterizado porque el medio es cuando menos uno de estructura central de copolímero de metacrilato etilenglicol o una agarosa reticulada. 38. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 34, caracterizado porque el medio es una resina en forma de cuentas en rango de tamaño de 15 a 100 mieras. 39. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la mezcla tiene un pH en el rango de aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.4. 40. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 35, caracterizado porque el pH es de aproximadamente 7.4. 41. Un método para separar /ADN de plásmido superenrollado a partir de ADN de plásmido relajado que comprende poner en contacto una mezcla de ADN de plásmido superenrollado y ADN de plásmido relajado con un medio de interacción hidrofóbico bajo unas primeras condiciones en donde tanto el ADN de plásmido superenrollado como el ADN de plásmido relajado se enlazan al medio de interacción hidrofóbica para formar una primera mezcla enlazada, alterar las primeras condiciones que rodean a la primera mezcla enlazada con segundas condiciones para remover al ADN de plásmido relajado de la primera mezcla para formar componentes separados que contienen una segunda mezcla enlazada y el ADN de plásmido relajado, y modificar las segundas condiciones que rodean la segunda mezcla enlazada con terceras condiciones para remover el ADN de plásmido super-enrollado a partir de la segunda mezcla enlazada para formar componentes separados que contienen el medio de interacción hidrofóbico y el ADN del plásmido superenrollado. 42. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 41, caracterizado porque el medio de interacción hidrofóbico comprende un soporte cromatográfico con grupos hidrofóbicos pendientes. 43. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 42, caracterizado porque los grupos hidrofóbicos pendientes se seleccionan del grupo que consiste en grupos alquilo con 3 a 10 átomos de carbono y mezclas de los mismos. 44. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 41, caracterizado porque la resina hidrofóbica es una estructura central de polímero o copolímero metacrilato enlazada a cuando menos uno de un ligando propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, o decilo. 45. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 44, caracterizado porque la resina es cuando menos una de estructura central de copolímero de metacrilato y etilenglicol o una agarosa reticulada. 46. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 41, caracterizado porque la resina está en forma de cuentas que varían de tamaño de 35 a 100 mieras. 47. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 41, caracterizado porque las primeras condiciones comprenden equilibrar la mezcla y el medio con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en un rango de concentración de aproximadamente 2.5 M a aproximadamente 4 M. 48. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 47, caracterizado porque las segundas condiciones comprenden lavar la primera mezcla enlazada con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de aproximadamente 2.35 M a aproximadamente 2.45 M. 49. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 48, caracterizado porque las terceras condiciones comprenden lavar la segunda mezcla de enlace con una solución de sal que contiene sulfato de amonio en una concentración de aproximadamente ÍM a aproximadamente 2.3M. 50. El método de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 17 y 41,. caracterizado porque la alteración y la modificación se combinan en un proceso continuo que comprende la elución por gradiente del ADN de plásmido relajada y del ADN de plásmido superenrollado mezclando la primera mezcla enlazada con el sulfato de amonio que contiene solución de sal con una concentración continuamente variable de sulfato de amonio, variando dicha concentración de aproximadamente 3M a aproximadamente ÍM de sulfato de amonio, y el ADN de plásmido relajado se recolecta en un primer volumen eluido y el ADN de plásmido super enrollado se recolecta en un segundo volumen eluido. 51. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 41, caracterizado porque el componente del ADN de plásmido relajado separado y el ADN de plásmido super-enrollado separado se recolectan y se aislan. 52. Un método para enriquecimiento de la cantidad de ADN superenrollado relativo al ADN relajado en una mezcla de los mismos, comprendiendo: (1) interactuar la mezcla que contiene el ADN superenrollado y el ADN relajado con un medio interactivo hidrofóbico que comprende una fracción alquilo bajo condiciones iónicas caracterizado porque el ADN superenrollado preferencialmente se enlaza con el medio interactivo hidrofóbico; (2) tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN relajado y superenrollado bajo condiciones iónicas que permiten la remoción preferencial del ADN relajado; y (3) eluir el ADN superenrollado del medio interactivo hidrofóbico. 53. Un método para remover lipopolisacárido (LPS) a partir de una composición que contiene ADN, comprendiendo el método: (1) interactuar la mezcla que comprende el ADN y el lipopolisacárido con un medio interactivo hidrofóbico que comprende una fracción alquilo, caracterizado porque la interacción es bajo condiciones iónicas en donde el lipopolisacárido preferencialmente se enlaza con el medio interactivo hidrofóbico relativo al ADN; y (2) tratar el medio interactivo hidrofóbico que contiene el ADN y el lipopolisacárido con condiciones iónicas que permiten la remoción selectiva del ADN. ftjaJZ8 I o I . 74 RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para la purificación de ADN de plásmido, que incluyen la remoción de las impurezas de la célula huésped, tales como endotoxinas, ARN, proteínas, y ADN cromosomal, a partir de una solución acuosa que contiene ADN del plásmido, y métodos para la separación y purificación de ADN de plásmido superenrollado a partir de una solución acuosa que contiene una mezcla de ADN del plásmido superenrollado y mellado o relajado, utilizando soportes de cromatografía de interacción hidrofóbica. * * * * *